VERGLEICHENDE UNTERSUCHUNGEN ZUR H Ä M O G L O B I N S Y N T H E S E UND

VERGLEICHENDE UNTERSUCHUNGEN ZUR H Ä M O G L O B I N S Y N T H E S E UND

ZUR ZELLALTERUNG BEIM

KERNHALTIGEN KARPPENERYTHROZYTEN UND HUMANERYTHROZ YTEN

DISSERTATION

ZUR ERLANGUNG DES DOKTORGRADES

DER NATURWISSENSCHAFTEN (DR. RER. NAT. ) DER NATURWISSENSCHAFTLICHEN FAKULTÄT I I I

- BIOLOGIE UND VORKLINISCHE MEDIZIN - DER UNIVERSITÄT REGENSBURG

v o r g e l e g t von

WERNER SPECKNER

aus FURTH i . WALD

1988

0« 2j>|f3

P r o m o t i o n s g e s u c h e i n g e r e i c h t am 10.2.1988

D i e A r b e i t wurde a n g e l e i t e t v o n P r o f . Dr. C. A l b e r s Prüfungsausschuß:

Tag d e r mündlichen Prüfung:

INHALTSVERZEICHNIS

S e i t e

1. E i n l e i t u n g 1

2. Geräte, M a t e r i a l i e n , Methoden 5

2 . 1 . Abkürzungen 5

2 . 2 . Geräte 6 2 . 3 . S u b s t a n z e n und R e a g e n t i e n 7

2.4. V e r s u c h s t i e r h a l t u n g und B l u t g e w i n n u n g 10 2 . 5 . A u f t r e n n u n g v o n Human- und K a r p f e n e r y t h r o z y t e n n a c h

D i c h t e und A l t e r und hämatologische C h a r a k t e r i s i e r u n g

f r a k t i o n i e r t e r und u n f r a k t i o n i e r t e r Z e l l e n 13 2 . 5 . 1 . Bestimmung v o n Hämatokrit, E r y t h r o z y t e n z a h l ,

Hämoglobinkonzentration und Plasmaosmolarität 13

2 . 5 . 2 . D i c h t e f r a k t i o n i e r u n g 14 2 . 5 . 3 . Bestimmung v o n D i c h t e , MCV, MCH, MCHC

i n E r y t h r o z y t e n f r a k t i o n e n 16

2.5. 4 . M i k r o s k o p - C y t o p h o t o m e t r i e 17

2 . 5 . 5 . M a r k i e r u n g m i t r a d i o a k t i v e m G l y c i n

und C^{1 4}- Bestimmung 19

2 . 5 . 6 . G e l f i l t r a t i o n , I E F und Hämoglobinspaltung 20 2.6. Bestimmung v o n Enzymaktivitäten i n f r a k t i o n i e r t e n

und u n f r a k t i o n i e r t e n K a r p f e n - und H u m a n e r y t h r o z y t e n . 23

2. 6. 1 . A l l g e m e i n e Durchführung 23

2. 6. 2 . Methoden d e r e n z y m a t i s c h e n Bestimmungen 26

2. 6. 2 . 1 . A c e t y l c h o l i n e s t e r a s e 26 2. 6. 2 . 2 . A s p a r t a t - A m i n o t r a n s f e r a s e (GOT) 27

2. 6. 2 . 3 . G l u c o s e - 6 - p h o s p h a t - D e h y d r o g e n a s e 27

2. 6.2. 4 . P e r o x i d a s e 28

2. 6. 2 . 5 . G l u t a t h i o n - R e d u k t a s e 28 2 . 6 . 3 . Berechnung d e r Enzymaktivitäten 29

2 . 7 . S t a t i s t i k 30 3. E r g e b n i s s e 31 3 . 1 . V o r v e r s u c h e ( E r g e b n i s s e z u 2 . 5 . 1 . ) 31

3.2. D i c h t e , MCV, MCH, MCHC i n E r y t h r o z y t e n f r a k t i o n e n

( E r g . z u 2.5.3. ) 32

3 . 3 . Hämoglobinabsorption von E i n z e l z e l l e n p e r

M i k r o s k o p - C y t o p h o t o m e t r i e ( E r g . z u 2.5.4.) 36 3.4. E r y t h r o z y t e n m a r k i e r u n g i n Abhängigkeit vom Z e l l a l t e r

beim K a r p f e n ( E r g . z u 2.5.5«) 39

3 . 5 . E r y t h r o z y t e n m a r k i e r u n g b e i Humanblut ( E r g . z u 2 . 5 . 5 . ) 47 3 . 6 . E i n b a u v o n C^{1 4} i n Hämoglobin, Häm und G l o b i n

( E r g . z u 2. 5.6. ) 47 3.7. I E F von K a r p f e n b l u t f r a k t i o n e n ( E r g . z u 2.5«6.) 52

3 . 8 . E r g e b n i s s e d e r e n z y m a t i s c h e n Bestimmungen ( z u 2.6.2.) 54

4. D i s k u s s i o n 57 4.1. D i c h t e t r e n n u n g 57

4.2. Z e l l a l t e r und Hämoglobingehalt 59

4.2.1. B l u t z e l l b i l d u n g beim F i s c h 59

4.2.2. V e i t e r b e s t e h e n d e r Hämoglobinsynthese im

p e r i p h e r e n K a r p f e n e r y t h r o z y t e n i n v i v o 63 4.2.3. K o r r e l a t i o n D i c h t e - A l t e r des E r y t h r o z y t e n

und G l y c i n v e r w e r t u n g 65 4.2.4. Hämoglobinsynthese im K a r p f e n e r y t h r o z y t e n i n v i t r o 69

4 . 3 . Einflüsse a u f d i e Z e l l a l t e r u n g beim H u m a n e r y t h r o z y t e n 71

4.3.1. D i e V e r m i n d e r u n g d e r m e t a b o l i s c h e n Aktivität 71 4.3.2. D i e V e r m i n d e r u n g des r e d u k t i v e n P o t e n t i a l s 76

4 . 3 . 3 . Zellmembranveränderungen 78 4.4. Z e l l a l t e r und Enzymaktivitäten beim K a r p f e n - und

H u m a n e r y t h r o z y t e n 80 4.4.1. A c e t y l c h o l i n e s t e r a s e 80

4.4.2. A s p a r t a t - A m i n o t r a n s f e r a s e (GOT) 81

4.4.3. G l u c o s e - 6 - p h o s p h a t - D e h y d r o g e n a s e 83

4.4.4. P e r o x i d a s e 83 4.4.5. G l u t a t h i o n - R e d u k t a s e 84

4.5. A u s b l i c k 85

5. Zusammenfassung 86

6. L i t e r a t u r 89

1. EINLEITUNG

S e i t d e r Beobachtung, daß R e t i k u l o z y t e n l e i c h t e r a l s E r y t h r o z y t e n s i n d , wurde g e n e r e l l angenommen, daß d i e D i c h t e von r o t e n B l u t z e l l e n m i t dem Z e l l a l t e r anwächst. Zumindest für d i e o f t m a l s u n t e r s u c h t e n k e r n l o s e n H u m a n e r y t h r o z y t e n ( B o r u n e t a l . 1957, P r a n k e r d 1958, R i g a s & K o l e r 1961, Garby

& HJelm 1963, Murphy 1973. Cohen e t a l . 1976) und e b e n s o l c h e von v e r s c h i e d e n e n Säugetieren ( K a n i n c h e n , Maus, Hund, P f e r d , S c h w e i n ) (Hoffman 1958, Danon & M a r i k o v s k y 1964, P r e n t i c e &

B i S h o p 1965, B i s h o p & P r e n t i c e 1966, W i l t o n 1966, P i o m e l l i e t a l . 1967, P a r k e r 1973, Abraham e t a l . 1978) wurde d i e s e B e z i e h u n g m i t D i c h t e f r a k t i o n i e r u n g e n bestätigt, d i e s i c h s o m i t z u r A l t e r s t r e n n u n g d e r Z e l l e n anwenden ließen. E i n e z u Säugererythrozyten a n a l o g e D i c h t e - A l t e r K o r r e l a t i o n wurde v o n Lane e t a l . (1982) für F o r e l l e n e r y t h r o z y t e n aus m o r p h o l o g i s c h e n B e t r a c h t u n g e n g e s c h l o s s e n , i s t a b e r n i c h t g e s o n d e r t w e i t e r v e r f o l g t worden.

Im Gegensatz z u den k e r n l o s e n Säugererythrozyten i s t d i e r e i f e r o t e B l u t z e l l e a l l e r anderen W i r b e l t i e r e ( F i s c h e , A m p h i b i e n , R e p t i l i e n , Vögel) k e r n h a l t i g . Der E r y t h r o z y t d e r K n o c h e n f i s c h e s t e l l t s i c h a l s e i n e r e l a t i v große, r u n d b i s o v a l e Z e l l e m i t z e n t r a l gelegenem K e r n d a r , d e r von e i n e r Doppelmembran m i t z a h l r e i c h e n P o r e n umgeben i s t (Yasuzumi &

H i g a s h i z a w a 1955, F a w c e t t & W i t e b s k i 1964, Kreutzmann & Jonas 1 9 7 8 ) . E r enthält u.a. Ribosomen, E n d o p l a s m a t i s c h e s R e t i c u l u m , M i t o c h o n d r i e n , G o l g i - A p p a r a t , V a k u o l e n (Weinreb 1963, F e y 1965b, Sekhon & Beams 1969, Yamamoto & I u c h i 1976) und könnte s o m i t a l s e i n m e t h o d i s c h e i n f a c h verfügbares M o d e l l e i n e r s t o f f w e c h s e l a k t i v e n S o m a z e l l e angesehen werden, d e r e r i n Transportmechanismen und StoffWechselvorgängen mehr ähnelt a l s e i n H u m a n e r y t h r o z y t .

W i l l man nun den A l t e r u n g s v o r g a n g d i e s e r Z e l l e b i o c h e m i s c h und hämatologisch c h a r a k t e r i s i e r e n , i s t e i n e r e p r o d u z i e r b a r e und e f f e k t i v e A u f t r e n n u n g d e r E r y t h r o z y t e n n a c h i h r e m A l t e r e i n e w e s e n t l i c h e V o r a u s s e t z u n g für d i e b e a b s i c h t i g t e n U n t e r s u c h u n g e n .

