Identifikation von
Kardiomyozyten-Differenzierungs-Genen
durch einen
siRNA-basierenden Screeningansatz
Inaugural-Dissertation
Zur Erlangung des Doktorgrades der Naturwissenschaften
(Dr. rer. nat.)
An der Justus Liebig Universität Gießen
Fachbereich 08
„Biologie und Chemie“
angefertigt am
Max-Planck-Institut für Herz- und Lungenforschung
Bad Nauheim
vorgelegt von
Stefanie Köhler-Bachmann
aus Hilden
Dekan:
Prof. Dr. Volkmar Wolters
1.Gutachter: Prof. Dr. Adriaan Dorresteijn
2.Gutachter: Prof. Dr. Dr. Thomas Braun
Unsere Bestimmung verfügt über uns,
auch wenn wir sie noch nicht kennen;
es ist die Zukunft,
die unserm Heute die Regel gibt.
Friedrich NietzscheInhalt
Abkürzungen _____________________________________ 1 1. Einleitung ______________________________________ 3
1.1. Die frühe Entwicklung des Herzens ____________________________________ 5
1.1.1. Die Bildung der Keimblätter: Gastrulation in Vertebraten _______________ 6 1.1.2. Bildung des kardialen Mesoderms_______________________________________ 8 1.1.3. Frühe Morphogenese des embryonalen Herzens _______________________ 11
1.2. in vitro Differenzierung embryonaler Stammzellen _________________ 12
1.2.1. Differenzierung von Kardiomyozyten aus murinen Embryonalen
Stammzellen __________________________________________________________ 14
1.3. RNA Interferenz ________________________________________________________ 16
1.3.1. Vektor-basierende Expressions-Systeme für Säugerzellen _____________ 21 1.3.2. siRNA Bibliotheken ____________________________________________________ 23
1.4. Fragestellung und Ziel der Arbeit _____________________________________ 24
2. Material und Methoden___________________________ 25
2.1. Chemikalien, Enzyme, Lösungen ______________________________________ 25 2.2. Arbeiten mit Nukleinsäuren ___________________________________________ 25
2.2.1. Sequenzspezifische Spaltung von DNA mit Restriktionsendonukleasen _ 25 2.2.2. Dephosphorylierung von 5'-Enden der DNA ____________________________ 25 2.2.3. Agarose-Gelelektrophorese ____________________________________________ 26 2.2.4. Aufreinigung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen _________________ 26 2.2.5. Paarung komplementärer DNA-Oligonukleotide („Annealing“) __________ 26 2.2.6. Phosphorylierung von DNA-Oligonukleotiden __________________________ 27 2.2.7. Ligation von DNA-Fragmenten _________________________________________ 27 2.2.8. Analytische Plasmid-Isolierung (Mini-Präparation) _____________________ 27 2.2.9. Präparative Plasmid-Isolierung (Maxi-Präparation) _____________________ 28 2.2.10. Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren in Lösung ___________ 28 2.2.11. Sequenzierung von DNA _____________________________________________ 28 2.2.12. Isolation von Gesamt-RNA aus eukaryotischen Zellen _______________ 29 2.2.13. Fällung von RNA ____________________________________________________ 29 2.2.14. cDNA-Synthese mittels reverser Transkription_______________________ 29 2.2.15. Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) nach (Saiki et al., 1986) ________ 30 2.2.16. Aufreinigung von PCR-Produkten ____________________________________ 32 2.2.17. λ-Exonuklease-Behandlung von PCR-Produkten _____________________ 33
2.3. Bakterien _______________________________________________________________ 33
2.3.1. Bakterienstämme ______________________________________________________ 33 2.3.2. Bakterienmedien ______________________________________________________ 33 2.3.3. Herstellung chemisch-kompetenter Bakterien__________________________ 34 2.3.4. Transformation von chemisch-kompetenten Bakterien _________________ 34
2.4. Zellkultur _______________________________________________________________ 35
2.4.1. Zelllinien ______________________________________________________________ 35 2.4.2. Zellkulturmedien, Lösungen und Reagenzien __________________________ 35 2.4.3. Kultivierung der Zellen ________________________________________________ 36 2.4.4. Passagieren von Zellen ________________________________________________ 36 2.4.5. Einfrieren und Auftauen von Zellen ____________________________________ 37 2.4.6. Transfektion von Zellen ________________________________________________ 37 2.4.7. G418-Selektion ________________________________________________________ 38 2.4.8. Puromyzin-Selektion ___________________________________________________ 38 2.4.9. in vitro Differenzierung von ES-Zellen _________________________________ 38
2.5. Viren ____________________________________________________________________ 39
2.5.1. Generierung lentiviraler Partikel _______________________________________ 39 2.5.2. Konzentrierung lentiviraler Partikel ____________________________________ 40 2.5.3. Bestimmung des Titers ________________________________________________ 40
Inhalt
2.5.4. Bestimmung der MOI für ES-Zellen ____________________________________ 40
2.6. Proteine ________________________________________________________________ 41
2.6.1. Isolation von Proteinen aus eukaryotischen Zellen _____________________ 41 2.6.2. Konzentrationsbestimmung von Proteinen in Lösung
(nach Bradford, 1976) _________________________________________________ 42 2.6.3. SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE)
nach (Laemmli, 1970) _________________________________________________ 42 2.6.4. Proteintransfer und -nachweis (Western-Blot (Immunoblot)) __________ 43
2.7. Histologische Techniken _______________________________________________ 44
2.7.1. Herstellung von Kryoschnitten _________________________________________ 44
2.8. Immunhistologische und Immunhistochemische Techniken _______ 44
2.8.1. Antikörper-Färbung von Kryoschnitten _________________________________ 44 2.8.2. Durchflußzytrometrie (FACS-Analyse) _________________________________ 46 2.8.3. Affymetrix Gene Chip Expressionsanalyse _____________________________ 47
2.9. Photodokumentation __________________________________________________ 47
3. Ergebnisse ____________________________________ 48
3.1. Charakterisierung der von embryonalen Stammzellen abgeleiteten Kardiomyozyten _______________________________________________________________ 48
3.1.1. Die in vitro Generierung ESC-abgeleiteter Kardiomyozyten folgt einem spezifischen Muster und ist standardisierbar ___________________________ 48 3.1.2. in vitro generierte Kardiomyozytzen zeigen Charakteristika neonataler
Herzmuskelzellen ______________________________________________________ 50 3.1.3. Die „Cardiac Bodies“ bestehen ausschließlich aus Kardiomyozyten ____ 53
3.2. Genomweite siRNA-vermittelte Gensuppression während der in vitro Differenzierung ESC-abgeleiteter Kardiomyozyten ___________________ 55
3.2.1. Die Komplexität der sh/siRNA Bibliothek wurde durch die Amplifikation nicht beeinträchtigt ____________________________________________________ 55 3.2.2. Die lentivirale Infektion interferiert nicht mit der Differenzierung ______ 55 3.2.3. Inhibition der kardiomyozytären Differenzierung in vitro durch
siRNA-vermittelte Suppression von GATA4 _____________________________ 56 3.2.4. Identifikation kardioessentieller Gene im „batch-Verfahren“ ___________ 58 3.2.5. Identifikation funktionell relevanter Kandidatengene der frühen
Kardiomyogenese mit Hilfe eines komplexen bioinformatischer
Algorithmus ___________________________________________________________ 62
3.3. Der Screen zeigt eine hohe Repräsentanz bekannter
kardiogenetisch essentieller Faktoren verschiedenster Proteinklassen und beteiligter Prozesse ___________________________________________________________ 66 3.4. Interferenz identifizierter individueller siRNAs mit der
kardiomyozytären Differenzierung in vitro __________________________________ 69 3.5. Isolation und Identifikation angereicherter Knotenpunkte durch Annotationsverknüpfung nach GO (Gene Ontology) ________________________ 70
4. Diskussion ____________________________________ 77
4.1. In vitro generierte Kardiomyozyten eignen sich für die
Identifikation pränatal kardiogenetisch essentieller Faktoren ___________ 77 4.2. Die genomweite siRNA-vermittelte Gensuppression im „batch-Verfahren“ eignet sich zur Identifikation von Genen, welche die
Herzentwicklung beeinflussen _______________________________________________ 79
4.2.1. Die siRNA-vermittelte Suppression von GATA4 verhindert die
kardiomyozytäre Differenzierung in vitro, aber nicht in vivo ___________ 79 4.2.2. Die Komplexität der lentiviralen sh/siRNA-Bibliothek bleibt auf
zellulärer Ebene erhalten _____________________________________________ 81 4.2.3. Das Stadium der Testpopulationen definiert das entwicklungsbiologische Zeitfenster ____________________________________________________________ 82
