Antigenspezifische Migration von T-Helfer-Zellen im murinen Inflammationsmodell

der Medizinischen Fakultät Charité – Universitätsmedizin Berlin

DISSERTATION

Antigenspezifische Migration von T-Helfer-Zellen im murinen

Inflammationsmodell

zur Erlangung des akademischen Grades

Doctor medicinae (Dr. med.)

vorgelegt der Medizinischen Fakultät

Charité – Universitätsmedizin Berlin

von

Saeed Anwar Ghani

aus Halle (Krs. Gütersloh)

Gutachter: 1. Prof. Dr. rer. nat. A. Hamann

2. Prof. Dr. med. J. Sieper

3. Priv.-Doz. Dr. M. Lipp

Zusammenfassung

Die Effektorphase adaptiver Immunantworten ist gekennzeichnet durch die Akkumulation von Lymphozyten im entzündeten Gewebe. Die Einwanderung der Lymphozyten wird vermittelt durch die Interaktion verschiedener Adhäsionsmoleküle. In der Frühphase dominieren Granulo-zyten das Entzündungsgeschehen, zu späteren Zeitpunkten beherrschen LymphoGranulo-zyten das Bild und man findet insbesondere eine Akkumulation von Antigen(Ag)-spezifischen Lymphozyten. Der Wirkmechanismus von Antigen für diese spezifische Rekrutierung, Akkumulation oder mögliche lokale Proliferation von Lymphozyten ist jedoch bisher unklar.

In der vorliegenden Arbeit wird der Effekt von lokalem Antigen auf die Migration einer Lymphozytensubpopulation der T-Helferzellen (CD4+-T-Effektorzellen) untersucht. Im murinen Hautinflammationsmodell wird gezeigt, dass in der Frühphase einer Immunantwort die lokale Aktivierung von wenigen Ag-spezifischen T-Effektorzellen eine Konditionierung des Entzündungsherdes verursacht, die eine hocheffektive Rekrutierung von weiteren T-Effektor-zellen unabhängig von ihrer Ag-Spezifität auslöst. Über einen Zeitraum von Tagen entwickelt sich dann eine Dominanz von Ag-spezifischen T-Effektorzellen im Bereich der Entzündungs-reaktion, die wahrscheinlich durch eine lokale Proliferation Ag-spezifischer T-Effektorzellen bedingt ist.

Weiterhin wird gezeigt, dass TNFα die Intensität der T-Zell-abhängigen Entzündung steuert, jedoch nur teilweise die T-Effektorzell-Rekrutierung inhibiert.

Abstract

The effector phase of adaptive immune responses is characterized by the accumulation of lymphocytes in the inflamed tissue. The migration of effector cells to acute inflamed sites requires the interaction of various adhesion molecules. During the initial response granulocytes represent the dominant cell type, while lymphocytes predominate at later time points. Especially antigen (ag)-specific T-cells can be found. The role of antigen for this process is unclear.

Here we show that local activation of ag-specific T-effector cells within the site of inflammation conditions the local environment to promote recruitment of effector cells irrespective of their ag-specificity. However, over a period of several days, ag-specific T-cells dominate within the site of ag-challenge most likely due to recruitment of progeny of ag-specific activated T-cells. Furthermore, does TNFα control the strength of the T-cell dependent inflammation as determined by local swelling but only partially regulates the recruitment of subsequent effector T-cells to the site of ag-challenge.

Schlagwörter:

T-Helferzellen, Entzündung, Migration, Antigen-Spezifität Keywords:

Inhaltsverzeichnis

Einleitung...9

1.1 Das adaptive Immunsystem ...9

1.2 T-Helferzellen ...10

1.3 Th1/Th2-Differenzierung...11

1.4 Leukozytäre Migration (Multi-Step-Modell)...13

1.5 Migrationseigenschaften unterschiedlicher T-Helfer-Zellpopulationen...14

1.6 Die Rolle von Antigen für die Akkumulation von T-Effektorzellen Lymphozyten im peripheren Gewebe ...17

1.7 Zielstellung der Arbeit ...20

2 Material ...22

2.1 Medien und Lösungen ...22

2.2 Zusätze zur Zellkultur...22

2.3 Antikörper ...23

2.4 Radioisotope zur Zellmarkierung...24

2.5 Versuchstiere...24

3 Methoden...25

3.1 Lymphozytenisolation aus der Maus...25

3.2 In-vitro-Generierung von CD4+-Effektorzellen (Th1-Kultur) ...25

3.3 In-vivo-Entzündungsmodell in der Haut ...28

3.4 Migrationsanalysen (Homing Assays)...32

4 Ergebnisse ...34

4.1 In-vitro-Differenzierung Ag-spezifischer und polyklonaler T-Helferzellen ...34

4.2 Ag führt zur lokalen Anreicherung Ag-spezifischer Th1-Zellen in der akuten Inflammation ...36

4.3 Der Kotransfer von Ag-spezifischen und polyspezifischen T-Effektorzellen führt zur Ansammlung von T-Effektorzellen unabhängig von ihrer Ag-Spezifität ...38

4.4 Der Einfluss der radioaktiven Markierung auf die leukozytäre Migration...40

4.5 Die Modulation des Inflammationsherdes durch lokale Aktivierung Ag-spezifischer T-Effektorzellen führt zu verstärkter Th1-Zellrekrutierung ...43

4.6 Mechanismen der Konditionierung: Einfluss von TNFα auf die Konditionierung des Gewebes...44

4.7 Die Spätphase der Inflammationsphase ist dominiert von einem Ag-spezifischen T-Effektorzellinfiltrat ...47

5 Diskussion ...51

5.1 Die Präsenz von spezifischem Antigen führt zur Aktivierung weniger ortsständiger Ag-spezifischer T-Effektorzellen mit Konditionierung der lokalen Entzündungsregion ...52

5.2 Die sekundäre Akkumulation von T-Effektorzellen erfolgt unabhängig von deren Ag-Spezifität ...53

5.3 Die Dominanz Ag-spezifischer T-Effektorzellen im Ag-exponierten Inflammationsgebiet entwickelt sich im Verlauf über Tage...54

5.4 Die Bedeutung von TNFα ...55

5.5 Die Rolle des Endothels in der Ag-spezifischen Effektorzell-Migration...56

5.6 Die T-Effektorzell-Migration in nicht inflammatorische Organe ...56

5.7 Methodische Limitationen der Untersuchung Ag-spezifischer T-Effektorzell-Migration...57

5.8 Modell der Migration Ag-spezifischer T-Effektorzellen...58

6 Zusammenfassung ...61

7 Literaturverzeichnis ...62

8 Danksagung ...72

9 Lebenslauf ...73

Widmung

Abkürzungsverzeichnis

Ag Antigen

Ak Antikörper

APC Antigen-präsentierende Zelle BCR B-Zellrezeptor

BrefA Brefeldin A

BSA Bovines Serumalbumin

c Konzentration

CD62L L-Selektin

CFSE Carboxy-fluoresceindiacetatsuccinimidylester

d day (Tag)

DC Dendritische Zelle

DTH delayed type hypersensitivity ED Enzephalitis disseminata

EAE experimentelle Autoimmunenzephalitis FACS Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung FITC Fluoresceinisothiocyanat

HEV hochendotheliale Venolen ICAM intercellular adhesion molecule IFA Inkomplettes Freundsches Adjuvans IFN Interferon

Ig Immunglobulin

Il Interleukin

k. o. knock out

LN Lymphknoten

MACS Magnet-aktivierteZellsortierung

MAdCAM mucosal adhesion cellular adhesion molecule MHC Major Histocompatibility Complex

OVA Ovalbumin

PBS Phosphate buffered Saline

PE Phycoerythrin

PI Propidiumioid

PMA Phorbol-12-Myristat-13-Acetat PSGL P-Selektin-Liganden

S1P1 Sphingosin-1-Phosphat

SPF spezifiziert pathogenfreie Bedingungen TCR T-Zell-Rezeptor

tg Transgen

Th- Zellen T-Helfer-Zellen

Th eff/mem Th-Effektor-/Memory-Zellen TNF Tumor-Nekrosefaktor

VCAM Vascular cell adhesion molecule

Einleitung

1.1 Das adaptive Immunsystem

Das Immunsystem dient u. a. zur Erkennung und Abwehr von vielfältigen mikrobiellen Erregern wie Bakterien, Viren oder Pilzen und es schützt den Organismus, indem es entdifferenzierte oder mutierte Zellen zerstört und so deren malignes Wachstum verhindert.

Hierfür sind verschiedene humorale und zelluläre Mechanismen wichtig. Höhere Wirbeltiere sind gekennzeichnet durch die Ausbildung eines spezifischen zellulären Abwehrsystems, das über eine differenzierte Strukturerkennung, die Ag-Präsentation, aktiviert wird. Diese erlaubt eine Unterscheidung zwischen körpereigenen und Fremdstrukturen, die eine Immunantwort induzieren bzw. zur Toleranz führen.

Antigene sind Teilstücke von Proteinen etwa von phagozytierten Erregern, Viruspartikeln oder Selbstproteinen aus dem endogenen Proteinumsatz. Nach intrazellulärem Verdau werden diese Teilstücke der Proteine an spezielle Proteine, den Major Histocompatibility Complex-Molekü-le(MHC), gebunden. Diese – verankert in der Zellmembran – präsentieren dann das Antigen an der Zelloberfläche. Zum einen geschieht dies über MHC-Klasse-I(MHC-I)-Moleküle, die von allen kernhaltigen Zellen exprimiert werden. Teilstücke von Selbstproteinen aus dem intrazellu-lären Proteinumsatz werden hier beispielsweise präsentiert. Zum anderen werden extrazelluläre Fremdproteine präsentiertdurch spezialisierte Zellen des Immunsystems, so genannte „Ag-prä-sentierende Zellen“ (APC), wie dendritische Zellen und Makrophagen. Diese präsentieren charakteristischerweise Teilstücke phagozytierter Antigene über MHC-II-Moleküle dem zellulä-ren Abwehrsystem, also T-Helfer- und B-Zellen. Diese Interaktion wird in direktem Zellkontakt über einen strukturerkennenden Rezeptor vermittelt. T-Zellen interagieren über den T-Zell-Rezeptor (TCR) und B-Zellen über den B-Zellrezeptor (BCR) mit MHC-Molekülen, die mit dem Fremd- oder Selbstprotein beladen sind.