Abb. 1 : R e i f e und unvollständig e n t w i c k e l t e , hämoglobinarme ( P f e i l ) K a r p f e n e r y t h r o z y t e n , d i e e i n i g e Tage n a c h Blutabnähme v e r m e h r t a u f t r e t e n ( n a c h Pappenheimfärbung) ( A l b e r s 1985)

W i r b e o b a c h t e t e n beim K a r p f e n 1-2 Wochen n a c h Abnahme e i n e r größeren Menge B l u t (20%~50% des G e s a m t b l u t v o l u m e n s ) das A u f t r e t e n e i n e r besonderen E r y t h r o z y t e n p o p u l a t i o n aus im M i k r o s k o p r u n d und h e l l e r s c h e i n e n d e n Z e l l e n (Abb. 1), d i e s i c h i m Hämatokritröhrchen z w i s c h e n d u n k e l r o t e n E r y t h r o z y t e n und weißen L e u k o z y t e n a l s e i g e n e h e l l r o t gefärbte S c h i c h t a b s e t z e n . D a r a u f h i n wurde zunächst g e t e s t e t , ob s i c h d i e B e z i e h u n g D i c h t e - A l t e r a u c h für d i e k e r n h a l t i g e n E r y t h r o z y t e n des K a r p f e n n u t z e n läßt, um i n A n l e h n u n g an b i s h e r b e s c h r i e b e n e T r e n n v e r f a h r e n i n d e r L i t e r a t u r e i n e Methode z u e n t w i c k e l n , d i e s i c h g e n e r e l l z u r altersabhängigen A u f t r e n n u n g d i e s e r Z e l l e n e i g n e t .

D i e so e r h a l t e n e n Z e l l f r a k t i o n e n s o l l t e n dann näher u n t e r s u c h t werden. I n s b e s o n d e r e wurde d e r b i s h e r n i c h t gelösten F r a g e nachgegangen, ob d i e auffälligen m o r p h o l o g i s c h e n B e s o n d e r h e i t e n d e r K a r p f e n e r y t h r o z y t e n während i h r e r L e b e n s d a u e r z u b i o s y n t h e t i s c h e n Aktivitäten g e n u t z t werden, o d e r ob - w i e b e i Säugererythrozyten l e d i g l i c h u n r e i f e V o r s t u f e n außerhalb des K r e i s l a u f s b i o c h e m i s c h e S y n t h e s e n z e i g e n . Neben d e r U n t e r s u c h u n g d e r Hämoglobinsynthese i n v i t r o und i n v i v o wurden i n Abhängig- k e i t vom Z e l l a l t e r e i n i g e Enzymaktivitäten b e s t i m m t , d i e über i h r e B e t e i l i g u n g a n K o h l e n h y d r a t - , P r o t e i n - und F e t t - s t o f f w e c h s e l A u s s a g e n z u m e t a b o l i s c h e n Aktivitäten, S t o f f - wechselveränderungen und AlterungsVorgängen i m K a r p f e n - e r y t h r o z y t e n z u l a s s e n .

Im E i n z e l n e n l i e g e n d i e s e r A r b e i t f o l g e n d e Z i e l s e t z u n g e n z u Grunde:

1. ) E n t w i c k l u n g und T e s t u n g e i n e r r e p r o d u z i e r b a r e n , e f f e k t i v e n , möglichst e i n f a c h e n Z e n t r i f u g a t i o n s m e t h o d e z u r routinemäßigen A u f t r e n n u n g von K a r p f e n e r y t h r o z y t e n n a c h i h r e r D i c h t e ,

2. ) Bestimmung hämatologischer B a s i s p a r a m e t e r (Hämatokrit, E r y t h r o z y t e n z a h l , Hämoglobinkonzentration, MCV = M i t t l e r e r s k o r p u s k u l a r e s Volumen, MCH • M i t t l e r e r k o r p u s k u l a r e r Hämoglobingehalt, MCHC • M i t t l e r e r e k o r p u s k u l a r e Hämoglobinkonzentration) i n K a r p f e n - e r y t h r o z y t e n und d e r e n D i c h t e f r a k t i o n e n und V e r g l e i c h m i t H u m a n e r y t h r o z y t e n m i t t e l s Standardmethoden d e r k l i n i s c h e n Chemie und rechnergestützter C y t o p h o t o m e t r i e ,

3. ) U n t e r s u c h u n g d e r K o r r e l a t i o n E r y t h r o z y t e n d i c h t e E r y t h r o z y t e n a l t e r i n v i v o m i t t e l s r a d i o a k t i v e r M a r k i e r u n g ,

4. ) Klärung d e r F r a g e s t e l l u n g zum Hämoglobinstoffwechsel:

" F i n d e t im K a r p f e n e r y t h r o z y t e n i m G e g e n s a t z zum H u m a n e r y t h r o z y t e n i n v i v o im B l u t k r e i s l a u f und i n v i t r o Hämoglobinsynthese s t a t t ? " ,

5. ) E i n b l i c k i n den K o h l e n h y d r a t - , P r o t e i n - , und F e t t s t o f f w e c h s e l m i t d a m i t v e r b u n d e n e n Membran- und Strukturveränderungen im L a u f e d e r Z e l l a l t e r u n g über b e i s p i e l h a f t e altersabhängige Enzyme ( A c e t y l c h o l i n - e s t e r a s e , A s p a r t a t - A m i n o t r a n s f e r a s e , P e r o x i d a s e , G l u c o s e - 6-phosphat-Dehydrogenase, G l u t a t h i o n - R e d u k t a s e ) .

2. GEBÄTE, MATERIALIEN, METHODEN

2.1. Abkürzungen Hkt = Hämatokrit

RBC = R o t e - B l u t z e l l - Z a h l Hb = Hämoglobin

MCV • M i t t l e r e s k o r p u s k u l a r e s Volumen ( s . 3« 2 . )

MCH = M i t t l e r e r k o r p u s k u l a r e r Hämoglobingehalt ( s . 3 . 2 . ) MCHC = M i t t l e r e k o r p u s k u l a r e Hämoglobinkonzentration

( s . 3 - 2 . )

SEM • S t a n d a r d e r r o r o f f r a c t i o n means ( s . 2 . 7 . ) LSD = L e a s t s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e ( s . 2 . 7 . ) FG • F r e i h e i t s g r a d e

PSC • P h y s i o l o g i s c h e Salzlösung n a c h Imamura ( 1 9 7 9 ) ; ( s . 2 . 5 - 2 . )

EDTA = Ethylendiamin-tetraessigsäure

DTNB = 5,5'- D i t h i o b i s-2- n i t r o b e n z o e s ä u r e GSH - G l u t a t h i o n ( r e d u z i e r t )

GSSG = G l u t a t h i o n ( o x i d i e r t ) AChE = A c e t y l c h o l i n e s t e r a s e

GOT = A s p a r t a t - A m i n o t r a n s f e r a s e ( G l u t a m a t - O x a l a c e t a t - T r a n s a m i n a s e )

G6PDH = G l u c o s e - 6 - p h o s p h a t - D e h y d r o g e n a s e GRED • G l u t a t h i o n - R e d u k t a s e

POX = P e r o x i d a s e

LDH = L a c t a t - D e h y d r o g e n a s e MDH • M a l a t - D e h y d r o g e n a s e

T r i s = T r i s ( h y d r o x y m e t h y l ) - a m i n o m e t h a n USP = U n i t e d S t a t e s Pharmacopoea

2.2. Geräte

H e p a r i n i s i e r t e G l a s k a p i l l a r e n ( H a w k s l e y , L a n c i n g S u s s e x U.K.) M i c r o - H a e m a t o k r i t Reader ( H a w k s l e y , L a n c i n g S u s s e x U.K.)

K u n s t o f f s p r i t z e n 1 ml ( A s i k , Dänemark) Spezialkunststoffröhrchen ( K r a u t h , Hamburg)

Z e l l u l o s e n i t r a t 1.2 F i l t e r ( M i l l i p o r e SM 11303 S a r t o r i u s , Göttingen)

M i x e r 5432 ( E p p e n d o r f , Hamburg)

T h e r m o s t a t 5320 ( E p p e n d o r f , Hamburg) T h e r m o s t a t F 423 (Haake, B e r l i n ) Magnet-Rührgerät ( H e i d o l p h , K e l h e i m )

S c h u t t e l - und Mischgerät ( H e i d o l p h , K e l h e i m ) M i c r o f u g e HC 101 (Heraeus C h r i s t , O s t e r o d e ) K l e i n - Z e n t r i f u g e 3200 ( E p p e n d o r f , Hamburg) Z e n t r i f u g e IV-KS (Heraeus C h r i s t , O s t e r o d e )

S o r v a l l RC-2B L a b o r z e n t r i f u g e m i t R o t o r SS 34, SM 24 (Du P o n t , W i l m i n g t o n USA)

Isomess IM 3000 Radio-Dünnschicht A n a l y s a t o r ( I s o m e s s , S t r a u b e n h a r d t )

Halbmikro-Osmometer Type M ( K n a u e r , B e r l i n )

LKB 2117 M u l t i p h o r I I E l e k t r o p h o r e s e e i n h e i t (LKB, Gräfelfing) LKB 2103 Power S u p p l y (LKB, Gräfelfing)

Z e i s s S c a n n i n g C y t o p h o t o m e t e r 05

Z e i s s ölimmersionsobjektiv N e o f l u a r 1 0 0 x / 1.30 K o n d e n s o r P l a n 40x/0.60

Z e i s s Prismamonochromator M 4 Q I I I Osram Xenonhochdrucklampe XBO 150/W1 Hamamatsu M u l t i p l i e r 931 A

D i e t z 621 X 2 M i n i c o m p u t e r

C o u l t e r C o u n t e r D 1 ( C o u l t e r E l e c t r o n i c s , Harpenden H e r t s , U.K.) P h o t o m e t e r LKB U l t r a S p e c 4050 (LKB, Gräfelfing) P h o t o m e t e r 1101 M ( E p p e n d o r f , Hamburg)

K o m p e n s a t i o n s s c h r e i b e r 6511 ( E p p e n d o r f , Hamburg) pH G l a s e l e k t r o d e EaK 3-A ( E s c h w e i l e r , K i e l )

pH R e f e r e n z e l e k t r o d e Ea 3-C ( E s c h w e i l e r , K i e l ) pH G l a s e l e k t r o d e ( I n g o l d , F r a n k f u r t )

M i k r o p r o z e s s o r - p H - M e t e r Typ 34 ( K n i c k , B e r l i n )

M i k r o - U l t r a f i l t r a t i o n s s y s t e m M o d e l l 8 MC (Amikon, W i t t e n ) T r i - C a r b - O x i d i z e r 306 ( P a c k a r d , I l l i n o i s USA)

T r i - C a r b - S c i n t i l l a t i o n - C o u n t e r 300 C ( P a c k a r d , I l l i n o i s USA) O l i v e t t i PC M 24

2.3» S u b s t a n z e n und R e a g e n t i e n

C h e m i k a l i e n und R e a g e n t i e n wurden i n d e r v o r g e s c h r i e b e n e n R e i n h e i t verwendet;

L i e f e r f i r m e n : BM • B o e h r i n g e r Mannheim; Me • Merck;

