Migration und Funktion
autoaggressiver T-Zellen während der Prodromalphase der Experimentellen
Autoimmunenzephalomyelitis
Kristina Streyl
Aus der
Abteilung für Neuroimmunologie Max-Planck-Institut für Neurobiologie, München
und der
Arbeitsgruppe Immunologie Tierärztliche Hochschule Hannover
______________________________________________________
Migration und Funktion autoaggressiver T-Zellen während der Prodromalphase der Experimentellen
Autoimmunenzephalomyelitis
THESE
zur Erlangung des Grades eines DOCTOR OF PHILOSOPHY (PhD) durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von Kristina Streyl, geb. Rune
aus Warendorf
Hannover 2010
Supervisoren: Prof. Dr. A. Flügel Prof. Dr. W.Leibold
Betreuungsgruppe: Prof. Dr. A. Flügel Prof. Dr. W. Leibold Prof. Dr. A. Tipold Prof. Dr. S. von Hörsten
1. Gutachten: Prof. Dr. A. Flügel, Institut für Multiple Sklerose Forschung, Universität Göttingen Prof. Dr. W. Leibold, AG Immunologie, TiHo Hannover
Prof. Dr. A. Tipold, Kleintierklinik, TiHo Hannover
Prof. Dr. S. von Hörsten, Franz-Penzoldt- Zentrum, Universität Erlangen
2. Gutachten: Prof. Dr. R. Gold, Neurologische Klinik, Ruhr- Universität Bochum
Verteidigung der These am 12.04.2010
Für Dominik
„Der Kopf ist rund,
damit das Denken die Richtung ändern kann.“
Francis Picabia
ABKÜRZUNGEN 7
1 EINLEITUNG 11
1.1 T-Zell Immunologie 11
1.1.1 Einleitung 11
1.1.2 T-Zell Rezeptor und MHC Komplex 12 1.1.3 Antigenpräsentation und Effektorphase 13
1.1.4 Toleranz und Autoimmunität 14
1.2 Multiple Sklerose 16
1.2.1 Epidemiologie 16
1.2.2 Mögliche Ursachen 17
1.2.3 Klinik 18
1.2.4 Pathogenese 19
1.2.5 Therapie 20
1.3 Experimentelle Autoimmune Enzephalomyelitis 21
1.3.1 Einleitung 21
1.3.2 Autoantigene 21
1.3.3 EAE in der Lewis Ratte 22
1.3.3.1 Induktionsarten 22
1.3.3.2 Die Prodromalphase 23
2 MATERIAL UND METHODEN 26
2.1 Material 26
2.1.1 Tiere 26
2.1.2 Medien 26
2.1.3 Antikörper 27
2.1.4 Chemikalien und Einzelsubstanzen 28
2.1.5 Verbrauchsmittel und Geräte 30
2.1.6 Computerprogramme 32
2.2 Methoden 33
2.2.1 Tierexperimentelle Arbeiten 33
2.2.1.1 Haltung und Handhabung der Tiere 33
2.2.1.2 Immunisierung 33
2.2.1.3 Adoptiver T-Zell Transfer 34
2.2.1.4 Ex vivo T-Zell Transfer 34
2.2.1.5 Klinische Überwachung und Bewertung der
EAE 34
2.2.1.6 Perfusion 35
2.2.2 Zellkultur Arbeiten 35
2.2.2.1 Primärkultur/ T-Zell Transduktion 35
2.2.2.2 Restimulation 36
2.2.2.3 Einfrieren und Auftauen der Zellen 37
2.2.2.4 Zellzählung 38
2.2.3 Immunologische Arbeiten 38
2.2.3.1 Gewebszell Suspension 38
2.2.3.2 Zellisolierung aus dem Blut mittels Optiprep
Gradient 39
2.2.3.3 Milz Erythrolyse 39
2.2.3.4 Knochenmarks Präparation 40
2.2.3.5 Zellisolierung aus dem Rückenmark mittels
Percoll Gradient 40
2.2.3.6 Durchflusszytometrische Messung und Zell-
Zählung 40
2.2.3.7 Phänotypisierung von Zellen mittels
fluoreszierender Antikörper 41
2.2.3.8 Intrazelluläre Färbung von Zytokinen 42 2.2.3.9 Zellfärbung mit Carboxyfluoreszein
succinimidyl Ester 43
2.2.4 Molekularbiologische Arbeiten 43
2.2.4.1 RNS Extraktion aus dem Rückenmark 43
2.2.4.2 cDNS Synthese 44
2.2.4.3 Quantitative Real Time PCR 45
2.2.5 Chirurgische Arbeiten 48
2.2.6 Mikroskopie 49
2.2.6.1 Konfokale Mikroskopie frischer
Gewebeschnitte 49
2.2.6.2 2-Photonenmikroskopie am lebenden Tier 49
2.2.7 Statistik 50
3 ERGEBNISSE 51
3.1 Wanderung autoaggressiver Effektor-T-Zellen 51 3.1.1 Infiltration aktivierter TMBP-GFP Zellblasten in das
ZNS. 51
3.1.2 Das Migrationsmuster der TMBP-GFP Zellblasten in der Peripherie teilt sich in zwei Phasen. 56 3.1.3 Das Wanderungsverhalten von TOVA-GFP Zellblasten
spiegelt das Verhalten der TMBP-GFP Zellblasten
wider. 61
3.1.4 TMBP-GFP Zellblasten verändern während der
peripheren T-Zell Wanderung ihren Phänotyp. 63
3.2 Präklinisches ZNS Milieu 64
3.2.1 Das ZNS Milieu wird nicht erkennbar auf die TMBP- GFP Zellblasten Infiltration vorbereitet. 64 3.3 Eigenschaften migratorischer Effektor-T-Zellen 67
3.3.1 Migratorische TMBP-GFP Zellen besitzen prinzipiell die Fähigkeit, das naive ZNS zu infiltrieren. 67 3.3.2 Migratorische TMBP-GFP Zellen infiltrieren das naive
ZNS schneller und zahlreicher als Blasten. 69 3.3.3 Das Migrationsmuster der migratorischen TMBP-GFP
Zellen in der Peripherie unterscheidet sich
wesentlich von dem der TMBP-GFP Zellblasten. 74
3.3.4 Migratorische T-Zellen weisen unabhängig von ihrer Antigenspezifität ein gleichbleibendes
Migrationsmuster auf. 76
3.3.5 Migratorische TMBP-GFP Zellen werden im ZNS
reaktiviert. 78
3.3.6 Die Reaktivierung der migratorischen TMBP-GFP
Zellen führt zu Veränderungen im ZNS Milieu. 79 3.3.7 Das enzephalitogene Potenzial der migratorischen
TMBP-GFP Zellen ist erhöht. 82
4 DISKUSSION 85
5 ZUSAMMENFASSUNG 91
6 SUMMARY 94
7 LITERATURVERZEICHNIS 97
Abkürzungen
Ag Antigen
APC Allophycocyanin
APZ Antigen-präsentierende Zelle
BHS Bluthirnschranke
CD Cluster of Differentiation
cDNS Complementary DNS (zur RNS komple-
mentäre DNS)
CFSE Carboxyfluoreszein succinimidyl Ester ct cycle threshold (Schwellenwert-Zyklus in
der Real Time PCR, an dem die Fluores- zenz erstmalig signifikant über die Hin- tergrund-Fluoreszenz ansteigt)
DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium
DNS Desoxyribonucleinsäure
DZ Dentritische Zelle
EAE Experimentelle Autoimmune
Enzephalomyelitis EH Medium Eagles Hepes Medium
FACS Fluorescence-activated cell sorting (fluo- reszenzbasierte Durchflusszytometrie)
g Gramm
GFP Grün-fluoreszierendes Protein
GPE Zellen Verpackungszelllinie GP+E86 (siehe 2.2.2.1)
HLA Humanes Leukozyten Antigen
i.v. intravenös
IFNγ Interferon γ
IL Interleukin
IS Immunsystem
LK Lymphknoten
MBP Myelinbasisches Protein
MHC Major histocompatibility complex
(Haupthistokompatibilitätskomplex)
ml Milliliter
MOG Myelin/Oligodendrozyten-Glykoprotein
MS Multiple Sklerose
ND Nicht detektiert
OVA Ovalbumin
PAA PAA Laboratories GmbH; Firma für Zell- kulturbedarf
PBS Phosphate Buffered Saline (Phosphat- gepufferte Kochsalzlösung)
PCR Polymerase chain reaction (Polymerase Ketten Reaktion)
PE Phycoerithrin
Pellet Bodensatz nach einer Zentrifugation
PFA Paraformaldehyd
PLP Proteolipid Protein
PRR Pathogen recognition receptors (Rezepto- ren für Erkennungsmuster von Pathoge- nen)
p.t. post transfer (nach Transfer)
RFP Rot-fluoreszierendes Protein
RM Rückenmark
RNS Ribonukleinsäure
RNSase Ribonukleasen
RT Raumtemperatur
Std Stunden
tEAE Adoptive transfer EAE
TGFβ Transforming Growth Faktor β (Trans- formierender Wachstumsfaktor β)
TNFα Tumor Nekrose Faktor α
TZM T-Zell-Medium
TGFP Zellen GFP exprimierende T-Zellen
TMBP-GFP Zellen MBP spezifische GFP exprimierende T- Zellen
TOVA-GFP Zellen OVA spezifische GFP exprimierende T- Zellen
TRFP Zellen RFP exprimierende T-Zellen
TZR T-Zell-Rezeptor
αβTZR αβT-Zell Antigenrezeptor-Komplex γδTZR γδT-Zell Antigenrezeptor-Komplex well Vertiefung einer Mikrotiterplatte
ZNS Zentrales Nervensystem
11
1 Einleitung
1.1 T-Zell Immunologie 1.1.1 Einleitung
Grundsätzlich wird zwischen dem angeborenen und adaptiven Im- munsystem (IS) unterschieden. Das angeborene IS ist entwicklungs- geschichtlich älter und kann sofort auf Pathogene reagieren. Seine Komponenten reagieren antigenunspezifisch und bilden bei wieder- holter Exposition mit Pathogenen kein immunologisches Gedächtnis aus. Keimbahncodierte unspezifische Rezeptoren erkennen typische Muster z.B. auf der Oberfläche von Mikroben. Diese werden darauf- hin mit Hilfe des humoralen Komplementsystems oder durch Phago- zytose beseitigt.