Im Folgenden wird auf die Funktion von T-Helferzellen eingegangen. Diese erkennen Antigen über den TCR, der mit Ag-beladenen MHC-II Komplexen interagiert. Dies führt im Beisein weiterer Corezeptoren (CD3 und CD4 bei T-Helfer-Zellen) zur Signalübertragung. In Abhängig-keit von diesen costimulatorischen Signalen, die von Zellsubset, Differenzierungs- und Aktivie-rungsstatus der APC abhängen, kommt es zur Aktivierung des adaptiven Immunsystems. B- und T-Helfer-Zellen werden auf diese Weise in Proliferation, Differenzierung, Aktivierung oder dem programmierten Zelltod kontrolliert. Störungen dieses Prozesses können zu Autoimmunerkran-kungen führen, wenn etwa eine T-Zell-Aktivierung in peripheren Organen unkontrolliert

geschieht. Das Verständnis der lymphozytären Wanderungseigenschaften und der Dynamik der T- Zellmigration kann daher zur Weiterentwicklung der Therapie von Autoimmunerkrankungen dienen.

1.2 T-Helferzellen

T-Helferzellen sind eine Untergruppe des zellulären Abwehrsystems. Sie gehen im Knochen-mark aus der hämatopoetischen Stammzelle hervor. Aus dem Pool dieser sich selbst erneuernden Stammzellen gehen dann multipotente hämatopoetische Vorläuferhervor, die teilweise eine lymphoide Spezifizierung aufweisen[1]. Lymphoid spezifizierte Vorläufer verlassen das Knochenmark und migrieren als früheste intrathymische T-Zell-Vorläufer in den Thymus[2]. Die weitere Ausreifung in naive T-Zellen erfolgt über verschiedene lymphoide Vorläuferstadien mit unterschiedlicher Potenz zur Differenzierung. Ergebnis der Reifungsprozesse über positive und negative Selektionsschritte sind naive zytotoxische T-Zellen (CD8+) oder T-Helferzellen (CD4+), die einen funktionsfähigen Rezeptor zur Strukturerkennung, den T-Zell-Rezeptor (TCR)[3], tra-gen[4]. Im Rahmen der thymischen Differenzierung wird so eine funktionsfähige und selbst-tolerante T-Zell-Population generiert. T-Helferzellen haben eine wichtige Funktion in der Regu-lation der Immunantwort durch Produktion von Zytokinen, welche die antimikrobielle Funktion anderer Abwehrzellen steuern, so etwa die Antikörperproduktion von B-Zellen oder die Lyse virusinfizierter Zellen durch zytotoxische T-Zellen[5, 6]. Im Rahmen einer Immunantwort diffe-renzieren sich naive T-Zellen in Effektor- und Gedächtniszellen, die lebenslang persistieren und eine schnelle Immunantwort auslösen können und so das immunologische Gedächtnis bilden. Eine wichtige Funktion für die Regulation der Immunantwort haben die Oberflächenmoleküle CD4 und CD8, die als Corezeptoren der Aktivierung des TCR dienen. Reife T-Lymphozyten exprimieren ausschließlich CD4 oder CD8. CD8 vermittelt die Interaktion mit MHC-I-Molekü-len, die Antigen aus dem intrazellulären Umsatz präsentieren. CD4 vermittelt die Interaktion mit MHC-II-Molekülen, die hauptsächlich von APCs exprimiert werden und die phagozytiertes und Antigen präsentieren. CD4+-T-Helferzellen können sich in weitere Subsets differenzieren, wie Th1, Th2 oder regulatorische T-Zellen, die unterschiedliche Funktionen ausüben. Th1-Zellen fördern die lokale Entzündungsantwort, u. a. durch Sekretion von zytotoxischen Zytokinen, während Th2-Zellen zur Aktivierung von B-Zellen und Generierung einer B-Zellantwort beitragen.

1.3 Th1/Th2-Differenzierung

Die Entwicklung von Effektor-T-Zellen aus reifen naiven Th-Zellen ist von einer Abfolge definierter Schritte abhängig, die zu einer Population Ag-spezifischer, hochreaktiver T-Zellen führt. Diese beinhaltet die Aktivierung naiver Th-Zellen, Proliferation, Differenzierung zu hoch-potenten Effektorzellen mit der Kapazität zur schnellen Zytokinproduktion nach erneutem Antigenkontakt und der systemweiten Verteilung in nicht-lymphoiden Organen.

Aktivierung naiver T-Zellen und Differenzierung in Effektorzell-Subsets

Naive Th-Zellen befinden sich nahezu ausschließlich in sekundären lymphatischen Organen und werden Ag-spezifisch im drainierenden Lymphknoten bei Entzündungsreaktionen oder in der Milz bei systemischen Inflammationsreaktionen aktiviert[7, 8]. Im Verlauf einer Entzündungs-reaktion phagozytieren gewebsständige APCs (Makrophagen und dendritische Zellen) Ag, prozessieren es, um es auf MHC-II-Molekülen im Beisein von costimulatorischen Signalen zu präsentieren. Gleichzeitig wandern APCs nach Aktivierung und Phagozytose von Antigen vom Ort der Entzündung in den drainierenden Lymphknoten und transportieren damit Antigen aus nicht-lymphatischen, peripheren Geweben in spezialisierte lymphatische Organe. Alternativ kann lösliches Antigen auch direkt in den Lymphknoten durch die afferente Lymphe gelangen, wo es in ein System aus kleinen Kanälen, das die T-Zell-Zone in Lymphknoten durchzieht, mündet. Cytoplasmatische Ausläufer von dendritischen Zellen in den T-Zell-Zonen gelangen durch kleine Lücken in die Kanäle und können hier Ag aufnehmen. Bereits 30 Minuten nach Ag-Deposition in der Haut sind dendritische Zellen(DC) so in der Lage, Antigen im Lymphknoten zu präsentieren[9, 10]. Naive Th-Zellen, die beständig durch das lymphatische Gewebe migrieren, kommen hier in direkten Zellkontakt mit aktivierten APCs. Im Fall der Bindung der Ag-MHC-II-Komplexe an den TCR kommt es, unterstützt durch Bindung von costimulatorischen Molekülen, zu einer Aktivierung der Th-Zelle[9]. Die Aktivierung wird vermittelt durch Ligation des TCR und CD28 auf der naiven T-Zelle durch Ag-Peptid-MHC-II-Komplexe und CD80 und CD86 auf der DC[8]. DCs sezernieren weiterhin Zytokine, die zu einer T-Zell-Proliferation und Differenzierung beitragen. Naive Th-Zellen exprimieren nach Aktivierung CD69 und produzieren Wachstumsfaktoren, wie IL-2- und TNFα-Rezeptor-Moleküle[11]. In Abhängigkeit von der Qualität dieser Aktivierungssignale kommt es zur Proliferation und funktionellen Differenzierung der CD4+_{-T-Zellen in unterschiedliche} T-Helfer-Subpopulationen (s. u.). Nach einer Proliferationsphase, ca. eine Woche nach Ag-Kontakt, verlassen die Effektorzellen den Lymphknoten durch die efferente Lymphe und gelangen ins Blut.

T-Helferzell-Subpopulationen

Entsprechend ihrer Funktion werden T-Helferzellen bisher in Th1-, Th2-, regulatorische Th(Treg)- und Th17-Zellen unterschieden. Die verschiedenen Populationen entstehen nach einer Aktivierungsphase (ca. 1-2 Tage)aus naiven T-Lymphozyten. Auf diese folgt eine Ag-unabhän-gige Proliferationsphase bis zum Tag 4[6, 12]. In dieser Phase kommt es zu einer zellulären Expansion um den Faktor 1.000 bis 10.000[7] mit deutlicher Vergrößerung der aktivierten Lymphknoten. Sowohl costimulatorische Rezeptoren, als auch die von den Ag-präsentierenden Zellen sezernierten Zytokine beeinflussen die spätere funktionelle Differenzierung der T-Zellen. Die Dominanz von IFNγ und Interleukin-12 (IL12) und die Abwesenheit von TGFβ in der frühen Aktivierungsphase führt zur Differenzierung in Th1-Effektorzellen, die gekennzeichnet sind durch die Produktion von IFNγ, IL2, TNFα und TNFβ[13-16]. Zu späteren Zeitpunkten der Th1-Differenzierung werden die Chemokinrezeptoren CCR5 und CXCR6, die mit inflamma-tionsassoziierten Chemokinen MIP-1α, MIP-1β und IP10 interagieren[17, 18] exprimiert.

Th2-Zellen werden durch ein anderes Profil costimulatorischer Signale induziert, insbesondere IL4 in Abwesenheit von TGFβ. Sie spielen eine große Rolle in der Abwehr parasitärer Infektio-nen und der Vermittlung von allergischen ReaktioInfektio-nen und sind charakterisiert durch die Sekretion der Zytokine IL4, IL5, IL10 und IL13.

Weitere Liniendifferenzierungen in regulatorische oder kürzlich beschriebene Th17-Zellen werden durch andere Kombinationen und costimulatorische Signale vermittelt[19-22]. Regula-torische T-Zellen werden insbesondere durch TGFβ in der Abwesenheit von IL6 generiert. Th17-Zellen sind abhängig von TGFβ, IL23, IL6 und TNFα. Sie sezernieren vornehmlich IL17. Die Beschreibung der Th17-Zellen hat die Vorstellungen der Regulation von T-Zell-vermittelten Gewebsdefekten stark verändert. Die Effektorphase von Autoimmunerkrankungen wie ED, Kontaktdermatitis und der rheumatoiden Arthritis[23-26] wird maßgeblich durch Th17-Zellen unterhalten. Dies hat die Bedeutung der Th1-Zellen für die Entstehung des Gewebsschadens stark in den Hintergrund gerückt. In der Auslösung T-Zell-abhängiger Inflammationsantworten jedoch sind – auch durch die Rekrutierung von Th17-Zellen – Th1-Effektorzellen maßgeblich an der Entstehung einer Inflammationsreaktion beteiligt. Th1-Effektorzellen stehen daher zur mechanistischen Untersuchung der Dynamik Ag-spezifischer Migration von Leukozyten in eine Inflammationsreaktion im Zentrum dieser Arbeit. Funktionelle Kennzeichen von Th1-Effektorzellen sind ihre Fähigkeit zur schnellen Zytokinproduktion nach erneuter Aktivierung, eine geringe Aktivierungsschwelle zur Restimulation, schnelle Proliferation und ihre Fähigkeit,

in periphere, nicht-lymphatische Gewebe unter homöostatischen und entzündlichen Bedingun-gen, zu migrieren. Sie werden im Folgenden als T-Effektorzellen bezeichnet.

