Untersuchungen zur Wirkung von Mannanoligosacchariden (MOS) gegen Salmonella spp. in Schweinemastbeständen

(1)

(2)

(3)

(4)

Bibliografische Informationen der Deutschen Bibliothek Die Deutsche Bibliothek verzeichnet diese Publikation in der Deutschen

Nationalbibliografie;

Detaillierte bibliografische Daten sind im Internet über http://dnb.ddb.de abrufbar.

1. Auflage 2010

Printed in Germany

ISBN 978-3-86345-000-7

Verlag: DVG Service GmbH Friedrichstraße 17

35392 Gießen 0641/24466 geschaeftsstelle@dvg.net

www.dvg.net

(5)

Tierärztliche Hochschule Hannover

Untersuchungen zur Wirkung von Mannanoligosacchariden (MOS) gegen Salmonella spp. in Schweinemastbeständen

INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer

Doktorin der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae -

(Dr. med. vet.)

vorgelegt von Juliane Annette Nobmann

Wilhelmshaven

Hannover 2010

(6)

Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. Thomas Blaha Außenstelle für Epidemiologie Bakum

1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Thomas Blaha

2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Karl-Heinz Waldmann

Tag der mündlichen Prüfung: 03.11.2010

(7)

Hic Rhodus, hic salta!

(Aesop)

Meinen geliebten Eltern

(8)

(9)

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung ... 13

2 Literaturübersicht ... 17

2.1 Salmonella spp. ... 17

2.2 Bedeutung der Salmonellen ... 17

2.2.1 Salmonellen beim Schwein ... 18

2.2.2 Salmonellen beim Menschen ... 21

2.2.3 Salmonellen in Lebensmitteln ... 21

2.3 Salmonella Typhimurium ... 22

2.4 Typ-1-Fimbrien der Salmonellen ... 23

2.5 Rechtliche Grundlagen zur Salmonellenbekämpfung ... 24

2.6 Mannanoligosaccharide (MOS) ... 25

2.6.1 MOS beim Geflügel ... 28

2.6.2 MOS beim Schwein ... 29

2.7 Diagnostik ... 33

2.7.1 Serologie ... 33

2.7.2 Molekularbiologie... 34

2.7.3 Kulturelle Mikrobiologie ... 36

3 Material und Methoden... 37

3.1 Teilnehmende Betriebe... 37

3.2 Tiere ... 46

3.3 Versuchsgruppen ... 46

3.4 Futter ... 46

3.5 Probenplan ... 47

3.6 Probenentnahme im Bestand ... 49

3.6.1 Sammelkotproben ... 49

3.6.2 Blutproben ... 50

(10)

Inhaltsverzeichnis

3.6.3 Einzelkotproben ... 50

3.7 Probenentnahme auf dem Schlachthof ... 51

3.7.1 Vorbereitungen ... 51

3.7.2 Fleischsaftproben ... 52

3.7.3 Fleischsaftproben - Interne Validierung ... 53

3.8 Untersuchung der Proben ... 54

3.8.1 Serologische Untersuchung der Proben ... 54

3.8.2 Molekularbiologische Untersuchung der Proben ... 57

3.8.3 Kulturell-mikrobiologische Untersuchung der Proben ... 63

3.8.4 Serotypisierung ... 72

3.8.5 Kryokonservierung... 72

3.8.6 Resistentest... 73

3.9 Sektion……….………....76

4 Ergebnisse ... 77

4.1 Serologie ... 77

4.2 Molekularbiologie... 88

4.3 Kulturelle Mikrobiologie ... 89

4.4 Resistenztest ... 90

4.5 Sektion ... 91

5 Diskussion ... 93

5.1 Beurteilung der serologischen Ergebnisse ... 93

5.2 Beurteilung der molekularbiologischen Ergebnisse ... 96

5.3 Beurteilung der kulturell-mikrobiologischen Ergebnisse ... 97

5.4 Wirksamkeit der untersuchten Mannanoligosaccharide gegen Salmonella spp. bei Mastschweinen ... 98

5.5 Antibiotika-Einsatz ... 101

6 Schlussfolgerungen ... 103

(11)

Inhaltsverzeichnis

7 Zusammenfassung ... 105

8 Summary ... 109

9 Literaturverzeichnis ... 113

10 Anhang ... 123

10.1 Einzeltierergebnisse der serologischen Untersuchungen in OD% ... 123

10.2 PCR-Ergebnisse der Sammelkotproben ... 134

10.3 Kulturelle Untersuchung serologisch positiver Einzelkotproben ... 136

10.4 Ergebnisse der Resistenzbestimmung isolierter Salmonellen-Stämme im Mikrodilutionsverfahren anhand ausgewählter Antibiotika ... 139

10.5 Zusammensetzung der Futtermittel ... 140

10.6 Antibiotika-Einsatz ... 143

(12)

(13)

Abkürzungsverzeichnis

Farbmarkierung für Futter mit einem Zusatz von 3 kg MOS/t, bzw. die Tiergruppe, welche dieses Futter erhielt

Farbmarkierung für Futter mit einem Zusatz von 1,5 kg MOS/t, bzw. die Tiergruppe, welche dieses Futter erhielt

Farbmarkierung für Futter ohne Zusatz von MOS, bzw. die Tiergruppe, welche dieses Futter erhielt und somit als Kontrolle diente

® Symbol für einen registrierten Warennamen Abb. Abbildung

Ag Antigen

Ak Antikörper

AMP Ampicillin APR Apramycin

AUG2 Amoxicillin/ clavulanic acid 2:1 bzw. beziehungsweise

°C Grad Celsius

ca. circa

CEP Cephalothin CLI Clindamycin

CLSI Clinical Laboratory Standards Institute COL Colistin

CQN Cefquinome d. h. das heißt

DIN Deutsches Institut für Normung e. V.