Ro • Roth; Se • S e r v a ; S i = Sigma;

A c e t o n

Konz. Salzsäure (Me) N a t r o n l a u g e (Me)

m-Aminobenzoesäureethylester-methansulfonat (MS 222) (Sandoz) H e p a r i n - N a ( V e t r e nR, Promonta)

A c r i f l a v i n ( S e )

E t h a c r i d i n l a c t a t ( S e ) K r i s t a l l v i o l e t t ( S e ) M e t h y l e n b l a u ( S e ) Malachitgrün ( S e ) M a s o t e n^R ( B a y e r ) D i m e t h y l p h t h a l a t (Ro) D i b u t y l p h t h t a l a t (Me) H202

G u a j a c o l (Ro)

A c e t y l t h i o c h o l i n j o d i d ( S e )

DNAse I ( D e s o x y r i b o n u c l e a s e ) ( S i )

DTNB (5,5*- D i t h i o b i s-2- n i t r o b e n z o e s ä u r e ) ( S i )

EDTA (Ethylendiamin-tetraessigsäure-Dinatriumsalz) ( S e ) NADPH-Na^ (ß-Nicotinamid-adenin-dinucleotid-phosphat,

r e d . ) ( B M )

NADH-Na² (ß-Nicotinamid-adenin-dinucleotid» r e d . ) (BM) NADP-Na² (ß-Nicotinamid-adenin-dinucleotid-phosphat) (BM) ATP ( A d e n o s i n- 5 '- t r i p h o s p h a t ) (BM)

GSSG ( L - G l u t a t h i o n , o x i d i e r t ) ( S i )

Glucose-6-phosphorsäure-Dinatriumsalz-Dihydrat (Me) DL-Glutaminsäure ( S i )

P y r i d o x a l -5 -p h o s p h a t ( S e ) G l u t a r a l d e h y d ( S e )

2-Oxo-glutarsäure-Dinatriumsalz-Dihydrat (Me) L-Asparaginsäure-Mononatriumsalz-Monohydrat (Me)

L a c t a t - D e h y d r o g e n a s e (LDH) (Susp, aus K a n i n c h e n m u s k e l ) (BM) M a l a t - D e h y d r o g e n a s e (MDH) (Susp, aus K a n i n c h e n m u s k e l ) (BM) N a t r i u m n i t r i t ( S e )

T r i t o n X 100 ( S e ) P e r m a f l u o r^R ( P a c k a r d ) C a r b o s o r bR ( P a c k a r d ) R o t i s z i n t^R (Ro)

Sephadex G-25 ( P h a r m a c i a ) U r o g r a f i n^R 7 6 % ( S c h e r i n g ) H a e m a c c e l^R ( B e h r i n g ) M a c r o d e x^R ( S c h i w a )

Röntgenschnellentwickler (Kodak) X - r a y s c r e e n b l u e base

S e r v a l y t^R p r e c o t e s pH 5-8 T5 C3 ( S e ) 2 5 % Rinderserumalbumin-lösung

P o l i n - C i o c a l t e a u - P h e n o l r e a g e n s 2% N a²C 0⁵ i n 0.1 N NaOH

1% Natriumcitratlösung 0. 5 % CuSO^-lösung

5% Glucoselösung 10 % Glucoselösung 0.1 M NaCl-lösung 0.15 M NaCl-lösung 0 . 2 M NaCl-lösung

P h y s i o l o g i s c h e Salzlösung n a c h Imamura (1979) ( s . Tab. 2) I s o t o n i s c h e Salzlösung nach S c h i n d l e r e t a l . 1985 ( s . Tab. 2) Ringerlösung USP ( s . Tab. 2)

Transformationslösung ( s . 2 . 5 . 1 . ) 0.5 mM P h o s p h a t p u f f e r pH 7.5 0 . 0 5 M P h o s p h a t p u f f e r pH 7 . 2 0.1 M T r i s / H C l - P u f f e r pH 7 - 4 0.1 M T r i s / H C l - P u f f e r pH 7. 8 0.1 M T r i s / H C l - P u f f e r pH 8. 0 1 mM T r i s / H C l - P u f f e r pH 8. 0 1 mM T r i s / H C l - P u f f e r pH 8. 3

2. 4. V e r s u c h s t i e r h a l t u n g und B l u t g e w i n n u n g

D i e v e r w e n d e t e n K a r p f e n (Cjrprinus carpio L. , aus dem T e i c h w i r t s c h a f t s g e b i e t Wöllershof, c a . 1.5-2.5 k g ) wurden m i n d e s t e n s 4 Wochen l a n g i n einem 3 0 0 0 1- Becken, v e r s e h e n m i t e i n e m k o n t i n u i e r l i c h e n Wasserfluß (180 1/h), 12 h H e l l - D u n k e l Z y k l u s und S a u e r s t o f f V e r s o r g u n g , b e i 14°C - 16°C eingewöhnt. B e i B e d a r f wurden z u r E n t f e r n u n g v o n P a r a s i t e n und H a u t i n f e k t i o n e n i n e i n e r e i n m a l i g e n Gabe b e i E r h a l t d e r T i e r e f o l g e n d e Lösungen z u g e s e t z t : 0. 0 9 mg A c r i f l a v i n , 0. 0 9 mg E t h a c r i d i n l a c t a t , 0. 0 3 mg K r i s t a l l v i o l e t t , 0.06 mg Malachitgrün, 0.12 mg M e t h y l e n b l a u ad 1000 m l und 0.5 g/1 M a s o t e n^R ( B a y e r ) . D i e K a r p f e n e r h i e l t e n p r o t e i n a n g e r e i c h e r t e F o r e l l e n f u t t e r p e l l e t s ( S i l v e r c u p - M e l a ) . B l u t wurde i h n e n nach dem v o n S o i v i o e t a l . ( 1 9 7 5 ) v o r g e s t e l l t e n und Hughes e t a l . ( 1 9 8 3 ) m o d i f i z i e r t e n V e r f a h r e n entnommen. Dazu wurde d i e D o r s a l a o r t a p u n k t i e r t und m i t einem D a u e r k a t h e t e r v e r s e h e n (Abb. 2 ) . D i e Methode i s t G r u n d l a g e z a h l r e i c h e r U n t e r s u c h u n g e n ( A l b e r s e t a l . 1981, A l b e r s e t a l . 1983, Hughes e t a l . 1983, A l b e r s 1985, A l b e r s & Götz 1985»

S c h i n d l e r & de V r i e s 1986) und gewährt zusammen m i t den s t a n d a r d i s i e r t e n Bedingungen ( s p e z i e l l e Becken, F u t t e r , c i r c a d i a n e r Rhythmus, T e m p e r a t u r ) s c h n e l l und e i n f a c h d i e Gewinnung repräsentativer und r e p r o d u z i e r b a r e r B l u t p r o b e n von l e b e n d e n V e r s u c h s t i e r e n .

A l s Kurzzeitanästhetikum während d e r O p e r a t i o n (Dauer c a . 10 Min.) d i e n t e 0.1 g/1 MS 222 (Meta-amino-benzoesäureethyl- e s t e r - m e t h a n s u l f o n a t , S a n d o z ) . D i e K a r p f e n wurden e i n e n Tag v o r d e r b e a b s i c h t i g t e n B l u t e n t n a h m e z u z w e i e n i n g u t d u r c h - lüftete, t e m p e r i e r b a r e 60 1- A q u a r i e n m i t Frischwasserzufluß (10 1/h) und H e l l - D u n k e l Z y k l u s u m g e s e t z t . D i e Blutabnahme e r f o l g t e i n vorgekühlte Gefäße m i t H e p a r i n z u s a t z ( 3 0 I.U./ml B l u t ) und g e l a n g n o r m a l e r w e i s e i n w e n i g e n M i n u t e n ohne e r k e n n b a r e Streßbelastung des V e r s u c h s t i e r s .

Abb. 2 : Röntgenaufnahme (60 kV, 30 mA, 5 s ) n a c h I n j e k t i o n von Röntgenkontrastmittel ( U r o g r a f i n 7 6 % R, S c h e r i n g ) z u r V e r a n s c h a u l i c h u n g d e r P o s i t i o n des D a u e r k a t h e t e r s i n d e r A o r t a d o r s a l i s des K a r p f e n (Hughes e t a l . 1983).

Z u r V e r h i n d e r u n g d e r B l u t g e r i n n u n g sowohl i m K a t h e t e r wie beim Umgang m i t K a r p f e n - und Humanblutproben d i e n t e j e w e i l s H e p a r i n ( V e t r e n1 1 P r o m o n t a ) .

D i e s zum e i n e n , um e i n e größtmögliche Übereinstimmung d e r V o r b e h a n d l u n g v o n K a r p f e n - und H u m a n b l u t z e i l e n z u e r r e i c h e n . H a t t i n g h (1975) und Smit & H a t t i n g h (1980) b e z e i c h n e n H e p a r i n a l s das A n t i k o a g u l a n s d e r Wahl für F i s c h b l u t ( g e r i n g s t e r Einfluß a u f pH, p 0², p C 0², H k t , RBC, H b - k o n z e n t r a t i o n , MCV, MCH, MCHC, P l a s m a p r o t e i n e und Osmolarität, E l e k t r o l y t - L a k t a t - , G l u c o s e - und ATP- g e h a l t ) .

Zum a n d e r e n s i n d für N a t r i u m e i t r a t und N a t r i u m o x a l a t (Schrumpfung d e r E r y t h r o z y t e n i n f o l g e pH- V e r s c h i e b u n g ) , EDTA (> 2 mg/ml oder < 1 mg/ml Membrandefekte und Größenverände- r u n g e n am E r y t h r o z y t e n , 3 r d D r a f t S t a n d a r d f o r Specimen C o l l e c t i o n , ECCLS, z i t i e r t b e i B e h r i n g - W e r k e 1984), sowie Ammoniumkaliumoxalat (hämolytische W i r k u n g , Smit & H a t t i n g h 1980) ungünstige E f f e k t e b e s c h r i e b e n .

Humanblut wurde, um unerwünschte Einflußgrößen und präanalytische Fehlermöglichkeiten b e i d e r Probengewinnung so g u t w i e möglich auszuschließen, an a u s g e r u h t e n , männlichen P r o b a n d e n ( A l t e r 1 9 - 2 8 J a h r e ) i m L i e g e n venös entnommen und m i t H e p a r i n a l s A n t i k o a g u l a n s (10 I.ü./ml) v e r s e t z t . Entnahme v o n K a p i l l a r b l u t i s t h i e r wegen ungenügender Probenmengen, i n k o n s t a n t e r B l u tZ u s a m m e n s e t z u n g ( Z e l l a n r e i c h e r u n g , A u s t r i t t v o n Gewebeflüssigkeit, j e n a c h E i n s t i c h s t e l l e , - t i e f e und D u r c h b l u t u n g s g r a d ) u. ä. F e h l e r q u e l l e n g e r a d e i m H i n b l i c k a u f d i e Enzymaktivitätsbestimmungen ungünstig.