T-Zell-Subsets

T-Zell-Subset Induzierende Faktoren Effektorzytokin

Th1 _{IL12, IFNγ, IFNγ}

Th2 IL4 IL4, IL10

Th17 _{IL23, TGFβ, IL6} IL17

Treg TGFβ IL10, TGFβ

Migrationseigenschaften

Zielorgan Adhäsionsmoleküle

Naive T-Zellen Lymphknoten CD62L, CCR7

T-Effektor-Gedächtniszellen Periphere Gewebe P-Selektin-Liganden, α4β7, CCR4 zentrale-T-Gedächtniszellen Lymphknoten, Milz CD62L, CCR7

Tabelle 1:

Übersicht über induzierende Faktoren und Migrationseigenschaften der unterschiedlichen T-Helferzell-Subsets

1.4 Leukozytäre Migration (Multi-Step-Modell)

Die Einwanderung von Leukozyten und Lymphozyten in verschiedene Kompartimente des Körpers ist essentiell für ihre effektive Funktion im Rahmen der Immunantwort. Während naive T-Zellen zwischen Lymphknoten und Blut zirkulieren, gelangen Effektorzellen schnell in ent-zündetes Gewebe. Die Einwanderung der Zellen ist ein streng regulierter Prozess, der in mehre-ren Schritten abläuft und im sogenannten Multi-Step-Modell verdeutlicht wird (siehe 1.5.1)[27-30]. Im Rahmen einer Inflammationsreaktion kommt es durch lokale proinflammatorische Zyto-kine und ChemoZyto-kine zur Aktivierung des Endothels mit folgender Expression von Adhäsions-molekülen. Aktivierte Lymphozyten marginalisieren zunächst im Gefäßbett der Inflammations-reaktion durch niedrig affine Interaktionen zwischen Selektinen und entsprechenden Rezeptoren der Endothelwand. Dieser Prozess führt zur nächsten Phase, dem Rollen der Lymphozyten entlang der Endothelwand. Durch Chemokine, die auf den Endothelzellen in das Gefäßlumen präsentiert werden und entsprechende Rezeptoren auf Lymphozyten binden, erfolgt eine Aktivierung der Lymphozyten („outside-in signalling“), die eine Affinitätssteigerung von Adhäsionsmolekülen, den Integrinen, verursacht („inside-out signalling“)[29, 31-33]. Die Steigerung der Affinität führt zur festen Bindung der Integrine mit den entsprechenden endothelialen Rezeptoren. Die fest adhärierenden, aktivierten Lymphozyten migrieren dann

durch die Basalmembran des Endothels und werden durch Entzündungsmediatoren wie Zytokine in das Entzündungsgebiet gelenkt.

1.5 Migrationseigenschaften unterschiedlicher T-Helfer-Zellpopulationen

Lymphozyten zeigen ein sehr differenziertes Rezirkulationsverhalten abhängig von Subset, Aktivierung und funktioneller Differenzierung. Hier soll insbesondere auf die Migration von (CD4+) _{T-Helferzellen eingegangen werden. Grundlegend unterschieden werden muss zwischen} naiven und T-Effektor-/Gedächtniszellen, welche unterschiedliche Funktionen und ein unter-schiedliches Migrationsmuster aufweisen. Dieses unterschiedliche Verhalten ist durch eine differentielle Expression von Adhäsionsmolekülen und Rezeptoren für lokal und systemisch wirkende Botenstoffe vermittelt.

Erste Arbeiten in den 70er Jahren konnten verschiedene leukozytäre Subsets nachweisen, die sich in ihrem Migrationsverhalten unterscheiden. Gowans und Taub konnten so zeigen, dass Lymphozyten zwischen Blut und ihrem primären Aktivierungsort rezirkulieren, und so zwischen Lymphknoten- und Milz-migrierenden Lymphozyten unterscheiden[34, 35]. Cahil et al. konnten in einem Schafmodell durch selektive Drainage von lymphatischen Gefäßen lymphozytäre Populationen unterscheiden, die selektiv in intestinale und periphere Lymphknoten migrieren[36]. Eine genauere Differenzierung der lymphozytären Migrationseigenschaften konnte jedoch erst nach genauerer Charakterisierung und Differenzierung von naiven und T-Effektor/ Gedächtnis-Zellen durch Oberflächenmarker vorgenommen werden[37, 38].

Naive T-Helferzellen (CD4+)

Während naive Th-Zellen durch lymphoide Organe bei fehlendem Kontakt zu ihrem spezifischen Antigen rezirkulieren, haben T-Effektorzellen Zugang zu nicht-lymphoidem Gewebe[39]. Die Grundlage für dieses differentielle Wanderungsverhalten ist die koordinierte Regulation von Adhäsionsmolekülen im Verlauf der T-Zell-Differenzierung[17] und -Aktivierung[40]. Naive Th-Zellen exprimieren das Selektin CD62L oder das α4β7-Integrin, CCR7 und LFA-1, um mit Adhäsionsmolekülen, die auf spezialisierten Endothelzellen der Lymphknotenvenolen (high endothelial venoles, HEV) exprimiert werden, zu interagieren[41]. Selektine vermitteln die initiale Marginalisierung und das Rollen der Lymphozyten entlang der Endothelwand durch Interaktion mit den entsprechenden Liganden. Cd62L bindet an PNAd (peripheres Lymphknotenadressin), das vornehmlich auf den Venolen peripherer Lymphknoten exprimiert wird; hingegen bindet das α4β7-Integrin das mukosale Adhäsionsmolekül-1 (MAdCAM-1), das

vornehmlich auf hochendothelialen Venolen (HEV) Mukosa-assoziierter lymphatischer Gewebe exprimiert wird[42]. HEV präsentieren weiterhin die Chemokine CCL19 und CCl21, die den CCR7-Rezeptor auf den rollenden naiven Th-Zellen aktivieren. Dies führt zu einer Aktivierung des Adhäsionsmoleküls LFA-1 auf den T-Zellen und vermittelt eine starke Bindung an ICAM-1 auf der Endothelwand[32]. Nach Adhäsion migrieren Lymphozyten durch das Endothel und erreichen, gesteuert über einen Chemokingradienten[43], die Lymphfollikel, wo sie in Kontakt zu aktivierten dendritischen Zellen kommen, die eine chemokinvermittelte (CCL 10) Retention naiver T-Helferzellen vermitteln.

Naive Th-Zellen verbleiben ca. einen Tag im Lymphknoten und interagieren mit dendritischen Zellen. Bei Fehlen einer Ag-Präsentation auf MHC-II-Molekülen wandern naive Th-Zellen wieder aus dem Lymphknoten aus. Im Falle der Ag-Erkennung auf MHC-II-Molekülen verbleiben naive Zellen im Lymphknoten[9]. Nach Aktivierung und Retention der naiven Th-Zellen, die zuerst im Schafmodell von Ford und Cahill als „lymphocyte shutdown“[44, 45] bezeichnet wurde, folgt auf eine Proliferations- und Differenzierungsphase die Ausschwemmung der Effektorzellen ins periphere Blut.

Lymphknotenegress

Der Mechanismus der leukozytären Auswanderung aus dem Lymphknoten konnte kürzlich durch die Charakterisierung eines hierfür zentralen Rezeptors entschlüsselt werden. Die Familie der Sphingosin-1-Phosphatrezeptoren (S1P1) – bisher sind 5 im humanen System bekannt – vermittelt G-Protein gekoppelt ein Migrationssignal[46, 47]. Aktivierte naive Th-Zellen regulieren so nach Ag-Kontakt S1P1-Rezeptoren temporär herunter, verbleiben im Lymphknoten[48, 49] und migrieren nach Reexpression von S1P1-Rezeptoren aus dem lymphoiden Gewebe.

T-Effektor-/Gedächtniszellen Subsets

Wie schon vorher beschrieben, kommt es in Abhängigkeit von der Qualität der Aktivierung naiver Th-Zellen zur Differenzierung in unterschiedliche T-Effektor- oder regulatorische Th-Zel-len. Diese Differenzierung beinhaltet auch die Expression neuer Adhäsionsmoleküle, die es den T-Effektorzellen erlaubt, in nicht-lymphoides Gewebe zu migrieren. Die unterschiedlichen Subsets an T-Effektorzellen können anhand dieses gewebsspezifischen Migrationsmusters weiter unterschieden werden in lymphoides Gewebe, dünndarm- oder hautmigrierende T-Effektorzellen.

Unterschieden wird zunächst die Differenzierung in zentrale Gedächtnis- und periphere Effektor-und Gedächtnis-Th-Zellen. AufgrEffektor-und des ähnlichen Immunphänotyps Effektor-und der Migrationseigen-schaften werden Letztere zusammengefasst zu T-Effektor-Gedächtnis(„effector-memory“; Teff/em)-Th1-Zellen[50, 51].

Zentrale Gedächtnis-T-Zellen sind bevorzugt im Lymphknoten lokalisiert und werden nach erneutem Ag-Kontakt erst nach einer Stimulationsphase aktiviert. Sie sind charakterisiert durch die Expression des Adhäsionsmoleküls CD62L und der Chemokinrezeptoren CCR7 und CXCR4. Teff/mem-Zellen hingegen lokalisieren präferentiell in peripherem Gewebe[39, 52] und sind direkt nach Ag-Kontakt in der Lage, Effektorfunktionen mittels Zytokinproduktion aufzunehmen. Basis ihres potenten Gewebshomings ist zum einen das Fehlen von CCR7 oder CD62L, die vornehmlich eine Migration in lymphoide Gewebe vermitteln[53], zum anderen die Expression spezifischer Adhäsionsmoleküle, welche die Migration in peripheres Gewebe vermit-teln[50].

Die gewebsspezifische Migration von T-Effektorzellen wird im Rahmen der Aktivierung naiver T-Zellen durch eine gewebsspezifische Induktion von Adhäsionsmolekülen verursacht. Teff/mem -Zellen, die in peripheren Lymphknoten aktiviert werden, exprimieren in Anwesenheit von IL-12 präferentiell den P-Selektin-Liganden-1 (PSGL-1). Die Liganden für diesen – CD62P und CD62E (P- und E-Selektine) – werden wiederum vorwiegend auf hautassoziierten aktiviertem Endothel exprimiert[54]. Das Endothel entzündeter Hautareale exprimiert vermehrt das Chemokin CCL17 und durch die Expression des korrespondierenden Rezeptors CCR4[18, 55-57] entsteht ein hautspezifisches Adhäsionsmuster. Die Bedeutung dieser Interaktionen für eine hautspezifische Migration wird unterstrichen durch die verminderte Migration von T-Effektor-zellen in entzündete Haut in CCR4-, CD62E- oder CD62P-defizienten Mäusen[58].