Phagozyten sind die wichtigsten zellulären Vertreter des angebore- nen IS und werden grob zwei großen Gruppen zugerechnet: den Granulozyten (Neutrophile, Eosinophile, Basophile, Mastzellen) und Monozyten/Makrophagen/dendritische Zellen, deren Hauptaufgaben die direkte Vernichtung von Pathogenen ist. Allerdings arbeitet das angeborene IS auch eng mit dem adaptiven IS zusammen, z.B. im Zusammenspiel zwischen dendritischen Zellen (DZs) und T-Zellen:
die DZs präsentieren den T-Zellen, die entsprechende spezifische Oberflächenrezeptoren tragen, Antigene und werden ihrerseits ange- regt, aufgenommene Pathogene zu zerstören.
Auch das entwicklungsgeschichtlich jüngere adaptive IS verfügt über zelluläre und humorale Bestandteile: den T- und B- Lymphozyten, sowie den von Plasmazellen (weiter differenzierte B- Zellen) produzierten Antikörpern. Die Lymphozyten werden aus Vorläuferzellen des Knochenmarks gebildet und zeichnen sich durch ihre Fähigkeit aus, antigenspezifisch zu reagieren und ein lang anhal- tendes Gedächtnis gegenüber individuellen Antigenen auszubilden.
12
Die Entwicklung der B-Lymphozyten wird im Knochenmark abge- schlossen, wo sie mit ihren antigenerkennenden Molekülen ausge- stattet werden: Membrangebundenen Immunglobulinen als spezifi- scher Teil des Antigenrezeptorkomplexes der B-Zellen. Diese wer- den als Antikörper sezerniert und übernehmen die humorale spezifi- sche Immunkontrolle. Anders als bei den B-Lymphozyten findet die Reifung der T-Lymphozyten im Thymus statt, wo diese zu CD4 oder CD8 positiven T-Zellen differenzieren und ihren zellgebundenen spezifischen Antigenrezeptorkomplex exprimieren.
1.1.2 T-Zell Rezeptor und MHC Komplex
T-Zellen erkennen ihr Antigen mit Hilfe des spezifischen membranständigen T-Zell-Rezeptors (TZR). Dieser setzt sich bei der Mehrheit der T-Zellen aus jeweils einer hochvariablen α- und ß- Ket- te zusammen, die über Disulfidbrücken miteinander verbunden sind.
Jeder T-Zellklon exprimiert nur eine bestimmte TZR- Kettenkombination, jedoch in vielfacher identischer Ausfertigung pro Zelle. Für die Signalgebung ins Zellinnere sorgt die Assoziation mit dem CD3 Komplex, der aus vier unterschiedlichen Signalketten besteht, und seinerseits über assoziierte ζ-Ketten Signale ins Zellin- nere sendet. Je eine α- und ß- Kette plus die vier CD3-Moleküle bil- den einen αßT-Zell Antigenrezeptor-Komplex (αßTZR) Eine Min- derheit der T-Lymphozyten exprimiert statt der α- und ß-Ketten γ- und δ-Ketten. Gemeinsam mit den CD3-Molekülen bilden sie den γδT-Zell Rezeptor (γδTZR) oder präziser, den γδT-Zell Antigenre- zeptor-Komplex.
Der αßTZR erkennt das spezifische Antigen nicht wie der B- Zellrezeptor in Form des gefalteten Proteins, sondern als Peptid.
Dieses wird T-Zellen nach intrazellulärem Verdau im Kontext mit MHC Molekülen dargeboten. Diese hochpolymorphen Glykoproteine verfügen über eine Bindungsspalte für die Peptidantigene. Es werden zwei Klassen von MHC-Molekülen un- terschieden, die jeweils mit unterschiedlichen T-Zellpopulationen
13
interagieren. MHC I Moleküle befinden sich auf fast allen Körper- zellen und präsentieren Antigene für CD8+ T-Zellen, während MHC II Moleküle hauptsächlich auf professionellen antigenpräsentieren- den Zellen (APZ), z.B. DZs, vorkommen und die Antigenpräsentati- on für CD4+ T-Zellen vermitteln.
1.1.3 Antigenpräsentation und Effektorphase
DZs sind als unreife Zellen nahezu ubiquitär im Körper verteilt. Bei Eindringen von Pathogenen werden DZs z.B. durch Rezeptoren des Komplementsystems oder Rezeptoren für Pathogenerkennungs- muster (pathogen recognition receptors: PRR), z.B. Toll ähnliche Rezeptoren (Toll like receptors TLR) angeregt, diese zu phagozytieren und über die lokalen Lymphgefäße in die drainieren- den Lymphknoten (LKs) zu wandern. Auf ihrem Weg durchlaufen die Zellen einen Reifungsprozeß, bei dem es zu einer erhöhten Ex- pression von MHC und kostimulatorischen Molekülen kommt. Eine ausreichende Kostimulation ist unerlässlich, um eine vollständige Aktivierung naiver T-Zellen zu erreichen. Reife DZs verfügen daher über eine Vielzahl an kostimulatorischen Molekülen, wie z.B. B7, LICOS und CD40L.
Naive T-Zellen, welche ständig zwischen Blutkreislauf und Lymphorganen zirkulieren treffen im LK auf die gereiften DZs und werden bei Erkennung des spezifischen Antigens in Effektorzellen umgewandelt. Die Aktivierung der naiven T-Zellen erfordert also zwei voneinander unabhängige Signale: die Erkennung des Peptid- MHC Komplexes und kostimulatorischer Signale über CD28 (B7), ICOS (LICOS) und CD40 (CD40L).
Es werden im Wesentlichen drei Untergruppen von CD4+ T-Zellen unterschieden: TH1, TH2 und TH17 Zellen. Die Differenzierung zu einer der Gruppen findet erst relativ spät in der T-Zellentwicklung statt und ist stark vom Mikromilieu abhängig, welches vor allem durch das vorhandene Zytokinmuster bestimmt wird. Durch einen
14
Überschuss an IL-12 differenzieren naive T-Zellen zu TH1 Zellen, welche primär IL-2 und IFNγ sezernieren. Liegt hauptsächlich IL-4 vor, kommt es zur Ausbildung von TH2 Zellen, die IL-4, IL-5, IL-10 und IL-13 sezernieren. TH17 Zellen werden wesentlich durch das gemeinsame Vorliegen von IL-6 und TGFβ gebildet und sezernieren IL-17A und –E, TNFα, IL-1 und IL-6 (Furuzawa-Carballeda et al.
2007). Je nach Entwicklung in eine der drei Populationen kann die Immunantwort einen sehr unterschiedlichen Verlauf nehmen, da die T-Zell Populationen antagonistisch aufeinander einwirken können (Romagnani 1997; Bettelli et al. 2006).
Durch die Erkennung eines spezifischen Antigens und der darauf folgenden Aktivierung der T-Zellen kommt es zur Proliferation die- ser einzelnen Population, der klonalen Expansion. Ein Großteil der expandierten Effektorzellen stirbt im Verlauf der Immunreaktion ab und hinterlässt nur eine kleine Population an Gedächtniszellen, die im Falle einer erneuten Infektion mit dem gleichen Erreger eine sehr schnelle Immunantwort auslösen.
1.1.4 Toleranz und Autoimmunität
Die einzelnen Ketten des αßTZRs setzen sich aus verschiedenen Gensegmenten zusammen. Diese werden während der T-Zellent- wicklung durch genomische Umlagerungen angeordnet, wodurch eine extreme Variabilität des Rezeptors entsteht (theoretische Varia- bilität > 1014). Dadurch wird sichergestellt, dass das spezifische IS auf eine nahezu unendliche Zahl von Antigenen, präziser auf erfass- bare Teilstrukturen von Antigenen (Epitope), reagieren kann. Aller- dings erfolgen die Zusammenlagerungen der αßTZR-Gensegmente zufällig, d.h. es werden auch αßTZR gebildet, die körpereigene An- tigene erkennen können. Daher bedarf es verschiedener Kontrollme- chanismen, um eine Immunantworten gegen körpereigene Strukturen zu verhindern. Diese Mechanismen lassen sich in zentrale und peri- phere Toleranz-Strategien unterteilen.
15
Ob autoaggressive T-Zellen ein körpereigenes Zielantigen überhaupt erreichen können, hängt aber auch von anatomischen Strukturen ab:
So ist beispielsweise das Zentralnervensystem (ZNS) durch die Blut- Hirn-Schranke (BHS) vor dem Eindringen von Immunkomponenten aus dem Blut teilweise geschützt.
Bereits während der Entwicklung im Thymus kommt es zu einer gezielten Abtötung von T-Zellen, die Selbst-Antigene mit hoher Avidität erkennen, was als negative Selektion bezeichnet wird (Starr et al. 2003; Palmer 2003b). Hierbei präsentieren spezialisierte DZs Selbstantigene im Kontext von MHC-Klasse II Molekülen (Heath &
Carbone 2001; Mellman & Steinman 2001). Aber auch andere Zellen spielen für die negative Selektion eine wesentliche Rolle: so werden viele Gewebsantigene, die sonst nur peripher exprimiert werden, in spezialisierten Epithelzellen des Thymus präsentiert oder von diesen auf APZs übertragen (Palmer 2003a; Gallegos & Bevan 2004). Um das T-Zell Repertoire jedoch nicht zu sehr einzuschränken, können Zellen mit einer geringen Avidität für Selbst-Antigene erhalten blei- ben (Liu et al. 1995; Morgan et al. 1998). Diese Zellen sind für Selbstantigene „blind“, da die Avidität ihres αßTZR für das spezifi- sche Antigen nicht ausreicht, um die T-Zellen zu aktivieren. Dieser Mechanismus ist jedoch durchlässig und im entsprechenden stimulatorischen Milieu kann es zum Einsetzen einer Autoimmun- antwort kommen (Ohashi et al. 1991; Oldstone et al. 1991).