Da während längerer Probenaufbewahrung Hämolyse, Adhäsion d e r Z e l l e n an d e r Wand, Verklumpung, Schrumpfung o d e r S c h w e l l u n g d e r Z e l l e n , B l u t g e r i n n u n g , m i k r o b i e l l e K o n t a m i n a t i o n e t c . a u f t r e t e n können, wurden a l l e P r o b e n n a c h d e r V o r b e h a n d l u n g b e i 4°C g e l a g e r t und i n n e r h a l b 24 h n a c h Entnahme v e r a r b e i t e t bzw. a l s Hämolysat e i n g e f r o r e n .

2. 5* A u f t r e n n u n g von Human- und K a r p f e n e r y t h r o z y t e n nach D i c h t e und A l t e r und hämatologische C h a r a k t e r i s i e r u n g f r a k t i o n i e r t e r und u n f r a k t i o n i e r t e r Z e l l e n

2 . 5 » 1. Bestimmung v o n Hämatokrit, E r y t h r o z y t enz a h l , Hämoglobinkonzentration und Plasmaosmolarität

D i e hämatologischen Basisgrößen Hämatokrit ( H k t ) , E r y t h r o z y t e n z a h l (REC) und Hämoglobinkonzentration wurden m i t Standardmethoden d e r k l i n i s c h e n Chemie gemessen:

Hkt ( 1 Z e l l v o l u m e n / 1 B l u t v o l u m e n , bzw. %) i n h e p a r i n i s i e r - t e n Kapillarröhrchen m i t Heraeus C h r i s t ( O s t e r o d e ) M i c r o f u g e HC 101 (max. 2 0 0 0 0 g) und H a w k s l e y M i c r o - H a e m a t o k r i t Reader ( L a n c i n g Sussex U.K.);

RBC ( M i o . r o t e B l u t z e l l e n / \il S u s p e n s i o n ) i m a u t o m a t i s i e r t e n V e r f a h r e n p e r k o n d u k t o m e t r i s c h e m Meßprinzip m i t C o u l t e r C o u n t e r M o d e l l D ( C o u l t e r E l e c t r o n i c s , Harpenden H e r t s U.K.) b e i a u s g e t e s t e t e n und k o n s t a n t g e h a l t e n e n Verdünnungsmedien (PSC, s. 2 . 5 - 2 . ; 0 . 1 5 M N a C l ) , Verdünnung ( 1 : 1 2 5 0 0 ) , E i c h u n g und Geräteeinstellung.

D i e Hämoglobinkonzentration m i t d e r H a e m i g l o b i n c y a n i d - Methode nach B e t k e & S a v e l s b e r g ( 1 9 5 0 ) , s t a n d a r d i s i e r t von van Kampen & Z i j l s t r a ( 1 9 6 1 ) , u n t e r Verwendung von T r a n s - formationslösung ( 2 0 0 mg K ^ P e ( C N )⁶, 50 mg KCN, 1 0 0 0 mg NaHCO^

ad 1 0 0 0 m l ) , E p p e n d o r f (Hamburg) P h o t o m e t e r 1101 M, Hg- F i l t e r 546 nm. Wegen a u s f a l l e n d e r DNA und ungenügenden M e m b r a n a u f s c h l u s s e s war b e i r e s u s p e n d i e r t e n und gewaschenen K a r p f e n e r y t h r o z y t e n d i e Zugabe v o n T r i t o n X 1 0 0 ( 0 . 0 5 %) und DNAse ( 1 0 jig/ml) z u r Transformationslösung und anschließende Z e n t r i f u g a t i o n b e i 3 5 0 0 0 g, 2 0 M i n . ( S o r v a l l RC 2B, SM 24) nötig. R e p r o d u z i e r b a r e Meßwerte b e i V o l l b l u t p r o b e n vom

K a r p f e n e r h i e l t man n a c h F i l t r a t i o n des A n s a t z e s (20 ßl B l u t i n 5 ml Transformationslösung) d u r c h e i n 1.2 pm Z e l l u l o s e - n i t r a t - F i l t e r ( M i l l i p o r e SM 1 1 3 0 3 ) - D i e Berechnung i n (mmol/1) bzw. ( g / d l ) e r f o l g t e m i t dem M o l e k u l a r g e w i c h t 64500 und dem m i l l i m o l a r e n E x t i n k t i o n s k o e f f i z i e n t e n € = 1 1 .0 ( v a n Kampen & Z i j l s t r a 1 9 6 1 ) .

Aus d i e s e n d r e i Basisgrößen l a s s e n s i c h a l s hämatologische Grundparameter MCV, MCH und MCHC b e r e c h n e n ( s . 3 . 1 . , 3 . 2 . ) Darüberhinaus wurde b e i K a r p f e n p l a s m a p r o b e n und Salzlösungen d i e Osmolarität m i t dem HalbmikroOsmometer Typ M (Knauer, B e r l i n ) d u r c h Messung d e r G e f r i e r p u n k t s e r n i e d r i g u n g e r m i t t e l t .

2.5» 2 D i c h t e f r a k t i o n i e r u n g

Plasma: Z e l l e n g u t aufschüttelbar, k e i n e Hämolyse PSC: Z e l l e n g u t aufschüttelbar, k e i n e Hämolyse

0. 9 % NaCl: b i s zum 4. Waschen s t a b i l , dann Hämolyse 0.6 % NaCl: b i s zum 4. Waschen s t a b i l , dann Hämolyse 1.2 % NaCl: Z e l l e n b l e i b e n s t a b i l

25 % R i n d e r s e r u m - A l b u m i n l s g . : l e i c h t e Hämolyse 5 % G l u c o s e l s g . : K l u m p e n b i l d u n g

10 % G l u c o s e l s g . : K l u m p e n b i l d u n g M a c r o d e x^R ( i s o t . 6 % D e x t r a n l s g . )

o d e r H a e m a c c e l^R ( i s o t . 3 . 5 % k o l l . G e l a t i n e l s g . ) : schwer r e s u s p e n d i e r b a r e E r y t h r o z y t e n

Tab. 1 : T e s t ( 5- m a l i g e s Z e n t r i f u g i e r e n von 1:6 verdünnten K a r p f e n e r y t h r o z y t e n b e i c a . 5 0 0 0 g, 2 0 °C , 4 M i n . ) z u r

E i g n u n g v e r s c h i e d e n e r M e d i e n für d i e D i c h t e z e n t r i f u g a t i o n

Plasma und b u f f y c o a t d e r B l u t p r o b e n ( i . a . 5 ml m i t H e p a r i n - z u s a t z , s. 2. 4 . ) wurden p e r Z e n t r i f u g a t i o n e n t f e r n t ( C h r i s t IV KS, O s t e r o d e , 9 0 0 g = max. Drehgeschw., 4°C, 10 M i n . ) . D i e E r y t h r o z y t e n wurden J e z w e i m a l 5 M i n . gewaschen. V o r v e r s u c h e a u f E i g n u n g v e r s c h i e d e n e r M e d i e n für K a r p f e n e r y t h r o z y t e n l i e f e r t e n d i e i n Tab. 1 g e s c h i l d e r t e n E r g e b n i s s e .

Auf Grund d e s s e n wurde i n a l l e n n a c h f o l g e n d e n M a n i p u l a t i o n e n ( Z e n t r i f u g a t i o n , Vaschen, R e s u s p e n d i e r e n , Verdünnen) von K a r p f e n e r y t h r o z y t e n d i e an Imamura ( 1 9 7 9 ) angepaßte (pH 7 » 9 , 275 mosm/1) p h y s i o l o g i s c h e Salzlösung ( i m f o l g e n d e n k u r z

"PSC" g e n a n n t ) verwendet ( s . Tab 2 ) .

i r 1 A |

i

B | C

| PSC * p h y s i o l o g . | i s o t . S a l z l s g . z.| Ringerlösung (USP)

| Salzlösung für | C y t o p h o t o m e t r i e | z. C y t o p h o t o m e t r i e

| K a r p f e n e r y t h r o z y t e n | von K a r p f e n - | v. Human- e r y t h r o z y t e n | e r y t h r o z y t e n

| N a C l 1 4 1.1 | N a C l 1 4 0.2 | N a C l 1 4 7.5 |

| K C l 1.43 | K C l 4.0 | K C l 4.0 |

| C a C l2- 2 H²0 0. 9 9 | M g C l2- 6 H²0 1. 5 | C a C l² 2.25 |

| NaHCO^ 2.64 | NaHCO, 3. 6 | NaHCOj 3 . 5 |

| G l u c o s e 6.16 C a C l2. 2 H²0 0. 5 | 290 mosm/1 |

| pH 7- 9 , 275 mosm/1 |

I i pH 7 .9, 280 mosm/1|

i

| Tab. 2 : D i e g e n e r e l l v e r w e n d e t e p h y s i o l o g i s c h e Salzlösung|

| für K a r p f e n e r y t h r o z y t e n (A: PSC, Imamura 1 9 7 9 ) , d i e i s o t o - |

| n i s c h e n Salzlösungen z u r C y t o p h o t o m e t r i e für K a r p f e n e r y - |

| t h r o z y t e n (B: S c h i n d l e r e t a l . 1985) und Humanerythrozyten|

| (C: Ringerlösung USP), J e w e i l s i n mmol/1

i I

D i e s e Lösung (PSC) erfüllt d i e A n f o r d e r u n g e n an e i n e p h y s i o l o g i s c h e Salzlösung zum U n i v e r s a l g e b r a u c h für E r y t h r o z y t e n e i n e r b e s t i m m t e n S p e z i e s (Lockwood 1961):

- e s s e n t i e l l e I o n e n i n r i c h t i g e r Osmolarität - P u f f e r u n g und p h y s i o l o g i s c h e r pH-Wert

- G l u c o s e a l s m e t a b o l i s c h e s S u b s t r a t - V e r w e n d b a r k e i t e i n e r s t a b i l e n Stammlösung.

Für H u m a n e r y t h r o z y t e n wurde 0. 1 5 M N a C l verwendet.