DNA Desoxyribonukleinsäure, DNS (engl. desoxyribonuclein assid) DVG Deutsche Veterinärmedizinische Gesellschaft e. V.

EFSA European Food Safety Authority (Europäische Behörde für Lebensmittelsicherheit)

ELISA enzyme linked immunosorbent assay EMM Environmental Master Mix

engl. englisch ENRO Enrofloxacin

(14)

ERY Erythromycin et al. et alii (und andere) etc. et cetera (und so weiter) EU Europäische Union

Fa. Firma

FFN Florfenicol

g Gramm/ Erdbeschleunigung im Zusammenhang mit Zentrifugation GEN Gentamicin

ggf. gegebenenfalls

gPW gepuffertes Peptonwasser

h Stunde

IPC Internal Positiv Control

ISO Internationale Organisation für Normung (engl. International Organization for Standardization)

K Kontrolle

kg Kilogramm

kg/t Kilogramm pro Tonne (Futter) MHK minimale Hemmstoffkonzentration min. Minute

MOS Mannanoligosaccharide

n Anzahl

neg., (-) Negativkontrolle NEO Neomycin OD Optische Dichte

PCR Polymerase-Kettenreaktion (engl. polymerase chain reaction) PEN Penicillin

pH potentia hydrogenii (Wasserstoffionenkonzentration) pos., (+) Positivkontrolle

QS Qualität und Sicherheit GmbH RKI Robert-Koch-Institut, Berlin

rpm Umdrehungen pro Minute (engl. rounds per minute) rt-PCR real time polymerase chain reaction

S. Salmonella

(15)

s. siehe

ser. Serovar SPE Spectinomycin

spp. Plural von sp. (Spezies); Gruppe von Spezies der gleichen Gattung SXT Trimethoprim/Sulfamethoxazol

Tab. Tabelle

TAM Target Assay Mix TET Tetracycline

TIA Tiamulin

TIL Tilmicosin

TM (noch) nicht registrierter Warenname (engl. unregistered trademark)

u. und

var. variatio

VO Verordnung

vs. versus

XNL Ceftiofur

(16)

(17)

13 Einleitung

1 Einleitung

Salmonellen stellen als ubiquitär vorkommende Zoonoseerreger nach wie vor eine der Hauptursachen lebensmittelbedingter Erkrankungen beim Menschen dar. Beispiele hierfür sind der Salmonellenausbruch von 2007 in Fulda mit rund 270 Erkrankten und drei Todesfällen (HICKMANN 2007) sowie der Salmonellenausbruch mit 1.144 humanen Salmonellose-Fällen 1993 in Dänemark (NIELSEN et al. 2001), die auf den Verzehr von Schweinefleisch zurückzuführen waren. Mit 31.379 gemeldeten Erkrankungsfällen in 2009 belegt die humane Salmonellose nach der Campylobacter- Enteritis den zweiten Rang der bakteriellen Zoonoseerkrankungen in Deutschland, gefolgt von der E.-coli-Enteritis und der Yersiniose (ANONYMUS 2009a). Rückgänge der Salmonellenmeldungen ab dem Jahr 2007 könnten ein Indiz für den Erfolg verstärkter Anstrengungen bei der Bekämpfung sein. Die Prävention und Bekämpfung von Salmonelleninfektionen ist jedoch nach wie vor von hoher Bedeutung.

Meldekategorie 2006 2007 2008 2009

Campylobacter-Enteritis 52.050 66.128 64.742 62.789

Salmonellose 52.602 55.408 42.921 31.397

E.-coli-Enteritis 6.473 6.435 7.002 6.224

Yersiniose 5.162 4.988 4.354 3.731

Tabelle 1: Auszüge aus dem Infektionsepidemiologischen Jahrbuch meldepflichtiger Krankheiten und dem Epidemiologischen Bulletin (Stand 01.03.10), RKI 2010

Nach dem Geflügel sind Schweine die zweithäufigste Übertragungsquelle von Salmonellen auf den Menschen. Humane Salmonellose-Erkrankungen, die auf Lebensmittel tierischen Ursprungs zurückzuführen sind, werden durchschnittlich zu 60 % durch Geflügelprodukte, zu 30 % durch Schweineprodukte und zu 10 % durch

(18)

Einleitung 14

Produkte, die von Rindern stammen, ausgelöst (BLAHA 2008). Ziel der 2007 in Kraft getretenen Verordnung zur Verminderung der Salmonellenverbreitung durch Schlachtschweine (Schweine-Salmonellen-Verordnung) ist es, das Risiko des Salmonelleneintrags in die Lebensmittelkette zu verringern. Laut dieser Verordnung ist jeder Inhaber eines Endmastbetriebes dazu verpflichtet, anhand eines vorgegebenen Stichprobenschlüssels regelmäßig Proben seiner zur Schlachtung abgegebenen Schweine auf Salmonellen untersuchen zu lassen. Für die Untersuchung sind entweder Blutproben, die maximal zwei Wochen vor dem Schlachttermin entnommen wurden, oder Fleischsaftproben, die während des Schlachtprozesses genommen werden, vorgesehen. Landwirte, die über 40 % positiv auf Salmonellen-Antikörper getestete Schlachtschweine abliefern und damit in die Kategorie III eingestuft werden, sind laut der Verordnung dazu verpflichtet, die Eintragsquelle der Salmonellen in den Bestand gemeinsam mit dem betreuenden Tierarzt zu ermitteln und Maßnahmen zu deren Verminderung zu ergreifen. Als Maßnahmen zur Verminderung der Salmonellen in Betrieben der Kategorie III werden in § 6.2 der Schweine-Salmonellen-VO die Reinigung und Desinfektion der frei werdenden Buchten oder Betriebsabteilungen, sowie eine Schadnagerbekämpfung genannt.