Ein anderes Verhalten zeigen T-Zellen, die innerhalb mesenterieller Lymphknoten oder Peyers patches aktiviert werden[54, 59]. Hierbei erfolgt eine Induktion des Integrins α4β7[60, 61] und des Chemokinrezeptors CCR9[62, 63], die eine Migration in mukosales Gewebe vermitteln[64]. Der wichtigste Ligand für das α4β7-Integrin ist MAdCAM-1, das in den Venolen der lamina propria exprimiert wird[65]. Die Liganden des Chemokinrezeptors CCR9, CCL25 und TECK, werden hingegen stark von epithelialen Zellen des Dünndarms exprimiert[66]. Gewebsspezi-fische dendritische Zellen werden für dieses Phänomen der differentiellen Induktion von Adhä-sionsmolekülen verantwortlich gemacht[67-70]. Insbesondere Retinolsäure und Vitamin D werden unterschiedlich von diesen DCs verstoffwechselt und führen gewebsspezifisch zur Induktion der entsprechenden Adhäsionsmoleküle[71-73]. Über diese spezifischen Muster der

Expression von Adhäsionsmolekülen können T-Effektorzellen unterschiedliche periphere inflammatorische Gewebe erreichen.

1.6 Die Rolle von Antigen für die Akkumulation von T-Effektorzellen Lymphozyten im peripheren Gewebe

Die effektive Funktion einer ortspezifischen Inflammationsantwort etwa zur Abwehr von Infektionen oder der Tumorsurveillance wird durch das adaptive Immunsystem potent vermittelt. Die Rolle von Adhäsionsmolekülen und aktivierungsabhängigen Mechanismen für die Ansammlung von T-Effektorzellen in nicht-lymphoiden Geweben ist intensiv untersucht[74]. Die Frage jedoch, welche Rolle die Spezifität der Erkennung bestimmter Strukturen durch den TCR hat, also die Ag-Spezifität, wird seit den 70er Jahren untersucht und weiterhin kontrovers diskutiert. Zunächst wurde gezeigt, dass T-Zellen nach Ag-Kontakt aus der Zirkulation verschwinden und sich im Ag-drainierenden Lymphknoten lokalisieren[75-77] und von dort ca. 30 h nach Aktivierung auswandern. Diese Arbeiten konnten zwar nicht zwischen unterschiedlichen Lymphozytenpopulationen unterscheiden, da die leukozytären Oberflächenmoleküle noch nicht beschrieben waren, dennoch konnte über selektive Lymphdrainage die Lymphozytenmigration verfolgt werden. Diese Arbeiten begründeten das Konzept des T-Zell-„Trappings“, die selektive Retention von Lymphozyten. Nach Charakterisierung der lymphozytären Oberflächenepitope und der funktionellen Beschreibung lymphozytärer Subsets konnte dann das Phänomen der Retention von Lymphozyten genauer beschrieben werden. Eine Reihe von Untersuchungen zeigte eine Abnahme von Effektor-/Gedächtnis-T-Zellen aus der Zirkulation und eine Anreicherung dieser Zellen innerhalb von Entzündungsherden im Mausmodell[39, 78-80]. Auch in weiteren Spezies gelang der Nachweis einer selektiven lymphozytären Migration, so z. B. in Ratten[81, 82], Schafen[76] und dem Menschen[83]. Schließlich gelang im TCR-transgenen Tiermodell mit genau definiertem Antigen der Nachweis einer Akkumulation von Ag-spezifischen T-Effektorzellen in Inflammationsreaktionen, die Antigen enthalten. Dies konnte zum Beispiel in Autoimmunreak-tionen[84-86] und in Infektionsmodellen[87] demonstriert werden. Dieser Prozess der Ag-spezifischen Migration hat für viele Prozesse, wie die Infektabwehr, die Regulation von Auto-immunprozessen und eine effektive Tumorsurveillance, eine große Bedeutung. Die Rolle von Antigen auf die Migration von Ag-spezifischen T-Effektorzellen im Gegensatz zu nicht spezifi-schen, polyklonalen T-Effektorzellen wurde bisher nicht untersucht und wird daher im Folgenden beschrieben. Dies erlaubt eine Abgrenzung aktivierungsabhängiger Mechanismen von Antigen-abhängigen Mechanismen in Entzündungsreaktionen.

Mechanismen des Trappings von T-Effektorzellen

Der deutlichste Hinweis für die Existenz eines Ag-spezifischen Trappings von T-Effektorzellen kam durch die Arbeiten von Reinhardt et al., die eine Akkumulation von Ag-spezifischen CD4+ -T-Effektorzellen in einer Hautinflammation im Verlauf von wenigen Wochen einer akuten Entzündungsreaktion nachweisen[87, 88]. Die Dynamik dieses Prozesses, insbesondere die Kinetik der leukozytären Immigration, wurde hier jedoch nicht näher untersucht. Antigen kann dabei theoretisch die Akkumulation von T-Effektorzellen auf mehreren Ebenen beeinflussen. So kann erstens der Schritt der Emigration oder Extravasation aus dem Blutstrom in das Gewebe z. B. durch endothelständige Ag-Präsentation beeinflusst werden. Zweitens kann die Dauer der APC:T-Zell-Interaktion durch Antigen beeinflusst werden und drittens kann der Egress der Zellen z. B. durch eine aktivierungsabhängige Regulation der dafür benötigten Rezeptoren beein-flusst werden.

1. Ag-spezifische Adhäsion von T-Effektorzellen am aktivierten Endothel

Eine Rolle für die Ag-spezifische Ansammlung von Th-Zellen wurde durch eine endothelasso-ziierte Ag-Präsentation postuliert, die eine direkte Bindung von Ag-spezifischen Th-Zellen am Endothel von Inflammationsreaktionen erlaubt[89-91]. Humanes Endothel exprimiert konstitutiv

MHC-II-Moleküle und in vitro konnte eine Ag-spezifische Interaktion zwischen humanen Th-Zellen und dem Endothel nachgewiesen werden[92]. Murines Endothel ist erst nach IFNγ-Stimulation in der Lage, MHC-II-Moleküle zu exprimieren[93, 94], doch konnten in vivo Untersuchungen keinen Effekt der endothelialen Ag-Präsentation für eine selektive Migration zeigen[95]. Der Mechanismus der endothelialen Ag-Präsentation scheint daher eine nachgeordnete Rolle für die leukozytäre Migration zu spielen[92, 96, 97].

2. Einfluss der Interaktion zwischen APC und T-Zellen auf die T-Effektorzell-Migration

Große Widersprüche existieren über die Vorstellungen zur Dauer der T-Zell:APC-Interaktion im Gewebe, um eine Ag-spezifische Nettoansammlung von Th-Zellenzu erklären. Für ein APC-vermitteltes spezifisches Trapping sprechen Arbeiten, die ein Verschwinden von Ag-spezifischen T-Effektorzellen aus der Zirkulation und die Ansammlung in Antigen enthaltenden Organen zeigen[78, 79, 98-100]. Dies unterstützend wurde eine Ansammlung von Autoantigen-spezifischen T-Effektorzellen in Organen mit Autoantigenexpression nachgewiesen[84, 101-103]. Weiterhin gelang der Nachweis einer Ansammlung Ag-spezifischer T-Effektorzellen in der Lunge im Verlauf einer experimentellen Influenza-Infektion[87] und in einer Ag-spezifischen Hautinflammationsreaktion[88]. Auf molekularer Ebene wird für das Ag-spezifische

Migrations-muster von T-Effektorzellen die Interaktion des TCR mit spezifischem Antigen auf MHC-II-Molekülen postuliert. Diese Interaktion soll zur differentiellen Regulation von z. B. Adhäsions-molekülen betragen, die so eine Ag-spezifische Lokalisation vermitteln. Die Interaktion des TCR mit Antigen beladenen MHC-II-Komplexen ist niedrigaffin, so dass sie wahrscheinlich keine direkte Rolle in der T-Zell-Adhäsion spielt. Hingegen ist die sekundäre Induktion von Adhäsionsmechanismen wahrscheinlicher[104]. Möglicherweise vermitteln proinflammatorische Effektorzytokine, wie TNFα oder IFNγ, diese sekundären Effekte und führen durch eine selektive Aktivierung zur Retention von Ag-spezifischen T-Effektorzellen.

Arbeiten, die In-vivo mit TCRtg-T-Helferzellen die Migration Ag-spezifischer T-Effektorzellen untersuchten, zeigten ein mehrphasiges Interaktionsmuster von T-Zellen mit Ag-präsentierenden Zellen, das initial durch eine serielle, kurzlebige Interaktion von Ag-spezifischen naiven Th-Zellen mit APCs gekennzeichnet ist. In der zweiten Phase der Inflammation, nach mehreren Stunden, kam es zu einer stabilen Bindung, die durch die Produktion von proinflammatorischen Zytokinen gekennzeichnet war und in die dritte Phase hochgradiger Motilität und Proliferation überging[99]. Hieraus lässt sich jedoch für Effektorzellen sowohl eine Ag-spezifische als auch eine unspezifische Retention ableiten. Andere Arbeiten unterstützen die Annahme von Ag-spezifischen, lang anhaltenden Bindungen von dendritischen Zellen und Ag-spezifischen T-Zellen[105]. In einem Inflammationsmodell des ZNS, der experimentellen Autoimmunenze-phalitis (EAE), die – ähnlich der T-Zell-abhängigen Immunantwort vom verzögerten Typ (delayed type hypersensitivity, DTH) – eine T-Zell-abhängige Inflammationsreaktion ist, zeigt sich eine MHC-II-abhängige Migrationsverlangsamung Ag-spezifischer T-Effektorzellen. Hier wurde erstmals auch eine Kontrolle mittels aktivierter T-Helferzellen mit irrelevanter Spezifität untersucht[106], die ohne Verlangsamung durch das Gewebe wandern. Ob diese Ag-spezifische Verlangsamung durch die Interaktion von APC mit Ag-spezifischen T-Effektorzellen bedingt ist, wurde jedoch nicht direkt gezeigt. Die genaueren molekularen Mechanismen dieser Interaktion, insbesondere notwendige Co-Rezeptoren und die Regulation dieser spezifischen Interaktion, sind bisher unzureichend charakterisiert worden. Insbesondere die Integrine αL und α4 scheinen hierbei keine Rolle zu spielen. Dies ist insofern überraschend, da diese Integrine in der APC:T-Helferzell-Interaktion und in der Bindung von Leukozyten an extrazelluläre Strukturen beteiligt sind[83, 107].