Inhalt
4.3. Identifikation von Kandidatengenen durch einen bioinformatischer Algorithmus ___________________________________________________________________ 84
4.3.1. Die Identifikation der siRNAs wird durch die komplexe Verrechnung der Hybridisierungssignale erreicht ________________________________________ 84 4.3.2. Die Bestimmung der Anzahl der als essentiell identifizierten
Kandidatengene ist von der Stringenz abhängig _______________________ 86 4.3.3. Der Abgleich der Screeningresultate mit Expressionsdaten verbessert
die Qualität der Analyse und schließt falsch positive Kandidaten aus __ 87
4.4. Die Konsistenz des genomweiten Screens wird durch die
theoretische und biologische Validierung verbessert ______________________ 88
4.4.1. Die Identifikation bekannter kardiogenetisch essentieller Gene
demonstriert die Validität und die Potenz des in vitro Screens _________ 88
4.4.2. Die erfolgreiche Validierung der Screeningresultate bestätigt die
biologische Relevanz der identifizierten Gene für die Herzentwicklung _ 94
4.5. Die Annotationsverknüpfung nach GO (Gene Ontology) zeigt die Diversität betroffener biologischer Prozesse und ermöglicht die
Identifikation angereicherter funktionell assoziierter Gengruppen _______ 94
4.5.1. Der Screen zeigt den Einfluss β-Catenin-abhängiger und alternativer Wnt-Signalgebung in der kardiomyozytären Differenzierung in vitro ___ 95
4.5.2. Gene für Reizleitung und Erregbarkeit beeinflussen die kardiomyozytäre Differenzierung in vitro ________________________________________________ 98 4.5.3. Kalzium: ein Effektor kardialer Differenzierung und funktioneller
Regulator ______________________________________________________________ 99 4.6. Ausblick _______________________________________________________________ 101 5. Zusammenfassung _____________________________ 103 6. Literatur _____________________________________ 105 7. Anhang ______________________________________ 122 7.1. Oligodesoxynukleotide zu Detektierungszwecken (PCR) __________ 122 7.2. spezielle Oligodesoxynukleotide _____________________________________ 123 7.3. Oligodesoxynukleotide zur Klonierung ______________________________ 123 7.4. Plasmide _______________________________________________________________ 124 7.5. Identifizierte Gene ___________________________________________________ 124
Danksagung____________________________________ 207 Eidesstattliche Erklärung__________________________ 208
Abkürzungen
1
Abkürzungen & Einheiten
Abkürzungen
A Adenin bzw. Adenosin Abb. Abbildung
Ac Acetat
AHF engl.: Anterior Heart Field AK Antikörper
αMHC engl.: alpha Myosin Heavy Chain Amp Ampicillin
APS Ammoniumpersulfat ATP Adenosintriphosphat
AVE Anteriores Viscerales Entoderm
BSA Rinderserum-Albumin (engl.: bovine serum albumin) C Cytidin bzw. Cytosin
CB(s) engl.: Cardiac Body/Cardiac Bodies CBpl engl.: Cardiac Body plated
cDNA engl.: complementary DNA CM engl.: Cardiomyocytes CMV Cytomegalievirus CTP Cytosintriphosphat
DABCO 1,4-diazobicyclo[2.2.2]octan ddH2O deionisiertes und destilliertes Wasser
DEPC Diethylpyrocarbonat
DMEM "Dulbecco‘s modified Eagle‘s medium" DMSO Dimethylsulfoxid
DNA Desoxyribonukleinsäure dNTP Desoxyribonukleotidtriphosphat dsDNA engl.: doublestranded DNA dsRNA engl.: doublestranded RNA DTT Dithiotreitol
DVE Distales Viscerales Entoderm
EB(s) engl.: Embryoid Body/Embryoid Bodies EDTA Ethylendiamintetraessigsäure x Na2-Salz
ES(C) engl.: Embryonic Stem Cells
esiRNA engl.: endoribonucleaseprepared siRNA
EtBr Ethidiumbromid (3,8-Diamino-6-ethyl-5phenylphenatridiumbromid) Fa. Firma
FCS engl.: Fetal-Calf-Serum) FHF engl.: First Heart Field G Guanidin bzw. Guanosin GTP Guanosintriphosphat H1 Histon 1 HCl Salzsäure HEPES (N-(2-Hydroxyethyl)piperazin-N‘-2-ethansulfonsäure) HPRT Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyl-Transferase ICM engl.: Inner Cell Mass
IPTG Isopropyl ß-D-Thiogalactopyranosid LSM Laser-Scan-Mikroskop
mRNA engl.: messenger RNA NaOH Natronlauge
nCM engl.: neonatal Cardiomyocytes nt Nukleotide
OD optische Dichte
PBS Phosphat-gepufferte-Salzlösung (engl.: phosphate buffered saline) PCP engl.: Planar Cell Polarity
PCR engl.: polymerase chain reaction pH -log [H+]
PHF engl.: Primary Heart Field Pol Polymerase
Abkürzungen
2
R III RNase III
RISC engl.: RNA induced silencing complex RNA eng.: ribonucleic acid
RNase Ribonuklease RNAi RNA-Interferenz RT Raumtemperatur
SHF engl.:Second Heart Field SDS engl.: sodium dodecylsulfat
SDS-PAGE SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese siRNA engl.: short interfering RNA
siRNP engl.: siRNA containing Ribo-Nucleo-Proteincomplex ssDNA engl.: singlestranded DNA
ssRNA engl.: singlestranded RNA T Thymidin bzw. Thymin Tab. Tabelle TAE Tris-Acetat-EDTA-Puffer TBE Tris-Borat-EDTA-Puffer TE Tris-EDTA-Puffer TEMED N,N,N‘,N‘-Tetra-methylethylendiamin Tris Tris(hydroxymethyl)-aminomethan TTP Thymidintriphosphat Tween20 Polyoxyethylensorbitanmonolaurat U Uracil
Upm Umdrehungen pro Minute UTP Uraciltriphosphat
UV Ultraviolett ü.N. über Nacht
VE Viscerales Endoderm v/v engl.: volume per volume w/v engl.: weight per volume
X-Gal 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl ß-D-galactopyranosid ZNS Zentralnervensystem Einheiten A Ampere b Basen bp Basenpaare °C Grad Celsius Da Dalton g Gramm/ Erdbeschleunigung h Stunde l Liter M molar min Minute sec Sekunden U Unit V Volt Präfixe k kilo (103) µ mikro (10-6) m milli (10-3) M mega (106) n nano (10-6)
Einleitung
3
1. Einleitung
Das Verständnis über die Entstehung neuen Lebens und dessen progressiver Veränderung steht seit jeher im Interesse der Wissenschaft. Die komplexe räumliche, sowie zeitlich streng koordinierte Bildung eines multizellulären Organismus aus einer besamten Eizelle erfordert das kontrollierte Zusammenspiel von Zellteilung, Migration und Differenzierung. Obwohl alle Zellen des sich formenden Organismus die gleiche genetische Information enthalten, entwickeln sie sich ihrem positionell, sowie funktionell gefordertem „Schicksal“ entsprechend. Daher ist durchaus verständlich, dass diese hochselektive Informationsverarbeitung den regulatorischen Einfluss von verschiedenen Ebenen, sowohl intra-, als auch interzellulärer Art erfordert. So unterliegen die ablaufenden entwicklungsbiologischen Prozesse der simultanen, sowie sukzedanen Kontrolle epigenetischer, transkriptioneller, posttranskriptioneller, translationaler, posttranslationaler Modulation und Modifikation auf zellulärer Ebene. Desweiteren steuern und beeinflussen zellübergreifende Stimuli über direkten Zell-Zellkontakt, sowie parakrine Faktoren und ebenfalls physikalische und umweltbedingte Parameter synergetisch die progressiven Veränderungen.
Die Embryogenese läuft nicht immer fehlerfrei ab. Angesichts der Komplexität der Vorgänge, die zu der Entwicklung funktionsfähiger Organe führt, erscheint es eher verwunderlich, dass Fehlfunktionen nicht häufiger auftreten.
Die Analyse der oben genannten Einflüsse auf Zellspezifikation, Differenzierung und Organogenese stellt das „Herzstück“ der Erforschung einer Vielzahl genetisch bedingter Erkrankungen dar, mit dem Ziel der Entwicklung neuer Therapie- und Früherkennungsmöglichkeiten. Die häufigste Ursache humaner Geburtsdefekte ist mit annähernd 1% der weltweiten Bevölkerung die genetisch bedingte Missbildung des Herzens, weitere 1-2% weisen leichtere Herzfehler auf, welche erst mit zunehmenden Alter klinisch auffällig werden (Hoffman and Kaplan, 2002). Einen wichtigen Anteil der Herzzellen bilden die Kardiomyozyten, welche durch ihre Kontraktilität für die Pumpleistung des Herzens essentiell sind. Die Anlage dieser Zellen findet bereits im frühen Embryo, lediglich ein paar Tage nach Befruchtung der Eizelle, statt. Der hierfür maßgebliche Prozess bei welchem sich die drei Keimblätter Endo- Ekto- und Mesoderm formieren, wird als Gastrulation bezeichnet. Die hier beginnende Zellspezifikation und folgende Determination unterliegt unter Berücksichtigung der stattfindenden Migrationsvorgänge dem koordinatorischen Einfluss mittel- und unmittelbar
Einleitung
4 angrenzender Zellen, beziehungsweise Zellverbänden. So entwickeln sich die kardialen Vorläufer aus einem Teil des visceralen lateralen Plattenmesoderms, deren weiteres Schicksal den Signalen aus Ento- und/oder Ektoderm, sowie denen des umgebenden Mesoderms unterliegt. Allerdings gestalten sich biochemische Untersuchungen dieser frühen embryonalen Stadien aufgrund der schlechten Zugänglichkeit schwierig, zumal die Anzahl des jeweiligen Zelltyps meist zu gering für Analysen im größeren Maßstab ist.