D i e e i g e n t l i c h e D i c h t e z e n t r i f u g a t i o n d e r E r y t h r o z y t e n e r f o l g t e b e i hohem Hkt (80 %) i n l a n g e n , s c h m a l e n S p e z i a l - röhrchen (Länge 90 mm, Durchmesser 4 mm, Volumen 0 . 9 m l ) , d i e i n e i g e n s a n g e f e r t i g t e n Einsätzen i n S o r v a l l RC 2B - SS 34 R o t o r e n (Du P o n t , W i l m i n g t o n USA) b e i 20000 g und 15°C ( K a r p f e n e r y t h r o z y t e n ) bzw. 2 5 °C ( H u m a n e r y t h r o z y t e n ) 40 M i n . z e n t r i f u g i e r t wurden. Für das E i n b r i n g e n d e r s u s p e n d i e r t e n Z e l l e n i n d i e Röhrchen und das an d i e Z e n t r i f u g a t i o n anschließende R e s u s p e n d i e r e n z u 5 o d e r 6 gleichgroßen F r a k t i o n e n m i t Hkt v o n c a . 4 0 % wurden K u n s t s t o f f s p r i t z e n (1 ml, A s i k Dänemark) m i t 100 \±± G l a s k a p i l l a r e n b e n u t z t , i n denen b e r e i t s e i n T e i l d e r Resuspensionslösung zum v o r s i c h t i g e n Schütteln v o r g e l e g t war.

2.5» 3» Bestimmung v o n D i c h t e , MCV, MCH, MCHC i n E r y t h r o z y t e n f r a k t I o n e n

I n e x e m p l a r i s c h e n K o n t r o l l v e r s u c h e n wurde n a c h d e r Z e n t r i - f u g a t i o n i n a l l e n D i c h t e f r a k t i o n e n und i n R e s u s p e n s i o n e n von E r y t h r o z y t e n aus M i s c h b l u t d i e D i c h t e m i t d i s k o n t i n u i e r l i c h e n G r a d i e n t e n aus 10 M i s c h u n g e n v o n D i b u t y l p h t h a l a t = 1.046 g/ml) und D i m e t h y l p h t h a l a t ( f - 1.189 g/ml) ( a b g e s t u f t z w i s c h e n 1.0869 g/ml und 1.1278 g/ml) bestimmt. Dazu wurde e i n e k l e i n e Menge J e d e r Probe i n s e p a r a t e n Kunststoffröhrchen ( s . 2.5. 2 . ) über d i e s e G r a d i e n t e n m i s c h u n g e n g e l e g t und 20

Min. b e i 6000 g und 15°C ( K a r p f e n ) bzw. 2 5 °C (Human) z e n t r i f u g i e r t , bzw. d i e Mikromethode nach Danon und M a r i k o v s k y (1964) m i t Hämatokritröhrchen und M i c r o f u g e HC 101 durchgeführt, was z u v e r g l e i c h b a r e n V e r t e n führte.

MCV, MCH und MCHC wurden i n d e n F r a k t i o n e n m i t den g l e i c h e n Methoden w i e i n M i s c h b l u t ( s . 2 . 5 . 1 . ) e r m i t t e l t .

2.5. 4 . M i k r o s k o p - C y t o p h o t o m e t r i e

D i e v o n S c h i n d l e r e t a l . ( 1 9 8 5 ) v o r g e s t e l l t e M i k r o s k o p - C y t o p h o t o m e t r i e e r l a u b t d i e Messung d e r Hämoglobinabsorption am e i n z e l n e n E r y t h r o z y t e n .

Für d i e s e n V e r s u c h wurden d i e K a r p f e n b l u t p r o b e n i n 6 F r a k - t i o n e n g e t r e n n t : 5 g l e i c h große und e i n e zusätzliche F r a k t i o n , b e s t e h e n d aus dem A n t e i l d e r s i c h n a c h 2 Wochen v o r h e r g e h e n d e r Abnahme v o n c a . 20 % des B l u t v o l u m e n s ergebenden Zone h e l l r o t gefärbter Z e l l e n , d i e s o m i t a l s e i g e n e P o p u l a t i o n a u f i h r e n H b - g e h a l t h i n bestimmt werden konnten. D i e H u m a n b l u t p r o b e n wurden i n 6 a l i q u o t e T e i l e g e t r e n n t .

D i e Z e l l e n wurden folgendermaßen f i x i e r t : D r e i T r o p f e n ( G l a s k a p i l l a r e ) d e r r e s u s p e n d i e r t e n F r a k t i o n bzw. d e r gewaschenen E r y t h r o z y t e n aus M i s c h b l u t v o n K a r p f e n und Mensch wurden m i t 0. 5 % G l u t a r a l d e h y d i n 5 ml i s o t o n i s c h e r Salzlösung ( s . Tab. 2) v e r s e t z t und 3 h b e i 4°C l e i c h t geschüttelt. Z u r vollständigen O x i d a t i o n z u Methämoglobin wurde NaN0² (10 mmol/1) z u g e s e t z t . Nach Z e n t r i f u g a t i o n und v i e r m a l i g e m Waschen d e r Z e l l e n m i t 5 ml 0 . 5 mM P h o s p h a t p u f f e r (pH 7 . 5 ) wurden d i e S u s p e n s i o n e n b e i -80°C a u f b e w a h r t .

M i t H i l f e e i n e s Sprühkopfs wurden k l e i n e Mengen d i e s e r P r o b e n b e i g l e i c h z e i t i g e r L u f t t r o c k n u n g f e i n a u f Objektträger

v e r t e i l t und d i e Hämoglobinabsorption von j e etwa 100, zufällig gewählten Z e l l e n i m M i k r o s k o p - P h o t o m e t e r b e i 411 nm ( S o r e t b a n d e ; • 1. 05 nm) gemessen.

I n den V e r s u c h e n v o n S c h i n d l e r e t a l . (1985) e r w i e s s i c h d i e h i e r gewählte M o d i f i k a t i o n d e r Messung am t r o c k e n e n G l u t a r - a l d e h y d - F i x a t i v a l s verläßlichste Methode, w e i l Hämoglobin- m o d i f i k a t i o n e n m i t u n t e r s c h i e d l i c h e n E x t i n k t i o n s k o e f f i z i e n - t e n , Einfluß v o n Suspensionslösung, pH- Wert und o r g a n i s c h e n P o l y p h o s p h a t e n a u f d i e A b s o r p t i o n s w e r t e e n t f a l l e n .

F o l g e n d e Geräte wurden b e n u t z t : Z e i s s s c a n n i n g C y t o p h o t o m e t e r 0 5 , Z e i s s ölimmersionsobjektiv N e o f l u a r 1 0 0 x / 1. 3 0 , P l a n 40x/0.60 Kondensor, Z e i s s P r i s m a m o n o c h r o m a t o r M4 Q I I I , Osram Xenonhochdrucklampe XBO 150/W1, Hamamatsu Verstärker Type 931A, D i e t z 621X2 M i n i c o m p u t e r .

Über d i e s e V o r r i c h t u n g wurde j e d e r e i n z e l n e E r y t h r o z y t i n 0.5 pm- S c h r i t t e n b e i e i n e r G e s c h w i n d i g k e i t v o n 66 S c h r i t t e n p r o s e c . a b g e t a s t e t . U b e r das a n g e g l i e d e r t e Rechenprogramm wurde von d e r Summe d e r l o k a l e n A b s o r p t i o n s w e r t e d i e H i n t e r g r u n d - a b s o r p t i o n s u b t r a h i e r t . Nach K o r r e k t u r m i k r o s k o p i e b e d i n g t e r p h y s i k a l i s c h e r F e h l e r ( d e V r i e s & S c h i n d l e r 1984) wurde d i e s e k o r r i g i e r t e G e s a m t e x t i n k t i o n a l s Meßgröße ( i n a r b i t r a r y u n i t s , A.U.) g e s p e i c h e r t . D i e A u s d r u c k s w e i s e "willkürliche E i n h e i t " b e s a g t l e d i g l i c h , daß d a m i t k e i n e bekannte, p h y s i k a l i s c h d e f i n i e r t e E i n h e i t d a r g e s t e l l t i s t ; s i e b i e t e t a u f Grund d e r e i n h e i t l i c h e n und r e p r o d u z i e r b a r e n E r m i t t l u n g s w e i s e e i n e e x a k t e Größe zum V e r g l e i c h d e r Hämoglobinabsorption e i n z e l n e r Z e l l e n und d e r d u r c h d i e s e repräsentierten F r a k t i o n e n .

2. 5 . 5 » M a r k i e r u n g m i t r a d i o a k t i v e m G l y c i n und C¹ ^- Bestimmung I n d e r A b s i c h t , m i t d i e s e m L a n g z e i t v e r s u c h das S t u d i u m von s t o f f w e c h s e l b e d i n g t e n Einflüssen a u f d i e E r y t h r o p o i e s e z u v e r b i n d e n , wurden 10 K a r p f e n i n z w e i Gruppen g e t e i l t . Gruppe A b e s t a n d aus 5 K a r p f e n , d i e u n t e r " A k t i v b e d i n g u n g e n "

g e h a l t e n wurden ( W a s s e r t e m p e r a t u r : 20°C, Beckengröße: 430 1, Fütterung täglich ad l i b i t u m ) , Gruppe B aus 5 K a r p f e n u n t e r

"Reservebedingungen" ( W a s s e r t e m p e r a t u r : 15°C, Beckengröße:

60 1 für j e 2 F i s c h e , Fütterung 1x/10 Tage), d i e s e F i s c h e wurden n a c h 110 Tagen e b e n f a l l s i n A k t i v b e d i n g u n g e n u m g e s e t z t .

Von a l l e n 10 K a r p f e n wurden j e w e i l s 20 ml B l u t entnommen.

Nach E n t f e r n u n g von P l a s m a , z w e i m a l i g e m Waschen und R e s u s p e n d i e r e n zum Ausgangs- Hämatokrit d e r j e w e i l i g e n Probe i n PSC wurden d i e E r y t h r o z y t e n m i t 20 j i C i 2-C¹ ^ - G l y c i n (52 mCi/mmol, Amersham B r a u n s c h w e i g ) b e i 18°C 10 h l a n g u n t e r l e i c h t e m Schütteln i n k u b i e r t . Danach wurden d i e Z e l l e n d r e i m a l gewaschen, im j e w e i l i g e n Plasma r e s u s p e n d i e r t und i n d i e D o r s a l a o r t a r e i n j i z i e r t .

Im L a u f e von 7 Monaten wurden i n b e s t i m m t e n Abständen ( s . 3.4.) etwa 5 m l B l u t p r o V e r s u c h s t i e r entnommen und i n j e 5 n a c h D i c h t e g e t r e n n t e n F r a k t i o n e n d i e Radioaktivität ( T r i Carb Sample O x i d i z e r 306, T r i C a r b S c i n t i l l a t i o n C o u n t e r 3 0 0 D, P a c k a r d , I l l i n o i s USA) und RBC ( C o u l t e r C o u n t e r ) bestimmt.