In jüngster Vergangenheit wurden zahlreiche Maßnahmen zur Salmonellen- reduzierung in Schweinebeständen angewendet und deren Wirksamkeit in zahlreichen wissenschaftlichen Arbeiten untersucht. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass vor allem eine Kombination aus verschiedenen Maßnahmen, wie zum Beispiel die gründliche Reinigung und Desinfektion der Ställe vor Wiederbelegung, professionelle Schadnagerbekämpfung, Einsatz von Futtersäuren, konsequentes Wechseln von Stallkleidung und Stiefeln etc., abgestimmt auf die individuellen Gegebenheiten eines Betriebes, gute Erfolge zeigten (BODE 2007).

Als eine weitere Bekämpfungsmaßnahme steht zurzeit auch das Mannanoligosaccharid, kurz MOS, zur Diskussion. MOS wird aus Hefezellwänden gewonnen und ist international als nicht antibiotischer, biologischer Leistungsförderer zugelassen. Es handelt sich dabei um ein komplex aufgebautes Oligosaccharid mit einem hohen Mannoseanteil (BRANNER 2005). Der Einfachzucker Mannose hat eine

(19)

15 Einleitung

starke Bindungsaffinität zu Typ-1-Fimbrien. Fimbrien initiieren als bakterielle Oberflächenstrukturen die Invasion des Bakteriums ins Wirtsgewebe. Typ-1-Fimbrien kommen unter anderem auf zahlreichen Salmonellen- und E.-coli-Stämmen vor (KORHONEN et al. 1980). Dank des Mannoseanteils vermag MOS durch die Adhäsion an Typ-1-Fimbrien theoretisch diese Oberflächenstrukturen der Salmonellen zu blockieren, so dass diese nicht mehr dazu in der Lage sind, aktiv in das Wirtsgewebe einzudringen und dort keine Immunantwort hervorrufen können.

In der hier vorliegenden Feldstudie sollte die Wirksamkeit von MOS gegen Salmonellen in Schweinemastbeständen untersucht und nachgewiesen werden.

(20)

(21)

17 Literaturübersicht

2 Literaturübersicht

2.1 Salmonella spp.

Der Erreger der Salmonellose gehört zur Familie der Enterobacteriaceae. Aufgrund von somatischen (O) und Geißel-(H)-Antigenen auf ihrer Oberfläche werden heute bis über 2.400 Serotypen differenziert (SIEVERDING 2000). Die gramnegativen Stäbchenbakterien zählen weltweit zu den wichtigsten bakteriellen Infektionserregern bei Menschen und Tieren, viele von ihnen sind Zoonoseerreger. Charakteristische Stoffwechselleistungen sind u. a. die Reduktion von Nitrat zu Nitrit, die Bildung von H2S, der Abbau von Propylenglycol, fehlender Lactoseabbau und die Nutzung von Citrat als alleiniger Kohlenstoffquelle. Salmonellen sind in der Regel beweglich, wachsen auf Blutagar niemals hämolysierend und können intrazellulär parasitieren.

Das Genus Salmonella besteht nach DNA-Analysen aus zwei Spezies: Salmonella bongori und Salmonella enterica (ehemals S. cholerasuis) mit sechs Subspezies.

Anhand der Antigen-Formeln (O- und H-Antigene), welche im Kauffmann-White- Schema zusammengefasst wurden, können des Weiteren die heute etwa 2.500 gelisteten Serovare differenziert werden. Im Interesse einer übersichtlicheren Schreibweise wird in der Regel nur der Gattungsname Salmonella, gefolgt von der Serovarenbezeichnung, beginnend mit einem Großbuschstaben, verwendet, d. h. S.

Typhimurium anstelle der eigentlich korrekten Bezeichnung S. enterica spp. enterica ser. Typhimurium (ROLLE u. MAYR 2002).

2.2 Bedeutung der Salmonellen

Salmonellen können bei fast allen Tierarten inklusive Insekten und dem Menschen vorkommen und sind je nach Wirtsanpassung und Virulenz von unterschiedlicher Bedeutung. So nimmt die Rindersalmonellose beispielsweise den Rang einer anzeigepflichtigen Tierseuche ein (ROLLE u. MAYR 2002). Grundsätzlich kann jeder Salmonellen-Serotyp als potentieller Zoonoseerreger angesehen werden; laut

(22)

Literaturübersicht 18

Angabe des Robert-Koch-Institutes sind über 500 Serovare nachweislich humanpathogen. Salmonelleninfektionen des Menschen unterliegen in jeder Form der Meldepflicht.

2.2.1 Salmonellen beim Schwein

Salmonellen können für die Tierart Schwein von unterschiedlicher Bedeutung sein.

Zum einen können die Tiere an einer Salmonellose im engeren Sinne klinisch erkranken, die durch die schweineadaptierten Serotypen Salmonella Cholerasuis und Salmonella Typhisuis sowie in Einzelfällen durch Salmonella Typhimurium, letztere mit breitem Wirtsspektrum, hervorgerufen wird. Klinische Fälle sind bei Schweinen jedoch eher selten. Die Hauptproblematik liegt bei den klinisch inapparenten Salmonelleninfektionen an denen eine Vielzahl an Serotypen beteiligt sein kann.

Klinisch gesunde Schweine, die dennoch Salmonellen-Ausscheider sind, sind in der Lage, im Laufe des Schlachtprozesses einen hohen Prozentsatz an Schlachtprodukten zu kontaminieren und können somit zu einem großen fleischhygienischen Problem werden.

Es kann davon ausgegangen werden, dass ein gewisser Prozentsatz an Keimträgern in fast jedem Schweinebestand vorkommt. Erregerausscheidung mit dem Kot ist jedoch nur zeitweilig oder gar nicht nachweisbar. Die Zahl der Ausscheider erhöht sich, wenn die Schweine nach Transport zur Schlachtstätte untersucht werden. Diese Erscheinung wird durch Stresswirkung erklärt (WALDMANN u. WENDT 2004).