Gegen ein Ag-spezifisches Trapping sprechen Befunde, die zeigen, dass Ag-spezifische CD4+-und CD8+-Gedächtniszellen in einer Reihe nicht-lymphoider Organe, die kein Antigen enthal-ten, nachweisbar sind[39, 108-111]. Für CD8+-T-Zellen, die jedoch möglicherweise einer

ande-ren Regulation als CD4+-Zellen unterworfen sind, konnte in einem Tumorantigen-spezifischen Modell eine Ag-unabhängige Infiltration in Tumore gezeigt werden[112]. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass naive Th-Zellen, Effektor- und Gedächtnis-T-Zellen Interaktionen mit APCs in lymphoiden Organen in gleicher Frequenz und Dauer unabhängig von der Ag-Spezifität eingehen[100]. Ein weiterer Mechanismus der Anreicherung Ag-spezifischer Effektorzellen ist eine Ag-spezifische Proliferation am Inflammationsort. Die bisher durchgeführten Studien konnten zwar eine proliferierte Population von T-Effektorzellen am Inflammationsort nachweisen; ob dies durch lokale Proliferation oder selektive Migration proliferierter Zellen verursacht war, ließ sich jedoch nicht klären[88]. Die Konsequenzen der lokalen APC:TCR-Interaktion für die Lokalisation oder Proliferation Ag-spezifischer T-Effektorzellen sind somit nicht abschließend untersucht.

3. Einfluss von Antigen auf den lymphozytären Egress

Die Regulation des Egresses von T-Effektorzellen ist bisher wenig untersucht. Bekannt ist, dass CCR7- und S1P1-Rezeptoren insbesondere in Lymphknoten für die Emigration aktivierter T-Effektorzellen von Bedeutung sind[113, 114]. Unklar ist jedoch, ob eine Ag-abhängige Aktivierung direkten Einfluss auf den Egress hat.

Somit existieren direkte und indirekte Mechanismen, die einen Einfluss von lokalem Antigen auf die Lokalisation von Ag-spezifischen T-Effektorzellen wahrscheinlich machen. Die beobachtete Akkumulation von Ag-spezifischen T-Effektorzellen in Entzündungsreaktionen ist das Resultat von Ag-spezifischer Migration, Ag-spezifischem Trapping, verändertem Egress Ag-spezifischer Zellen und lokaler Proliferation Ag-spezifischer Zellen. Durch die bisher durchgeführten Experimente lässt sich nicht zwischen dem Verhalten von Ag-spezifischen und polyklonalen T-Effektorzellen unterscheiden und die Rolle von Antigen auf die Akkumulation von Ag-spezifischen T-Effektorzellen im inflammatorischen Kontext in nicht-lymphoiden Organen ist somit nicht klar.

1.7 Zielstellung der Arbeit

Ziel der vorliegenden Arbeit war die Untersuchung der Funktion von Ag-spezifischen T-Effektorzellen in der Entwicklung einer Inflammationsreaktion und der Funktion von lokalem Antigen für eine präferentielle Akkumulation Ag-spezifischer T-Effektorzellen.

Die Rolle von Antigen in der Auslösung und Steuerung der Immunantwort wird derzeit nach fol-gendem Paradigma beschrieben: In primären Immunreaktionen werden APCs durch

unspezifi-sche Reize bei Gewebsuntergang und durch unspezifiunspezifi-sche Abwehrmechanismen aktiviert, prozessieren Antigen und präsentieren dies auf MHC-II-Molekülen. In Folge der Aktivierung wandern die APCs in den Lymphknoten aus. Hier kommt es zur Interaktion mit naiven Th-Zellen, die durch lymphoide Gewebe rezirkulieren und nach Ag-Erkennung aktiviert werden, proliferieren und differenzieren. Die entstandenen Effektor-/Gedächtnis-Zellen (z. B. Th1-Zellen) verlassen den Lymphknoten über die efferente Lymphe, gelangen über den ductus thoracicus in den Blutstrom und werden im gesamten Körper verteilt. Unter homöostatischen Bedingungen wandern diese Zellen in periphere Gewebe ein. Erfolgt dort keine Ag-Erkennung, wandern diese Zellen in die lokalen Lymphknoten(LN)und verlassen diese wieder über die efferente Lymphe um letztlich wieder über den Blutstrom erneut zu rezirkulieren. Besteht eine Entzündung im peripheren Gewebe, kommt es zur verstärkten Extravasation von T-Effektor-zellen in das Gewebe. Erkennen spezifische T-EffektorT-Effektor-zellen ihr spezifisches Ag, führt dies zur Aktivierung der Effektorfunktionen und einer Verstärkung der Inflammation. Im Rahmen der sich entfaltenden Entzündungsreaktion wird wiederum Antigen in die drainierenden Lymphknoten transportiert und an naive, Effektor- und Gedächtnis-T-Zellen präsentiert, die in der Folge aktiviert werden und proliferieren. Am Inflammationsort wird dann eine starke Ansammlung Ag-spezifischer T-Effektorzellen beobachtet.

Die Rolle von Antigen für diese Akkumulation von Ag-spezifischen Effektorzellen im Entzün-dungsgewebe im Verlauf einer akuten Entzündung ist jedoch unklar. Nach der zu untersuchen-den Hypothese, die sich aus der Modellvorstellung des Ag-spezifischen „Trappings“ ableitet, werden Ag-spezifische T-Effektorzellen in der Entzündungsreaktion durch Ag-Präsentation in nicht-lymphoiden Geweben selektiv zurückgehalten. In der Folge akkumulieren Ag-spezifische T-Effektorzellen über die Zeit und verstärken die Entzündungsreaktion. Alternativ kann die Migration der T-Effektorzellen vollständig unabhängig von der Ag-Spezifität sein, und die Migration aktivierter T-Effektorzellen in eine Inflammationsreaktion wäre alleinig abhängig vom Aktivierungsstatus. Möglicherweise verändert sich auch die Migrationskapazität zu unterschied-lichen Phasen der Inflammationsreaktion, so dass unterschiedliche Mechanismen zur Ansammlung Ag-spezifischer T-Effektorzellen in Inflammationsreaktionen führen.

Untersucht werden sollten daher die folgenden Fragen:

• Welche Rolle haben Ag-spezifische T-Effektorzellen für das Auslösen der Inflammations-antwort?

• Ist die Migration Ag-spezifischer T-Effektorzellen im Gegensatz zu polyklonalen Zellen in eine akute Inflammationsantwort spezifisch?

• Akkumulieren Ag-spezifische T-Effektorzellen in der akuten Inflammationsreaktion?

• Unterscheidet sich das T-Effektorzell-Infiltrat in frühen von dem in späten Zeitpunkten?

• Welche Rolle spielen sekundäre Aktivierungsmechanismen wie das proinflammatorische Zytokin TNFα für die Migration von T-Effektorzellen?

2 Material

2.1 Medien und Lösungen

Komplett-Medium RPMI 1640 mit Glutamax-I (incl. 25mM HEPES, 10 % fetales Kälberserum, 50 uM Mercaptoethanol, 1mM Na-Pyruvat, 100 U/ml Penicillin, 100 U/ml Streptomycin)

PBS einfach NaCl 8 g/l, KCl 0,2 g/l, KH2PO4 0,2 g/l, 1,4 g/l Na2HPO4*2H2O Waschmedium PBS, einfach, Rinderserumalbumin (BSA) 2 g/l

Saponin-Puffer PBS, BSA 2 g/l, Saponin 5 g/l, NaN3 15mM Fixierungslösung PBS, Paraformaldehyd (PFA) 10 g/l, pH 7

Erythrozyten-Lyse-Puffer KHCO3 10mM, NH4Cl 155 mM, EDTA 0,1 mM, pH 7,5

Nycodenz-Lösung Nycodenz 17g, RPMI 1640 26ml, FCS 10ml, ad 100ml mit H2O dest

2.2 Zusätze zur Zellkultur

Rekombinante Zytokine

rek. murines Il-2 R+D Systems (Wiesbaden)

rek. murines Il-12 R+D Systems (Wiesbaden)

rek. murines IFN-γ R+D Systems (Wiesbaden)

Ovalbumin Protein und Peptid

Es wurde Ovalbuminprotein Grade V von Sigma mit einem Molekülgewicht von 44287 verwendet.

Ovalbuminpeptid OVA323-329 mit der Sequenz 323 ISQAVHAAHAEINEAGR 329 wurde vom Institut für Biochemie der Humboldt Universität zu Berlin synthetisiert.

2.3 Antikörper

Aufreinigung von CD4+ T Zellen via „Panning“

Spezifität Klon Quelle

anti Ratte IgG polyclonal DAKO

Panning Mix:

Ratte-anti-Maus CD8 TIB105 (53-6.72) ATCC

Ratte-anti-Maus Mac-1 M1/70 ATCC

Ratte-anti-Maus CD25 PC6.1 Nabholz, Hartmann

Ratte-anti-Maus B220 RA3-6B2 DAKO

Ratte-anti-Maus FcRII, III 2.4G2 ATCC

Antikörper zur durchflusszytometrischen Färbung

Blockade von TNFα

Hierzu wurde ein lösliches Rezeptorkonstrukt aus zwei p75-Untereinheiten des humanen TNFα-Rezeptors verwendet (Etanercept, Enbrel®). Es wurden 0,4 mg/kg KGappliziert[115]. Zu den gekennzeichneten Zeitpunkten wurde das Rezeptorkonstrukt i. p. injiziert[116, 117].