Neben diesen Mechanismen der zentralen Toleranz gibt es in der Peripherie zwei wesentliche Strategien zur Vermeidung von Autoag- gressivität: die Anergie und die Unterbindung einer Immunantwort durch regulatorische T-Zellen. Wenn T-Zellen in Abwesenheit kostimulatorischer Moleküle stimuliert werden, können sie keine weitere Immunreaktion auszulösen, sondern werden inaktiv bzw.
anergisch. Aus noch ungeklärten Gründen sterben diese anergischen Zellen nicht ab, sondern bleiben erhalten. Möglicherweise ist dies für die Aufrechterhaltung der Toleranz wichtig. Eine weitere T- Zellpopulation übernimmt eine wichtige Funktion zur Aufrechterhal-
16
tung der Toleranz: die regulatorischen CD4+CD25+ T-Zellen (Sakaguchi 2000; Shevach et al. 2001). Ihre Eliminierung kann zu systemischen Autoimmunerkrankungen führen und ihnen wird eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung einer peripheren Toleranz gegenüber autoreaktiven T-Zellen, die auch im gesunden Menschen vorkommen, zugeschrieben (Ota et al. 1990; Pette et al. 1990).
Erst beim Versagen all dieser Mechanismen kann es zum Auftreten von Autoimmunerkrankungen kommen. Diese können systemisch auftreten, oder sich auf ein bestimmtes Organ beschränken, wie bei der Multiplen Sklerose, bei der ausschließlich Strukturen des ZNS angegriffen werden.
1.2 Multiple Sklerose 1.2.1 Epidemiologie
Die Multiple Sklerose (MS) wurde von Charcot 1868 erstmals als
„Encephalomyelitis disseminata“ beschrieben. Es handelt sich um eine der häufigsten neuroinflammatorischen Erkrankungen weltweit, von der ca. 2 Mio. Menschen betroffen sind. Sie betrifft mehr Frauen als Männer im Verhältnis von ca. 2:1 wobei erste Symptome meis- tens zwischen 20 und 40 Jahren auftreten (McFarlin & McFarland 1982a; McFarlin & McFarland 1982b). Die Ätiologie der MS ist noch nicht gesichert, genetische Prädisposition und Umweltfaktoren tragen allerdings deutlich zur Manifestation der Erkrankung bei. Die Erkrankung selbst ist durch höchste Heterogenität gekennzeichnet.
Das betrifft sowohl den klinischen Verlauf, die Läsionsverteilung im ZNS, das klinische Bild, die pathologischen Veränderungen der ZNS-Läsionen und das Ansprechen auf therapeutische Maßnahmen.
Daher wird neuerdings die MS als eine einheitliche Krankheitsentität in Frage gestellt und es wird postuliert dass der Erkrankung ver- schiedene pathogenetische Ursachen zugrunde liegen könnten.
17
1.2.2 Mögliche Ursachen
In zahlreichen Studien wurden genetische Faktoren untersucht, die bei der Auslösung der MS eine Rolle spielen könnten. In Zwillings- studien wurde eine erhöhtes Erkrankungsrisiko eineiiger Zwillinge im Vergleich zu Geschwisterkindern festgestellt (Mackay &
Myrianthopoulos 1966; Dyment et al. 2004). Auch unterschiedliche Genloci wurden mit einem erhöhten Erkrankungsrisiko in Verbin- dung gebracht, insbesondere der MHC- bzw. HLA-Komplex des Menschen (Hillert & Olerup 1993). Diese Zusammenhänge bieten aber keine Erklärung für ausgeprägte Unterschiede in der geografi- schen Verteilung der Krankheitshäufigkeit; z.B. ist die Prävalenz in gemäßigten Klimazonen deutlich höher als unter extremen Wetter- bedingungen. Neben einer genetischen Prädisposition scheinen somit auch Umwelteinflüsse eine Rolle zu spielen. (Ascherio & Munger 2008; Ebers 2008).
Des weiteren werden immer wieder infektiöse Ursachen diskutiert und insbesondere virale Erreger, wie Herpesviren, als Krankheitsauslöser genannt (Gilden 2005). Auch ein vermehrtes Auftreten von MS Schüben nach viralen Infektion konnte beobachtet werden (Sibley et al. 1985). Ein endgültiger Nachweis eines ur- sprünglichen Erregers steht jedoch aus und wahrscheinlicher ist, dass im Rahmen einer Entzündung autoreaktive Zellen durch starke inflammatorische Signale, wie der Ausschüttung von Zytokinen un- spezifisch aktiviert werden. Durch „Molekulare Mimikry“ könnte es zu einer Kreuzreaktion zwischen einem Erreger und einem Autoanti- gen kommen. So können autoaggressive Zellen, welche aufgrund eines niedrig affinen TZR gegen körpereigene Antigene im Thymus nicht ausselektiert wurden, durch eine Infektion indirekt aktiviert werden (Oldstone 2005). Möglicherweise gilt dies für Myelin- basisches Protein (MBP) spezifische T-Zellen, die in aktiviertem Zustand in MS Patienten nachgewiesen werden konnten und wahr- scheinlich in vivo durch Kreuzreaktivität aktiviert wurden (Burns et
18
al. 1983; Richert et al. 1983; Fujinami & Oldstone 1985; Chou et al.
1989; Martin et al. 1990; Tejada-Simon et al. 2003). Die Aktivierung autoaggressiver Zellen kann sich auch unspezifisch als „Bystander Activation“ entwickeln, welche durch allgemeine starke Entzün- dungsreaktionen ausgelöst werden könnte (Brocke et al. 1993;
Pender 2003; Waldner et al. 2004).
Auch auf hormonelle Faktoren deuten einige Daten hin, wie die Tatsache, dass mehr Frauen als Männer betroffen sind und sich deren Krankheitszustand durch besondere hormonelle Zustände wie einer Schwangerschaft bessert (Runmarker & Andersen 1995;
Vukusic & Confavreux 2006).
Heute geht man allerdings mehrheitlich davon aus, dass es sich bei der MS um eine Autoimmunerkrankung handelt, bei der unterschiedliche Autoantigene des ZNS beteiligt sein können. Neben den obengenannten Gründen fußt diese Erkenntnis auf tierexperi- mentelle Studien: 1933 konnte gezeigt werden, dass durch wieder- holte Injektion von Kaninchen ZNS Gewebe in Primaten eine auto- immune Reaktion gegen ZNS Antigen ausgelöst werden kann. Die als Experimentelle Autoimmune Enzephalomyelitis (EAE) bezeich- nete Erkrankung zeigt eine MS ähnliche Symptomatik (Rivers et al.
1933). Den endgültigen Beweis für die Rolle autoimmuner T-Zellen lieferten schließlich Ben-Nun und Wekerle, als sie zeigten, das eine EAE mit Antigen-spezifischen T-Zellen ausgelöst werden kann (Ben-Nun et al. 1981; Ben-Nun & Cohen 1982). Auch in MS Patien- ten selber können CD4+ T-Zellen aus dem ZNS isoliert werden.
1.2.3 Klinik
Klinisch werden verschiedene Verlaufsformen unterschieden: am häufigsten wird ein schubförmig-remittierender Krankheitsverlauf mit oder ohne sekundäre Progredienz beobachtet. Dieser Verlauf betrifft über 80% der Patienten. Seltener tritt ein primär- progredientes Fortschreiten der Klinik auf. Eine Minderheit der Pati- enten erlebt lediglich einen oder sehr wenige Schübe, die nicht in
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eine chronische Erkrankung übergehen (sog. „benigne“ MS). Erst- symptome der MS sind häufig Sensibilitätstörungen, Gangataxien sowie eine Schwäche der Beine und einseitige Optikusneuritis, die sich innerhalb weniger Tage entwickeln und dann stabilisieren. In- nerhalb von zwei Monaten nach dem Schub bilden sich die Sympto- me meist wieder zurück. Ist dies jedoch in den ersten 6 Monaten nicht der Fall, bleiben die Behinderungen in mehr als 95% bestehen.
Im weiteren Krankheitsverlauf bleiben immer mehr Behinderungen nach den Schüben zurück und bei der Hälfte der Patienten tritt nach ca. 10 Jahren eine sekundäre Progredienz auf, d.h. es kommt zu einer schleichenden Verschlechterung. Bei der primär progredienten MS kommt es von Anfang an zu einer stetigen Zunahme der Behinde- rungen und auch diese Form kann von Krankheitsschüben begleitet sein, deren Auswirkungen sich wieder zurückbilden. Der individuel- le Krankheitsverlauf ist schwer vorhersehbar und die Beschwerden richten sich nach der Lokalisation der Schäden, wie z.B. Sehnerven, Hirnstamm, Cerebellum oder Rückenmark.
1.2.4 Pathogenese
Beim akuten und schubförmigen Verlauf treten zuerst entzündliche, demyelinisierende Läsionen in der Weißen Substanz auf, während die Schäden beim progredienten Verlauf diffuser verteilt sind und Demyelinisierung auch die Graue Substanz betrifft (Bo et al. 2003;
Kutzelnigg et al. 2005). Die Entzündungsherde, welche hauptsäch- lich aus T-Zellen und Makrophagen bestehen, bilden sich entweder vollständig zurück oder der Zerfall der betroffenen Markscheiden führt zur Entwicklung von Narbengewebe, zur Sklerosierung. Diese stört die Erregungsweiterleitung und hinterlässt dauerhafte Behinde- rungen. Die Läsionen der Markscheiden lassen sich vier unterschied- lichen pathologischen Mustern zuordnen (Lucchinetti et al. 2000).
Auch axonale Schäden treten nach akuten Entzündungen der Mye- linscheiden bereits im frühen Krankheitsstadium auf und führen zu
20
irreversiblen neurodegenerativen Schäden (Ferguson et al. 1997;
Trapp et al. 1998; Bitsch et al. 2000; Lassmann et al. 2001).