Salmonellen im Gastrointestinaltrakt des Schweins

Latent mit Salmonellen infizierte Schweine können eine direkte Ansteckungsquelle für Buchtengenossen sein und sowohl ihre direkte Umwelt, als auch über Vektoren den gesamten Stall oder sogar bei nicht ausreichend gereinigten und desinfizierten Transportwagen andere Ställe oder Schlachthöfe mit Salmonellen kontaminieren.

(23)

Die Infektion erfolgt primär durch die orale Aufnahme von salmonellenhaltigem Kot.

Beschrieben werden auch Infektionswege über die Luft, bzw. den Respirationstrakt (PROUX et al. 2001) und experimentell über die Konjunktiven (BLAHA 1993; ROLLE u. MAYR 2007).

Nach der oralen Aufnahme können Salmonellen beim Schwein in die Krypten der Tonsillen eindringen und dort persistieren (HORTER et al. 2003). Die infizierten Tonsillen können stark salmonellenhaltig sein und sind als Kontaminationsquelle beim Schlachtprozess nicht zu unterschätzen (KÜHNEL und BLAHA 2004). In der Doktorarbeit von KÜHNEL (2004) wurden 1,7 % bis 8,4 % der getesteten Tonsillen positiv auf Salmonellen getestet. SWANENBURG et al. (2001) geben den Anteil an positiv getesteten Tonsillen mit 19,6 % an und CHAUNOMS (2003) mit 10,8 %.

Im porzinen Magen müssen die Salmonellen einen sauren pH-Wert von bis zu 2 in der Fundus- und Pylorusregion überleben um in den Darmtrakt zu gelangen.

Untersuchungen von BERK et al. (2005) haben gezeigt, dass Salmonellen in einem sauren Milieu von pH 3 überleben können, indem sie Schock-Proteine produzieren.

Eine Möglichkeit zur Salmonellenreduzierung wäre an dieser Stelle laut MIKKELSEN et al. (2004), indem vermehrt grob gemahlenes Futter verabreicht wird, welches eine längere Verweildauen im Magen aufweist und demnach stärker angesäuert würde.

VISSCHER (2006) untersuchte die Wirkung von grob vermahlenem Futter und Säure- Futterzusätzen gegen Salmonellen bei Mastschweinen von der Einstallung bis hin zur Schlachtung. Umfassende mikrobiologische Untersuchungen ergaben, dass der Caecuminhalt das am häufigsten mit Salmonellen belastete Material des Schlachtkörpers ist. Bei Einsatz grob vermahlener Mischfutter konnten signifikant erhöhte Stärkegehalte, signifikant niedrigere pH-Werte sowie allgemein erhöhte Gehalte an Propionat und Butyrat im Caecuminhalt der Schlachtschweine nachgewiesen werden. Diese Effekte können zu einer nachhaltig verringerten Salmonellenbelastung bei Mastschweinen beitragen.

Salmonellen, die den Magen unbeschadet passiert haben, gelangen ins Duodenum und in das proximale Jejunum, welche reich an Gallensalzen sind. Gallensalze wirken antibakteriell und verhindern das Eindringen der Bakterien in die Darmepithelzellen

(24)

(PROUTY u. GUNN 2000). Da im distalen Jejunum, im Ileum, Caecum und Colon kaum noch Gallensalze präsent sind, könnte dies auch eine Erklärung dafür sein, dass Salmonellen vor allem in diesen Regionen kolonisieren und die Epithelzellen besiedeln (BOYEN et al. 2008).

Die Möglichkeit zur Adhäsion von beispielsweise Salmonella Typhimurium an die Darmepithelzellen des distalen Intestinaltraktes gilt allgemein als erster pathogener Schritt im Laufe der Salmonelleninfektion beim Schwein. Obwohl viele mutmaßliche Adhäsine für S. Typhimurium beschrieben wurden, so sind doch Typ-1-Fimbrien die einzigen, die zur Anhaftung an die porzinen Enterozyten und die anschließende Kolonisation beisteuern (ALTHOUSE et al. 2003).

Nach der Adhäsion durchdringen Salmonellen das intestinale Epithel. SCHAUSER et al. (2004) haben gezeigt, dass Salmonellen in porzine, absorbierende Enterozyten, M- Zellen und Becherzellen eindringen können. Bereits zwei Stunden nach der oralen Aufnahme, können Salmonellen im Inneren der Enterozyten und in mesenterialen Lymphknoten nachgewiesen werden (REED et al. 1986).

Fäkale Ausscheidung von Salmonellen

Nach einer experimentellen Infektion mit Salmonellen scheiden Schweine den Erreger ca. 14 Tage lang kontinuierlich in hohen Mengen aus. Danach sinkt die Anzahl der positiv getesteten Tiere und die Ausscheidung wird intermittierend (SCHERER et al.

2008). Mit Salmonellen infizierte Schweine können über einen langen Zeitraum asymptomatische Träger sein, die somit als „Carrier“ fungieren und unregelmäßig die Erreger ausscheiden (WOOD et al. 1991; SCHAREK u. TEDIN 2007). Sie sind schwer zu identifizieren, da weder eine serologische Untersuchung auf spezifische Antikörper, noch eine negativ ausfallende bakteriologische Untersuchung bei der intermittierenden Ausscheidung der Erreger eine aktuelle An- bzw. Abwesenheit der Salmonellen beweisen. Eine vermehrte Ausscheidung von S. Typhimurium wird vor allem bei Stresseinwirkung, wie z. B. nach Umgruppierungen oder Transporten beobachtet

(25)

(WALDMANN u. WENDT 2004; UTHE et al. 2009). Auch Co-Infektionen mit Erregern, die eine Immunsuppression beim Schwein bewirken, sind möglicherweise dazu in der Lage, eine Salmonelleninfektion zu begünstigen, die Ausscheidung zu forcieren und auch die Mortalitätsrate zu erhöhen (BOYEN et al. 2008).