Mit der Möglichkeit Embryonale Stammzellen (ESCs) erfolgreich als Zelllinien in Kultur zu halten, sowie gezielt in eine Vielzahl verschiedenster Zelltypen, so auch Kardiomyozyten zu differenzieren, wurde der Wissenschaft ein geeignetes in vitro Modellsystem für diverse genetische Manipulationen, sowie molekulare Analysen nutzbar gemacht. ESC- abgeleitete Zellen bilden nicht nur einen interessanten wissenschaftlichen Ansatz, es verbindet sich mit ihnen auch die Hoffnung auf die Herstellung therapeutisch nutzbarer Zellmengen. Die Differenzierung von Herzmuskelzellen aus ESCs erfolgt über die Bildung von Embryoid Bodies (EBs) in Suspensionskultur. Zusätzlich bietet sich bei Verwendung transgener Zelllinien, welche zelltypspezifische Resistenzen aufweisen, die Möglichkeit der genetischen Selektion zum Erhalt einer Reinkultur an. So ist die unter der Kontrolle eines αMHC (α Myosin Heavy Chain) Promoters erhaltene Population von Kardiomyozyten molekular weitestgehend homogen. Sowohl Aggregate als auch „Monolayer“ (einzelllagige Kultur) dieser Zellen können einige Wochen in Kultur gehalten werden. Sie bieten eine leicht zugängliche Möglichkeit für entwicklungsbiologische Untersuchungen, die Rückschlüsse auf die embryonale Kardiomyozytogenese zulassen.
Die umfassende Betrachtung der kardiomyozytären Differenzierung und die Identifikation einer Vielzahl an ihr beteiligter Faktoren, unter Berücksichtigung möglichst vieler dabei Einfluss nehmender Vorgänge, erfordert den Einsatz genomweiter Screening-Verfahren. Diese wurden in den letzten Jahren nach Entschlüsselung des Genoms diverser Organismen entwickelt und der Forschung zugänglich gemacht. Mit der erfolgreichen Anwendung des hochkonservierten Mechanismus der RNA Interferenz (RNAi) zur vergleichsweise einfachen und schnellen spezifischen Gensuppression in vivo und in vitro konnte eine geeignete Methode für ein Sreeningsystem im großen Maßstab nutzbar gemacht werden. So wurden short hairpin/short interfering RNA (sh/siRNA)-Bibliotheken entwickelt. Diese unterdrücken gezielt die Aktivität bestimmter, in einem Prozess oder Signalweg vorkommenden Gene, aber auch ihre
Einleitung
5 Gesamtheit, in Form einer genomweiten Bibliothek. Der Einsatz solcher Bibliotheken ermöglicht die Identifikation von vielen bisher unbekannten beteiligten, sowie essentiellen Faktoren und Signalwegen innerhalb des Testsystems mit Hilfe zuvor klar definierter phänotypischer Selektion. Durch den Einsatz vektor-basierender siRNA-Expressionssysteme ist die Generierung stabiler transgener Zellen möglich. Durch geeignete Promotoren, welche die Effektormoleküle konstitutiv exprimieren können auch Langzeitstudien, wie die in dieser arbeit fokussierte Untersuchung der kardiomyozytären Differenzierung durchgeführt werden. Die Isolation der wirksamen Effektormoleküle, der siRNA-Sequenzen aus einer Zellpopulation, die anschließende Identifikation der entsprechenden Zielgene und deren Strukturierung, erforderte den Einsatz bioinformatischer Hilfsmittel. Die grundlegenden Anforderungen an dieses Programm, sowie die Art und Weise der Datenverarbeitung und Lösung dabei auftauchender Probleme wurden Im Rahmen dieser Arbeit definiert. Die informatische Umsetzung ist kein Bestandteil dieser Arbeit und erfolgte im Rahmen einer Projektarbeit (Projektarbeit Ludmila Schulz). Das für die Auswertung generierte Programm wurde als Teil dieser Projektarbeit detailliert erläutert.
1.1.
Die frühe Entwicklung des Herzens
Das Herz ist neben dem Gehirn das erste Organ, welches sich während der Säugerembryogenese entwickelt und seine Funktion aufnimmt.
Die Entwicklung des Herzens ist prinzipiell in fünf Stufen unterteilbar und beginnt mit der Spezifikation der kardialen Vorläuferzellen während der Gastrulation (1), gefolgt von deren bilateraler Migration und Fusion der Primordien (2). Nach dem Looping des Herzschlauchs (3) bilden sich die Herzkammern (4). Der Prozeß endet schließlich mit der Septierung des Herzens und der Ausbildung der Herzklappen (5). Diese Prozesse gehen fließend ineinander über und beinhalten die Differenzierung aller beteiligten Herzzelltypen. In der vorliegenden Arbeit wurden vor allem die Kardiomyozyten untersucht. Das für den Screen gewählte entwicklungsbiologische Zeitfenster der Kardiomyozytogenese in vitro beginnt mit der positiven Selektion αMHC-positiver Zellen aus reifen EBs. Die molekulare Identität dieser frühen Kardiomyozyten ist daher etwa mit den Zellen des kardialen Mesoderms vergleichbar, dessen Bildung im Folgenden recht ausführlich beschrieben wird.
Einleitung
6
1.1.1. Die Bildung der Keimblätter: Gastrulation in Vertebraten
Der Prozess der Gastrulation führt zu der Ausbildung der drei Keimblätter - Ekto-, Ento und Mesoderm. Hierbei kommt es zur Etablierung der dorso-ventralen Körperachsen. Diese Prozesse werden im Folgenden am Beispiel der Maus dargelegt.
Mit der Implantation der murinen Blastozyste, die am Tag 3.5 postcoitum stattfindet, beginnt eine Reihe zahlreicher Zellteilungen, welche die innere Zellmasse (Inner Cell Mass = ICM) von etwa15 auf 120 Zellen anwachsen lässt. Diese, sowie das Blastocoel, werden von einer circa 60 Zellen umfassenden, dünnen epithelialen Schicht , dem Trophektoderm umgeben, welcher unter extensiver Proliferation die Invasion in das uterine Stroma und somit den embryonal-maternalen Kontakt gewährleistet.
Kurz nach Implantation der Blastozyste differenziert aus der ICM das primitive Endoderm, welches sich über der inneren Oberfläche des Trophektoderms ausbreitet und in der Formation des parietalen Entoderms resultiert. Dieses formt zusammen mit den Riesen-trophektoderm-Zellen und mit der Reichert-Membran den parietalen Dottersack. Die Zellen des primitiven Entoderms, welche die ICM flankieren, bilden später vermutlich das viscerale Entoderm (Tam and Schoenwolf, 1999).
Die verbleibenden Zellen der ICM beginnen sich in einem pseudogeschichteten Epithel, dem Epiblasten zu organisieren, welcher aufgrund der physikalischen Bedingungen einen Zylinder formt und vom Trophektoderm und dem primitiven Entoderm (Hypoblast) flankiert wird. Im weiteren Verlauf formt das Epithelium des Epiblasten mit dem primitiven Entoderm eine zweischichtige Becherstruktur, die kurz vor Beginn der Gastrulation am Tag 6,5 postcoitum etwa 660 Epiblastenzellen und 300 Zellen des primitiven Entoderms zählt (Tam and Schoenwolf, 1999). Zu diesem Zeitpunkt beginnt die Gastrulation mit der Ausbildung des Primitivstreifens (Primitive Streak = PS) auf einer Seite der Epiblast-extraembryonalen Grenze, welche das posteriore Ende des Embryos markiert. Während dieses Prozesses werden noch nicht determinierte Zellen des Epiblasten mobilisiert und passieren unter epithelialer-mesenchymaler Transition (EMT) den Primitivstreifen. In der Tiefe angekommen werden sie zu meso-, oder entodermalen Zellen und interkalieren zwischen Epiblast und visceralem Entoderm. Dabei ist die Position des Eintritts in den PS von entscheidender Bedeutung für die spätere Identität der migrierenden Zellen (zur Übersicht: Gadue et al., 2005).
Das Expressionsprofil des PS zeigt antero-posteriore Unterschiede, anhand derer eine Unterteilung in posteriore, mittlere und anteriore Regionen vorgenommen werden kann
Einleitung
7 (Abb. 1.1). Während einige Gene, wie Brachyury (T) (Kispert and Herrmann, 1994; Wilkinson et al., 1990) und Mixl1 (Hart et al., 2002) in dem gesamten PS exprimiert werden, ist der posteriore Anteil des PS durch die Expression von HoxB1 und Evx1 (Dush and Martin, 1992; Forlani et al., 2003) und der anteriore Bereich durch FoxA2 und Goosecoid (Kinder et al., 2001; Sasaki and Hogan, 1993) gekennzeichnet. Die Spezifikation distinkter meso-, sowie entodermaler Subpopulationen ist sowohl von der Region des Eintritts in den PS, als auch von dem entsprechenden Eintrittszeitpunkt abhängig. So konnte gezeigt werden, dass aus den ersten Epiblastenzellen, welche in den posterioren PS eintreten, extraembryonales Mesoderm hervorgeht, aus dem sich sowohl das Amnion und die Allantois, als auch hämatopoetische, endotheliale und glatte Gefäßmuskelzellen des Dottersacks entwickeln (Parameswaran and Tam, 1995). Mit fortschreitender Gastrulation migrieren die Zellen zunehmend durch die anterioren Regionen des PS, was in der Formation kranialen und kardialen Mesoderms und schließlich paraxialen und axialen Mesoderms resultiert (Kinder et al., 1999). Die Spezifikation des Entoderms erfolgt durch die Passage der anteriorsten Region des PS (Abb. 1.1). Im Gegensatz zu Mesoderm und Entoderm bildet sich das Ektoderm aus dem anterioren Bereich des Epiblasten, welcher den PS nicht passiert.
Abb. 1.1: Gastrulation im murinen Embryo
Gezeigt ist die posteriore Region des Primitivstreifens (PS), welche den Marker Brachyury (T) exprimiert (blau) und die anteriore Region des PS, welche durch die Koexpression von T und Foxa2 gekennzeichnet ist (rot). Die Epiblastenzellen treten in den PS ein (schwarze dicke Pfeile). Die gelbe Region kennzeichnet das gebildete Mesoderm, deren Migration aus dem PS durch dünne schwarze Pfeile angezeigt ist. Die Bewe-gung des frühen Endoderms ist durch den roten Pfeil gekennzeichnet (aus Murry and Keller, 2008).