D i e H b - h a l t i g e n P r o b e n ( c a . 100 ji,l) wurden wegen des z u s t a r k e n Qenchs b e i d i r e k t e r Flüssigkeits-Szintillations- zählung a u f F i l t e r p a p i e r k a p s e l n v e r b r a n n t und C¹* a l s ^{1 i f}C 0² gemessen ( C a r b o s o r b^R a l s o r g a n i s c h e Base und P e r m a f l u o r V^R a l s Szintillationsflüssigkeit).

A n a l o g m a r k i e r t wurde e i n e Humanblutprobe:

- 10 m l , venös entnommen;

- z w e i m a l gewaschen;

- i n k u b i e r t i n Ringerlösung ( s . 2.5.2., Tab. 2 ) , a n g e r e i c h e r t mit 6 mmol/1 G l u c o s e , 10 h b e i 37°C m i t 5 pC± 2-C1 ^ - G l y c i n ; - d r e i m a l gewaschen;

- i n P l a s m a + 1 0 0 I.U. H e p a r i n b e i 4°C a u f b e w a h r t ;

- 2 Tage nach d e r M a r k i e r u n g e r f o l g t e d i e A u f t r e n n u n g i n 5 F r a k t i o n e n und d i e Bestimmung v o n Radioaktivität und RBC i n j e d e r F r a k t i o n ( w i e oben g e s c h i l d e r t ) .

2.5» 6. G e l f i l t r a t i o n , I E F und Hämoglobinspaltung

Zusätzlich z u r Bestimmung d e r Radioaktivität i n den f r a k t i o n i e r t e n P r o b e n wurde v e r f o l g t , ob C¹* i n Hämoglobin, Häm und G l o b i n e i n g e b a u t worden war.

Dazu wurden b e i einem K a r p f e n , s o f o r t nach i n v i t r o - I n k u b a t i o n m i t G l y c i n ("HÄ CA") s o w i e 34 Tage n a c h e r f o l g t e r R e i n j e k t i o n ("HÄ CB"), und b e i d e r Humanblutprobe, s o f o r t nach I n k u b a t i o n ("HÄ HU"), e i n Hämolysat e i n e r k l e i n e n Probe gewaschener E r y t h r o z y t e n i n 1 mM T r i s / H C l P u f f e r (pH 8 . 3 m i t 0. 0 5 % DNAse für K a r p f e n p r o b e bzw. pH 8.0 für Humanprobe) d u r c h d r e i m a l i g e s E i n f r i e r e n und A u f t a u e n i n flüssigem S t i c k s t o f f h e r g e s t e l l t . Nach Z e n t r i f u g a t i o n b e i 40000 g/ 10 Min. wurden d i e Hämolysate ( H b - g e h a l t c a . 5 g / d l ) j e w e i l s a u f e i n e G 25-Sephadex Säule (Länge 40 cm, Durchmesser 2 cm) aufgegeben, m i t 1 mM T r i s / H C l P u f f e r , 100 mM N a C l , 1 mM EDTA, pH 8 . 3 ( K a r p f e n p r o b e ) bzw. 8.0 (Humanprobe) b e i 15 T r o p f e n / M i n . e l u i e r t und J e 40 T r o p f e n a u t o m a t i s c h gesammelt.

I n a l l e n Gläschen wurden d i e Hämoglobinkonzentration ( s . 2.5. 1 . ) und d i e Radioaktivität ( i n den H b - h a l t i g e n Gläschen wie u n t e r 2 . 5 . 5 - g e s c h i l d e r t ; i n den ungefärbten Lösungen m i t d i r e k t e r Flüssigkeits-Szintillations-Messung i n R o t i s z i n t^R) bestimmt.

Von e i n e m zurückbehaltenen T e i l v o n "HÄ CA" wurde nach Z e n t r i f u g a t i o n b e i 40000 g/ 10 M i n . , Verdünnung m i t 5 mM T r i s / H C l P u f f e r pH 8. 3 z u einem H b - g e h a l t von c a . 0 . 2 g / d l und 10 minütiger Begasung m i t CO ( z u r V e r h i n d e r u n g d e r A u t o x i d a t i o n ) e i n e i s o e l e k t r i s c h e F o k u s s i e r u n g ( I E F ) i n A n l e h n u n g an D r y s d a l e e t a l . ( 1 9 7 1 ) u n t e r a k t u a l i s i e r t e n B e d i n g u n g e n m i t Dünnschicht-Polyacrylamid-Gelen durchgeführt:

- S e r v a l y t p r e c o t e s pH 5- 8 , 1 2 5 x 1 2 5 x 0 . 1 5 mm, T 5 C3 ( S e r v a , H e i d e l b e r g ) ;

- E l e k t r o d e n a b s t a n d 1 0 0 mm; Elektrodenlösungen: 40 mM DL- Glutaminsäure ( A n o d e ) , 0 . 1 mM NaOH ( K a t h o d e ) ;

- A u f t r a g s m e n g e 5 A u f t r a g s p u n k t 3 0 mm v o n d e r Kathode;

- T e m p e r a t u r 4°C (Haake T 5 2 T h e r m o s t a t ) ;

- V o r f o k u s s i e r u n g s z e i t 1 h, F o k u s s i e r u n g s z e i t 6 h;

- LKB 2 1 1 7 M u l t i p h o r I I E l e k t r o p h o r e s e e i n h e i t (LKB, Gräfelfing); LKB 2 1 0 3 Power S u p p l y , e i n g e s t e l l t a u f k o n s t a n t e L e i s t u n g von 1 . 5 W, maximale Spannung v o n 2 kV und maximale Stromstärke v o n 8 mA;

- D e t e k t i o n p e r d i r e k t e r R a d l o g r a p h i e m i t Isomess (Isotopenmeßgeräte S t r a u b e n h a r d t ) sowie A u t o r a d i o g r a p h i e m i t X - r a y s c r e e n b l u e base f i l m und Röntgenschnellentwicker ( K o d a k ) .

I n s e p a r a t e n V e r s u c h e n wurde b e i 5 n i c h t m a r k i e r t e n K a r p f e n i n a n a l o g e r Weise ( m i t Ausnahme d e r I s o t o p e n d e t e k t i o n ) e i n e I E F d e r D i c h t e f r a k t i o n e n neben M i s c h b l u t durchgeführt.

E i n T e i l des Karpfenbluthämolysats "HÄ CB" wurde gegen d e s t i l l i e r t e s Wasser d i a l y s i e r t und u l t r a f i l t r i e r t ( M i k r o - U l t r a f i l t r a t i o n s s y s t e m 8MC, Amikon W i t t e n ) . I n d i e s e r Lösung wurde Hämoglobin m i t einem 2 0 : 1 (V/V) Überschuß von A c e t o n/ 0 . 2 M HCl-lösung ( t r o p f e n w e i s e Zugabe b e i -20° C über 20 M i n . und g e l e g e n t l i c h e s Rühren) n a c h d e r Methode von R o s s i F a n e l l i e t a l . ( 1 9 5 8 ) i n G l o b i n und Hämin g e s p a l t e n . Das Präzipitat, 5 m a l gewaschen m i t k a l t e m A c e t o n / H C l ( - 2 0° C ) und

gelöst i n d e s t i l l i e r t e m Wasser, enthält G l o b i n , das F i l t r a t Hämin i n A c e t o n / H C l (Chlorhämin) ( s . 3-6.).

Der P r o t e i n g e h a l t d e r Globinlösung wurde m i t d e r Methode v o n Lowry ( 1 9 5 1 ) bestimmt; R e a g e n z i e n : 0. 5 % CuSO^- 5 H²0 und 1 % N a t r i u m e i t r a t i n H²0 , 2 % N a²C 0⁵ i n 0.1 N NaOH, F o l i n - C i o c a l t e a u - P h e n o l r e a g e n s 1:1 m i t H²0 verdünnt, R i n d e r s e r u m - a l b u m i n a l s S t a n d a r d ; Messung b e i 5 7 8 nm gegen L e e r w e r t a n s a t z m i t d e s t . Wasser.

Im F i l t r a t wurde r e i n e s Chlorhämin d u r c h Aufnahme e i n e s Spektrums v o n 400 nm b i s 650 nm (LKB U l t r a Spec 4050, Gräfelfing) n a c h g e w i e s e n ( s . 3 . 6 . ) .

I n b e i d e n Lösungen wurde d i e Radioaktivität ( s . 2 . 5 . 5 . und 2.5.6. oben) bestimmt.

2.6 . Bestimmung v o n Enzymaktivitäten i n f r a k t i o n i e r t e n und u n f r a k t i o n i e r t e n K a r p f e n - und H u m a n e r y t h r o z y t e n

2 .6 . 1 . A l l g e m e i n e Durchführung

Gemäß d e r M i c h a e l i s - M e n t e n G l e i c h u n g H

- *e • [•] •

LsJ • *^m [s] = S u b s t r a t k o n z e n t r a t i o n [E[ = E n z y m k o n z e n t r a t i o n

k^e - G e s c h w i n d i g k e i t s k o n s t a n t e d e r E n z y m r e a k t i o n kj_ = G e s c h w i n d i g k e i t s k o n s t a n t e d e r I n d i k a t o r r e a k t i o n k^m = M i c h a e l i s - K o n s t a n t e

kann

a) e i n e E i n - S u b s t r a t - R e a k t i o n A f ^ B r ^ C

d u r c h Wahl e i n e r hohen S u b s t r a t k o n z e n t r a t i o n ([A]»km), b) e i n e Z w e i - S u b s t r a t - R e a k t i o n

A + B C + D; C + E P + G

d u r c h E i n s a t z des e i n e n S u b s t r a t s [a] i n großem Uberschuß i . V . zum a n d e r e n [ V ] , d e s s e n K o n z e n t r a t i o n wiederum s e h r h o c h gegenüber s e i n e r M i c h a e l i s - K o n s t a n t e k^m gewählt w i r d ,

i n d e r P r a x i s z u e i n e r R e a k t i o n 1. Ordnung (v= [ s f j • Vm a x/ km) o d e r i d e a l e r w e i s e z u e i n e r R e a k t i o n 0. Ordnung m i t l i n e a r e r U m s a t z k u r v e (v« k • [JEj • vmax) gemacht werden.

Zusätzlich muß ^ki> > k e s e i n , d i e n a c h g e s c h a l t e t e I n d i k a t o r r e a k t i o n a l s o w e s e n t l i c h s c h n e l l e r a b l a u f e n a l s d i e z u messende E n z y m r e a k t i o n , so daß das G l e i c h g e w i c h t so w e i t n a c h r e c h t s v e r s c h o b e n w i r d , daß d i e G e s c h w i n d i g k e i t d e r E n z y m r e a k t i o n n u r n o c h von d e r E n z y m k o n z e n t r a t i o n abhängt.