Spezifität Klon Kopplung

anti-Maus CD3 145-2C11 PE, FITC

anti-Maus CD4 GK1.5 FITC, CY5, PerCP

anti-Maus OVA-TCRtg KJ1-26.1 CY5

anti-Maus CD62L Mel14 FITC, PE

human-P-Sel Vestweber unkonjugiert

anti-human P-Sel Vestweber PE

anti-Maus IFNγ XMG1.2 FITC, PE

anti-Maus CD8 53-6.72 FITC, PE

anti-Maus B220 RA3-6B2 FITC, PE

anti-Maus IL-4 11B-11 FITC, PE

Isotypkontrollen

anti-Maus IgG1 R3-34 FITC, PE

anti-Maus IgG2a R35-95 FITC, PE

2.4 Radioisotope zur Zellmarkierung

111 _{Indiumoxin 8-Chinolinol,[}111In_{]Indium(III)-Salz Amersham Buchler}

51 _{Chromium Na-}51_{Chromat Amersham Buchler}

51_{Cr ist ein γ-Strahler und gibt Elektronen im Bereich von 250 bis 350 keV ab; ein} charakte-ristischer Peak liegt bei 320 keV. Die Halbwertszeit liegt bei 66,7 h.

111_{In ist ein γ-Strahler und gibt Elektronen im Bereich von 320 bis 541 keV ab; ein} charakteristi-scher Peak liegt bei 416 keV. Die Halbwertszeit liegt bei 67,7 h.

2.5 Versuchstiere

Zur Organentnahme wurden weibliche Balb/c, Do11.10 und Do11.10 TCRα k. o.[118, 119] Mäuse verwendet. Die Mausstämme sind haploident (Haplotyp b im H-2).

Die Stämme Do11.10 und Do11.10 TCRα k.o. exprimieren einen monoklonalen T-Zell-Rezeptor, der immunodominant die Sequenz OVA323-329 aus Hühneralbumin erkennt. Der Stamm Do11.10 bildet zu ca. 60 % Ag-spezifische T-Zell-Rezeptoren aus, wohingegen der Stamm Do11.10 TCRα k. o. ausschließlich den transgenen T-Zell-Rezeptor exprimiert.

Der TCR setzt sich aus je 2 Untereinheiten zusammen, die auf unterschiedlichen T-Zell-Subsets exprimiert werden. Unterschieden werden α/β- und γ/δ-TCR, wobeiα/β-TCR-exprimierende T-Zellen hauptsächlich zur adaptiven Immunantwort beitragen. T-T-Zellen von Do11.10-Tieren exprimieren T-Zellen mit je 2 unterschiedlichen TCR. Durch die endogene α-Kette wird der endogene α/β-TCR unddurch die transgene α-Kette der transgene α/β-ΤCR gebildet[118]. In DO11.10 TCR α k. o. ist die α Kette deletiert, so dass der endogene T-Zell-Rezeptor nicht mehr zusammengesetzt werden kann, und die T-Zellen exprimieren ausschließlich einen funktionellen transgenen α/β-TCR. Für In-vivo-Homing-Versuche wurden Balb/c als Empfängertiere verwen-det. Die Tiere waren acht bis zwölf Wochen alt. Die Zuchthaltung wurde im Institut für Risiko-bewertung Berlin unter SPF-Bedingungen durchgeführt. Die Versuche wurden im Rahmen der Tierversuchsgenehmigung G0028/97 (Prof. Hamann) durchgeführt.

3 Methoden

3.1 Lymphozytenisolation aus der Maus

Zur Gewinnung der Lymphozyten wurden die Tiere durch Genickbruch getötet und anschließend erfolgte die Entnahme von peripheren und mesenteriellen Lymphknoten und der Milz. Nach mechanischer Zellvereinzelung aus dem Gewebsverband wurden vitale monozytäre Zellen durch Gradientenzentrifugation gewonnen und entsprechend der Zielpopulation aufgereinigt und kultiviert. Alle Zellkulturisolationsschritte wurden unter sterilen Bedingungen in Laminair-Flow-Arbeitsplätzen durchgeführt.

3.2 In-vitro-Generierung von CD4+_{-Effektorzellen (Th1-Kultur)}

Ziel der Arbeit war, das Verhalten von CD4+-T-Effektorzellen zu verfolgen. Hierzu wurden naive CD4+-T-Zellen isoliert und polyklonal mit Antikörpern In-vitro stimuliert und unter Zyto-kineinfluss zu T-Effektorzellen (Th1) polarisiert.

Aufreinigung von naiven (CD62L high) CD4-Zellen

Zunächst wurden Lymphknoten, die den höchsten Anteil an naiven CD4+-Zellen enthalten, aus gesunden Wildtyp(wt)- und OVA-TCRtg-Tieren isoliert. Monozytäre Zellen aus lymphatischen Organen wurden nach mechanischer Organzerkleinerung mittels Dichtezentrifugation für 10 min. bei 2.000 g über Nycodenz aufgereinigt. Die gereinigten Zellen wurden in einer Petrischale ausgesät, welche über Nacht mit Kaninchen-anti-Maus-Antikörpern (50 ug/ml, DAKO) beschichtet wurde und vor Einsatz 5-mal mit PBS gewaschen wurde. Dieser Schritt isoliert unspezifisch bindende Zellen, insbesondere B-Zellen. Nach 20 min. wurden die nicht adhärenten Zellen durch vorsichtiges Spülen abgenommen und bei 2*107 Zellen/ml im Panning-Mix resuspendiert. Nach 20 min. Inkubation auf Eis und 2-maligem Waschen wurden die Zellen in Folge auf 2 anti-Maus-Ig-Ak-beschichtete Petrischalen ausgesät und nach 20 min. Inkubation durch vorsichtiges Spülen gewonnen. Bei dieser Technik sind mehrere Interaktionen der zu depletierenden Zellen mit der mit Immunglobulin beschichteten Oberfläche möglich. Fc-Rezeptor-tragende Zellen (Makrophagen, B-Zellen) können über eine Bindung des Fc-Fragments des Ratte-anti-Maus-Ak adhärieren, die durch die Panning-Mix-Ak markierten Zellen werden durch die anti-Fab-Fragmente der Ratte anti-Maus-Ak gebunden.

Durch die Negativdepletion ließ sich eine 94- bis 98%ige Reinheit von CD4+-Zellen erzielen. Im Anschluss erfolgte eine Positivselektion auf CD62L (L-Selektin), ein Marker für naive

Th-Zellen, mittels Magnet-aktivierter Zellsortierung (MACS). Hierbei wurden Antikörper verwen-det, die mit paramagnetischen Metallpartikeln (MACS beads) gekoppelt waren. Nach Mar-kierung der Zielpopulation ließ sich eine Positivselektion durch selektive Adhäsion im magnetischen Feld in einer Säule aus Stahlwolle durchführen. Nach Entfernung des magneti-schen Felds konnten die Zellen mobilisiert und in Kultur genommen werden. Insgesamt ließ sich eine Reinheit von CD4+ CD62L+-Zellen von 94-98 % erzielen (Abbildung 1).

Abbildung 1: Aufreinigung von naiven CD4-Zellen

Immunphänotypisierung der angereicherten Zellfraktionen A nach Negativdepletion für CD4 (Panning) und B nach magnetaktivierter Zellsortierung für CD62L (L-Selektin). In den Quadranten wird die prozentuale Verteilung der Zellen angegeben.

Th1-Polarisierung von naiven T-Helferzellen

Die aufgereinigten Zellen wurden polyklonal für 2 Tage stimuliert mit plattengebundenen anti-CD3(3 ug/ml)- und anti-CD28(5 ug/ml)-Antikörpern in c-RPMI 1640 angereichert mit löslichem anti-IL4 (5 ug/ml), IFNγ (20 ng/ml) und IL-12 (5 ng/ml). Nach 2 Tagen erfolgte die Umsetzung auf unbeschichtete Petrischalen, und an Tag 5, nach Abschluss der Proliferationsphase, wurden die Zellen in den Experimenten eingesetzt[12].

Phänotypisierung von Th1-Kulturen

An Tag 5 wurden die gewonnenen Kulturen zur Vergleichbarkeit vor dem Einsatz phänotypi-siert. Nach unspezifischer Stimulation mit PMA (10 ng/ml) und Ionomycin (500 ng/ml) für 4 h und BrefA (10 ug/ml) für die letzten 2 h wurde die Ag-Spezifität mit klonotypischem Ak gegen den transgenen TCR, die P-Selektinligandenexpression, als Ausdruck der inflammatorischen

CD62L

CD4

A

B

Migrationskapazität und die Produktion von IFNγ, als Ausdruck der Th1-Effektorzell-Diffe-renzierung, gemessen (s. u.).

Markierung von Lymphozyten Radioaktivmarkierung

Radioaktive Strahlung und die verwendeten Trägersubstanzen sind für lebende Zellen toxisch. Zur Minimierung von toxischen Effekten wurden Markierungsprotokolle verwendet, die als neu-tral auf die Zellmigration beschrieben sind (s. u.). Lymphozyten wurden zur In-vivo-Detektion mit zwei unterschiedlichen Radioisotopen markiert. Die Markierung erfolgte mit 51Chromium (51Cr) und 111Indium (111In). Zur Chrommarkierung wurden die Zellen mit 20 µCi 51Cr bei 2*107 Zellen/ml für 60 min. bei 36 ºC in c-RPMI inkubiert und danach einmal gewaschen. Die 111 In-Markierung erfolgte mit 1 µCi 111In bei 1*108 Zellen/ml. Hierzu wurden die Zellen mit serum-freiem Medium gewaschen und bei 1*107 Zellen/100 µl mit 1 µCi 111In für 20 min. bei Raum-temperatur inkubiert und im Anschluss einmal mit c-RPMI gewaschen. Nach radioaktiver Markierung wurden die Lymphozyten 2 h bei 36 °C inkubiert. Vor adoptivem Transfer wurde eine Dichtegradientenzentrifugation mittels Nycodenz (17,1% isotonische Lösung) durchgeführt, um durch die Markierungsprozedur geschädigte Zellen zu entfernen.

Radiodetektion

Die Messung der Radioaktivität wurde in einem automatischen γ-Zähler vorgenommen (Wallac 1480 WIZARD). Bei simultaner Messung von 51Cr und 111In wurde eine Spillover-Korrektur durch Bestimmung des Korrektionskoeffizientenund bei kurzer Halbwertszeit des 111In eine Korrektur für den radioaktiven Zerfall während der Messung sowie eine Korrektur der Hinter-grundstrahlung durchgeführt. Vor Messung wurde die korrekte Lage der radioisotopspezifischen Detektionsfenster nach automatischer Kalibrierung überprüft. Die Markierungsprozeduren waren auf eine maximale Aktivität der Proben auf 2*106 cpm eingestellt, da die Messung höherer Aktivitäten im verwendeten Gerät nicht möglich war.