Die Diagnose folgt international anerkannten Kriterien welche stetig weiterentwickelt werden (Polman et al. 2005). Sie stützt sich auf das klinische Erscheinungsbild sowie auf unterschiedliche Laborparame- ter. Eine besondere Bedeutung haben die Analyse der Zerebrospinal- flüssigkeit und bildgebende Verfahren mittels Magnetresonanztomo- graphie, welche multifokale Läsionen unterschiedlichen Alters zei- gen kann, die bei einer Anreicherung mit Gadolinium als aktive Lä- sion angesehen werden. Die Zerebrospinalflüssigkeit wird auf zellu- läre Veränderungen (Noseworthy et al. 2000) und das Vorliegen oligoklonaler IgG Banden untersucht, welche bei 90% der Patienten nachweisbar und prognostisch relevant sind (Kabat et al. 1947).
1.2.5 Therapie
Es gibt bislang keine heilende Therapie der MS, so dass die Behand- lung auf eine Begrenzung der entzündlichen Krankheitsaktivität und der symptomatischen Begleiterscheinungen abzielt. Krankheitsschü- be werden mit hochdosierten Kortikosteroiden behandelt, um ein möglichst rasches Abklingen der Entzündungssymptome zu errei- chen. Bei mangelndem Erfolg der Kortikosteroid Therapie kann eine Plasmapheresebehandlung zur Durchbrechung eines Schubes einge- setzt werden (Weinshenker et al. 1999; Keegan et al. 2002; Ruprecht et al. 2004). Langfristig werden immunmodulatorische und bei feh- lendem Ansprechen gegebenenfalls immunsupprimierende Medika- mente eingesetzt. Krankheitsfreie Intervalle der MS eröffnen ein mögliches therapeutisches Fenster, dessen optimale Nutzung weitere Schübe verhindern und das Fortschreiten der Erkrankung aufhalten könnte. Da bei der Initiierung der Krankheitsschübe autoaggressive T-Zellen eine maßgebliche Rolle spielen dürften, ist die Kenntnis über deren Migrations- und Reifungsprozesse nötig, um Ansätze neuer Therapiemöglichkeiten zu entwickeln.
21
1.3 Experimentelle Autoimmune Enzephalomyelitis 1.3.1 Einleitung
Die Entdeckung der EAE geht auf Versuche zurück, bei denen mit Hilfe von Kaninchen-Rückenmarksgewebe eine entzündliche Reak- tion im ZNS von Primaten ausgelöst wurde. Seitdem gelang es expe- rimentell in einer Vielzahl unterschiedlicher Tierarten, darunter Pri- maten und Nager, eine EAE auszulösen. Besonders Maus- und Rat- tenmodelle dienen der Erforschung von Pathomechanismen autoim- muner ZNS-Prozesse. Je nach Tiermodell kommt es zu unterschied- lichen Verläufen der Erkrankung und es werden jeweils unterschied- liche Teilaspekte der MS dargestellt (Gold et al. 2006). Die Tiermo- delle bieten die beste Möglichkeit, das Immunsystem in seiner Kom- plexität zu verstehen und es sind tatsächlich einige Therapieansätze der MS aus diesen Modellen hervorgegangen.
Unsere Arbeit stützt sich auf das klassische, durch MBP induzierte EAE-Modell der Lewis Ratte, bei dem MBP-reaktive T-Zellen ent- scheidend bei der Auslösung der Erkrankung beteiligt sind. EAE- Modelle unterscheiden sich sehr bezüglich ihrer Induzierbarkeit und der Krankheitsausprägung. Ein wesentlicher Vorteil der Lewis Rat- ten EAE besteht in dem zeitlich strikt vorhersehbaren Verlauf und monophasischen Krankheitsbild. Die Erkrankung kann ohne An- wendung zusätzlicher Faktoren, z.B. Pertussistoxin, induziert wer- den. Dieses Modell ist daher besonders im Hinblick auf die Erfor- schung akut auftretender (auto)entzündlichen ZNS-Prozesse rele- vant.
1.3.2 Autoantigene
Nicht nur die Tierart bzw. der eingesetzte Stamm hat einen großen Einfluss auf den Verlauf der Erkrankung, sondern auch das Autoan- tigen und der Zustand des Zielgewebes. So weisen vorgeschädigte Strukturen des ZNS eine größere Akkumulation von Entzündungs- zellen auf als gesunde Anteile und fungieren als Prädilektionsstellen
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für weitergehende Schädigung (Maehlen et al. 1989; Konno et al.
1990).
Lange Zeit wurde das MBP als einzig relevantes Autoanti- gen für die EAE angesehen. Inzwischen wurde jedoch eine Vielzahl von Myelin-Antigenen identifiziert, welche eine EAE auslösen kön- nen, z.B. das Proteolipid Protein (PLP) und das Myelin Oligodendrozyten Glykoprotein (MOG) (Waksman et al. 1954;
Linington et al. 1993). Auch Nicht-Myelin Proteine des ZNS, wie das Kalzium bindende Protein S100β, können eine EAE auslösen.
Diese unterscheidet sich wesentlich von der MBP vermittelten EAE.
Im S100β Modell kommt es zu diffusen Entzündungsherden im ge- samten ZNS, in denen CD4+ T-Zellen vorherrschen. Die Herde bil- den sich simultan im Rückenmark (RM), Gehirn, Optikusnerven und teilweise auch im peripheren Nervengewebe. Zudem entwickeln die Tiere eine starke Uveitis und manchmal auch Retinitis. Trotz der ausgeprägten entzündlichen Reaktionen zeigen die Tiere eine ver- gleichsweise milde Klinik (Wekerle et al. 1994).
1.3.3 EAE in der Lewis Ratte 1.3.3.1 Induktionsarten
Die in dieser Arbeit verwendeten Tiere waren Lewis Ratten des Haplotyps N (Charles River) und bei dem eingesetzten Antigen MBP handelt es sich um einen Hauptbestandteil der Myelinscheiden im ZNS. Je nach Induktionsart unterscheidet man zwischen einer akti- ven und einer passiven EAE. Bei der aktiven EAE wird die Erkran- kung durch die Gabe des spezifischen Antigens zusammen mit kom- plettem Freunds Adjuvans als Immunstimulans ausgelöst während bei der passiven EAE in vitro aktivierte EAE-spezifische T-Zellen transferiert werden (Paterson 1960; Ben-Nun et al. 1981; Ben-Nun &
Cohen 1982).
Ca. zehn Tage nach der Immunisierung kommt es zu Gewichtsver- lust und aufsteigenden Lähmungen. In der zehntägigen Latenzphase
23
kommt es zur Entwicklung der spezifischen T-Zellantwort, wie sie bereits im ersten Kapitel der Einleitung beschrieben wurde. Das spe- zifische Antigen wird von DZs in den drainierenden LK naiven T- Zellen präsentiert. Diejenigen T-Zellen welche das präsentierte Epitop erkennen, werden aktiviert, proliferieren und wandern über die Blutbahn zurück zum Eintrittsort des Antigens. Hierbei durch- brechen sie die BHS und lösen in der weißen Hirnsubstanz eine Ent- zündungsreaktion aus. Bis vor kurzem wurden hauptsächlich CD4+
Th1 Zellen für die Auslösung der EAE verantwortlich gemacht, doch neuen Studien zufolge spielen auch Th17 Zellen eine Rolle, deren Funktion in der Ratte aber noch nicht abschließend untersucht ist.
Neben den T-Zellen sind andere Zellarten, wie Makrophagen, von Bedeutung, wie durch Depletionsversuche nachgewiesen werden konnte (Tran et al. 1998; Martiney et al. 1998). Ungefähr zehn Tage nach Ausbruch erster Symptome kommt es zur spontanen Remission der Erkrankung. Diese wird durch Apoptose der Entündungszellen im ZNS erklärt (Pender et al. 1991; Schmied et al. 1993).
Die passive EAE, auch Transfer EAE (tEAE), wird durch intravenö- se Injektion in vitro aktivierter T-Zellen ausgelöst. Hierfür werden aus Lymphknoten immunisierter Tiere EAE-spezifische T-Zellen gewonnen und kultiviert. Die Vermehrung der Zellen in vitro erfolgt über wiederholte Stimulationen mit dem spezifischen Antigen, wel- ches ihnen mit Hilfe professioneller, aus dem Thymus gewonnener, APZs präsentiert wird. Im Laufe des Kultivierungsverfahrens erfolgt außerdem eine Zugabe von Il-2.
1.3.3.2 Die Prodromalphase
Für die passive EAE-Induktion werden in vitro vermehrte Zellen als aktive T-Zellblasten injiziert. Diese Zellen sind maximal stimuliert und produzieren große Mengen pro-inflammatorischer Zytokine.
Bemerkenswerterweise sind die T-Zellen aber nach dem Transfer nicht in der Lage, sofort in das ZNS einzudringen und eine Erkran- kung auszulösen. Stattdessen kommt es zu einer obligatorischen er-
24
krankungsfreien Latenzzeit von drei bis vier Tagen. Wodurch ist diese Latenzphase begründet? Das gesunde ZNS ist durch eine sehr stark reduzierte Immunreaktivität gekennzeichnet: 1.eine lymphati- sches Transportsystem fehlt; 2. MHC II Moleküle, 3. APZs und an- dere Immunzellen sind spärlich vorhanden und 4.die BHS verhindert den Übertritt von Zellen und immunaktiven Faktoren. Diese Gege- benheiten könnten dazu beitragen, dass zerstörerische Entzündungs- reaktionen im empfindlichen ZNS-Gewebe verhindert oder zumin- dest stark unterdrückt werden. Dieses Konzept des Immunprivilegs ist aber nicht absolut und es zeigte sich, dass insbesondere aktivierte T-Zellen durchaus in der Lage sind, in das ZNS einzudringen. Hirn- antigen-reaktiven „Pionierzellen“ wird bei der Entwicklung der auto- immunen ZNS-Entzündung eine besondere Rolle zugesprochen, da sie das Gewebe für folgende Immunzellinfiltrationen vorbereiten sollen („Priming Model“). Demzufolge dringen wenige Stunden nach Injektion der autoaggressiven T-Zellblasten einige der aktivier- ten T-Zellen als Pioniere in das ZNS ein und erkennen vor Ort ihr Antigen. Es kommt daraufhin zur Ausschüttung von Entzündungs- mediatoren, z.B. Zytokinen und Chemokinen, und dadurch zum
„Priming“ des ZNS Milieus und der BHS. Dieses angeregte Milieu ermöglicht unspezifischen Immunzellen, die nun durchlässigere BHS zu überwinden und schließlich eine Erkrankung auslösen.