Einleitung
8 Die spatio-temporale Abhängigkeit der Zellspezifikation impliziert den Einfluss der Umgebung. Diese definiert durch aktivierende und inhibierende Modulation intra-, sowie interzellulärer Signaltransduktion entwicklungsregulatorische Domänen und ermöglicht so den Gatrulationsprozess. Die Schlüssel-Signaldomänen, welche die Induktion und Musterbildung der Keimblätter gewährleisten, sind der posteriore Epiblast, das anteriore viscerale Entoderm (AVE), sowie das extraembryonale Ektoderm und der Knoten. Der posteriore Epiblast, aus dem sich die PS zunächst bildet, ist durch die Expression der parakrinen Wachstumsfaktoren Nodal und Wnt3a gekennzeichnet (Conlon et al., 1994; Liu et al., 1999; Varlet et al., 1997). Noch vor Beginn der Gastrulation differenziert ein Teil des visceralen Endoderms (VE) in das morphologisch unterscheidbare distale VE (DVE), welches unter Expression von Hex, Lefty1 und Dkk1 entlang der distal-proximalen Achse migriert und oberhalb des späteren anterioren Epiblasten das AVE bildet (zur Übersicht: Srinivas, 2006; Tam and Loebel, 2007). Das AVE exprimiert Dkk1 (Glinka et al., 1998), sowie die Nodal-Antagonisten Cerberus-like (Belo et al., 2000) und Lefty1 (Meno et al., 1997) und wirkt somit der anterioren Ausbreitung des PS entgegen und begrenzt ihn, und demzufolge auch die Induktion des Mesoderms, auf den posterioren Teil des Embryos (Perea-Gomez et al., 2002; zur Übersicht: Rossant and Tam, 2009). Zudem geht man davon aus, dass die AVE die Mobilisation der Epiblastenzellen durch Induktion des Wnt planaren Zellpolaritäts-Signalwegs (PCP) steuert (Voiculescu et al., 2007).
Im späten Stadium des PS bildet sich der Knoten an der anterioren Grenze der PS, ein Signalzentrum, welches durch die Expression von Nodal gekennzeichnet ist. Das extraembryonale Ektoderm sezerniert BMP4 welches auf den angrenzenden Epiblasten wirkt (Coucouvanis and Martin, 1999; Lawson et al., 1999).
1.1.2. Bildung des kardialen Mesoderms
Die myokardialen Vorläufer passieren während des Gastrulationsprozesses den anterioren Bereich des PS als Teil des sich bildenden Mesoderms, welches sich folgend durch kraniobilaterale Migration in einer semizirkulären Anordnung formiert. Die myokardialen Vorläuferzellen des ventralen visceralen Plattenmesoderms, welches auch noch einen dorsalen parietalen Bereich besitzt, liegt unter dem Ektoderm, während das viscerale Mesoderm zunächst über dem Entoderm liegt. Der sich ergebende Zwischenraum bildet die Körperhöhle, das Coelom, welches sich in der weiteren
Einleitung
9 Entwicklung in Pleural-, Pericardial- und Peritonealhöhle unterteilt und Thorax, Herz, sowie Abdomen umgibt (Abu-Issa and Kirby, 2007)
Die molekulare Determination der myokardialen Vorläufer, ist bis heute nicht vollständig geklärt und wird kontrovers betrachtet. Eine wahrscheinliche Induktionsquelle für kardiale Vorläufer ist das kraniale Endoderm und das Ektoderm. Kandidaten für die Kardioinduktion sind Mitglieder der Transforming Growth Factor β (TGFβ)-Superfamilie, Bone Morphogenetic Proteins (BMPs) und Fibroblast Growth Factors (FGFs). Sonic Hedgehog (SHH) und nicht-kanonisches WNT-Signaling wirken unterstützend. Kanonische WNT- und Notch/Serrate-Signalgebung haben allerdings einen kardioinhibitorischen Einfluß (Foley and Mercola, 2004; Pedrazzini, 2007; Solloway and Harvey, 2003). Die auf die Spezifikation des kardialen Mesoderms Einfluss nehmenden Faktoren sind in Abb. 1.2 dargestellt.
Abb. 1.2 Induktionsfaktoren des kardialen Mesoderms
Verschiedene Signalwege sind an der Rekrutierung kardialer Muskelzellen beteiligt. Bislang konnten drei Sig-nalwege identifiziert werden, die an der Spezifikation von Herzmuskelzel-len beteiligt sind: BMP 2, FGF8, and Wnt11. Zwei Signalwege: Wnt1/3/8 and Notch/Serrate inhibieren die Bil-dung von Herzgewebe und sind an der genauen Positionierung kardialer Vorläufer beteiligt.
Alternatives Wnt-signaling, wie an Wnt11 gezeigt, führt einerseits zur Aktivation der Jun-N-Terminalen Kinase (JNK) und der kleinen GTPase RhoA und andererseits zur intrazellulären Calcium-Freisetzung und Aktivierung der Phospholipase C (PLC) und der Proteinkinase C (PKC) (Pandur et al., 2002; Sheldahl et al., 2003). Die Relevanz der PKC-Aktivierung konnte in murinen ESCs gezeigt werden, deren Differenzierung zu Kardiomyozyten von den PKC Isoformen ζ und ε abhängig ist (Zhou et al., 2003).Während das intrazelluläre Protein dishevelled (dvl) sowohl den β-Catenin abhängigen, als auch alternativen β-Catenin unabhängigen Wnt Signalweg moduliert (Boutros and Mlodzik, 1999) inhibieren Strabismus, Naked Cuticle sowie PKC und das Wnt/Ca2+ Signalweg Zielmolekül CalmodulinkinaseII (CamKII) kanonisches β-Catenin Signaling (Alvarez-Buylla et al., 2000; Darken et al., 2002; Kuhl et al., 2001; Park and Moon, 2002). Dennoch ist der Einfluß der Aktivierung des alternativen
Wnt-Einleitung
10 Signalweges auf die Inhibition der kanonischen Wnt-Signalgebung noch weitestgehend ungeklärt.
Der zur TGFβ-Superfamilie zugehörige Faktor Nodal einschließlich seines essentiellen, membrangebundenen Korezeptors Cripto sind von entscheidender Bedeutung für die Kardioinduktion sowohl in Embryonen, als auch in ESCs. So konnte mit Cripto-defizienten ESCs zwar die Formation von Mesoderm, nicht aber von Kardiomyozyten herbeigeführt werden (Xu et al., 1998). Ähnliche Ergebnisse lieferte die Analyse Cripto-defizienter Embryonen, in welchen zwar Mesoderm gebildet wird, allerdings keine Entwicklung axialer anteroposteriorer Strukturen und keine Differenzierung von Herzmuskelzellen stattfindet (Ding et al., 1998; Xu et al., 1999).
Der phänotypische Vergleich der Cripto- und Nodal-defizienten Embryonen weist auf die Relevanz der Cripto-abhängigen Nodalsignalgebung im Epiblasten, als auch dem darüber befindlichen anterioren visceralen Entoderm (AVE) hin (Beddington and Robertson, 1999). Die konditionelle Deletion von Nodal mit Hilfe des Cre/loxP-Systems in dem zeitlichen, sowie räumlichen Expressionsbereich von Brachyury (T) zeigt, abgesehen von schweren Defekten in der Entwicklung der Links-Rechts-Achse, keine weiteren Anomalitäten in der weiteren Musterbildung der mesodermalen, sowie entodermalen Bereiche, so dass eine essentielle Funktion von Nodal hier ausgeschlossen werden kann (Kumar et al., 2008).
Auch die BMPs wurden als Promotoren der Kardiogenese in Embryonen identifiziert. Zusammen mit FGF-Isoformen bewirken sie die posteriore Ausweitung der kardiogenen Region. Mit der Ankunft der Vorläuferzellen an ihrer lateralen Position, wird das kardiogene Programm durch die vom aufliegenden Ento- und Ektoderm exprimierten BMPs induziert. Das Ektoderm sezerniert BMP4 und BMP7, das Entoderm exprimiert BMP2 und BMP5 (Schultheiss et al., 1997; Somi et al., 2004). Allerdings werden BMP2, 4 und 7 in der Maus auch im anterioren Mesoderm inklusive der herzformenden Region exprimiert (Dudley and Robertson, 1997; Solloway and Robertson, 1999; Zhang and Bradley, 1996). In den Zellen dieses bilateralen Mesoderms kann erstmals die durch
oben genannte Faktoren induzierte Expression der kardiospezifischen
Transkriptionsfaktoren Nkx2.5 und GATA4 detektiert werden. Im weiteren Entwicklungsverlauf folgen Mef2c, SRF, Tbx2, Tbx5 und Tbx20 und schließlich die sarkomerischen Proteine (Abu-Issa and Kirby, 2007).
Das bilaterale präkardiale Mesoderm trifft am Tag E7.5 der murinen Embryonalentwicklung an der Mittellinie aufeinander und bildet den sogenannten
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11 kardialen Halbmond. Entsprechend des späteren Beitrags zu unterschiedlichen Teilen des Herzens und der Expression von Markergen-Kombinationen wird es in das primäre und das anteriore Herzfeld, beziehungsweise erste und zweite Herzfeld unterteilt (Abu-Issa and Kirby, 2007).
