E. coli Electromax DH10B (Invitrogen # 18290-015)
3. Ergebnisse
3.5. Isolation und Identifikation angereicherter Knotenpunkte durch Annotationsverknüpfung nach GO (Gene Ontology)
Für die Erstellung eines funktionellen Profils der kardiomyozytären Differenzierung wurde einen Klassifikation der identifizierten Gene anhand ihrer Einordnung nach GO (Gene Ontology) Annotationen vorgenommen. Diese ordnet die Genprodukte dem entsprechenden biologischen Prozess, der zellulären Komponente, sowie ihrer molekularen Funktion Spezies-unabhängig zu. Diese drei Hauptontologien gliedern sich in eine Vielzahl verzweigter Subontologien, welche die Identität des betrachteten Genproduktes den verfügbaren Informationen entsprechend zunehmend spezifizieren.
Zudem sind die drei „Hauptäste“ untereinander verknüpft.
Für die Klassifizierung wurde die Population ∆K[(ESCs(2/3) ∩ EB(2/3)) ∩ CB(2/3)]
zugrunde gelegt, welche eine Anzahl von 3482 Genen umfasst und von denen 2739 mit entsprechenden Annotationen verknüpft wurden. Mit Hilfe des Programmes „GO Tree plus“ wurde eine Einordnung der Gene vorgenommen. Dieses Programm ermöglicht die selektive Darstellung der „getroffenen“ Knoten, sowie die Identität der ihnen zugeordneten Gene unter Beachtung der Ebenenhierachie. Dabei ist zu berücksichtigen, dass ein Gen multiplen Knoten zugeordnet werden kann. Demnach sind die im Folgenden angegebenen Zahlen unabhängig von der Gesamtzahl zu betrachten. Zudem können die Gene untergeordneter Knotenpunkte als Gesamtheit in der ihnen übergeordneten fokussierten Ebene vereinigt werden. Zwecks Übersicht wurde eine Klassifikation im Kontext des Hauptknotens „Biologischer Prozess“ (GO:0008150) vorgenommen. Die in dieser Hauptontologie stark angereicherten untergeordneten
Ergebnisse
71 Ebenen sind unter Berücksichtigung ihrer quantitativen Repräsentanz in Abb. 3.15 gezeigt.
Abb. 3.15 Angereicherte GO Annotations Knoten der Ebene „Biologischer Prozess“
Die angereicherten Knotenpunkte wurden direkt der Ebene „biologischer Prozess“ zugeordnet. Der größte Anteil der annotierten Gene findet sich in den Subebenen „Zellulärer Prozess“ und „Metabolischer Prozess“, des weiteren finden sich 604 Gene, welche mit „Biologischer Regulation“ assoziiert werden. 455 Gene sind an Entwicklungsprozessen beteiligt, 409 fungieren unter dem Aspekt der „Lokalisation“. Eine deutliche Anreicherung findet sich zudem bei Genen, welche im Kontext einer „Reaktion auf einen Stimulus“ agieren.
Zudem konnten die identifizierten Gene mit „Wachstum“, „Biologischer Adhäsion“ und „Prozessen des Immunsystems“ assoziiert werden.
Aufgrund der fehlenden Einflussnahme anderer mittel- und unmittelbar angrenzender Gewebe und Zelltypen während der in vitro Differenzierung der CBs , werden im Folgenden die Subebenen des Knotenpunktes „Zellulärer Prozess“ in den Vordergrund gestellt.
Für eine detailliertere Darstellung und Gruppierung der Gene wurden die angereicherten Knotenpunkte unter der Annotationsebene „Zellulärer Prozess“ (GO:0009987) fokussiert (Abb.3.16), wobei hier die Unterebene „Zellulärer Metabolischer Prozess“
(GO:0044237) vernachlässigt wurde. Hier wird deutlich, dass die getroffenen Knoten dieser Subebene weitestgehend mit denen der Hauptebene übereinstimmen und die Ontologien „Entwicklung“, “Regulation“, „Wachstum“, Lokalisation“/“Motilität“, sowie
„Adhäsion“ die zentralen Bereiche dieser Klassifikation repräsentieren. Von einer detaillierten Darstellung aller identifizierten Gengruppen der aufgeführten Ontologien wird im Rahmen dieser Arbeit aus Übersichts- und aus Platzgründen abgesehen.