2.2.2 Salmonellen beim Menschen

Bei den Salmonellen des Menschen wird zwischen den als Allgemeininfektion verlaufenden Krankheitsbildern des Typhus und Paratyphus und den Salmonellen- Enteritiden (siehe 2.2.3) unterschieden (ROLLE u. MAYR 2002). S. Typhi und S.

Paratyphi A, B oder C rufen beim Menschen systemische Infektionen mit Darmbeteiligung hervor, andere nicht-typhoidale Salmonellen verursachen beim Menschen in der Regel Gastroenteritiden, auch als Salmonellen-Enteritis oder Salmonellose bezeichnet. Die Infektion erfolgt durch orale Erregeraufnahme. S. Typhi und S. Paratyphi, bei denen der Mensch als Wirt fungiert, kommen nicht im Magen- Darm-Trakt von Tieren vor (ANONYMUS 2009b).

2.2.3 Salmonellen in Lebensmitteln

Die Salmonellose des Menschen ist eine klassische Lebensmittelinfektion. Eine Salmonella-Infektion bei Schlachtschweinen kann zu einer Salmonellen-Kontamination von Schweinefleisch und zur Erkrankung des Menschen führen. Maßnahmen zur Verringerung der Verbreitung der Infektion bei Schweinen könnten die Anzahl der Salmonellosefälle beim Menschen verringern (ANONYMUS 2008b). Über 80 % der Salmonellen, die Lebensmittel kontaminieren stammen von Salmonella-positiven, lebensmittelliefernden Tieren (BLAHA 2008). Das in Deutschland zurzeit dominierende Serovar S. Enteritidis wird vor allem über nicht ausreichend erhitzte Eier oder Eiprodukte übertragen. Des Weiteren werden Salmonellen häufig über rohes Fleisch bzw. nicht oder nicht ausreichend erhitzte Fleischerzeugnisse übertragen. Die Infektionsdosis für den erwachsenen Menschen liegt durchschnittlich bei 10⁴–10⁶

(26)

Keimen. Die Inkubationszeit beträgt in der Regel 12 bis 36 Stunden und ist abhängig von der Infektionsdosis und dem Serovar. Die Salmonellose manifestiert sich beim Menschen meist als akute Darmentzündung mit plötzlich einsetzendem Durchfall, Kopf- und Bauchschmerzen, Unwohlsein und manchmal Erbrechen. Häufig tritt leichtes Fieber auf. Bei Kleinkindern oder älteren Erwachsene kann die resultierende Dehydrierung stark ausgeprägt sein. In seltenen Fällen kann die initiale Darmentzündung einen septischen Verlauf mit zum Teil hohem Fieber annehmen.

Therapeutisch wird bei einer Salmonellen-Infektion normalerweise ausschließlich ein Flüssigkeits- und Elektrolytausgleich empfohlen, da durch eine Antibiotika-Therapie die Ausscheidung der Bakterien und somit auch eine Kontamination der Umwelt verlängert werden kann. In gravierenden Fällen empfehlen sich jedoch laut Angabe des Robert- Koch-Institutes in Abhängigkeit von den Ergebnissen der Resistenztestung Cephalosporine der dritten Generation, Cotrimoxazol, Ampicillin oder (bei Erwachsenen) auch Fluorochinolone wie Ciprofloxacin (ANONYMUS 2009b).

Die hygienische Handhabung von rohem Fleisch und das gründliche Garen sind wichtige Maßnahmen zur Minimierung von Gesundheitsrisiken durch Salmonella- kontaminiertes Schweinefleisch für den Menschen (ANONYMUS 2008b).

2.3 Salmonella Typhimurium

Unter den nicht-speziesadaptierten Salmonellen zählt Salmonella Typhimurium zusammen mit Salmonella Enteritidis zu den Haupterregern von Zoonosen, wobei zuletzt genannte für die Tierart Schwein kaum eine Rolle spielt. Beide Salmonella spp.

verfügen z. T. über Invasivität und können latente Infektionen bis hin zu seuchenhafte Krankheitsverläufe hervorrufen (ROLLE u. MAYR 2002). Beide können sich in Hühnerbeständen etablieren und durch die Kontamination von Stallanlagen und eine Verbreitung in der Nagetierpopulation lange eine Infektion aufrechterhalten. Der invasive Charakter dieser Stämme konnte experimentell durch eine orale Applikation mit anschließendem Fund der Salmonellen in Leber und Milz bewiesen werden. Trotz dieser systemischen Infektion kommt es normalerweise nicht zu klinischen

(27)

Manifestationen. S. Typhimurium ist sowohl als Volltyp als auch als O5-Minusvariante Copenhagen das zurzeit in den Schweinebeständen Nordwest-Deutschlands mit Abstand am häufigsten vorkommende Serovar. In Einzelfällen kann S. Typhimurium beim Schwein klinische Erkrankungen hervorrufen, die Hauptbedeutung liegt allerdings bei latenten Infektionen mit lebensmittelhygienischer Bedeutung. Der Phagentyp DT 104 von S. Typhimurium ist bei Rindern weit verbreitet (ROLLE u. MAYR 2002).

In einer baseline-Studie der EFSA (European Food Safety Authority), die von Oktober 2006 bis September 2007 lief, wurden europaweit Proben aus ileocaecalen Lymphknoten von Schlachtschweinen auf Salmonellen untersucht. Die hier mit Abstand am häufigsten vorkommenden Serovare waren S. Typhimurium, welche in allen teilnehmenden EU-Mitgliedsstaaten, die Salmonella-positive Ergebnisse meldeten, nachgewiesen werden konnte, und S. Derby. Insgesamt wurden 87 verschiedene Serovare in der Europäischen Union isoliert. Die EU-weite Prävalenz an Salmonella-positiven Schlachtschweinen lag durchschnittlich bei 10,3 %. Die niedrigste Prävalenz wiesen die Länder Finnland, Norwegen und Schweden auf, die höchsten Prävalenzen lagen mit über 22 % in den Ländern Portugal, Griechenland und Spanien vor. Deutschland lag bei dieser Studie nur knapp über dem europaweiten Durchschnitt (ANONYMUS 2008b, BLAHA 2008).