1.1.3. Frühe Morphogenese des embryonalen Herzens
Die Zellen des kardialen Halbmondes bilden unter Fusion an der Mittellinie den frühen Herzschlauch. Dieser formt durch eine Rechtsdrehung und Bewegung seines posterioren Bereichs in anteriore Richtung unter stetiger Expansion des Myokardiums die nunmehr erkennbaren Herzkammern (Kelly et al., 1999). Die Etablierung der regionalen Identität innerhalb des Herzschlauchs wird durch die Zellen der oben genannten Herzfelder bewerkstelligt, deren Definition und Unterscheidung kontrovers diskutiert wird (Buckingham et al., 2005). Das primäre Herzfeld (PHF=Primary Heart Field) definiert so die Vorläuferpopulation des Einfluß-Trakts, während die Zellen des Ausfluß-Trakts von der Population des anterioren Herzfelds (AHF=Anterior Heart Field) abstammen. Diese Einteilung wurde aufgrund der Expression von Fgf8/Fgf10 vorgenommen. Eine weitere Einteilung kann aufgrund der Expression und Funktion von Isl1 in das erste (FHF= First Heart Field) und zweite Herzfeld (SHF=Second Heart Field) vorgenommen werden. Nach dieser Isl1-basierenden Einteilung formt das erste Herzfeld den späteren linken Ventrikel, einen Teil des rechten Ventrikels und der Atrien, die Zellen des zweiten Herzfeldes bilden den Teil des späteren rechten Ventrikels und der Atrien, sowie den gesamten Auswurftrakt (Abu-Issa and Kirby, 2007).
Im Kontext der kardialen Morphogenese werden eine Reihe von evolutionär hochkonservierten Transkriptionsfaktoren exprimiert, welche die zellspezifische Regionalisierung positiv, sowie negativ in einem komplexen Netzwerk regulieren. Einer der frühesten Marker ist der Homeobox-Transkriptionsfaktor Nkx2.5, dessen Deletion in der Maus aufgrund morphogenetischer Störungen des Herzschlauchs etwa am Tag E9.5 zu embryonaler Letalität führt. Die Deletion von Nkx2.5 führt allerdings nicht zu einem Verlust der Bildung von Kardiomyozyten, da kontraktile Herzmuskelzellen in den Nkx2.5-defizienten Mäusen vorhanden sind (Lyons et al., 1995). Ein weiterer Faktor ist GATA4, dessen Mutation eine cardia bifida hervorruft (Kuo et al., 1997; Molkentin et al., 1997) und zusammen mit Nkx2.5 die Expression weiterer herzspezifischer Faktoren,
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12 wie z.B. Mef2c induziert und reguliert. Mef2c gehört zu der Mef2-Familie von MADS-Box-Transkriptionsfaktoren und wirkt transkriptionsaktivierend auf eine Reihe kontraktiler Proteine. Die Deletion von Mef2c in der Maus führt zu Herzkammerdefekten bei dem kein rechter Ventrikel und lediglich ein einzelner hypoplastischer Ventrikel entsteht, der direkt mit einem vergrößertem Atrium fusioniert ist (Lin et al., 1997). Eine weitere wichtige Gruppe von kardioessentiellen Transkriptionsfaktoren sind die T-Box Faktoren Tbx5 und Tbx20. Tbx5 wird bereits in frühen kardialen Vorläuferzellen, sowie später in Abhängigkeit von Retinolsäure graduell entlang des Herzschlauchs exprimiert (Bruneau et al., 1999; Liberatore et al., 2000; Niederreither et al., 2001). Das Herz Tbx5-defizienter Mausembryonen ist durch schwere Hypoplasie linksventrikulärer, sowie sinoatriale Regionen gekennzeichnet (Bruneau et al., 2001). Murines Tbx20 wird ebenfalls in kardialen Vorläuferzellen und später unter anderem im gesamten Myokardium des Herzschlauchs exprimiert. Seine Mutation resultiert in einen retardierten, nicht gedrehtem Herzschlauch, in welchem jedoch kleine ventrikelartige Herzkammern erkennbar sind (Kraus et al., 2001; Singh et al., 2005; Takeuchi et al., 2005).
Des Weiteren werden die basischen Helix-Loop-Helix-Transkriptionsfaktoren eHand/Hand1 und dHand/Hand2 exprimiert, die für die weitere Entwicklung des Herzens essentiell sind. Die Expression von eHand/Hand1 ist hauptsächlich auf den linken Ventrikel beschränkt und seine Mutation führt zu schweren Störungen der linksventrikulären Differenzierung in der Maus. Konträr zu eHand wird dHand im rechten Ventrikel exprimiert und führt bei Deletion zu nur leichten Defekten (Srivastava, 1999).
1.2.
in vitro Differenzierung embryonaler Stammzellen
Die erfolgreiche Isolation embryonaler Stammzellen (ESCs) aus der inneren Zellmasse (ICM) von Blastozysten und deren Kultivierung als permanente Zelllinie Anfang der achtziger Jahre eröffnete neue Perspektiven für die Zell- und Entwicklungsbiologie, sowie Anwendungen in der experimentellen Medizin. Die pluripotenten embryonalen Stammzellen zeichnen sich durch ihre annähernd unbeschränkte Selbst-erneuerungsfähigkeit und Differenzierungskapazität aus. Ihre Rückführung in ein embryonales Umfeld durch Transfer in eine Wirts-Blastozyste, oder die Aggregation mit Embryonen im Blastomerstadium ermöglicht eine Vielzahl genetischer Manipulationen,
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13 insbesondere der „gene targeting“ Technologie, welche die Generierung sogenannter „knock-in/knock-out“-Mäuse ermöglicht.
Die embryonalen Stammzellen können mit Ausnahme trophektodermaler Zellen über die Stufen der Spezifikation und Determination zu allen somatischen Zelltypen ekto-, ento-, sowie mesodermalen Ursprungs und ebenso Keimzellen, in vivo, als auch in vitro differenzieren. Vorraussetzung für eine pluripotente Differenzierungsleistung in vitro ist die Aufrechterhaltung des undifferenzierten Stadiums der embryonalen Stammzellen, meist durch Kultivierung auf murinen embryonalen „feeder cells“ und /oder der Zugabe differenzierungs-verhindernder Faktoren wie LIF (Leukemia Inhibitory Factor) zum Nährmedium. Die Initiation der Differenzierung setzt den Entzug von LIF meist einhergehend mit der Generierung dreidimensionaler spheroider zellulärer Aggregate, sogenannter „Embryoid Bodies“ (EBs), voraus. Letzteres erfordert die Kultivierung der ES Zellen entweder in Suspensionskultur auf nicht-adhäsiven Substraten, in „hängenden Tropfen“ („hanging drop“), oder auch in niedrig-adhäsiven Substraten wie Methylzellulose. Nach vier bis acht Tagen haben sich Zellaggregate gebildet, die weitestgehend mit frühen Embryonalstadien vergleichbar sind. Sie durchlaufen einen Prozess ähnlich dem der Gastrulation in vivo, welcher in die Bildung exterioren Endoderms, Mesoderms und interioren Ektoderms resultiert und in einigen Fällen eine zystische, dottersackartige Höhle umgibt (Abb. 1.3).
Abb. 1.3 Chronologie der ES Zell Differenzie-rung innerhalb des Embryoid Body. Die
Diffe-renzierung setzt am zweiten Tag in Suspensions-kultur mit der Ausbildung des extraembryonalen primitiven Endoderms ein, aus welchem sich fol-gend viscerales und parietales Endoderm entwi-ckelt. Nach 4-6 Tagen formiert sich interior das Ektoderm, zwischen dessen tieferen Schichten und der Grenze von extraembryonalen visceralen und parietalen Endoderms sich nach etwa 7 Tagen das Mesoderm entwickelt. Nach weiteren zwei Tagen erkennt man die spontan kontrahierenden Kardiomyozyten, sowie endotheliale Zellen. (mo-difiziert nach Sauer et al., 2004)
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14 Während der frühen Differenzierung sezerniert jeder entstehende Zelltyp innerhalb des EBs sein für ihn charakteristisches Set an Wachstums- und Differenzierungsfaktoren, was eine zum Teil chaotische zelluläre Anordnung innerhalb des Aggregats zur Folge hat. Diese ist nicht mit der präzisen, koordinierten räumlichen Organisation des sich entwickelnden frühen Embryos vergleichbar. So kann aufgrund der fehlenden antero-posterioren, sowie dorso-ventralen Positionsinformation innerhalb der EBs kein Rückschluss auf die räumliche Differenzierungsleistung in vivo getroffen werden.
Die gezielte Veränderung der Nährmediumzusammensetzung und/oder die Zugabe diverser Differenzierungsagenzien ermöglicht unter Beachtung der Supplementationszeit und -menge innerhalb dieses in vitro Differenzierungs-Systems eine gerichtete Verschiebung zu Gunsten eines spezifischen Zell-, oder Gewebetyps. In den letzten Jahren wurde eine Vielzahl von Protokollen zur kontrollierten Differenzierung verschiedenster spezialisierter Zelltypen etabliert, die neben definierten Nährmedien und Seren, einzusetzenden Wachstumsfaktoren und Additiva auch die initiale Zellzahl, sowie die ES-Zelllinie und EB-Formationszeit berücksichtigen. Wie auch im Embryo ist es das Entoderm, welches sich zuerst, direkt nach dem Entzug von LIF, auf der Oberfläche des sich formierenden EBs entwickelt. Es ist durch die Expression von Genen der HNF-Familie (Hepatocyte-Nuclear-Factor) gekennzeichnet. Die Induktion mit Retinolsäure (RA) führt zu der verstärkten Ausbildung visceralen Entoderms, während die kombinatorische Stimulation mit RA und db-cAMP in der Formation parietalen Entoderms resultiert (Sauer et al., 2004).