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72 Mit einer Anzahl von 344 zugeordneten Genen stellt der Knotenpunkt
„Zellkommunikation“ (GO:0007154) eine der größten und interessantesten Gruppen im Kontext der kardiomyozytären Differenzierung dar.
Abb. 3.16 Angereicherte Knoten unterhalb der Ebene „Zellulärer Prozess“
Die dem „Zellulären Prozess“ untergeordneten Gene zeigen eine deutliche Anreicherung in den Bereichen
„Zellkommunikation“, „Zellentwicklung“, „Zellzyklus“, „Zelladhäsion“, „Zellproliferation“ und
„Zellmotilität“. Den größten Anteil mit 344 Genen nimmt hierbei der Bereich „Zellkommunikation“ ein. In dieser Darstellung wurde der Anteil „Zellulärer Metabolischer Prozess“ vernachlässigt.
3.5.1.1. Verschiedene Komponenten der Zellkommunikation wurden in dem siRNA-Screen angereichert
Im Rahmen der zellulären Differenzierung stellt die Zellkommunikation eine unerlässliche und wichtige Komponente dar, welche unter Beachtung zeitlicher und räumlicher Parameter das geforderte Schicksal der Zelle individuell steuert und beeinflusst. Dementsprechend wurde dieser Bereich detaillierter betrachtet.
Der Knoten „Zellkommunikation“ zeigte eine Anreicherung der Unterknoten
„Signaltransduktion“ (GO:0007165), „Zell-Zell-Signalgabe“ (GO:0007267), sowie
„Reaktion auf extrazellulären Stimulus“ (GO:0031668), wobei der letztgenannte in dieser Arbeit nicht berücksichtigt wird (Abb.3.16). Die der Signaltransduktion zugeordneten Gene gliedern sich der Reihenfolge ihres Anteils in
„Zelloberflächenrezeptor-gebundene Signaltransduktion“, „intrazelluläre Signalgabe“, sowie die „Regulation der Signaltransduktion, auf. Um einen Überblick über die beteiligten Signalwege und Kaskaden zu erhalten, wurden die der „Regulation von Signaltransduktion“ zugeordneten Knoten isoliert und in Tab. 3.3 unter Angabe ihres prozentualen Anteils aufgelistet.
Ergebnisse
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Abb. 3.17 Angereicherte Knoten im Bereich der Zellkomunikation
Die mit dem Prozess „Zellkommunikation“ assoziierten Gene gliedern sich in die Bereiche
„Signaltransduktion“, „Zell-Zell-Signalgabe“ und „Reaktion auf einen externen Stimulus“ auf, wobei letzterer hier vernachlässigt wird. Mit einem Anteil von 301 zugeordneten Genen zeigt die Ebene der Signaltransduktion die stärkste Anreicherung und spaltet sich in „Zelloberflächenrezeptor-gebundene Signaltransduktion“ (155 Gene), „Intrazelluläre Signalgabe“ (141 Gene) und „Regulation der Signaltransduktion“ (57 Gene) auf. Eine mit 49 ebenfalls große Anzahl von Genen findet sich innerhalb der
„Zell-Zell-Signalgabe“, welche annähernd vollständig auf die Subebene „Transmission eines Nervenimpulses“ entfallen. In dieser Kategorie können die Gene der „Synaptischen Transmission“, der
„Regulation der Transmission eines Nervenimpulses“, sowie der „Generierung, Fortpflanzung und Regulation eines Aktionspotentials“ zugeordnet werden. Die Zahlen geben die Anzahl der jeweils zugeordneten Gene jeder Ontologie an.
Die konkretere Aufschlüsselung der Zell-Zell-Signalgabe (Abb. 3.17) zeigte eine annähernd vollständige Anreicherung auf der Ebene „Transmission eines Nervenimpulses“ (GO:0019226), welche sich aus den Subebenen „synaptische Transmission“, „Regulation der Transmission eines Nervenimpulses“, sowie der „ Generierung, Fortpflanzung und Regulation eines Aktionspotentials“ zusammensetzt und unter Angabe der Anzahl der zugeordneten Gene in Abb.3.17 dargestellt ist. Diese auffällige Anreicherung von Kandidatengenen im Bereich der Reizleitung zeigt die
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74 Notwendigkeit der elektrischen Signalübermittlung während der kardiomyozytären Differenzierung. In diesem Kontext stellt sich die Frage nach den funktionell identifizierten Komponenten des Ionentransports, welcher ein essentieller Bestandteil der kardiomyozytären Reizleitung und –generierung ist.
