Die genomweite siRNA-vermittelte Gensuppression im

„batch-Verfahren“ eignet sich zur Identifikation von Genen, welche die Herzentwicklung beeinflussen

4.2.1. Die siRNA-vermittelte Suppression von GATA4 verhindert die kardiomyozytäre Differenzierung in vitro, aber nicht in vivo

Eines der vergleichsweise früh exprimierten Gene der Kardiogenese ist GATA4, welches zu einer sechs Mitglieder umfassenden GATA Familie von Zink-Finger

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80 Transkriptionsfaktoren gehört. Das Protein stimmt in der Aminosäuresequenz und in überlappenden Expressionsdomänen zusammen mit GATA5 und GATA6 überein, so dass eine Subfamilie erkennbar wird. GATA4 enthält zwei Zinkfinger DNA-bindende Domänen des Typs IV und bindet das Konsensusmotif A/T-G-A-T-A-A/G, welches Namensgeber dieser Genfamilie ist und in einer Vielzahl Transkriptionsregulatorischer Elemente von Promotoren kardiospezifischer Gene identifiziert wurde (Harvey und Rosenthal, 1999).

GATA4-defiziente Mauslinien sind embryonal letal im Embryonalstadium E8.5-E10.5.

Sie weisen auffällige kardiale morphogenetische Störung auf, welche in einer cardia bifida resultieren. Dennoch ist die initiale kardiomyozytäre Differenzierung nicht betroffen, welches durch die Anwesenheit primitiver Kardiomyozyten in den homozygoten GATA4-defizienten Mäusen gezeigt wurde. Die unter progressiver Differenzierung folgende Morphogenese des Herzens ist jedoch unmittelbar von der Aktivität von GATA4 abhängig (Kuo et al., 1997; Molkentin et al., 1997). Konträr zu dieser Beobachtung in vivo, konnte jedoch durch RNAi vermittelte Suppression von GATA4 die Differenzierung von Kardiomyozyten aus P19 embryonalen Karzinomzellen verhindert werden (Grepin et al., 1995). Dieses Ergebnis zeigt, dass die Ausschaltung, sowie der „knock down“ eines Gens in vitro nicht zwangsläufig den in vivo erzielten Phänotyp reproduziert, aber dennoch die Relevanz des Gens für die Herzentwicklung reflektiert.

Zwecks interner funktioneller Kontrolle des Testablaufs durch Generierung einer mit der kardiomyozytären Differenzierung interferierenden siRNA, wurden drei gegen GATA4 gerichtete shRNA-kodierende Lentiviren generiert (Abb. 3.7) und auf ihre Effizienz, sowie kardioinhibitorische Wirkung getestet. Eine der drei siRNAs konnte die fortschreitende Differenzierung , nicht aber die Differenzierungsinitiation effektiv verhindern, so dass mit Beginn der Selektion zwar kontrahierende Zellen vorhanden waren, diese jedoch mit zunehmender Selektionsdauer einem massiven Zellsterben unterlagen. Die in der RT-PCR (Abb. 3.8) ermittelten Signalintensitäten der Banden zeigt eine deutliche Reduktion des GATA4-Transkriptes im Vergleich zu der Kontrollpopulation nach Abgleich der cDNA anhand der HPRT-Expression. Durch eine moderate Supression von GATA4 durch si3 konnte hier ein verzögertes Auftreten spontan kontrahierender Zellen, sowie eie geringere Größe der CBs beobachtet werden.

Die Ergebnisse sind mit den zuvor beschriebenen Resultaten anderer Arbeitsgruppen kompatibel, da die initiale Differenzierung nicht gestört zu sein scheint (Kuo et al., 1997;

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81 Molkentin et al., 1997) die Beibehaltung der Differenzierung jedoch stark gestört ist, was schließlich zum Zelltod führt, wie es Grepin et al. 1995 beschrieben hat. Demzufolge konnte die Unterdrückung von GATA4 mit „si1“ für die funktionelle Kontrolle des Testablaufs genutzt werden.