1.2.1. Differenzierung von Kardiomyozyten aus murinen Embryonalen Stammzellen
Das Vertebratenherz ist neben dem Gehirn das erste Organ, welches sich während der Embryogenese entwickelt. Es ist aufgrund seiner geringen Größe in frühen Embryonalstadien für Untersuchungen in vivo nur schwer zugänglich. Die Möglichkeit, über die Stufe der Embryoid Body Formation vergleichsweise einfach und zahlreich Kardiomyozyten in vitro aus ES-Zellen zu gewinnen und in Kultur zu halten, erlaubt multiple pharmakologische, molekularbiologische, sowie physiologische Analysen. Dieser Ansatz trägt zum Verständnis der frühen Herzentwicklung bei und weist zugleich mit dem Ziel der zelltherapeutischen Anwendung eine große medizinische Relevanz auf. Mit der Bildung des Mesoderms zwischen dem extraembryonalen visceralen, sowie
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15 parietalen Entoderm und den tieferen Schichten des Ektoderms beginnt die kardiomyozytäre Differenzierung in dem Embryoid Body etwa ab dem siebten Tag. Dort enstehen die Kardiomyocyten zwischen einer äußeren epithelialen Schicht mit Charakteristika von visceralem Entoderm und einer basalen Schicht mesodermaler Zellen (Boheler et al., 2002). Für diesen Prozeß der Kardiogenese sind eine Reihe spezifischer Signalmoleküle verantwortlich, welche intrazellulär mit Hilfe gewebespezifische Transkriptionsfaktoren wirken und so progressiv die weitere Spezifikation der Kardiomyozyten aus den mesodermalen Stammzellen vorantreibt. Einige dieser Proteine konnten innerhalb der letzten Jahre bereits als essentiell für die kardiomyozytäre Entwicklung identifiziert werden.
Die kardioinduktive Wirkung des extraembryonalen, sowie embryonalen Entoderms ist dabei von entscheidender Bedeutung (Egea et al., 2008; Hrabchak et al., 2008). Zusätzlich nehmen physikalische Parameter, sowie das Nährstoffangebot Einfluss auf die Differenzierung. So wurde gezeigt, dass die dreidimensionale Struktur des EBs essentiell für die Induktion der Kardiomyogenese ist (Maltsev et al., 1993). Interessanterweise bilden sich jedoch innerhalb der EBs keine erkennbaren Herzstrukturen aus. Letzteres impliziert die Unabhängigkeit der Differenzierung verschiedenster Herzzelltypen von einer strukturellen Organisation. Die entstehenden Herzmuskelzellen erscheinen als spontan kontrahierende Zellgruppen, welche als heterogene Population molekular und elektrophysiologisch sowohl dem sinusnodalen, atrialen, als auch ventrikulären Zelltyp ähneln und weitestgehend die in vivo Bedingungen reflektieren, ungeachtet der fehlenden morphogenetischen Prozesse wie Herzkammer- und Klappenbildung (Maltsev et al., 1993). Zudem weist die Population differenzierter Kardiomyozyten eine Diversität in ihrem Reifegrad auf. So konnten Zellen, die denen des embryonalen Herzschlauchs ähneln, neben solchen mit Charakteristika frühem Kammermyokards identifiziert werden (Fijnvandraat et al., 2003a; Fijnvandraat et al., 2003b). Ungeachtet dessen korreliert die zeitliche Abfolge des Differenzierungsprozesses der von Stammzellen abgeleiteten Kardiomyozyten in ihrer Gesamtheit mit der in utero. Im murinen Embryonalstadium E8,5 postcoitum sind die ersten kontrahierenden Zellen sichtbar und im EB etwa am siebten Tag der Differenzierung. Ebenso weist die Ableitung der Aktionspotentiale eine dem Differenzierungsstadium entsprechende charakteristische Form auf und geht mit der Expression spezialisierter Ionenkanäle einher. Die in vitro terminal differenzierten Kardiomyozyten zeigen den in vivo Bedingungen von Säuger Kardiomyozyten vergleichbare positive, sowie negative chronotrope Reaktionen auf entsprechende
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16 Stimuli (Maltsev et al., 1994). So konnte mit Hilfe der β-Adrenorezeptor-Agonisten (-)-Isoprenalin und Clenbuterenol, dem Adenylatzyklase-Aktivator Forskolin, dem Phosphodiesterase-Inhibitor Isobutylmethylxanthin, sowie dem α1-Adrenorezeptor-Agonisten (-)Phenylephrin eine frequenzsteigernde Wirkung erzielt werden. Dagegen führte der Einfluß von Agonisten des muscarinen Cholinrezeptors und Inhibitoren des L-type voltage dependent Ca2+ Channels (VDCC) zu einer negativen Chronotropie (Maltsev et al., 1994). In frühen Stadien der Kardiomyogenese innerhalb der EBs konnte dieses nicht gezeigt werden, so dass von einer sukzedanen funktionellen Kopplung genannter Komponenten im Verlauf der Differenzierung auszugehen ist (Boheler et al., 2002).
Die beobachteten primitiven Schrittmacher-Aktionspotentiale in frühen Differenzierungstadien werden durch VDCC, sowie transiente Kaliumkanäle (Ik,t0) ausgelöst. Hinzu kommen in späteren Stadien eine Vielzahl zusätzlicher Ionenkanäle. Dazu zählen spannungsabhängige Na+-Kanäle, verzögerte einwärts, sowie auswärts gleichgerichtete K+-Kanäle, muscarine Acetylcholin-aktivierte K+-Kanäle und hyperpolarisationsgesteuerte Schrittmacher Kanäle (Maltsev et al., 1993).
1.3.
RNA Interferenz
Die in der vorliegenden Arbeit verwendete Methode zur Unterdrückung von Genaktivitäten basiert auf dem Mechanismus der RNA Interferenz (RNAi). Dieser Mechanismus bildet die Grundlage für das Verständis und die Funktionalität des Screens, sowie der erzielten Resultate und wird dementsprechend ausführlich beschrieben.
Mit der Entdeckung des Mechanismus der RNA-Interferenz (RNAi) in dem Nematoden Caenorhabditis elegans (Fire et al., 1998), wurde eines der ältesten und zugleich ubiquitärsten antiviralen Systeme der Forschung zugänglich gemacht. Schon vor der Divergenz des Pflanzen- und Tierreiches wurde mittels PTGS (posttranscriptional gene silencing) die Virusreplikation infizierter Zellen unterbunden. RNA-Interferenz (RNAi) bewirkt, durch doppelsträngige RNA (dsRNA) induziert, die posttranskriptionelle Suppression der Expression von Fremdgenen in den meisten Eukaryonten, ebenso wie die Kontrolle der Expression von Transposons und repetitiven Sequenzen (Ketting et al., 1999; Tabara et al., 1999). Eine genspezifische Wirkung der dsRNA-induzierten PTGS wurde auch in Pflanzengeweben gezeigt (Hamilton and Baulcombe, 1999), in welchen kurze, zu beiden Strängen des Gens komplementäre RNAs von 25 nt Länge
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17 nachgewiesen wurden. Der Mechanismus der RNAi konnte erstmals durch die Verwendung von embryonalen Extrakten aus Drosophila melanogaster-Embryonen in vitro reproduziert werden (Tuschl et al., 1999). Dem Extrakt zugefügte dsRNA wurde in RNA-Fragmente prozessiert, welche den intervallartigen Abbau der homologen mRNA nach je 21-23 nt bewirkte (Zamore et al., 2000). Die Analyse dieser kurzen RNA-Fragmente zeigte, dass es sich um RNA-Duplexe mit 2-3 nt 3´-Überhängen und 5´-phosphorylierten Enden handelte, die als siRNAs (short interfering RNAs) bezeichnet wurden (Elbashir et al., 2001c). Die biochemische Grundlage des Mechanismus RNAi wurde an Drosophila-Embryonen näher erforscht. Aus dsRNA-behandelten Drosophila S2-Zellen, einer Standard-Zelllinie von Drosophila, wurde ein mit siRNAs kofraktionierter Proteinkomplex isoliert, welcher als RISC (RNA induced silencing complex) bezeichnet wird und die Degradierung der mRNA in vivo bewirkte (Hammond et al., 2001). In Abb. 1.4 ist der Mechanismus der RNA-Interferenz schematisch dargestellt.