Z u r e x a k t e n Messung d e r Enzymaktivität wäre es a l s o vonnöten, das i n d e r j e w e i l i g e n Z e l l e , Organ, Gewebe d e r u n t e r s u c h t e n S p e z i e s v o r l i e g e n d e Enzym i n s e i n e n p h y s i k o c h e m i s c h e n und e n z y m k i n e t i s c h e n E i g e n s c h a f t e n v o r h e r z u c h a r a k t e r i s i e r e n , s o w e i t d i e benötigten G r u n d l a g e n aus d e r L i t e r a t u r n i c h t entnommen werden können. Das b e d e u t e t , daß für d i e Bestimmung d e r Aktivität j e d e s i m K a r p f e n e r y t h r o z y t e n z u messenden Enzyms i n e n z y m k i n e t i s c h e n V o r v e r s u c h e n d e s s e n P u f f e r - , pH- und TemperaturOptimum s o w i e d i e o p t i m a l e n K o n z e n t r a t i o n e n d e r e n z y m h a l t i g e n Präparationen, S u b s t r a t e und Coenzyme z u e r m i t - t e l n wären. D i e s würde den Rahmen d i e s e r A r b e i t b e i weitem s p r e n g e n . Da d i e g e n a n n t e n P a r a m e t e r a u c h n i c h t aus den wenigen s i c h m i t K a r p f e n e r y t h r o z y t e n e n z y m e n b e f a s s e n d e n L i t e r a t u r q u e l l e n h e r v o r g e h e n , wurden d i e Messungen u n t e r f o l - genden Annahmen und Bedingungen s t a n d a r d i s i e r t :

- d i e für d i e Enzymaktivitätsbestimmungen i n Humanserum, - b l u t , oder -erythrozytenpräparationen angegebenen o p t i m a l e n Bedingungen wurden für K a r p f e n p r o b e n übernommen.

Zusätzlich wurde i m B e r e i c h von 1/10 b i s zum Z e h n f a c h e n d e r angegebenen Probenmenge d i e R e a k t i o n höchster Enzym- aktivität und am b e s t e n a u s w e r t b a r e r

A E / A t -

- s o w e i t n i c h t a n d e r s angegeben, wurden d i e für d i e j e w e i - l i g e n Humanenzyme empfohlenen P u f f e r für Karpfenenzym- messungen a u f T r i s / H C l - P u f f e r pH 7 . 8 abgeändert und d i e Temperatur von 2 5 °C ( a l l g e m e i n e r L a b o r s t a n d a r d ) s o w o h l für Human- w i e für Karpfenenzymmessungen b e i b e h a l t e n .

- R e a g e n z i e n und Enzyme wurden i n d e r v o r g e s c h r i e b e n e n R e i n h e i t e i n g e s e t z t und gemäß a l l g e m e i n e n V o r s c h r i f t e n (Bergmeyer 1 9 7 4 ) v e r a r b e i t e t und g e l a g e r t .

- D i e Bestimmung d e r Enzymaktivität e r f o l g t e s o f o r t n a c h H e r s t e l l u n g des Hämolysats bzw. - s o w e i t k e i n e V e r m i n d e r u n g d e r Enzymaktivität b e s c h r i e b e n - nach E i n f r i e r e n b e i -20°C.

- D i e Hämolysate wurden folgendermaßen h e r g e s t e l l t : Nach V o r b e h a n d l u n g , F r a k t i o n i e r u n g und R e s u s p e n s i o n

Verdünnen von H u m a n e r y t h r o z y t e n s u s p e n s i o n e n i n d e s t . H²0 m i t 0. 5 mmol/1 EDTA,

von K a r p f e n e r y t h r o z y t e n s u s p e n s i o n e n i n g l e i c h e n T e i l e n v o n PSC/DNAse ( 5 0 fig/ml) und T r i s - H C l (1 mM, pH 8.0) / E D T A ( 0 . 5 mM) ( + , wo beab- s i c h t i g t , Z u s a t z von 0 . 5 % T r i t o n ) ,

anschließendes d r e i m a l i g e s E i n f r i e r e n und A u f t a u e n i n flüss. S t i c k s t o f f .

Wie b e r e i t s b e i d e r E r m i t t l u n g d e r Hämoglobinkonzentration erwähnt, kommt es b e i d e r B e r e i t u n g v o n Fischhämolysaten m i t d e s t . Wasser zum A u f t r e t e n störender g e l a t i n e a r t i g e r Massen ( R i g g s 1 9 8 1 ) , was d u r c h Hämolyse i n p h y s i o l o g i s c h e r Salzlösung u n t e r Zugabe v o n DNAse eingeschränkt werden kann.

- V o r d e r Bestimmung d e r Enzymaktivität e r f o l g t e j e w e i l s Präinkubation des Hämolysats für 10 M i n . b e i 25°C .

- Geräte: E p p e n d o r f (Hamburg) P h o t o m e t e r 1101 M m i t S p e k t r a l f i l t e r Hg 366 nm, Hg 437 nm, Hg 405 nm und t e m p e r i e r b a r e m Küvettenhalter (Haake T h e r m o s t a t F423, B e r l i n ) ; E p p e n d o r f K o m p e n s a t i o n s s c h r e i b e r 6511 m i t r e g u l i e r b a r e r G e s c h w i n d i g k e i t und E x t i n k t i o n s w e r t s k a l a .

2 . 6 . 2 . Methoden d e r e n z y m a t i s c h e n Bestimmungen

D i e f o l g e n d e A u f l i s t u n g z e i g t d i e Meßansätze für d i e Be- stimmung v o n A c e t y l c h o l i n e s t e r a s e , A s p a r t a t - A m i n o t r a n s f e r a s e (GOT), G l u c o s e - 6 - p h o s p h a t - D e h y d r o g e n a s e , P e r o x i d a s e und G l u t a t h i o n - R e d u k t a s e , einschließlich d e r E n d k o n z e n t r a t i o n e n d e r R e a g e n z i e n i m T e s t (mmol/1), des Probenvolumens ( m l ) und des Gesamtvolumens i n d e r Küvette ( m l ) .

2.6.2.1. A c e t y l c h o l i n e s t e r a s e (AChE) T e s t a n s a t z für

T r i s / H C l - P u f f e r pH 7 - * T r i s / H C l - P u f f e r pH 7-8 A c e t y l t h i o c h o l i n j o d i d DTNB

Hämolysat(1:10)/Plasma(1:4) Hämolysat ( 1 : 4 ) / P l a s m a A n s a t z v o l u m e n

Human- K a r p f e n - Enzym 48. 0 mmol/1

48. 0 mmol/1 2 . 5 / 5 . 0 mmol/1 2 . 5 / 5 . 0 mmol/1

0 . 2 5 mmol/1 0 . 2 5 mmol/1

0 . 0 2 / 0 . 0 2 m l

0 . 1 / 0 . 0 2 m l 3 . 1 2 m l 3 . 2 / 3 . 1 2 m l

( Q u e l l e : Bergmeyer 1 9 7 4 , Methode nach E l l m a n n e t a l . 1 9 6 1 )

(CH³)³ N - C H² - C H²- S • H²0 ^ = " (CH³)³ N - C H²- C H²- S^e • C H³C 0 0^e • 2H®

Acetylthiocholin 0=0

i

CH³

Thiocholin

• RSSR (=DTNB )

R S0 * R - S - S - C H2- C H2- N (CH3)3

t X00H \

R=hQ^no²

Abb. 3 : Meßprinzip d e r AChE-Bestimmung n a c h E l l m a n n

2.6.2.2. A s p a r t a t - A m i n o t r a n s f e r a s e (GOT)

T e s t a n s a t z für Human- K a r p f e n - Enzym T r i s / H C l - P u f f e r pH 7 - 8

P y r i d o x a l p h o s p h a t L - A s p a r t a t

a - K e t o g l u t a r a t NADH

LDH MDH

Hämolysat ( 1 : 1 ) A n s a t z v o l u m e n

80.0 mmol/1 0 . 1 mmol/1 2 0 0 . 0 mmol/1 1 2 . 0 mmol/1 0.18 mmol/1

> 1 . 2 U/ml

>0.6 U/ml 0 . 2 m l 3 . 1 3 m l

80.0 mmol/1 0 . 1 mmol/1 2 0 0 . 0 mmol/1 1 2 . 0 mmol/1 0.18 mmol/1

> 1 . 2 U/ml

>0.6 U/ml 0 . 2 m l 3 . 1 3 m l ( Q u e l l e : IFCC S e c t i o n 1 9 7 7 )

Meßprinzip:

a - K e t o g l u t a r a t + L - A s p a r t a t ; A l s I n d i k a t o r r e a k t i o n d i e n t : O x a l a c e t a t + NADH + H⁺ —

G l u t a m a t + O x a l a c e t a t M a l a t + NAD+

2. 6. 2 . 3 . G l u c o s e - 6 - p h o s p h a t - D e h y d r o g e n a s e (G6PDH)

T e s t a n s a t z für Human- K a r p f e n - Enzym

T r i s / H C l - P u f f e r pH 7 . 8 EDTA

M g C l² NADP G-6-P

Hämolysat ( 1 : 1 ) A n s a t z v o l u m e n

8 8 . 9 mmol/1 1 . 1 9 mmol/1 6 . 3 O mmol/1 0 . 7 1 mmol/1 O.95 mmol/1 0 . 0 5 m l 2 . 2 5 m l

8 8 . 9 mmol/1 1 . 1 9 mmol/1 6 . 3 0 mmol/1 0 . 7 1 mmol/1 O.95 mmol/1 0 . 0 5 m l

2 . 2 5 ml ( Q u e l l e : Bergmeyer 1 9 7 4 , B e u t l e r 1 9 7 5 )

Meßprinzip:

G l u c o s e - 6 - P + NADP+ Gluconsäure-6-P + NADPH + H+

Anm: B e i d e r Berechnung wurde d e r WHO-Standard l t . B e u t l e r ( 1 9 7 5 ) z u r g r u n d e g e l e g t (Umsatz v o n 1 M o l NADP⁺ t r o t z möglicher W e i t e r r e a k t i o n von Gluconsäure-6-P m i t NADP⁺ über 6 - P h o s p h o g l u c o n a t - D e h y d r o g e n a s e ) .

2.6.2.4. P e r o x i d a s e (POX)

T e s t a n s a t z für K a r p f e n - Enzym

T r i s / H C l - P u f f e r pH 7.8 H²0²

G u a j a c o l

Hämolysat i n Transformationslösung (1:10) A n s a t z v o l u m e n

88.9 mmol/1 0 . 5 5 mmol/1 8.96 mmol/1 0 . 0 5 m l 2 . 2 5 m l ( Q u e l l e : M a e h l y & Chance 1964)

Meßprinzip:

2 H²0² —»

D H2 + ROOH

2 H²0 + 0²

H²0 + ROH + D (D= D o n a t o r )

Das G u j a c o l - D e h y d r o g e n i e r u n g s p r o d u k t i s t c h e m i s c h n i c h t e i n d e u t i g d e f i n i e r t .