2.4 Typ-1-Fimbrien der Salmonellen

Fimbrien, oder auch Pili genannt, sind filamentöse Anhänge von Bakterien, welche elektronenmikroskopisch dargestellt werden können. Sie sind kleiner und zahlreicher vertreten als Flagellen und stehen im Gegensatz zu diesen nicht im Zusammenhang mit der bakteriellen Fortbewegung. Die meisten fimbrientragenden Bakterien weisen eine adhäsive Affinität zu verschiedenen Zellarten von Säugetieren, Pflanzen und Pilzen auf (DUGUID et al. 1966).

Innerhalb der Familie der Enterobacteriaceae wurden durchgehend Typ-1-Fimbrien nachgewiesen. Charakteristisch für diese ist u. a. die Fähigkeit zur Agglutination von

(28)

Geflügel- und Meerschweinchen-Erythrozyten und eine mögliche Inhibition dieser durch Mannose (BUCHANAN et al. 1985). Die Typ-1-Fimbrien von Salmonella Typhimurium haben einen Durchmesser von 6 nm und können bis zu über einem Mikrometer lang sein. Aufgereinigt können diese Pili Pferde- und Hühnererythrozyten, sowie Hefezellen agglutinieren, jedoch keine Rinder-, Schaf- oder humane Erythrozyten. Eine Agglutination wird durch D-Mannose, D-Fructose und lösliche Hefezell-Mannane inhibiert, jedoch nicht durch D-Galactose oder Saccharose (KORHONEN et al. 1980). Typ-1-Fimbrien wurden bisher unter anderem bei Salmonella Typhimurium und E. coli (KORHONEN et al. 1980), aber auch bei Klebsiella pneumoniae untersucht (FADER et al. 1982).

2.5 Rechtliche Grundlagen zur Salmonellenbekämpfung

Beim Welternährungsgipfel 1996 bekräftigen die Vereinten Nationen das Recht jedes Menschen auf Zugang zu gesundheitlich unbedenklichen und nährstoffreichen Nahrungsmitteln. Sowohl das Recht auf angemessene Ernährung, als auch auf den besten erreichbaren Gesundheitszustand gelten als Menschenrechte.

Der Schutz der menschlichen Gesundheit vor Krankheiten und Infektionen ist von höchster Bedeutung. Der Bekämpfung von Zoonosen und deren rechtlicher Regelung gilt daher große Aufmerksamkeit. Die Mitgliedstaaten der Europäischen Union legen nationale Pläne zur Überwachung und Bekämpfung von Salmonellen und anderen durch Lebensmittel übertragbaren Zoonoseerregern fest. Europaweit gilt die Verordnung (EG) Nr. 2160/2003 des Europäischen Parlaments und des Rates vom 17.

November 2003 zur Bekämpfung von Salmonellen und bestimmten anderen durch Lebensmittel übertragbaren Zoonoseerregern. Bekämpfungsprogramme sind festgelegt für Geflügel (Gallus-gallus-Zuchtherden, Legehennen, Masthähnchen und Puten) und Schweine (Bestände von Schlachtschweinen und Schweine- zuchtbestände). Zur Verwirklichung der Gemeinschaftsziele in der EU haben die Mitgliedstaaten nationale Bekämpfungsprogramme aufgestellt in denen die durchzuführenden Maßnahmen festgelegt sind (ANONYMUS 2008a).

(29)

Ziel der 2007 in Deutschland in Kraft getretenen Verordnung zur Verminderung der Salmonellenverbreitung durch Schlachtschweine (Schweine-Salmonellen-Verordnung) ist es, das Risiko des Salmonelleneintrages in die Lebensmittelkette zu verringern.

Laut der Verordnung ist jeder Landwirt, der Mastschweine zur Schlachtung abgibt, dazu verpflichtet in Zusammenarbeit mit Tierärzten, die Salmonellen-Eintragsquellen aufzuspüren und auf die Reduzierung der Keime hinzuwirken.

In jüngster Vergangenheit wurden zahlreiche Maßnahmen zur Salmonellen- reduzierung angewendet und deren Wirksamkeit in zahlreichen wissenschaftlichen Arbeiten untersucht. Es stellte sich heraus, dass vor allem eine Kombination aus verschiedenen Maßnahmen, wie z.B. konsequente Reinigung und Desinfektion, Schadnagerbekämpfung, Futteradditive etc., Erfolge zeigte (BODE 2007).

2.6 Mannanoligosaccharide (MOS)

Mannanoligosaccharide (MOS) werden aus Zellwandbestandteilen des Bierhefepilzes Saccharomyces cerevisiae gewonnen. Es handelt sich dabei um ein komplexes Kohlenhydrat-Konstrukt. Die Hefezellwände bestehen hauptsächlich aus Proteinen, Homo-Polysacchariden, die sich aus Glucose, Mannose und N-Acetylglucosaminen zusammensetzen, sowie zu einem geringen Anteil aus Chitin. Die Mannane, die sich an der Oberfläche der Hefepilze befinden (äußere Wand), sind mit den Zellwandproteinen verbunden (CABIB et al. 1982) und bilden die so genannten Mannoproteine. Die Mannanfraktionen können unterschiedlich lange Ketten ausbilden und dienen dem Zellkontakt.

Es gibt keine einfache Strukturformel für die Mannane aus der Hefezellwand, da es sich bei dem Manno-Protein-Komplex um ein riesiges Molekül handelt, das sich kaum einfach darstellen lässt (BRANNER 2005).