Abb. 1.4 Schema der dsRNA-vermittelten RNA-Interferenz. Die dsRNA wird durch
Dicer, einem Enzym der RNase III-Familie sequentiell in 21 nt umfassende siRNAs prozessiert. Diese Duplexe haben einen 19 bp großen Bereich, der von 2-3 nt 3´-Überhängen flankiert wird. Diese siRNAs bilden durch Assoziation mit dsRNA-bindenden Proteinen, wie z.B. Ago2 den siRNA-enthaltenden Ribo-Nukleo-Protein-Komplex (siRNP) und schließlich den RISC (RNA Induced Silencing Complex). Dieser Komplex erkennt die Ziel-mRNA durch Basenpaarung des komplementären siRNA-Stranges und führt zu dem ATP-abhängigen Schnitt der mRNA an einer Position, die gegenüber der Base liegt, welche 10 nt stromaufwärts vom 5´-Ende des siRNA-Stranges lokalisiert ist. Die durch die Endonukleaseaktivität des RISC geschnitte-ne Ziel-mRNA wird daraufhin durch andere, noch nicht identifizierte Ribonukleasen de-gradiert. Ziel-mRNA Erkennung Ziel-mRNA Degradierung Ziel-mRNA Erkennung Ziel-mRNA Degradierung
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18 Entstehung der siRNAs
Den initialen Schritt der RNAi bildet die Enstehung der siRNAs aus der dsRNA. Dieser Schritt wird durch Dicer, ein Enzym der RNase Familie katalysiert. Die RNase III-Enzyme werden aufgrund der Struktur ihrer Domänen in drei Klassen eingeteilt (Abb. 1.5). Alle Mitglieder der RNase III-Familie enthalten eine N-terminale dsRNA-bindende Domäne (dsRBD). Die erste Klasse bilden die bakteriellen RNAse III-Enzyme, welche eine RIII-Domäne (RNase III-Domäne) enthalten. Die Drosha-Nukleasefamilie enthält zwei RIII-Domänen und zwei N-terminale putative Protein-Protein-Interaktionsdomänen, eine Prolin-reiche und eine Serin-Arginin-reiche. Die dritte Klasse, die Dicer-Familie, enthält zwei RIII-Domänen, eine funktionell noch unbekannte Domäne (DUF283), ein PAZ-Motif (Piwi Argonaute, Zwille/Pinhead) und eine N-terminale Helikase-Domäne (Bernstein et al., 2001; Filippov et al., 2000). Letztere erkennt präferentiell die Enden seines Substrates, von welchen ausgehend eine Art sequentieller Abbau stattfindet und so zu Fragmenten definierter Länge von 21-23 nt führt. Es wird vermutet, dass Dicer als Homodimer agiert und die Erkennung des Substrat-Endes von der PAZ-Domäne vermittelt wird (Carmell and Hannon, 2004). Die daraus entstehenden siRNAs zeigen dementsprechend keine Sequenz-Überlappungen (Zhang et al., 2002) und weisen die für den RNase III-katalysierten Abbau typischen phosphorylierten 5´-Enden, sowie 2-3 nt 3´-Überhänge auf.
Abb. 1.5 Schematische Darstellung der RNase III-Familie.
Die RNase III-Familie umfasst drei Klassen. Alle Klassen enthalten eine C-terminale dsRNA-Bindende Do-mäne (dsRBD in türkis). Die Klasse I beinhaltet die bakteriellen RNase Enzyme, die nur eine RNase III-Domäne (RIII in blau) besitzt. Die Klasse II wird durch die Drosha-Enzyme repräsentiert. Diese besitzen zwei RIII-Domänen, die zwecks Unterscheidung als RIIIa und RIIIb benannt sind. Sie sind durch eine N-terminale Prolin-reiche Domäne (gelb) und eine Serin-Arginin-reiche Domäne (RS, rosa), welche wahr-scheinlich Motife für Protein-Proteininteraktionen darstellen, gekennzeichnet. Die Klasse III umfasst die Dicer-Enzyme, welche eine N-terminale Helikase-Domäne, eine funktionell unbekannte Domäne (DUF283), ein PAZ-Motif (Piwi-Argonaute-Zwille/Pinhead) und zwei RIII-Domänen aufweisen, wovon RIIIx als funk-tionell inaktiv vermutet wird. Die Größenverhältnisse der Proteine untereinander wurden bei der Darstellung nicht beachtet (nach Carmell und Hannon, 2004).
Klasse I Klasse I Klasse II Klasse II Klasse III Klasse III dsRBD dsRBD dsRBD
DUF283 PAZ RIIIa RIIIx
Helikase RIIIb RIIIa RIII RS Prolin-reich Klasse I Klasse I Klasse II Klasse II Klasse III Klasse III dsRBD dsRBD dsRBD
DUF283 PAZ RIIIa RIIIx
Helikase RIIIb RIIIa RIII RS Prolin-reich
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19 Erkennung und Degradierung der Ziel-mRNA
Die Erkennung der Ziel-mRNA wird durch die Dicer-prozessierten siRNAs bewerkstelligt. Diese werden in einen dsRNA-bindenden Multienzymkomplex, den siRNP (siRNA containing Ribo-Nukleo-Protein complex) inkorporiert, welcher dann den RISC formt. Es wird vermutet, dass der RISC aus einer inaktiven, doppelsträngigen siRNA-enthaltenden Form, durch Entwindung des siRNA-Duplexes in den aktiven Zustand überführt werden (Nykanen et al., 2001). Die strukturelle Symmetrie der Duplexe ermöglicht eine Entwindung von beiden Seiten. Andere Daten zeigen, dass die ATP-abhängige Entwindung des siRNA-Duplexes von dem thermodynamisch instabileren 5´-Ende ausgehend bewerkstelligt wird (Schwarz et al., 2003). Der Strang des Duplexes, von dessen 5´-Ende ausgehend die Entwindung stattfindet, wird als Untereinheit des RISC wirksam und vermittelt über Watson-Crick-Basenpaarungen zur homologen Sequenz der Ziel-mRNA deren ATP-abhängige Degradierung. Der andere Strang des siRNA-Duplexes wird abgebaut.
Die beteiligten Enzyme des RISC sind bis heute nicht vollständig identifiziert. Es konnten jedoch aus Drosophila melanogaster Schneider-Zellen einige der RISC-Komponenten isoliert werden. Dazu gehören Argonaute2 (Ago2; (Hammond et al., 2001; Liu et al., 2004)), das Vasa intronische Genprodukt (VIG; (Caudy et al., 2002)), das Drosophila Homolog des Fragile X Mentale Retardation Protein (FMRP), dFXR (Caudy et al., 2002) und die Tudor Staphylococcus Nuklease (Tudor SN; (Caudy et al., 2003)). Die Proteine der Argonaute-Familie besitzen, ebenso wie Dicer, eine PAZ-Domäne und werden als mögliche Kandidaten für die Erkennung der chemischen Struktur der RNAi-vermittelnden RNAs vermutet. So konnte gezeigt werden, dass Ago2 eine geringere Affinität für dsRNS mit glatten Enden („blunt end“), im Vergleich zu den siRNAs mit einzelsträngigen 3´-Enden aufweist (Yan et al., 2003).
Die Erkennung der Ziel-mRNA durch Basenpaarung des siRNA-Stranges des RISC und der homologen Sequenz, führt zur Spaltung der mRNA an dem Nukleotid, welches zu dem 10 nt stromaufwärts von dem 5´- Ende des siRNA-Stranges gelegenem Nukleotid komplementär ist (Elbashir et al., 2001b). Diese hydrolytische Spaltung wird von der RNA-Endonuklease-Aktivität des RISC bewerkstelligt, die Produkte mit 3´-Hydroxyl- und 5´-Phosphomonoester-Termini freisetzt. Gleichzeitig konnte die Mindestlänge der Substrat-mRNA von 15 nt bestimmt werden (Martinez and Tuschl, 2004).
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20 RNAi –Technologie und reverse Genetik
In den Anfängen der Molekularbiologie wurden Gene durch die sogenannte „Vorwärts-Genetik“ funktionell analysiert. Darunter versteht man die Identifikation eines Gens, welches einen bekannten Phänotyp hervorruft. Doch der Fortschritt der Sequenzierungstechnik und die Entschlüsselung ganzer Genome identifizierte eine Vielzahl von Genen mit unbekannter Funktion. Diese kann mit Hilfe der reversen Genetik ermittelt werden, welche durch die Technik der Genmanipulation ausgehend, den Genotyp verändert und somit die Untersuchung des Phänotyps ermöglicht. Mit der Entdeckung der RNA-Interferenz wurde der Forschung eine Technologie durch Applikation von dsRNA zugänglich gemacht, welche die posttranskriptionelle Suppression der Genexpression zur Folge hat. Die Erfolge in der Genanalyse bei C.elegans führten zu vergleichbaren Versuchen in anderen Organismen, wie zum Beispiel Pflanzen und frühen Mäuse-Embryonen (Svoboda et al., 2000; Wianny and Zernicka-Goetz, 2000). Allerdings erwies sich der Einsatz von dsRNA in Säugern als problematisch, da die Applikation von dsRNA in somatischen, nicht aber in embryonalen Zellen zu einem unspezifischen Effekt führte. Dieser wird durch Aktivierung der Typ I-Interferone (IFNs) und herbeigeführt, welche durch die RNA-abhängige Protein Kinase (PKR) die Phosphorylierung von EIF-2 und infolgedessen einen unspezifischen Translationsarrest bewirken (Gil and Esteban, 2000). Um diesen Effekte zu umgehen, wurden synthetische siRNAs appliziert, welche den endogen prozessierten Dicer-Produkten entsprachen und die spezifische Degradierung der Ziel-mRNA in verschiedenen Säuger-Zelllinien bewirkten (Elbashir et al., 2001a). Die Effizienz der posttranskriptionellen Reduktion der Ziel-mRNA konnte auf die Länge der siRNAs und auf die Länge der 3´-Überhänge, sowie deren Sequenz zurückgeführt werden. So wurde mit RNA-Duplexen von 19 bp mit 2 nt umfassenden „UU“, oder „TT“ 3´-Überhängen die besten Erfolge erzielt (Elbashir et al., 2001a; Tuschl et al., 1999). Allerdings konnte in Säuger-Zellkulturexperimenten auch die Transfektion mit siRNAs einen unspezifischen Effekt hervorrufen, welcher die Suppression von Nicht-Ziel-Genen zur Folge hatte (Bridge et al., 2003; Kim et al., 2004; Moss and Taylor, 2003; Sledz et al., 2003). Einige Effekte ließen sich jedoch auf die Präparations- sowie Applikationsmethodik zurückführen. Demnach stellt die Transfektion mit lipidbasierenden Transportsystemen eine mögliche Ursache für die Interferon-vermittelten Immunantwort dar (Heidel et al., 2004).