4.2.2. Die Komplexität der lentiviralen sh/siRNA-Bibliothek bleibt auf zellulärer Ebene erhalten

Die in Plasmidform kommerziell erworbene genomweite lentiviral basierende siRNA-Bibliothek musste zunächst amplifiziert werden, um eine ausreichende Plasmidmenge für die Generierung der lentiviralen Partikel zu erhalten. Dabei wurde unter Beachtung der Plasmidgröße und der Komplexität der Bibliothek, wie unter Material und Methoden beschrieben, eine annähernd zehnfache Vervielfältigung des Ausgangsproduktes erzielt.

Die Qualitätskontrolle der amplifizierten Bibliothek mit Hilfe der Affymetrix Gene Chip-Analyse zeigte eine Repräsentanz der siRNAs mit einer Anzahl von 39897 entsprechenden Zielgenen. Allerdings kann hier keine quantitative Aussage über die relative Menge der einzelnen siRNAs getroffen werden, da die bioinformatische Verarbeitung der Hybridisierungssignale eine Klassifikation der Signalintensitäten, unter Beachtung des gesetzten Schwellenwertes, lediglich in „Anwesend“ (P=present) und

„Abwesend“(A=absent) zulässt was in Abschnitt 4.3.1 ausführlicher diskutiert wird.

Die Qualität der Bibliothek bezüglich ihres Umfangs repräsentierter siRNAs ist entscheidend für die genomweite Abdeckung, aber nicht essentiell für die Qualität der Ergebnisse des Screeningsystems. Somit ist der hier definierte Umfang der Bibliothek lediglich als kalkulierte Limitation zu betrachten, welcher zusätzlich durch die Effizienz der biologisch nicht validierten siRNAs beeinflusst wird.

Des weiteren wurde bei der Generierung der Lentiviren die Menge der eingesetzten Plasmidbibliothek, die Kapazität der Verpackungszelllinie HEK293T, sowie die Menge des für die Infektion der definierten Anzahl an Zielzellen benötigten Virus mit entsprechend ausreichendem Titer berücksichtigt, um eine möglichst geringe Qualitätsminderung auf der Ebene der Zielzellen über die gesamte Dauer der Differenzierung zu haben. Durch die Kalkulation oben genannter Parameter wurde eine größtmögliche Standardisierung angestrebt, um eine gleichermaßen größtmögliche Konsistenz und interne Stabilität der in drei unabhängig voneinander durchgeführten Versuchsabläufen generierten Daten zu gewährleisten. Die Anzahl identifizierter siRNAs, beziehungsweise deren Zielgenen beträgt auf ES-Zellebene in der Population

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„ESCs“ (Abb. 3.12A) 39670 und zeigt damit eine annähernd vollständige Übereinstimmung mit der Plasmidbank. Somit wurde auf Ebene der Zielzellen die Komplexität aufrechterhalten.

Trotz der erreichten Optimierung des Systems gilt es jedoch einige Einschränkungen anzuführen. Die Anzahl der mit den individuellen Viruspartikeln infizierten Zellen ist unterschiedlich und aufgrund der Signalverarbeitung nicht relativ quantifizierbar. Somit variiert die für den Screen verwendete Zahl der für die jeweiligen siRNAs exprimierenden Zellen und kann somit nicht jedes Zielgen gleich repräsentieren.