(30)

Abb. 1: Skizze der Hefezellwand-Struktur von Saccharomyces cerevisiae, eigene Darstellung

Durch das Verbot des Einsatzes antimikrobiell wirksamer Substanzen als Wachstumsförderer sind die Bemühungen, alternative, v. a. natürliche bioaktive Substanzen zu finden, welche in der Lage sind, die Tiergesundheit aufrecht zu erhalten und die Wachstumsrate zu verbessern, intensiviert worden (KOGAN u.

KOCHER 2007). Aktuell werden Mannanoligosaccharide (MOS) als alternative Leistungsförderer eingesetzt und stehen zudem als mögliche Bekämpfungs- Maßnahme gegen Salmonellen zur Diskussion.

M = Mannose P = Peptide

S-S = Schwefelverbindungen

Zellinnenseite Glucan Mannoprotein

Membran

(31)

Mannanoligosaccharide werden in der Tierfutterindustrie als Additive verwendet, da sie sich durch Bindung pathogener Mikroorganismen wie z. B. Salmonellen und durch Modulation des spezifischen sowie des unspezifischen Immunsystems positiv auf die Tiergesundheit und –leistung auswirken (SPRING 1996; PARKS et al. 2001;

SWANSON et al. 2002). Enterobacteriaceae wie z. B. E. coli und Salmonella spp., die Typ-1-Fimbrien besitzen, binden an das α-D-Mannan des Mannanoligosaccharids (FIRON et al. 1983), wodurch ein Anheften dieser Bakterien an die Rezeptoren der Darmschleimhaut, die ebenfalls Mannose enthalten, verhindert wird (SPRING 1996).

Da die Adhäsion von Bakterien an das Wirtsepithel der erste Schritt zur mikrobiellen Invasion ist, könnte ein Blockieren der Mannoserezeptoren der Pathogene eine Infektion vorbeugen oder sogar eliminieren (KOGAN u. KOCHER 2007). In den Untersuchungen von SWANSON et al. (2002) scheint MOS außerdem die Gesamtkonzentration aerober Bakterien im Kot zu senken und die der Lactobacillen zu fördern. In einer Fütterungsstudie bei der eine Gruppe von abgesetzten Ferkeln über fünf Wochen einen Zusatz von 0,2 % MOS in Futter erhielten, war die quantitative Nachweisrate an Enterobacteriaceae im Jejunum per real-time PCR bereits 14 Tage nach dem Absetzen deutlich niedriger als im Vergleich zu einer Kontrollgruppe, die Standardfutter ohne Zusatz bekam (CASTILLO et al. 2008). Agglutinations-Tests von KOGAN und KOCHER (2007) in denen 258 pathogene Bakterien auf ihre Agglutinations-Fähigkeit mit MOS untersucht wurden ergaben, dass 31 von 46 getesteten veterinärmedizinisch relevanten Salmonellen-Stämmen und darunter sieben von zehn S. Typhimurium agglutinierten.

Als weitere positive Eigenschaft von Sacchariden erwähnt SHARON (2006), dass die Wirkung der Anti-Adhäsive weder im Abtöten, noch in der Wachstumshemmung der Pathogenen basiert und sie somit, im Gegensatz zum Antibiotikaeinsatz, kaum eine bakterielle Resistenzentwicklung hervorrufen können.

(32)

2.6.1 MOS beim Geflügel

In der Vergangenheit liefen bereits zahlreiche Studien, in denen der Einfluss von MOS auf die Tiergesundheit in Geflügelbeständen wissenschaftlich untersucht wurde. So wurden beispielsweise in Kanada die Effekte von oral verabreichten Antibiotika (Virginiamycin und Bacitracin) und MOS in unterschiedlichen Konzentrationen (0,2 % und 0,5 %) bei Masthähnchen vergleichend untersucht. Als Kontrolle diente eine Tiergruppe, die herkömmliches Futter ohne Zusätze erhielt. Verglichen wurden v. a.

die Effekte auf die histologisch untersuchte Darm-Morphologie und die jeweilige mikrobiologisch untersuchte Darm-Flora. Das Ergebnis war, dass die Darmzotten bei den Tieren, welche MOS erhielten im Vergleich zu den Antibiotika-Tieren höher waren und auch mehr Becherzellen aufwiesen, was allgemein als Hinweis auf eine vitalere Darmstruktur gilt. Zudem wurde ein höherer Gehalt an Bifidobakterien nachgewiesen, was allgemein als gesundheitsfördernd gilt. Bei der mikrobiologischen Untersuchung fiel auf, dass der Gehalt an E. coli im Caecum der MOS-Tiere im Vergleich zur Kontrollgruppe signifikant reduziert war. Signifikante Unterschiede in der Wirkung auf die Darm-Flora von MOS in unterschiedlichen Konzentrationen konnten nicht nachgewiesen werden (BAURHOO et al. 2009). In einer ähnlichen Studie wurden die Effekte durch die Verfütterung von Antibiotika (Virginiamycin), MOS und Lignin als Futterzusatz verglichen. Auch hier zeigte sich, dass die MOS-Tiere im Vergleich zu den Tieren, die Antibiotika erhielten, längere Zotten im Jejunum und mehr Becherzellen aufwiesen. Weiterhin hatten die MOS- und die Lignin-Tiere eine höhere Anzahl an Laktobazillen und die MOS-Tiere zusätzlich im Caecum einen höheren Gehalt an Bifidobakterien (BAURHOO et al. 2007).

In einer weiteren Studie wurden Hennen mit mannosehaltigen Kohlenhydraten gefüttert. Eingesetzt wurden D-Mannose, MOS und Palmkernmehl (PKM). Der Caecum-Inhalt dieser Hennen wurde gewonnen und mit dem gleichen Futterzusatz noch 2,5 %ig angereichert. Diese Suspension wurde daraufhin an Küken verfüttert und der Effekt auf die Kolonisation von S. Enteritidis untersucht. Laut FERNANDEZ et al.