Neuere Befunde zeigen demgegenüber, dass das Gros der autoag- gressiven T-Zellen während der präklinischen Latenzzeit in der Peri- pherie zirkuliert und dort eine grundlegende Veränderung des Gen- expressionsprofils erfährt. Diese „Umprogrammierung“ betrifft unter anderem Moleküle, die die Wanderungseigenschaften der T-Zellen beeinflussen (Flügel et al. 2001). Somit stellt sich die Frage, ob auto- aggressive T-Zellen erst während ihrer Wanderung in der Peripherie die Fähigkeit erlangen, in ihr Zielgewebe einzudringen.
In dieser Arbeit sollen die Wanderung und die funktionellen Eigen- schaften autoaggressiver T-Zellen während der präklinischen EAE- Phase untersucht werden. Insbesondere soll geklärt werden, welche Mechanismen und Faktoren das Eindringen der autoaggressiven T-
25
Zellen in ihr Zielgewebe steuern. Diese Studien könnten dazu die- nen, neue therapeutische Angriffspunkte bei autoimmunologischen ZNS-Prozessen zu identifizieren.
26
2 Material und Methoden
2.1 Material 2.1.1 Tiere
Bei den verwendeten Ratten handelt es sich um Lewis Ratten des Haplotyps N, welche in den Tierställen des Max-Planck-Institutes für Biochemie gezüchtet werden.
2.1.2 Medien
Medium Zusammensetzung
Auftaumedium TZM (Eigenherstellung); 10% hitze- inaktiviertes fetales Kälberserum (FKS; 56°C, 30 min)
Blockierungspuffer 1xPBS; 5% Rattenserum (Eigenher- stellung)
Eagles Hepes (EH oder Hepesmedium)
DMEM Pulver; 25 ml Hepes Lösung /l Einfriermedium 50% hitzeinaktiviertes Pferdeserum
(56°C, 30 min); 40% TZM; 10%
DMSO
Lysispuffer 0,15M NH4Cl; 1mM KHCO3; 0,1mM Na2 EDTA ; pH 7,2
Phosphat gepufferte Koch-salzlösung (PBS, 10x)
8,10 mM Na2HPO4; 1,47 mM NaH2PO4; 137 mM NaCl; 2,68 mM KCl; pH7,2
Restimulierungsmedium TZM (Eigenherstellung);
1%Rattenserum (Eigenherstellung) T-Zell Medium (TZM) DMEM; 10 ml L-Glutamin; 10 ml
Penicillin-Streptomycin; 10 ml Aspa- ragin; 10 ml Nicht-essentielle Amino- säuren; 10 ml Natriumchlorid;
27
4 µl 2-Mercaptoethanol pro Liter T-Zell-
Wachstumsmedium
TZM (Eigenherstellung); 10% hitze- inaktiviertes Pferdeserum (56°C, 30 min); 10% Concanavalin A (Con A) Überstand (Eigenherstellung)
2.1.3 Antikörper Spezifi-
tät
Gekop- pelt
Klon Spe- zies
Hersteller / Katalog- nummer
CD134 -- OX40 Maus AbD Serotec / MCA730XZ CD25 -- OX39 Maus AbD Serotec /
MCA273R CD4 -- W3/25 Maus AbD Serotec /
MCA55R IFNγ -- DB-1 Maus BD Pharmingen /
559650
IgG1 κ -- MOPC
31 C
Maus Sigma / M1398 IgG1 κ PE R3-34 Ratte BD Pharmingen /
554685
IL17 PE TC11-
18H10
Ratte BD Pharmingen / 559502
IgG (H+L)
APC -- Ziege Dianova / 115136146
28
2.1.4 Chemikalien und Einzelsubstanzen
Substanz Hersteller / Katalog-
nummer 2-Mercaptoethanol, zur Synthese,
>98%GC
Merck / 805740 2-Propanol, Bio Ultra für Moleku-
larbiologie
Sigma / 59304 Agarose, Lot 000181207C626L Biozym LE / 840004 Ammoniumchlorid (NH4Cl), p.a. Merck / 101145.1000 Artifizieller Liquor, Tutofusin OP,
ph7
Baxter / 3311290 Atropin, 1,0mg/ml Eifelfango Neuenahr /
0085858
Beads, CaliBRITE™ Becton Dickinson / 349502
Brefeldin A, für Molekularbiologie Sigma / B6542 CellTrace™ CFSE Cell Prolifera-
tion Kit
Molecular Probes / C34554
Chloroform, für Molekularbiologie, 99%
Sigma / C2432 Diethylether puriss. p.a. Sigma / 32202 Dimethylsulfoxid (DMSO),
99,5%GC
Sigma / D4540
DMEM Pulver Gibco / 52100-021
dNTP Mix, je 10 mM Fermentas / R0192 Ethanol absolut, puriss. p.a. Sigma / 32205
Fentanyl, 0,1mg Salutas Pharma / -
Fetales Kälberserum (FKS), für Zellkultur
PAN Biotech / 3302- P250922
Freunds Adjuvans (komplett) Becton Dickinson / 263910
G418-Sulphate, Lot P01107-2074 PAA / P25-011
29
Glykogen, für Molekularbiologie Sigma / G1767
Halothan Baxter / nicht mehr liefer-
bar Heparin Sodium Salt, from Porcine Intestinal Mucosa (5.000 U/ml)
Sigma / H9399 Hepes, (2-(4-(2-Hydroxyethyl)- 1-
piperazinyl)-ethansulfonsäure), 1 M
Sigma / H3375 Ionomycin Kalzium Salz von
Streptomyces
Sigma / I0634 Isofluran, Charge 09A09A30 Baxter / HDG 9623 Isopropanol, für Molekularbiologie Sigma / 59304 Kaliumchlorid (KCl), p.a. Merck / 104936.1000 Kaliumhydrogencarbonat (KHCO3) Merck / 4854 Kochsalzlösung (NaCl)
L-Asparagin, Lot 3046214 Gibco / 11013-026 L-Glutamin, steril, 200 mM PAN Biotech / P0480100 Medetomidinhydrochlorid
(Domitor), 1,0 mg/ml
Pfizer 140999 MEM-Nicht-essentielle Aminosäu-
ren, 100x
Gibco / 11140 Midazolamhydrochlorid
(Dormicum), 5 mg/ml
Roche / 3085793 Myelin Basisches Protein (MBP) Eigenherstellung aus
Meerschweinchen Hirnen Na2 EDTA
(Ethylendiamintetraessigsäure- Dinatriumsalz-Dihydrat), p.a.
Merck / 108418.1000
Natriumchlorid, für Zellkultur, 100mM,
Gibco / 11360-039 Optiprep, Dichte 1,23 g/ml Progen Biotechnik /
1114542 Ovalbumin (OVA), 99% Reinheit Sigma / A5503 Paraformaldehyd (PFA), reinst Merck / 104005.1000 Penicillin-Streptomycin, Gibco / 15140
30
10.000 U/ml Pen., 10.000 µg/ml Strep.
Percoll, Dichte 1,077 g/ml Biochrom AG / L6135 Percoll, Dichte 1,124 g/ml Biochrom AG / L6145 Permeabilisierungpuffer (PermP) Becton Dickinson /
554723 Pferdeserum, für Zellkultur PAA/
B15-021 PMA (Phorbol-12-Myristat-13-
Acetat)
Sigma / P148
qPCR Master Mix (RT-QP2X-03) Eurogentec / G6-0241
Ribonuclease H Fermentas / EN0201
Super-Script II First Strand Synthe- sis System for RT PCR (kit)
Invitrogen / 18080-051 Texas Red Dextran, 70kD Invitrogen / D1864
TRIZOL Reagent Invitrogen / 15596018
Trypanblau (0,4%), für Zellkultur Sigma / T8154
Wasser, RNSase frei Sigma / W1754
2.1.5 Verbrauchsmittel und Geräte
Verbrauchsmittel / Gerät Hersteller / Katalognummer Beatmungsgerät Harvard Apparatus / Inspira ASVv Eppendorfgefäß, 1,5 ml Becton Dickinson / 0030120086 Eppendorfgefäß, 2,0 ml Becton Dickinson / 0030120094 FACS Calibur Becton Dickinson
Fluoreszenzmikroskop Zeiss / Axiovert 200M
Gewebeschneider The Mickle Laboratory Engineer- ing Co
Hemacytometer nach Neu-
bauer, Bright Line Sigma / Z359629 Intubationskanüle mit Y-
Stück Havard Apparatus / NP-73-2738
31
Kanüle, 0,6x25 mm BSN medical / 74200-16 Kanüle, 0,9x40 mm BSN medical / 74200-01 Katheter, CBAS Heparin
Coated PU Cath 3Fr Havard Apparatus / 72-4403 Konfokalmikroskop Leica / TCS SP2
Kryoröhrchen Nunc / 375418
Lichtmikroskop Olympus / CK2 Mikrotiterplatte mit Flach-
boden Corning BV / 3596
Mikrotiterplatte mit Rund-
boden Corning BV / 3799
Mikrotiterplatte mit V-
Lochboden Corning BV / 3894
Nylon-Zellsieb (40 µm) Becton Dickinson / 352340 Optische Mikrotiterplatte
für qPCR Applied Biosystems / N8010560
Optischer Verschluss für
qPCR Mikrotiterplatten Applied Biosystems / 4311971 Perfusor® fm, Typ 8713820 B.Braun / 4128
Petrischale, 100x200 mm Falcon / 35003 Petrischale, 35x10 mm Falcon / 35001
pH-Meter InoLab / 720 Set
Real-time.Thermocycler Applied Biosystems / ABI 5700 Röntgenröhre Stabilipan Siemens
Spritze, 10 ml, Luer Lok Becton Dickinson / 2012-0407E10 Spritze, 5 ml, Luer Lok Becton Dickinson / 2013-0108B05 Sterilwerkbank, Typ HS 18 Heraeus /Thermo Scientific
50055556
Thermocycler Biometra / T3 Thermocycler Venenverweilkatheter mit
Zuspritzport, 0,64x19 mm (26G)
Klinika Medical GmbH / 1261006 Vortex Janke&Kunkel, IKA Labortechnik
/ VF2,
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Waagen Mettler Toledo
Wasserbad Thermomixer 5436
Zellinkubator Heraeus / Thermo scientific BBD 6220
Zellsieb (Metall) MPI Werkstatt Zentrifugen Hettich Zentrifugen Zentrifugenröhrchen, 15 ml Becton Dickinson / 352096 Zentrifugenröhrchen, 50 ml Becton Dickinson /352070
2.1.6 Computerprogramme
Programm Anwendung
CellQuest Aquisition und Analyse von FACS Daten
GeneAmp Aquisition und Analyse von Real- Time-PCR Daten
Leica LCS Software Bilderstellung Konfokalmikroskop Microsoft Office Standard
Primer Express 3.0 Design von Real-Time-PCR Oli- gonucleotiden
SPSS, Version 16 Statistik
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2.2 Methoden
2.2.1 Tierexperimentelle Arbeiten
2.2.1.1 Haltung und Handhabung der Tiere
Bei den verwendeten Ratten handelt es sich um Lewis Ratten des Haplotyps N, welche in den Tierställen des Max-Planck-Institutes für Biochemie gezüchtet werden. Die Zucht sowie sämtliche Mani- pulationen erfolgten gemäß den Bestimmungen der Ethikkommissi- on des Landes Bayern (Tierversuchsgenehmigung AZ 209.1/211- 2531-36/04).