Tab. 3.3 Regulierte Signalwege und -kaskaden
Regulierte Signalwege/Kaskaden %
kleine GTPase vermittelte Signaltransduktion 47 I-kappaB-Kinase/NF-kappaB Kaskade 9
JNK Kaskade 7
MAPKKK Kaskade 5
G-Protein gebundener Rezeptor Protein Signalweg 5
TGFβ Rezeptor Signalweg 5
Smoothened Signalweg 5
BMP Signalweg 2
Activin Rezeptor Signalweg 2
PKB Signalkaskade 2
Zytokin und Chemokin vermittelter Signalweg 2
VEGF Rezeptor Signalweg 2
Kalzium vermittelte Signalgabe 2
Notch Signalweg 2
3.5.1.2. Im Screen konnten viele Komponenten der Wnt-Signalgebung identifiziert werden
Die detailliertere Betrachtung durch manuellen Abgleich der im Screen identifizierten und mit Signaltransduktion assoziierten Gene ergab eine große Anzahl von Komponenten der Wnt-Signalgebung. Dabei fanden sich sowohl Faktoren des abhängigen, kanonischen Wnt-Signalweges, als auch der beiden alternativen β-Catenin-unabhängigen Wnt-Signalwege (Wnt-Ca2+, Wnt/PCP). Die identifizierten Gene sind unter Beachtung ihrer Funktion in Tabelle 3.4 aufgelistet.
Ergebnisse
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Tab. 3.4 identifizierte Komponenten der Wnt-Signalgebung
Komponente des Signalwegs (+), keine komponente des Signalwegs (-), nicht bekannt (nd)
3.5.1.3. Ionentransporter stellen eine distinkte Gruppe der im Screen identifizierten Gene dar
Die physiologische Funktion der Herzmuskelzelle ist unmittelbar an den Transport von verschiedensten Ionen gebunden. Die Besonderheit der autonomen Reizgenerierung, dessen Weiterleitung und die damit verbundene Kontraktilität fordert eine komplexe Ausstattung an Ionenkanälen, welche wiederum ein größtmögliches Maß an Regulation erfordern. Mit Hilfe der GO Annotationen wurden die Gene, welche mit „Ionentransport“
assoziiert sind, identifiziert und in Abb. 3.18 unter Berücksichtigung der quantitativen Verhältnisse dem Transport des entsprechenden Ions zugeordnet. Auffällig ist hier die Anreicherung der Gene, welche den Transport von Kalium, Natrium und Kalzium bewerkstelligen. Ein geringerer Anteil des Kationentransports entfällt auf Eisen und Protonen, sowie schließlich Zink. Bei der mengenmäßigen Verteilung des Anionentransports stellen Phosphat- und Chlorid-Transporter den größten Anteil, gefolgt
Wnt/ β-catenin
Wnt/Ca2+ Wnt/ PCP Literatur
Rezeptoren
Fzd1 + (+) (+) (Gazit et al., 1999)
Fzd6 nd + + (Guo et al., 2004)
Liganden
Wnt5b - + nd (Freisinger et al., 2010)
Wnt8b + nd nd (Fotaki et al., 2010)
sezernierte Modulatoren
Sfrp4 + nd + (Muley et al., 2010)
intrazelluläre Signalmoleküle
Dvl1 + - +
zur Übersicht:
(James et al., 2008)
GSK3β + - -
IP3 - + -
PKC - + -
Gα,β,γ - + -
JNK - - +
CAMKII - + -
Ergebnisse
76 von Sulfat-Transportern. Diese Verteilung spiegelt weitestgehend die physiologischen Anforderungen an die Herzmuskelzelle wider.
Abb. 3.18 Verteilung der mit „Ionentransport“ assoziierten Gene nach Art des Ions
Die Verteilung der im screen funktionell identifizierten Gene können einem transportierten Ion zugeornet werden. Die Anionen sind in blauen, die Kationen in gelben Farbabstufungen dargestellt. Der Transport von Kationen bildet mit annähernd 75% den größten Anteil und wird hauptsächlich von Kalium, Natrium und Kalzium gestellt. Ein geringerer Anteil entfällt auf den Eisen- und Protonentransport, mit nur einem assoziierten Gen ist der Zinktransport represäntiert. Bei dem Transport von Anionen stellt Phosphat mit 13, gefolgt von Chlorid mit 8 und Sulfat mit 3 zugeordneten Genen den größten Anteil.
Diskussion
77