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21
1.3.1. Vektor-basierende Expressions-Systeme für Säugerzellen
Die Transfektion mit synthetischen siRNAs bewirkt lediglich die transiente posttranskriptionelle Suppression der Genexpression und eignet sich somit nicht für die Analyse einer Genfunktion über einen Zeitraum von mehr als zwei bis maximal vier Tagen. Gerade für entwicklungsbiologisch relevante Gene, die räumlich, sowie temporal unterschiedlich exprimiert werden, ist eine andauernde sivermittelte RNA-Interferenz
essentiell, damit umfassende funktionelle Analysen durchgeführt werden können. Zu diesem Zweck wurden Vektor-basierende siRNA-Expressionssysteme für Säugerzellen entwickelt, die einen RNA-Polymerase III-Promotor beinhalten und die dauerhafte Synthese der siRNAs bewirken. Diese siRNA-Expressionsvektoren bieten die Möglichkeit stabile transgene Organismen und Zelllinien zu generieren. Sie bilden damit eine Alternative zu der „knock-out“ Strategie. Mit Hilfe dieser Vektoren konnten zahlreiche Gene in Säuger-Zelllinien posttranskriptionell supprimiert werden (Brummelkamp et al., 2002; Lee et al., 2002; Miyagishi and Taira, 2002; Paddison et al., 2002; Paul et al., 2002; Sui et al., 2002; Yu et al., 2002). Die Verwendung RNA-Polymerase III-abhängiger Promotoren hat den Vorteil, dass die Transkripte weder eine 5´-„Kappe“ noch eine 3´-Polyadenylierung aufweisen, wie sie bei RNA-Polymerase II-Transkripten zu finden sind. Zudem hat die RNA-Polymerase III eine definierte Start- und Terminationsequenz. Die RNA-Polymerase III bewirkt normalerweise die Transkription kleiner stabiler RNAs, einschließlich der 5s-ribosomalen RNA und der Transfer-RNA und ist dementsprechend in jeder Zelle aktiv. In Säugerzellen sind etwa 20000 Moleküle RNA-Polymerase III enthalten, wobei die Konzentration, wie die der anderen RNA-Polymerasen der Zellwachstumsgeschwindigkeit entsprechend individuell reguliert wird.
Der in dieser Arbeit verwendete lentivirale Expressionsvektor enthält einen humanen H1-Promotor. Dieser H1-Promotor wird von der RNA-Polymerase III erkannt, welche einen definierten Transkriptionsstart nach drei Cytidinen hat. Die Terminationssequenz der RNA-Polymerase III umfasst eine Folge von vier bis fünf Thymidinen, welche zu dem Abbruch der Transkription nach dem zweiten Uridin am 3´-Ende des Transkripts führt. Diesem Promotor wird ein „Insert“ unterstellt, dessen Transkript nach endogener Prozessierung die funktionelle siRNA bildet und somit die nachfolgende Struktur aufzuweisen hat (Abb. 1.6). Das Oligonukleotid muss die Startsequenz der Transkription
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22 für die RNA-Polymerase III enthalten, direkt gefolgt von einer 19 nt umfassenden Sequenz, die der Zielsequenz des Gens entspricht („sense“-Sequenz). Diese wird durch eine 9 nt lange Sequenz, welche nach Transkription die „Haarnadel“ bildet („spacer“-Sequenz) von der 19 nt umfassenden revers komplementären Zielsequenz („antisense“-Sequenz) separiert. Schließlich muß die Terminationssequenz von fünf aufeinanderfolgenden Thymidinen für die RNA-Polymerase III enthalten sein.
Das Transkript des „si-Inserts“ bildet eine Sekundärstruktur, welche aufgrund ihrer Form als Haarnadelstruktur bezeichnet wird. Durch die Endonuklease-Aktivität von Dicer wird die Haarnadel („hairpin“) wahrscheinlich an der in Abb. 1.6 durch den schwarzen Pfeil markierten Sequenz gespalten, so dass die 21 nt langen, als siRNAs bezeichneten RNA-Duplexe entstehen. Diese sind durch einen 19 bp langen doppelsträngigen Bereich mit flankierenden 2 nt umfassenden 3´-„UU“- Überhängen gekennzeichnet und entsprechen somit der Form synthetischer siRNAs.
Die Funktionalität der siRNAs hängt zudem von der Zielregion-, sowie der Zielsequenz auf der mRNA ab (Brummelkamp et al., 2002). Die Zielregion sollte 100 bp nach Transkriptionsstart lokalisiert sein, 3´-wärts von „AA“ und 5´-wärts von „TT“ flankiert werden, sowie einen GC-Gehalt von 30 %-60 % aufweisen. Des Weiteren darf die Zielsequenz keine aufeinanderfolgenden Thymidine enthalten, um eine vorzeitige Transkriptionstermination zu vermeiden.
5´-CCC(19nt sense)TTCAAGAGA (19nt antisense) TTTTT-3´
9nt „spacer“ Transkriptions-Termination Transkriptions-Start Transkription 5´-(N1…………..N19) 3´-UU(N1..…………N19) UU C A G A A G A shRNA Haarnadel wird prozessiert 5´-(N1…………..N19)UU-3´ 3´-UU(N1..…………N19)- 5´ siRNA
5´-CCC(19nt sense)TTCAAGAGA (19nt antisense) TTTTT-3´
9nt „spacer“ Transkriptions-Termination Transkriptions-Start Transkription 5´-(N1…………..N19) 3´-UU(N1..…………N19) UU C A G A A G A shRNA Transkription 5´-(N1…………..N19) 3´-UU(N1..…………N19) UU C A G A A G A shRNA 5´-(N1…………..N19) 3´-UU(N1..…………N19) UU C A G A A G A 5´-(N1…………..N19) 3´-UU(N1..…………N19) UU C A G A A G A UU C A G A A G A shRNA Haarnadel wird prozessiert 5´-(N1…………..N19)UU-3´ 3´-UU(N1..…………N19)- 5´ siRNA
Abb. 1.6 Schematische Darstellung der endogenen Entstehung von siRNAs aus dem Transkript des Oligonukleotids.
Am 5´-Ende des Oligonukleotids befindet sich die Transkriptionsstartsequenz von „CCC“ für die RNA-Polymerase III. Es folgt eine 19 nt umfassende Sequenz, welche der Zielsequenz auf der mRNA entspricht. Diese wird von einer 9 nt langen „spacer“-Sequenz von ihrem 19 nt reversen Komplement separiert. Am 3´-Ende befindet sich die Terminations-Sequenz von fünf Thymidinen in Folge. Das Transkript dieses Oligonukleotids bildet eine haarnadelartige Sekundärstruktur, welche als „shRNA“ bezeichnet wird („short hairpin RNA“). Die endonukleäre Spaltung der „spacer“-Sequenz an den mit schwarzen Pfeilen markierten Positionen führt zu der finalen Form der siRNAs. Diese sind gekennzeichnet durch einen 19 bp umfassenden Bereich, welcher von „UU“ 3´-Überhängen flankiert wird
Einleitung
23 Entscheidend für die Wirksamkeit der siRNA-vermittelten RNA-Interferenz ist die Bildung des RISC ( RNA Induced Silencing Complex), welcher lediglich einen der beiden Stränge des siRNA-Duplexes enthält, die Erkennung der Zielsequenz vermittelt und letztendlich zur Degradierung der mRNA führt. Der verbleibende, nicht in den RISC integrierte Strang des siRNA-Duplexes wird degradiert. Dieser Prozeß setzt voraus, dass der siRNA-Strang in dem RISC komplementär zu der Zielsequenz der mRNA, dem „antisense“-Strang ist. Aufgrund dieser unterschiedlichen Wirksamkeit der beiden siRNA-Stränge werden diese als funktionell asymmetrisch bezeichnet. Die Integration eines siRNA-Stranges in den RISC setzt die Entwindung des siRNA-Duplexes voraus und kann aufgrund der strukturellen Symmetrie von beiden Seiten geschehen. Es wurde jedoch gezeigt, dass die Seite, von welcher die Entwindung initial katalysiert wird, abhängig von der Art der Basenpaarung am 5´-Ende der siRNA-Stränge ist. Begünstigt wird die thermodynamisch energieärmere Basenpaarung (Schwarz et al., 2003), so dass die A/T- Paarung der stabileren G/C-Paarung und schwachen Fehlpaarungen („mismatch“-Paarungen) vorgezogen wird. Der Strang, welcher an seinem 5´-Ende die schwächere Bindung zu seinem Komlement aufweist, wird in den RISC inkorporiert. Somit nehmen die 5´-Endsequenzen des siRNA-Duplexes entscheidenden Einfluß auf die selektive Integration des „sense“-, b.z.w. „antisense“-Stranges und infolgedessen auch auf die Wirksamkeit des RISC.
1.3.2. siRNA Bibliotheken
Mit Entschlüsselung des murinen und humanen Genoms eröffnete sich die Möglichkeit der Durchführung funktioneller Studien auf genomweiter Ebene, so auch durch die Generierung von genomweiten siRNA-Bibliotheken. Der durch den Mechanismus der RNAi vermittelte Funktionsverlust durch posttranskriptionelle Gensuppression bietet eine effiziente Basis für funktionelle Untersuchungen im großen Maßstab. Die für Langzeitstudien ungeeignete transiente Applikation von siRNAs erforderte die Generierung Vektor-basierender sh/siRNA-Expressionsysteme, um eine stabile genspezifische Unterdrückung zu gewährleisten. Um die Transduktion einer großen Anzahl verschiedenster teilungsaktiver und -inaktiver Zelltypen, sowie Stammzellen und Zygoten zu ermöglichen, wurden lentiviral-basierende Expressionssysteme, auch für sh/siRNAs, als Transfektionsvektoren entwickelt (Abbas-Terki et al., 2002; Adjali et al., 2009; Dull et al., 1998; Frka et al., 2009; Pfeifer et al., 2002; VandenDriessche et al.,