In der Regel wurden weibliche Tiere im Alter von 6-8 Wo- chen eingesetzt. Bei ad libitum Fütterung weisen die Tiere in diesem Alter eine kontinuierliche Gewichtszunahme von wenigen Gramm Körpergewicht pro Tag auf.
Für kurzzeitige Eingriffe wurden die Tiere mittels Diethylether (Sigma) in eine tiefe Äthernarkose versetzt. Mit Hilfe einer Maske wurden die Tiere so lange in Narkose gehalten, wie es der Eingriff erforderte.
2.2.1.2 Immunisierung
Die Immunisierung erfolgte mit einer Emulsion aus gleichen Antei- len komplettem Freunds Adjuvans und gelöstem Ovalbumin (OVA;
1 mg/ml in PBS) oder MBP (1 mg/ml in PBS), welches aus Meer- schweinchenhirnen extrahiert wurde. Beide Flüssigkeiten wurden unter Luftausschluss miteinander vermischt, bis sich eine feste Emulsion gebildet hatte. Jeder Ratte wurden subcutan 200 μl der Emulsion appliziert, verteilt auf vier Stellen am Schwanzansatz und den Hintergliedmaßen.
34
2.2.1.3 Adoptiver T-Zell Transfer
Am zweiten Tag nach der Restimulation (siehe Kapitel 2.2.2.2), wurden den Ratten in der Regel 5x106 Zellen in 2 ml EH Medium (siehe 2.1.2) i.v. in die Schwanzvene appliziert. Zu diesem Zeitpunkt lagen die T-Zellen als vollaktivierte runde Blasten vor.
2.2.1.4 Ex vivo T-Zell Transfer
Am dritten Tag p.t. von TMBP-GFP oder TOVA-GFP Zellen (siehe 2.2.2.1) wurde den Ratten direkt nach der Tötung durch Äthernarkose und anschließendem Genickbruch die Milz entnommen und wie folgt aufbereitet: Das Organ wurde mit Hilfe eines Zellsiebes homogeni- siert, gewaschen und die Erythrozyten mit 5 ml Lysispuffer (siehe 2.1.2 ) 5 Minuten auf Eis lysiert. Anschließend wurde die Einzelzell- suspension mit 45 ml PBS abgepuffert und erneut zentrifugiert (4°C, 290g, 8 min). Das verbleibende Milzgewebe wurde in 10 ml TZM+10% FKS (siehe 2.1.2) aufgenommen und eine halbe Stunde bei 37°C im CO2 Brutschrank inkubiert um adhäsive Makrophagen und Monozyten zu entfernen. Abschließend wurde die Suspension mit einem 40 μm Nylonsieb (siehe 2.1.5) filtriert und in Hepesmedium (siehe 2.1.2) aufgenommen. Die Zahl der TGFP Zellen wurde durchflußzytometrisch bestimmt (siehe 2.2.3.6). Den Emp- fängertieren wurde die Milzzellsuspension mit den darin enthaltenen TGFP Zellen i.v. appliziert.
2.2.1.5 Klinische Überwachung und Bewertung der EAE Zur Überwachung des Krankheitsverlaufes wurden die Tiere täglich zur gleichen Tageszeit gewogen und auf Lähmungserscheinungen untersucht. Der Krankheitsgrad wurde auf einer Skala von 0 bis 5 wie folgt eingeteilt:
35
0 Keine Lähmung
1 Verlust des Schwanztonus
2 Gangataxien durch beginnende Hinterhandlähmung 3 Vollständige Hinterhandlähmung
4 Tetraplegie 5 Tod
2.2.1.6 Perfusion
Nach Freilegung des Herzens am anästhesierten Tier (siehe 2.2.1.1) wurde die linke Herzkammer durch eine Inzisur eröffnet und eine stumpfe Kanüle eingeführt und fixiert. Daraufhin wurde das Gefäß- system über eine Perfusionspumpe mit PBS gespült. Der Abfluss der Spüllösung und des Blutes wurde über die Eröffnung des rechten Herzohres gewährleistet.
2.2.2 Zellkultur Arbeiten
2.2.2.1 Primärkultur/ T-Zell Transduktion
Zehn Tage nach der Immunisierung (siehe 2.2.1.2) wurden die drai- nierenden inguinalen, lumbal-paraaortalen und poplitealen Lymph- knoten entnommen und die Zellen durch Zellsieb-Homogenisierung aufbereitet (siehe 2.2.3.1). Dann erfolgte eine Kokultivierung im Endverdünnungsverfahren mit der Verpackungszelllinie GP+E86 (Markowitz et al. 1988). Diese stammt von einer murinen Fibro- blastenlinie ab und besitzt neben dem Fehlen des Verpackungssig- nals eine zweifache Sicherung gegen Remutationsereignisse des Ret- rovirus zu einem replikationsfähigen Virus, da die komplementie- renden Virusproteinsequenzen (gag/pol einerseits, env andererseits) auf zwei getrennten Konstrukten in die Verpackungslinie einge- bracht wurden. Für die Kultivierung wurden in einer 96er Mikrotiterplatte mit Rundboden (siehe 2.1.5) pro well 15.000 GPE Zellen mit 200.000 Lymphknoten Zellen in Restimulierungsmedium (siehe 2.1.2) ausgesät. Dem Medium wurden MBP oder OVA als
36
spezifisches Antigen (10 μg/ml Endkonzentration) zugesetzt. Nach zwei Tagen wurden pro well 50 μl T-Zell-Wachstumsmedium (siehe 2.1.2) hinzugegeben. Der darin enthaltene ConA Überstand (Über- stand aus ConA stimulierten murinen Milzzellen, siehe 2.1.2) führt durch seine Wachstumsfaktoren zur Proliferation der T-Zellen. Am vierten Tag wurden die Zellen nach Abnahme von 50 μl Medium in eine 96er Mikrotiterplatte mit Flachboden (siehe 2.1.5) überführt und erneut 100 μl T-Zell-Wachstumsmedium hinzugegeben.
Als retroviraler Vektor dient das Moloney leukemia virus Derivat pLXSN, in welches die cDNS des grünfluoreszierenden Proteins (enhanced green fluorescent Protein, eGFP) eingebaut wurde. Mittels Kalziumphosphatpräzipitation wurde zunächst die Verpackungszell- linie transfiziert. Diese produziert daraufhin den retroviralen Vektor, welcher in der Lage ist, sich in das Wirtsgenom zu integrieren. Die Insertion in das Genom durch Retroviren kann nur stattfinden, solan- ge sich die T-Zellen teilen. Dadurch wird sichergestellt, dass nur die spezifischen, proliferierenden T-Zellen transduziert werden. Durch Zugabe des spezifischen Antigens werden ausschließlich die T- Zellen zum Wachstum stimuliert, welche das Antigen erkennen. Da- rüber hinaus führt die Zugabe des Neomycinderivates G418 zum Absterben von nicht transduzierten Zellen. Somit wird sichergestellt, dass nur antigenspezifische T-Zellen bei denen eine Integration der Virus-DNS stattgefunden hat, überleben.
2.2.2.2 Restimulation
Sieben Tage nach Erstellung der Primärkultur (siehe 2.2.2.1) erfolgte die erste Restimulation. Nach Entnahme von 100 μl Medium pro well wurden 1,4x106 bestrahlte syngene Thymozyten in 100 μl Re- stimulierungsmedium (siehe 2.1.2) zugegeben. Ein geringer Anteil der Thymozyten besteht aus antigenpräsentierenden Zellen, welche das zugegebene Antigen aufnehmen, prozessieren und den T-Zellen MHC-II vermittelt präsentieren können. Die Bestrahlung der
37
Thymozyten (5.000 rad/ 4min 41s = 50 Gy) hemmt die Antigenprä- sentation nicht, verhindert aber deren eigene Proliferation. Anschlie- ßend erfolgte die Zugabe von MBP oder OVA (je 10 μg/ml Endkon- zentration) und G418 (4 μg/ml Endkonzentration) in Restimulierungsmedium.