2. 6. 2. 5 . G l u t a t h i o n - R e d u k t a s e (GRED) Meßprinzip:

GSSG + NADPH + H+ 2 GSH + NADP⁺

T e s t a n s a t z für Human- K a r p f e n - Enzym T r i s / H C l - P u f f e r pH 8 . 0

EDTA NADPH GSSG

Hämolysat ( 1 : 1 ) A n s a t z v o l u m e n

8 7 . 0 mmol/1 1 . 1 7 mmol/1 0.26 mmol/1 3 - 5 5 mmol/1 0 . 0 5 m l 2. 3 0 m l

8 7 . 0 mmol/1 1 . 1 7 mmol/1 0.26 mmol/1 3 . 5 5 mmol/1 0 . 05 ml 2. 3 0 ml ( Q u e l l e : Bergmeyer 1 9 7 4 )

2 .6 . 3 . Berechnung d e r Enzymaktivitäten

S o w e i t n i c h t a n d e r s angegeben, e r f o l g t e d i e Berechnung d e r Enzymaktivitäten d u r c h g r a p h i s c h e A u s w e r t u n g d e r

A E / A t -

Geraden und Verwendung d e r f o l g e n d e n F o r m e l : A E • 1 0⁶ - V I . U . / I P r o b e n l s g . •

M i n

€ = m o l a r e r E x t i n k t i o n s k o e f f i z i e n t [ l - mol" ¹ • cm"^l

- S o w e i t d e r o p t i s c h e T e s t v e r w e n d e t , wurden d i e von Bergmeyer ( 1 9 7 5 ) angegebenen E x t i n k t i o n s k o e f f i z i e n t e n für NADH und NADPH b e i 3 6 6 nm ( 3 . 4 - 1 0³ bzw. 3 - 5 - 1 0³) e i n g e s e t z t .

- z u r AChE-Bestimmung: e ( 4 0 5 nm) • 1 3 . 3 - 1 0³ - z u r POX-Bestimmung: 6 ( 4 3 6 nm) = 2 5 . 5 - 1 0³ A E = Absorptionsänderung

d » S c h i c h t d i c k e [ein]

V • Meßansatzvolumen [mlj

v = Probenvolumen (Hämolysat, P l a s m a , V o l l b l u t ) [ml]

Wie aus d e n Messungen h e r v o r g i n g ( s . 3 . 2 . ) , ändern s i c h beim K a r p f e n d i e hämatologischen P a r a m e t e r MCV, MCH und MCHC, beim Menschen MCV, MCHC, aber n i c h t MCH regelmäßig m i t d e r D i c h t e d e r E r y t h r o z y t e n . Daher wurden d i e Enzymaktivitäten b e i K a r p f e n e r y t h r o z y t e n f r a k t i o n e n a u f d i e Z e l l z a h l ( a l s I . U . / 1 0^{1 2} bzw. 1 09 Z e l l e n ) b e r e c h n e t , b e i H u m a n e r y t h r o z y t e n f r a k t i o n e n a l s geläufige E i n h e i t I.U./gHb wiedergegeben.

2.7« S t a t i s t i k

S o w e i t d i e D a t e n a l s M i t t e l w e r t e i n den A b b i l d u n g e n und T a b e l l e n w i e d e r g e g e b e n s i n d , wurden d i e U n t e r s c h i e d e m i t f o l g e n d e n T e s t s ( S a c h s 1984) a u f S i g n i f i k a n z geprüft:

1. ) d i e d o p p e l t e V a r i a n z a n a l y s e m i t Angabe d e s F-Werts ( m i t F r e i h e i t s g r a d e n FG und I r r t u m s w a h r s c h e i n l i c h k e i t p ) , d e r S t r e u u n g d e r F r a k t i o n s m i t t e l w e r t e ( S t a n d a r d e r r o r o f f r a c t i o n means, ± SEM) und des k l e i n s t e n s i g n i f i k a n t e n U n t e r s c h i e d s ( l e a s t s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e , LSD) n a c h R. A.

F i s h e r m i t p = 0 . 0 5 ;

2. ) d i e m u l t i p l e R e g r e s s i o n s a n a l y s e z u r Bestätigung d e r U n t e r s c h i e d e und d e r K o r r e l a t i o n z w i s c h e n den F r a k t i o n s - m i t t e l w e r t e n m i t Angabe des m u l t i p l e n K o r r e l a t i o n s - k o e f f i z i e n t e n R.

Das z u d e n F-Werten gehörenden S i g n i f i k a n z n i v e a u wurde m i t dem A l g o r i t h m u s 8. 9 von Cooke e t a l . (1982) a u f einem PC ( O l i v e t t i M24) b e r e c h n e t .

D i e e n t s p r e c h e n d e n Werte und S i g n i f i k a n z s c h r a n k e n s i n d aus den T a b e l l e n und B i l d l e g e n d e n z u entnehmen.

3. ERGEBNISSE

3 » 1• V o r v e r s u c h e ( E r g . z u 2 . 3 . 1 . )

D i e E r g e b n i s s e d e r V o r v e r s u c h e z u r E r m i t t l u n g hämatologischer Grundparameter z e i g t Tab. 3.

I

| P a r a m e t e r

i r

| E i n h e i t | n

i XM

" l

± S.D. |

| Plasmaosmolarität | mosm/1 ] 8 274.4 4. 34 |

| Hämatokrit ( H k t ) 1 ^% 1 45 22. 00 4. 88 |

| E r y . - Z a h l (RBC) | M i o / f i l | 45 1.22 0. 26 |

| Hämoglobinkonz. | Hb^mmol/l | 45 0.96 0. 24 |

1 S/1 1 ^5 62.11 14. 78 |

| MCV 1 um³ | ^5 182.15 _{1 9 .} 85 |

| MCH 1 PS | 45 ₅₀. 5 3 6. _{07 |}

| MCHC 1 s / i 1 45 278.60 _{2 3 .} 89 |

| Hb^mmol/l |

i i

45 4. 32 0. _{37 |}

| Tab. 3 : S t a n d a r d p a r a m e t e r v o n K a r p f e n b l u t |

| ( n = A n z a h l d e r K a r p f e n ) |

I I H i e r w e i s t d i e i n t e r i n d i v i d u e l l e B a n d b r e i t e p h y s i o l o g i s c h e r

und hämatologischer Basisgrößen, z.B. Hkt , RBC , Hb-konz. , b e r e i t s a u f d i e Anpassungsfähigkeit des K a r p f e n an Verände- r u n g e n s e i n e r Umweltbedingungen h i n (Lebensraum, J a h r e s z e i t , Nahrungsangebot, Temperatur, Gaspartialdrücke, pH-Wert, Streß). B e i F i s c h e n s i n d s o l c h e Adaptionsvorgänge v i e l f a c h b e k a n n t ( S m i t h e t a l . 1 9 5 2 , Dombrowski 1 9 5 3 , M u r a c h i 1 9 5 9 . S r i v a s t a v a 1968, B l a x h a l l & D a i s l e y 1 9 7 3 , Weinberg e t a l . 1 9 7 3 , J o h a n s s o n e t a l . 1 9 7 4 , Saez e t a l . 1 9 8 2 , Hughes e t a l .

1 9 8 3 , Onate e t a l . 1 9 8 7 ) . E i n e nähere D i s k u s s i o n i n diesem Zusammenhang b i e t e t d e r G l y c i n e i n b a u - V e r s u c h u n t e r v e r s c h i e - denen S t o f f W e c h s e l b e d i n g u n g e n ( s . 3 * 4 . , 3.6.) an.

5 . 2 . D i c h t e , MCV, MCH, MCHC i n E r y t h r o z y t e n f r a k t i o n e n ( E r g . z u 2 . 5 . 3 » )

D i e Bestimmung d e r E r y t h r o z y t e n d i c h t e i n d e n f r a k t i o n i e r - t e n und u n f r a k t i o n i e r t e n K a r p f e n - und Humanblutproben ergab k o n t i n u i e r l i c h m i t d e r F r a k t i o n s n u m m e r a n s t e i g e n d e Werte (Abb. 4; Tab. 4 ) . Damit wurde d i e W i r k s a m k e i t d e r Trennmethode b e l e g t .

D i e Werte für H k t , H b - k o n z e n t r a t i o n und RBC i n den F r a k t i o n e n s i n d a u f Grund des R e s u s p e n d i e r e n s d e r nach Z e n t r i f u g a t i o n e r h a l t e n e n Zellsäulen n i c h t v e r g l e i c h b a r . D u r c h B i l d u n g d e r Q u o t i e n t e n H k t-10/ R B C (« MCV), Hb- k o n z e n t r a t i o n / R B C (* MCH), H b - k o n z e n t r a t i o n -1O O / H k t (» MCHC) erhält man J e d o c h d r e i repräsentative G r u n d p a r a m e t e r z u r hämatologischen C h a r a k t e r i s i e r u n g d e r F r a k t i o n e n . H i e r b e i z e i g t e n Human- und K a r p f e n e r y t h r o z y t e n g r u n d l e g e n d e U n t e r - s c h i e d e (Abb. 5 ; Tab. 5 a ,b ) :

- B e i K a r p f e n e r y t h r o z y t e n s t i e g e n a l l e d r e i Werte m i t d e r D i c h t e an.

- D i e b e i H u m a n e r y t h r o z y t e n b e k a n n t e n Veränderungen (MCV s i n k t , MCHC s t e i g t und MCH b l e i b t unverändert) d i e n t e n z u g l e i c h a l s B e l e g für d i e Trennmethode.

D i e s t a t i s t i s c h e Auswertung m i t t e l s d o p p e l t e r V a r i a n z a n a l y s e z e i g e n d i e T a b e l l e n . D i e p-Werte wurden m i t einem PC n u m e r i s c h a p p r o x i m i e r t , so daß a u c h d i e Werte p<0.1% größen- ordnungsmäßig b r a u c h b a r w i e d e r g e g e b e n werden konnten.

Zusätzlich ergab d i e m u l t i p l e R e g r e s s i o n s a n a l y s e für d i e K a r p f e n w e r t e von N u l l v e r s c h i e d e n e m i t t l e r e R e g r e s s i o n s - k o e f f i z i e n t e n und U n t e r s c h i e d e z w i s c h e n den G r u p p e n m i t t e l n m i t J e w e i l s p< 0 . 0 0 0 1 . D i e zugehörigen m u l t i p l e n K o r r e l a - t i o n s k o e f f i z i e n t e n waren: R^{M C V}= 0 . 7 3 , R^{M C H}= 0 . 8 8 , R f t C H C ^⁰'^{8 1 ,}