4.2.3. Das Stadium der Testpopulationen definiert das entwicklungsbiologische Zeitfenster

Der Aufbau des Versuches basiert auf dem Prinzip des „negativen Nachweises“, da die kardiogenetisch essentielle Genpopulation durch die Abwesenheit entsprechender siRNAs in der finalen Zellpopulation bestimmt wird. Der Vorteil dieses Ansatzes liegt in der Möglichkeit, die gesamte Population kardiogenetisch essentieller Gene im „batch-Verfahren“, also gebündelt zu identifizieren und ist somit unter Berücksichtigung der Komplexität der Bibliothek vergleichweise einfach verglichen mit einer klonalen Analyse. Allerdings ist in diesem Versuchsaufbau die individuelle Beurteilung der siRNA-vermittelten phänotypischen Veränderungen nicht möglich. So kann weder der Zeitpunkt der eintretenden Veränderung, noch deren Art analysiert werden. Letzterer Aspekt beinhaltet neben der kardiogenetischen Inhibition auch die Generierung eines kardioinduktiven Phänotyps, welcher durch Suppression eines kardiogen repressorisch wirksamen Gens hervorgerufen wird. Zudem sind Veränderungen elektrophysiologischer und morphologischer Parameter im „batch-Verfahren“ nicht einfach detektierbar.

Dennoch stellt der „negative“ Ansatz im „batch-Verfahren“ unter Berücksichtigung zeitlicher und wirtschaftlicher Aspekte die optimale Strategie mit dem Ziel der Identifikation kardiogenetisch essentieller Faktoren dar.

Der Versuchsansatz bedarf einer stabilen Referenzpopulation (EB), sowie Vergleichspopulation (CB), um die Wahrscheinlichkeit eines „falsch positiv“ bewerteten Kandidatengens auszuschließen. Zu diesem Zweck mußte die Komplexität der Bibliothek über die gesamte Dauer der Differenzierung, mit Ausnahme der gewünschten Limitation kardiogen inhibitorisch wirkender siRNAs, statistisch aufrechterhalten werden. Dieses wurde durch (1) den Einsatz eines vielfach größeren Umfangs der

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83 Zellpopulationen (siehe Material und Methoden), sowie (2) die Durchführung von drei unabhängigen Versuchen gewährleistet.

Die Wahl des Zeitpunktes der Probenentnahme der Referenz- und Vergleichspopulationen war von entscheidender Bedeutung für die Eingrenzung des relevanten entwicklungsbiologischen Zeitfensters. Die unmittelbar nach erfolgter Infektion entnommene Population „OS“ diente zum Einen der Beurteilung der Ausgangskomplexität der Bibliothek auf Zielzellebene, sowie in Verbindung mit der Population „MS“ als Vergleichspopulation und Basis erster Instanz. Die „OS-Population“ ermöglichte zusätzlich, nach Abgleich mit der durch die positive Selektion infizierter Zellen vier Tage „älteren“ Population „MS“ die Identifikation derjenigen Gene, welche für die Viabilität und Proliferationsfähigkeit der embryonalen Stammzellen notwendig sind. Als Referenzpopulation und damit Basis zweiter Instanz wurden die neun Tage in Suspension differenzierten „reifen“ EBs verwendet, die Vergleichspopulation bildeten die positiv selektionierten und „final“ differenzierten CBs, so dass ein betrachtetes Zeitfenster von neuntägiger in vitro Differenzierung zugrunde gelegt wurde. Dieses entwicklungsbiologische Fenster repräsentiert annäherungsweise die Zeit von der abgeschlossenen Gastrulation und progressiver Spezifikation der verschiedenen Zelltypen, beziehungsweise deren Vorläufern und einem Intermediat primitiver embryonaler, sowie terminal differenzierter perinataler Kardiomyozyten.

Ein weiterer kritischer Faktor für die Identifikation der in den Testzellpopulationen vorhandenen siRNA-Zielsequenzen, stellte deren Amplifikation und Biotinylierung mit Hilfe der Nested – PCR dar. Dabei wurde durch eine geringe Zykluszahl unter Einsatz einer großen Menge cDNA sicher gestellt, dass nur geringe amplifikationsbedingte Veränderungen eintraten. Die Qualität des nach λ-Exonuklease-behandlung erhaltenen einzelsträngigen Produktes wurde mittels Gelelektrophorese und durch Einsatz des Bioanalyzers gewährleistet.

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4.3. Identifikation von Kandidatengenen durch einen