Am zweiten Tage wurden pro well wieder 50 μl T-Zell- Wachstumsmedium mit G418 (4 μg/ml Endkonzentration) hinzuge- geben. Am vierten Tag wurden die Platten fluoreszenzmikroskopisch auf das Vorliegen transduzierter, d.h. GFP positiver, T-Zellen unter- sucht, die entsprechenden wells zusammengeführt und in 60 mm Petrischalen kultiviert.
Zwei Tage nach der Restimulation liegen die Zellen als vollaktiverte runde Blasten vor. Anschließend gehen die Zellen langsam in einen ruhenden Status über, bis sie schließlich um den siebten Tag als klei- ne, reiskornartige Zellen („ruhende T-Zellen“) vorliegen. Zu diesem Zeitpunkt erfolgte die neuerliche Restimulation der kultivierten Zel- len.
Hierfür wurden in einer 60 mm Petrischale 3-3,5x106 ruhende T- Zellen mit 70x106 frisch isolierten, bestrahlten syngenen Thymozyten in 5 ml Restimulierungsmedium unter Zugabe des An- tigens (10 μg/ml Endkonzentration) und des Antibiotikums G418 (4 μg/ml Endkonzentration) kultiviert. Ab dem zweiten bis zum vierten Tag konnten die Zellen, je nach Dichte, unter Zugabe von T-Zell- Wachstumsmedium mit G418 (4 μl/ml Endkonzentration) in 100 mm Petrischalen umgefüllt und aufgeteilt werden.
2.2.2.3 Einfrieren und Auftauen der Zellen
30-40x106 Zellen wurden in 1,8 ml Einfriermedium (siehe 2.1.2) resuspendiert und in Kryoröhrchen (siehe 2.1.5) aliquotiert. Die Röhrchen wurden in einer Styroporbox bei –80°C gelagert, um ein langsames Einfrieren der Zellen zu gewährleisten. Zur dauerhaften
38
Aufbewahrung wurden die Röhrchen auf Trockeneis in flüssigen Stickstoff überführt.
Zum Auftauen wurden die Kryoröhrchen kurz in einem Wasserbad bei 37°C geschwenkt. Anschließend wurden die Zellen in einem zehnfachen Volumen Auftaumedium (siehe 2.1.2) resuspendiert und abzentrifugiert (4°C, 290g, 8 min), wodurch DMSO Reste beseitigt wurden. Je nach Bedarf wurden die Zellen anschließend in T-Zell- Wachstumsmedium (siehe 2.1.2) ausgesät oder sofort restimuliert (siehe 2.2.2.2).
2.2.2.4 Zellzählung
Die Anzahl lebender Zellen wurden mittels Hemacytomer nach Neu- bauer (siehe 2.1.5) und dem Farbstoff Trypanblau (siehe 2.1.4) be- stimmt. Hierfür wurden 10μl der Zellsuspension mit 90μl einer 0,04%igen Trypanblau Lösung (Trypanblau in PBS, siehe 2.1.2) gemischt. Der blaue Farbstoff färbt membrandefekte Zellen und er- laubt somit die Unterscheidung zwischen lebenden und toten Zellen.
10μl der Zell-Farbstoff Suspension wurden in einer Neubauerzähl- kammer ausgezählt, indem die Anzahl lebender Zellen in vier Groß- quadranten der Zählkammer bestimmt wurde. Anschließend wurde die durchschnittliche Menge lebender Zellen pro Großquadrant be- rechnet und mit dem Verdünnungs- plus Volumenfaktor 10-5 multi- pliziert.
2.2.3 Immunologische Arbeiten 2.2.3.1 Gewebszell Suspension
Für die Herstellung von Einzelzellsuspensionen wurden die entspre- chenden Organe (Leber, Lung, Niere, Lymphknoten) heraus- präpariert und sofort in eiskaltes Hepesmedium (siehe 2.1.2) über- führt. Mit Hilfe eines in Hepesmedium getauchten Zellsiebes (siehe
39
2.1.5) und dem Stempel einer 5 ml Spritze (siehe 2.1.5) wurde das jeweilige Organ homogenisiert. Hierfür wurde die Organoberfläche mit einer Skalpelklinge eingeritzt und das Gewebe mit dem Spritzen- stempel durch das Zellsieb gedrückt. Anschließend wurde die Sus- pension in Zentrifugenröhrchen (siehe 2.1.5) überführt und abzentrifugiert (4°C, 290g, 8 min). Das verbleibende Pellet wurde in einem definierten Volumen Medium aufgenommen.
2.2.3.2 Zellisolierung aus dem Blut mittels Optiprep Gradient Vor der Blutentnahme wurde eine 10 ml Spritze mit einer Heparinlösung (5.000 U/ml PBS) (siehe 2.1.4) gespült. Nach Eröff- nung des Brustkorbes wurde direkt aus dem Herzen Blut entnommen und die Spritze auf Eis gelagert. Für den Gradienten wurden 5 ml Blut mit 0,625 ml Optiprep Lösung (1,23 g/ml, siehe 2.1.4) gut ge- mischt und mit einer Glaspipette in ein neues 15 ml Zentrifugenröhrchen überführt. Abschließend wurde das Blut mit 0,5 ml PBS überschichtet und der Gradient zentrifugiert (Raumtem- peratur, 1000g, 30 min, ohne Bremse). Durch die Zentrifugation bil- det sich eine gut abgegrenzte opaque Interphase, welche die Leuko- zyten enthält. Diese Interphase wurde entnommen und mit dem zehnfachen Volumen TZM + 10%FKS (siehe 2.1.2) gewaschen und abzen-trifugiert (4°C, 290g, 8 min). Das entstandene Zellpellet wur- de in einem definierten Volumen Hepesmedium (siehe 2.1.2) aufge- nommen.
2.2.3.3 Milz Erythrolyse
Die Milz wurde entnommen und wie die anderen Organe homogeni- siert (siehe 2.2.3.1). Nach der Zentrifugation (4°C, 290g, 8 min) wurde das Milzgewebe in 5 ml Lysispuffer (siehe 2.1.2) aufgenom- men und 5 min auf Eis inkubiert, um die Erythrozyten zu lysieren.
Anschließend wurde die Lösung mit 45 ml eiskaltem PBS abgepuffert und abzentrifugiert (4°C, 290g, 8 min). Das Zellpellet
40
wurde in einem definierten Volumen Medium Hepesmedium (siehe 2.1.2) resuspendiert.
2.2.3.4 Knochenmarks Präparation
Der linke Femur wurde am Hüft- und Kniegelenk heraus präpariert, mit einer Knochenzange (siehe 2.1.5) aufgebrochen und das Kno- chenmark mit Hilfe einer 5 ml Spritze (siehe 2.1.5) mit Hepes- medium (siehe 2.1.2) unter Druck herausgespült. Anschließend wur- de die Einzelzellsuspension zentrifugiert (4°C, 290g, 8 min) und das Pellet in einem definierten Volumen Medium Hepesmedium (siehe 2.1.2) resuspendiert.
2.2.3.5 Zellisolierung aus dem Rückenmark mittels Percoll Gradient
Nach der Entnahme wurde das RM wie die anderen Organe in eis- kaltem Hepesmedium (siehe 2.1.2) gelagert und mittels Zellsieb (siehe 2.1.5) wie beschrieben (siehe 2.2.3.1) verarbeitet. Die Einzel- zellsuspension (25 ml) wurde mit 10,8 ml isotonischem Percoll (1,124 g/ml, siehe 2.1.4) gemischt, 10 ml Percoll (1,077 g/ml, siehe 2.1.4) unterschichtet und zentrifugiert (RT, 1300g, 30 min, ohne Bremse). Die durch den Dichtegradienten entstandene Interphase mit den Leukozyten wurde mit einer Glaspipette abgenommen, welche vorher mit TZM + 10%FKS (siehe 2.1.2) gespült wurde, um ein An- haften der Zellen zu verhindern. Anschließend wurde die Interphase mit TZM + 10%FKS auf 50 ml aufgefüllt, gewaschen (4°C, 400g, und 10 min) und das Pellet in 0,5 ml Hepesmedium (siehe 2.1.2) resuspendiert.
2.2.3.6 Durchflusszytometrische Messung und Zell-Zählung Nach Erstellung der Einzelzellsuspension wurde die Konzentration der TGFP Zellen pro Gramm Organ bestimmt. Hierzu wurden 100 μl
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der jeweiligen Suspension mit 100 μl Phycoerythrin markierten Plas- tikkügelchen (PE-beads, siehe 2.1.4) vermischt, deren Konzentration durch Zählung in der Neubauer-Kammer bestimmt wurde. Im Durchflusszytometer wurde eine definierte Anzahl an Kügelchen gemessen und aus dieser Anzahl konnte mit folgender Formel die Konzentration an TGFP Zellen in 100 μl Suspension ausgerechnet werden: TGFP Zellen= (gezählte Zellen x Gesamt-Kügelchen ) / ge- zählte Kügelchen
Durch vorherige Messung des Organgewichtes und Resuspension in einem definierten Volumen war es möglich, die Anzahl der TGFP
Zellen pro Gramm Gewebe zu bestimmen.
2.2.3.7 Phänotypisierung von Zellen mittels fluoreszierender Antikörper
Die TGFP Zellen des RMs wurden mit einem Percoll Gradienten (sie- he 2.2.3.5) aufgereinigt und anschließend in einer 96er-V-Loch- Boden-Mikrotiterplatte (siehe 2.1.5) gleichmäßig verteilt. Nach ei- nem Zentrifugationsschritt (4°C, 290g, 4 min) erfolgten jeweils eine Waschung durch Resuspension und erneute Zentrifugation mit PBS und eine mit Blockierungspuffer (siehe 2.1.2), dessen Gehalt an Rat- tenserum (5%) unspezifische Bindungen des ersten Antikörpers ver- hindert. Dann folgte die Inkubation mit Primärantikörpern (CD4, CD25, CD134 oder IgG1 kappa; siehe 2.1.4), welche spezifisch für die zu untersuchenden zellulären Antigene und Aktivierungsmarker waren (100 μl, 4°C, 30 min) in einer Verdünnung von 1:100 in PBS.