Durchflusszytometrie (FACS)

Die Phänotypisierung der Lymphozyten wurde durch Messung der Fluoreszenzeigenschaften nach Markierung der Zellen mit Fluoreszenz-gekoppelten Antikörpern im Durchflusszytometer (Calibur und LSRII, BD Biosystems) durchgeführt. Hier lässt sich sowohl die Expression von Oberflächen- als auch von intrazellulären Proteinen auf Einzelzellebene bestimmen. Die verwendeten Geräte erlauben die Analyse von bis zu 20.000 Zellen/ Sekunde, so dass auch über

kleine Zellpopulationen eine genaue Aussage getroffen werden kann. Die fluoreszenz markierten Zellen passieren im hydrodynamisch fokussierten Einzelzellstrahl nacheinander zwei Laserstrahlen, einen 488 nm Argonlaser und einen 635 nm Diodenlaser. Sowohl die simultane Lichtemission der angeregten Fluorochrome, als auch Streulichtphänomene einer einzelnen Zelle werden dann nach optischer Auftrennung verschiedener Wellenlängen durch Bandpassfilter mittels Photoverstärkern gemessen. Es können dann Aussagen über die physikalischen Zelleigenschaften, die mit Größe und Granularität korrelieren und anhand der Fluoreszenzeigenschaften, Aussagen über die Proteinexpression gemacht werden. Zur Auswertung wurde die Software „Cellquest“ von BD benutzt. Zelltrümmer und tote Zellen wurden durch Größenanalyse und tote Zellen bei Messung von unfixierten Zellen durch Anfärbung mit Propidiumiodid (PI) ausgeschlossen.

Fluoreszenzmarkierung

Für die FACS Analyse wurden Lymphozyten mit den entsprechenden Flourezenzfarbstoff-gekoppelten Antikörpern in 100ul FACS Puffer für 15min. inkubiert, einmal gewaschen und dann analysiert.

Zur Verfolgung von Lymphozyten In-vivo wurden T-Effektorzellen mit einem Floureszenz-farbstoff intrazellulär gefärbt. Hierzu wurden In-vitro generierte Zellen mit 5-(and 6-)Carboxy-fluoresceindiacetatsuccinimidylester (CFSE; Molecular Probes; 5 µmol) für 2 min. und 40 sec. in PBS suspendiert. CFSE interagiert mit intrazellulären Proteinen und bildet eine kovalente Esterbindung mit diesen aus. Die CFSE Markierung lässt sich im Durchflusszytometer messen und so lassen sich markierte Zellen über einen langen Zeitraum In-vivo und In-vitro nachweisen. Die Zellen wurden gewaschen und für 2 h in frischem Medium inkubiert. Tote Zellen wurden vor Transfer über Gradientenzentrifugation mittels Nycodenz (17,1 % isotonische Lösung) ent-fernt[120].

3.3 In-vivo-Entzündungsmodell in der Haut

Um die Migrationseigenschaften der T-Effektorzellen zu untersuchen, wurden in der Arbeit experimentelle Modelle einer kutanen Inflammation verwendet. Diese Reaktion ist eine T-zellabhängige Inflammationsreaktion (Typ IV Reaktion, delayed-type hypersensitivity (DTH)), die hauptsächlich durch eine lokale Reaktivierung von T-Effektorzellen ausgelöst wird und zytotoxische T-Zellen (CD8+), Granulozyten, Makrophagen und NK-Zellen rekrutiert. Sie steht im Gegensatz zu den Antikörper-vermittelten Immunreaktionen vom „Sofort-Typ“.

Es wurden zwei Modelle verwendet, auf einige Mechanismen soll hier kurz eingegangen werden.

Unspezifische Inflammation mit Antigen

Begonnen wurden die Arbeiten mit einem Modell, in dem lokal eine Entzündungsreaktion durch komplettes Freundsches Adjuvans (CFA) mit Antigen ausgelöst wurde. CFA ist ein starkes Irritans, bestehend aus einer Öl-Emulsion mit Teilbestandteilen von Tuberkelbakterien. Als Antigen in dieser Reaktion wurde Ovalbumin, das spezifische Antigen für OVA-spezifische T-Zellen, oder Rinderserumalbumin als Kontrollantigen (BSA) eingesetzt. Vor Immunisierung/Auslösen der Inflammation wurden Balb/c-Mäuse je rechts und links an der Hinterflanke rasiert. Die Inflammationsreaktion wurde mittels s.c. Injektion von 100 µl einer Emulsion aus CFA und PBS mit 100 µg OVA-Protein oder 100 µg BSA (Kontrolle) durchgeführt. Im Verlauf von 24 h Stunden entwickelte sich eine akute Inflammationsreaktion, charakterisiert durch lokale Hautrötung und Schwellung (Abbildung 2). Es wurde dann die Akkumulation von Ag-spezifischen (OVAtg) und Ag-unspezifischen T-Effektorzellen In-vivo untersucht. Hierzu wurde die Migration von T-Effektorzellen in die behandelte Haut, die

drainierenden Lymphknoten, mesenterielle Lymphknoten, Milz, Leber, Lunge und peripheres Blut (500ul) analysiert.

OVA Protein/ CFA s.c. BSA/ CFA s.c. Adoptiver Transfer markierter Th1- Zellen 0 24 Zeit (h) (h)(h) 48 72 Antigen Exposition 24h _48h Homing Dauer

Abbildung 2:

Eine kutane Hypersensitivitätsreaktion wurde durch lokale Ag-Depositionoder Kontrollpeptid-Deposition in Verbindung mit einem unspezifischen Inflammationsreiz (CFA) ausgelöst. Markierte OVAtg_{- und wt-Th1-Zellen}

wurden 24 h später durch i.v. Injektion adoptiv transferiert und der Verlauf der Inflammation und die Migration der transferierten Zellen verfolgt.

Pionierzellvermittelte DTH

Zur genaueren Untersuchung der Ag-spezifischen Inflammation wurde das Modell modifiziert. Insbesondere zur Trennung der Effektor- von der Auslösephase der Immunreaktion, die im obigen Modell simultan erfolgte, wurde eine DTH durch Transfer von Ag-spezifischen T-Effektorzellen, im Folgenden als Pionierzellen bezeichnet, und lokale Applikation von Antigen ausgelöst und erst nach Entwicklung der Immunreaktion wurden Indikatorzellen appliziert (Abbildung 3a). Um die lokale Reaktion zu verstärken, die durch Aktivierung weniger in das Gewebe migrierter Ag-spezifischer Pionierzellen ausgelöst wird[39, 52, 121], wurde OVA-Peptid anstelle von Ovalbumin (Protein) verwendet. Lokale APCs sind so in der Lage, schneller und effektiver Antigen zu präsentieren, da eine intrazelluläre Prozessierung entfällt. In der Folge wird eine Lokalreaktion mit maximalem Ödem 24 h nach lokaler Ag-Gabe ausgelöst (Abbildung 3b). Um die Akkumulation von Ag-spezifischen und polyspezifischen T-Effektorzellen in diese Reaktion zu verfolgen, wurden diese nach Markierung adoptiv in Mäuse mit einer etablierten DTH transferiert unddie Migration gemessen.

Im Einzelnen wurden in Balb/c-Mäuse 5*105 OVA-TCRtg Th1-Effektorzellen (TCRtg) aus In-vitro-Kultur adoptiv durch Schwanzveneninjektion transferiert. Nach 24 h homöostatischer Migration dieser „Pionierzellen“ wurde eine Inflammation durch s.c. Injektion von 5 µl Emul-sion aus Inkomplettem Freundschen Adjuvans(IFA) und OVA-Peptid (OVA323-329) in die Fußsohle ausgelöst. Die deponierte Antigenmenge betrug ca. 250 ng OVA-Peptid. Im Verlauf von 24 h entwickelte sich eine akute Inflammationsreaktion. Eine Kontrollreaktion wurde mit IFA und PBS am kontralateralen Fuß ausgelöst (Abbildung 3b). Der Verlauf der so ausgelösten Entzündungsreaktion ist charakterisiert durch eine Schwellung mit Maximum 24 h nach Ag-Applikation, die im Verlauf von Tagen langsam abnimmt.

Adoptiver Transfer von ”Pionier” Zellen

A

OVA Peptid/ IFA s.c. PBS/ IFA s.c.

Adoptiver Transfer

radioaktiv markierter Th1-Zellen

- 24 0 24 Zeit (h) 48 72 Antigen Exposition 24h 48h Homing Dauer 6d 6d

B

Abbildung 3:

Eine Ag-abhängige Inflammationsreaktion, die verzögerte Hypersensitivitätsreaktion, wurde durch Transfer von OVAtg_{-Th1-Zellen unter homöostatischen Bedingungen in wt-Empfängertiere und 24 h nach Transfer durch}

OVA-Peptid-Applikation im Bereich der Fußsohle ausgelöst (Abbildung 3a). Nach weiteren 24 h wurden bei Bestehen der akuten Inflammationsreaktion markierte CD4+_{-Effektorzellen (Th1) transferiert. Die Stärke der}

Entzündungsreak-tion wurde durch Bestimmung der Fußdicke durchgeführt (Abbildung 3b) (0-48 h: n=6; 72-120 h: n = 3, * = p < 0,001, Student T Test).

3.4 Migrationsanalysen (Homing Assays)

Ziel der Arbeit war der standardisierte Vergleich der Migrationseigenschaften von polyklonalen mit Ag-spezifischen T-Effektorzellen. Um vergleichbare Populationen zu erhalten, wurden ex vivo differenzierte T-Effektorzellen generiert und adoptiv transferiert.

Untersuchung des Lymphozytenhomings mittels Radioaktivmarkierung

Die Zellen wurden wie oben beschrieben isoliert und markiert. Je 1-1,5*106 _{Zellen wurden in} Mäuse mit akuten Inflammationsreaktionen (24 h) mit und ohne Antigen transferiert. Nach 24 oder 48 h wurden die Tiere getötet und die angegebenen Organe isoliert. Eine differentielle Messung der Radioaktivität wurde mit einem γ-Counter (Wallac) durchgeführt. Dafür wurden folgende Organe isoliert: periphere Lymphknoten (cervical, axillär, inguinal), mesenterielle Lymphknoten, Milz, Leber, Darm, Lunge, peripheres Blut (500 ul), Gewebe der Inflammations-reaktion und der KontrollInflammations-reaktion (1 cm2 Haut der Flankenregion oder der gesamte Fuß) und der Restkörper. Der Anteil der Radioaktivität an der Gesamtaktivität wurde pro Organ bestimmt. Limitationen der Radioaktivmarkierung

Radioaktive Strahlung, insbesondere die verwendete γ-Strahlung, ist toxisch für lebende Zellen. Insbesondere kommt es durch strahlenvermittelte DNA-Schäden zur Aktivierung von Apoptose-mechanismen[122]. Weiterhin sind Zusatzstoffe der Radioisotope zur Stabilisierung und Kopplung für die Zellmarkierung sowie die Zerfallsprodukte toxisch.

51_{Cr wird bei Freisetzung schnell renal ausgeschieden, so dass die gemessene Aktivität lebenden} Zellen entspricht[123]. 111In wird aus apoptotischen Zellen nicht freigesetzt, sondern von ortständigen Zellen aufgenommen[124]. Die Indiumoxin-Markierung ist durch weitere, für die Lymphozytenmarkierung problematische Effekte charakterisiert. Chemotoxische Effekte aus Verunreinigungen der Indiumoxin-Präparation und eine höhere Radiotoxizität bedingen eine genaue Einhaltung der Markierungsprotokolle. Doch lässt sich unter genauer Einhaltung des oben beschriebenen Protokolls eine stabile leukozytäre Markierung erreichen, die für einen Zeitraum von 48 h eine reproduzierbare Messung erlaubt. Wichtig hierfür ist insbesondere hohe

111_{In-Aktivität, Verwendung des Isotops vor der 5. Halbwertszeit zur Minimierung der toxischen} Effekte der nicht radioaktiven Kontaminationen in der 111In-Oxinchelatlösung, Markierung mit 20 µCi/ml, da höhere Dosen zytotoxisch wirken und geringere Dosen eine oberflächliche, instabile Markierung erzeugen, sowie eine Inkubationsphase von ca. 2 h zum Auswaschen ungebundener Radioaktivität mit anschließender Gradientenzentrifugation zur Abtrennung toter Zellen[122, 125, 126]. Frühere Arbeiten der Gruppe belegten durch dieses Protokoll eine verlässliche Markierung für einen Zeitraum von 48 h[127].

Untersuchung des Lymphozytenhomings mittels Fluoreszenzmarkierung

In vitro generierte Effektorzellen aus Balb/c- und do11.10 TCRα k.o.-Mäusen wurden in einer Ratio von 1:1 gemischt und anschließend mit CFSE (s. o.) markiert. Nach 2 h Inkubation in c-RPMI bei 36 °C wurden tote Zellen durch Dichtegradientenzentrifugation entfernt (17,1% isotonische Nycodenz, 10 min., 2.000 g). 1-2*106 Zellen wurden 24 h nach Auslösen einer DTH transferiert.

Gewebsisolierung von Lymphozyten zur FACS-Analyse

Nach mechanischer Dissektion der Haut der Fußsohle wurde diese enzymatisch in serumfreiem Medium mit 50 µg/ml DNAse und 400 U/ml Collagenase bei 36 ºC für 60 min. verdaut. Die Verdauung wurde mit kaltem c-RPMI gestoppt und die Zellen nach Oberflächenfärbung mittels FACS untersucht.

4 Ergebnisse

4.1 In-vitro-Differenzierung Ag-spezifischer und polyklonaler T-Helferzellen

Zur Untersuchung Ag-spezifischer Migration von T-Effektorzellen wurden diese aus Tieren mit monoklonaler Ag-Spezifität (DO11.10/ DO11.10 TCRα k.o.) und wt-Tieren generiert. Der Frage nach unterschiedlichen Migrationseigenschaften der Populationen und somit der Vergleichbarkeit der eingesetzten Zellpopulationen wurde durch die In-vitro-Charakterisierung der wichtigsten Differenzierungs- und Adhäsionsmoleküle für Th1-Zellen nachgegangen. Balb/c- und Do11.10/ DO11.10 TCRα k.o.-T-Zellen zeigten unter den Kulturbedingungen keine signifikanten Unterschiede in Expansionsrate (Abbildung 4b) und Th1-assoziiertem Effektor-phänotyp (Abbildung 4a).

Phänotypisch zeigte sich eine Th1-Differenzierung durch den Verlust von CD62L (Daten nicht gezeigt), die Expression von Adhäsionsmolekülen (P-Selektin-Liganden) und im funktionellen Stimulationsassay die intrazelluläre IFNγ-Expression (Abbildung 4a). Eine Th2-Differenzierung konnte durch den Ausschluss einer IL4-Produktion ausgeschlossen werden (Daten nicht gezeigt). Die Reinheit der so generierten CD4+-Th1-Effektorzell-Population betrug 98 %. Die TCRtg -Zellen (Do11.10 TCRα k.o.) waren zu > 90 % positiv für den transgenen T-Zell-Rezeptor KJ126.1. Die Expression des P-Selektin-Liganden variierte zwischen 20 und 69 % zwischen einzelnen Experimenten, jedoch ohne Unterschied zwischen TCRtg _{und wt-Zellen im selben} Experiment. Die IFNγ-Produktion bewegte sich in bekanntem Ausmaß zwischen 20 und 50 % (Abbildung 4a). Die Unterschiede zwischen Ag-spezifischen und unspezifischen Zellen waren nicht signifikant für die getesteten phänotypischen Merkmale.

Abbildung 4:

Th1-Kulturen wurden nach 5 Tagen unter Th1 konditionierenden Bedingungen (plattengebundenes CD3, anti-CD28, lösliches IL12, IFNγ , anti-IL4) vor Einsatz im Migrationsassay phänotypisiert. Nach unspezifischer Stimulation mit Phorbolestern und Ionomycin wurde eine kombinierte Oberflächen-(CD4, OVA TCR, P-Selektin-Liganden) und Intrazellulärfärbung (IFNγ) durchgeführt (Abbildung 4a). Abbildung 4b zeigt die Expansionsrate der eingesetzten Zellen nach 5 Tagen (4a: n = 8, 4b: n = 11, Student T Test, p > 0,05).

A

B

Th1 Kulturen an d5 der Polarisierung

IFNγ P-Selektin-Liganden 0 25 50 75 n.s. n.s.

Th1 Kultur Expansion an d5 der Polarisierung wt Th1 OVA spez. Th1 0 5 10 15 wt Th1- Zellen

OVA spez.. Th1- Zellen

n.s.

4.2 Ag führt zur lokalen Anreicherung Ag-spezifischer Th1-Zellen in der akuten Inflammation

Zunächst wurde der Frage nachgegangen, welchen Effekt spezifisches Antigen am Ort der Ent-zündung in der Effektorphase auf die Anreicherung von Ag-spezifischen T-Effektorzellen hat. Hierzu wurde simultan eine akute Ag-enthaltende und eine Kontrollentzündungsreaktion in Balb/c-Mäusen ausgelöst (3.3.1 Abbildung 2) und 24 h Stunden nach Auslösung der akuten Inflammation wurden entweder radioaktiv markierte (51Cr) OVA-TCRtg- oder wt-T-Effektor-Zellen mittels i.v. Injektion in unterschiedliche Tiere transferiert.

In Mäusen, die wt-Zellen erhalten hatten, fand sich keine signifikant unterschiedliche Anreiche-rung der T-Effektorzellen innerhalb der Entzündungsreaktionen mit Antigen gegenüber der Kon-trollreaktion unabhängig von der Präsenz von OVA oder BSA am Ort der Inflammation(Ag oder Kontrollprotein) nach 24 h oder 48 h nach Transfer (Abbildung 5a und b). In Mäusen, die Ag-spezifische Zellen erhalten hatten, akkumulierten CD4+-OVA-TCRtg-T-Effektorzellen signifikant stärker innerhalb der Haut, die spezifisches Antigen enthielt, und innerhalb des entsprechenden drainierenden Lymphknotens, verglichen mit der Kontrollinflammation. Die verstärkte Einwanderung der Ag-spezifischen T-Effektorzellen in die Ag-enthaltende Entzündung war geringgradig ausgeprägt, jedoch signifikant unterschiedlich und verstärkte sich im Verlauf von 2 Tagen. Die Verteilung der Ag-spezifischen und unspezifischen Zellen war nicht abhängig von der Verteilung innerhalb anderer Organe (Lunge, Leber, Milz). Ein statistisch signifikanter, jedoch biologisch irrelevanter Unterschied zeigte sich in der Lunge nach 48 h mit verstärktem Nachweis von wt-Th1-Effektorzellen. Aktivierte T-Effektorzellen akkumulieren nach adoptivem Transfer zunächst in der Lunge und wandern danach weiter in Zielgewebe (Ab-bildung 5c). Eine selektive Retention der wt-T-Effektorzellen in der Lunge ist unwahrscheinlich und die statistische Signifikanz ist am ehesten ein Artefakt durch die Messung sehr geringer Radioaktivität in der Lunge (Abbildung 5c und d). Somit zeigte sich eine Ag-abhängige Lokalisation von Ag-spezifischen T-Effektorzellen am Ort der Inflammation und dem drainierenden Lymphknoten.

Abbildung 5:

Verteilung von OVA-spezifischen und wt-Th1-Effektorzellen im Verlauf einer akuten Entzündungsreaktion. Die akute Inflammationsantwort wurde durch s.c. Applikation von CFA mit OVA-Protein (spezifisches Ag) oder mit BSA (Kontrollprotein) ausgelöst. 24 h später wurden 51Chromium-markierte OVA-spezifische Th1- oder wt-Th1-Zellen transferiert. Dargestellt ist die Verteilung der Lymphozyten in der Hautreaktion und den drainierenden Lymphknoten nach 24 h (Abbildung 5a), 48 h (Abbildung 5b) und den großen Organen nach 24 h (Abbildung 5c) und 48 h (Abbildung 5d) (n = 16, Test für Vergleich gleicher Zellart an verschiedenen Lokalisationen: Wilcoxon für gepaarte Stichproben, Vergleich unterschiedlicher Zellarten an derselben Lokalisation Mann Whitney U, * = p < 0,05, ** = p < 0,001). A B D C 24h Homing Haut - Ag Haut + Ag Ln - Ag Ln + Ag 0 2 4 6 8 10 ns ns ** * Organe 48h Homing Haut - Ag Haut + Ag Ln - Ag Ln + Ag 0 2 4 6 8 10 ** ** ** ** Organe

Verteilung in großen Organen 24h

Milz Lunge Leber Rest 0 10 20 30 40 ns ns ns ns Organe

Verteilung in großen Organen 48h

Milz Lunge Leber Rest 0 10 20 30 40 ** ns ns ns Organe wt Th1- Zellen