Nach zwei weiteren Waschschritten durch Resuspension und an- schließende Zentrifugation mit Blockierungspuffer folgte die Inkuba- tion mit einem allophycocyanin (APC)-konjugierten anti-Maus Anti- körper (50 μl, 4°C, 45 min; siehe 2.1.4) in einer Verdünnung von 1:100 in PBS. Um die Fluoreszenz des APC konjugierten Antikör- pers nicht zu beeinträchtigen erfolgte dieser Inkubationsschritt unter Lichtausschluss. Abschließend wurden je ein weiterer Waschschritt,
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durch Resuspension und Zentrifugation mit Blockierungspuffer und PBS durchgeführt. Für die durchflusszytometrische Messung wurden die Proben in PBS aufgenommen.
Als Kontrolle dienten TGFP Zellen der Milz, welche mit einer Erythrolyse aufbereitet wurden (siehe 2.2.3.3). Die Färbung erfolgte parallel zu den Zellen des ZNS.
2.2.3.8 Intrazelluläre Färbung von Zytokinen
Nach der Aufreinigung der TGFP Zellen aus dem RM mit einem Percoll Gradienten (siehe 2.2.3.5) wurden ein Teil der Zellen mit PMA (0,16 µM Endkonzentration, siehe 2.1.4) und Ionomycin (1 µg/ml Endkonzentration, siehe 2.1.4) behandelt (3 Std, 37°C, in 100 μl TZM + 10% FKS). PMA führt zu einer Aktivierung der Zel- len durch die Aktivierung der Proteinkinase C, während Ionomycin zu einer erhöhten Membranpermeabilität mit darauffolgendem An- steigen des intrazellulären Ca2+-Spiegels führt. Um den intrazellulä- ren Proteintransport und damit die Exkretion der produzierten Zytokine zu verhindern, wurden die aktivierten sowie die un- behandelten Zellen anschließend mit Brefeldin (5 μg/ml Endkonzent- ration, siehe 2.1.4) blockiert (5 Std, 37°C, in 100 μl TZM + 10%
FKS). Nach der Resupension mit TZM + 10% FKS und anschlie- ßender Zentrifugation (4°C, 290g, 4 min) wurden die Zellen in einer 2 prozentigen PFA Lösung (siehe 2.1.4) fixiert (20 min, 4°C). An- schließend erfolgte die intrazelluläre Zytokinfärbung. Hierzu wurden die Zellen erst mit Permeabilisierungpuffer (PermP) (15 min, 4°C, siehe 2.1.2) behandelt und danach mit den Primärantikörpern (IFNγ und deren IgG1 Isotyp Kontrolle, siehe 2.1.3) in einer Verdünnung von 1:100 in PermP inkubiert, (50 μl, 45 min, 4°C). Nach erneuter Resuspension mit PermP und Zentrifugation (4°C, 290g, 4 min) er- folgte eine gleichzeitige Inkubation mit PE-konjugierten α-IL-17 Antikörpern bzw. PE-konjugierten IgG1 für die Kontrollgruppe (sie- he 2.1.3) und einem APC konjugieren Sekundärantikörper (50 μl, 2
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Std, 4°C, siehe 2.1.3) in Verdünnungen von 0,25 bzw. 0,5:100 in PermP. Abschließend wurden je ein weiterer Waschschritt, durch Resuspension und anschließende Zentrifugation mit PermP und PBS durchgeführt. Für die durchflusszytometrische Messung wurden die Proben in PBS aufgenommen.
2.2.3.9 Zellfärbung mit Carboxyfluoreszein succinimidyl Es- ter
Zur Zellzahlbestimmung mit Carboxyfluoreszein succinimidyl Ester (CFSE) -markierten T-Zellen, wurden diese mit Hilfe des CellTrace™ CFSE Proliferation Kit (siehe 2.1.4) gefärbt. Das farblo- se Substrat wird erst durch die intrazelluläre Abspaltung der Acetat Gruppen fluoreszierend und anschließend in den Zellen festgehalten.
Hierzu wurden die Zellen zentrifugiert (4°C, 290g, 8 min) und der Überstand abgegossen. Die CFSE Lösung wurde mit PBS auf eine 5 µM Färbelösung verdünnt, die Zellen in dieser aufgenommen und 15 min bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden die Zellen wieder zentrifugiert (4°C, 290g, 8 min) und für eine erneute Inkubation (30 min, 37°C) in frischem PBS aufgenommen. Diese zweite Inkubati- onszeit stellt eine vollständige Umsetzung des Substrats sicher. Die gefärbten Zellen wurden den Tieren direkt im Anschluss i.v. appli- ziert.
2.2.4 Molekularbiologische Arbeiten
2.2.4.1 RNS Extraktion aus dem Rückenmark
Bei der RNS Extraktion aus dem RM wurde auf eine zügige Ent- nahme des Gewebes und Weiterverarbeitung unter gekühlten Bedin- gungen (auf Eis) geachtet. Das RM wurde vollständig entnommen, in Hepesmedium (siehe 2.1.2) auf Eis transportiert und mit Hilfe eines sterilen Zellsiebes homogenisiert (siehe 2.1.4). Das Homogenisat wurde zentrifugiert (4°C, 290g, 8 min), der Überstand
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abgegossen und das verbleibende Gewebe in 3 ml TRIZOL (siehe 2.1.4) resuspendiert. Die Proben wurden 5 min bei RT inkubiert und bis zur weiteren Verarbeitung bei -80°C gelagert. Zur eigentlichen Extraktion wurden die Proben aufgetaut und wie im TRIZOL Stan- dardprotokoll beschrieben weiterverarbeitet: Die aufgetauten Proben à 1 ml wurden in RNSase freie Eppendorfgefäße pipettiert, 0,2 ml Chloroform (siehe 2.1.4) zugegeben und mittels Vortex geschüttelt.
Die Proben wurden 15 min bei RT inkubiert und dann zentrifugiert (4°C, 140g, 15 min). Hierbei entstanden drei Phasen: die obere wäss- rige Phase enthielt die RNS und wurde in ein frisches Reaktionsge- fäß pipettiert, wobei streng drauf geachtet wurde, keinen Kontakt der Pipette mit den darunter liegenden Phasen zuzulassen. Der wäßrigen Phase wurden zur RNS Fällung 0,5 ml Isopropanol (siehe 2.1.4) und Glykogen (100 µg/ml Endkonzentration, siehe 2.1.4) zugegeben und diese nach 10 minütiger Inkubation bei RT durch Zentrifugation (4°C, 140g, 20 min) pelletiert. Der Überstand wurde entfernt und das Pellet mit 75%igem Ethanol (siehe 2.1.4) gewaschen (4°C, 140g, 5 min). Nach Abnahme des Überstandes wurde das Pellet luftgetrock- net und in 10 µl RNSase freiem Wasser (siehe 2.1.4) resuspendiert.
Zur vollständigen Lösung wurde die RNS 10 min bei 55°C inkubiert und währenddessen mehrmals pipettiert.
2.2.4.2 cDNS Synthese
Für die cDNS Synthese wurden Random-Hexamer-Oligonukleotid- Primer und die Reverse-Trankriptase-Super-Script II (beides im Su- per-Script II First Strand Synthesis System for RT PCR kit enthalten, siehe 2.1.4) eingesetzt, sowie das Protokoll des Herstellers (Invitrogen) befolgt: Die Random-Hexamer-Oligonukleotid-Primer dienen der unspezifischen Umschreibung der gesamten RNS in cDNS. Die RNS wurde mit den Primern und Nukleotiden 5 min bei 65°C inkubiert. Bei diesem Schritt denaturiert die RNS und ermög- licht die Primerbindung. Nach Zugabe der Reversen-Transkriptase erfolgt eine 10 minütige Inkubation bei 25°C. Danach erfolgt der
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Syntheseschritt bei 42°C für 50 min, unter Zugabe des Ribonuklease-Inhibitors RNAseOUT, welcher die RNS Integrität schützt. Die Reaktion wird anschließend hitzeinaktiviert (70°C, 15 min) und die verbleibende RNS mittels RNAseH abgebaut (37°C, 20 min), um in der anschließenden Real Time PCR Reaktion eine Ver- unreinigung mit RNS zu vermeiden.
2.2.4.3 Quantitative Real Time PCR
Mit dem Programm Primer Express 3.0 wurden Oligonukleotidprimer und eine Fluorochrom-Oligonukleotidprobe (5’ FAM; 3’ TAMRA) entworfen, welche von der Firma Sigma Genosys hergestellt wurden. Jedes zu untersuchende Gen wurde in voneinander unabhängigen Duplikaten untersucht und pro Re- aktionsansatz wurden 7,5 µl der 1:80 mit RNSase freiem Wasser (siehe 2.1.4) verdünnten cDNS eingesetzt. Des Weiteren enthielt jede Reaktion 5 µl Primer-Probe-Mix (Konzentration siehe untenste- hende Tabelle) und 12,5 µl der Master Mix Lösung (siehe 2.1.4).
Das durchgeführte Thermo Protokoll war wie folgt: 2 min bei 50°C, 10 min bei 95°C, 40 Zyklen mit jeweils 15 sek bei 95°C, 20 sek bei 60°C und 40 sek bei 72°C.
Primer / Sonde
Sequenz (5’-3’) Konz.
(nM) ß-Aktin Vor GTA CAA CCT CCT TGC AGC TCC
T
300 ß-Aktin Rück TTG TCG ACG ACG AGC GC 900 ß-Aktin So CGC CAC CAG TTC GCC ATG GAT 100 CCL5 Vor CAA CCT TGC AGT CGT CTT TGT
C
300 CCL5 Rück GAT GTA TTC TTG AAC CCA CTT
CTT CTC
300 CCL5 So AGG AAC CGC CAA GTG TGT GCC
AAC
100