(2000) waren die Masthähnchen, welche den Caecum-Inhalt der MOS- oder PKM-

(33)

Hennen erhielten besser gegen eine Besiedlung mit S. Enteritidis geschützt, als die Kontrolltiere, welche „normalen“ Caecum-Inhalt erhielten.

2.6.2 MOS beim Schwein

DAVIS et al. (2002) haben in einer Studie die Wirkungen von MOS und Kupfersulfat auf die Zuwachsrate und die Immunkompetenz von Absetzferkeln und Läufern, bzw.

Mastschweinen untersucht. Resultat dieser Studie war, dass bei allen drei Altersklassen, die MOS-supplementiertes Futter erhielten, eine erhöhte Zuwachsrate zu verzeichnen war. Lediglich bei den Saugferkeln, die zusätzlich einen erhöhten Kupfergehalt im Futter hatten, nahm die Zuwachsrate ab. Auch in der nachfolgenden Studie von DAVIS et al. (2004) wurde ein leistungsfördernder Effekt bei Absetzferkeln durch die Verfütterung von 0,3 % phosphorilierten Mannanen, die aus der Zellwand von Saccharomyces cerevisiae gewonnen wurden, verzeichnet. Mannane werden hier vor allem für frisch abgesetzte Ferkel als Wachstumsförderer empfohlen.

Organisches Zink in Kombination mit Mannanoligosacchariden untersuchten CASTILLO et al. (2008) auf wachstumsfördernde und Diarrhö vorbeugende Wirkungen bei Absetzferkeln. Sowohl MOS alleine, als auch in Kombination mit Zink verabreicht, erzielte bei den Ferkeln 14 Tage nach dem Absetzen eine Reduktion der Enterobacteriaceae im Darmtrakt. Zudem wurde bei diesen Tieren eine erhöhte Zuwachsrate verzeichnet.

Der leistungsfördernde Effekt von MOS bei Schweinen basiert laut KOGAN und KOCHER (2007) auf drei verschiedenen Wirkungsmechanismen. MOS soll in der Lage sein, Mykotoxine zu adsorbieren, intestinale Immunzellen zu (re)-aktivieren und die Adhäsion von pathogenen Bakterien an die Darmmukosa zu inhibieren. Die Zuletzt genannte Wirkung soll darauf basieren, dass das α-D-Mannan im MOS als Konkurrent zur mannosereichen Oberfläche der Darmzotten die Bindung an die Typ-1-Fimbrien von pathogenen Bakterien kompetitiv hemmt. In dem durchgeführten in-vitro-Test

(34)

agglutinierten 31 von 46 Salmonella spp. und sieben von zehn verschiedenen S.- Typhimurium-Stämmen mit MOS.

ROZEBOOM et al. (2005) führten eine Feldstudie bei Absetzferkeln in drei verschiedenen Betrieben durch. Die Ferkel erhielten entweder das konventionelle Futter ohne Zusatzfuttermittel (Kontrolle), oder mit MOS-Zusatz (0,2 % – 0,3 %), oder mit Antibiotika-Zusatz (Tylosin und Sulfamethoxazol) oder beide Zusätze kombiniert.

Die Auswertung erfolgte anhand der Zunahmen und der Futterverwertung der Tiere bis zum 42. Tag nach dem Absetzen. Hoch signifikant höher (p < 0,001) war die Zuwachsrate bei den Ferkeln, die den Antibiotika-Zusatz im Futter bekamen im Vergleich zu den Kontrolltieren. Die Zuwachsrate der MOS-Tiere war ebenfalls signifikant höher (p = 0,02). Insgesamt wurden die Zuwachsraten durch die Antibiotika um 10 % und durch MOS um 7 % gesteigert.

WHITE et al. (2002) testeten die Auswirkungen der Fütterung von getrockneter Bierhefe als Quelle für Mannanoligosaccharide auf Absetzferkel. Eine der Versuchsgruppen bekam 3 % getrocknete Bierhefe in ihr Grundfutter eingemischt, eine weitere Versuchsgruppe die 3 % Hefe plus 2 % Zitronensäure. Die Auswertung ergab, dass in beiden Versuchsgruppen sowohl die Zuwachsrate, als auch die Futteraufnahme signifikant erniedrigt war (p < 0,05). Die Anzahl an coliformen Bakterien, E. coli und Clostridium perfringens im Kot wurde durch die Futterzusätze nicht beeinflusst. In der Gruppe, die 3 % Bierhefe bekam war jedoch die Anzahl an Lactobacillen im Kot signifikant erhöht (p < 0,05) und in der Gruppe, die beide Zusätze erhielt war Immunglobulin G (IgG) im Serum signifikant erhöht (p < 0,01).

Der Einfluss des Antibiotikums Flavomycin sowie des Präbiotikums MOS auf die Mast- und Schlachtleistungen, Blutparameter, morphometrische Darmeigenschaften und die Mikrodarmflora bei Mastschweinen untersuchten REKIEL et al. (2007). Bei den verglichenen Mast- und Schlachtmerkmalen ergaben sich zwischen Kontrollgruppe (mit Flavomycin) und Versuchsgruppe (mit MOS) keine signifikanten Unterschiede. Bei der MOS-Versuchsgruppe vergrößerte sich der Anteil an Milchsäurebakterien und es verminderte sich die Zahl der Bakterien der Familie Enterobacteriaceae. REKIEL et al.

(35)

(2007) schlussfolgern, dass MOS eine positive Wirkung auf die Gesundheit von Schweinen hat und eine Alternative zu Futterantibiotika zu sein scheint.

MIGUEL et al. (2004) führten eine Meta-Analyse durch und verglichen 54 zugängliche Datenquellen über Effekte bei mit MOS gefütterten Schweinen. Sie kamen zu dem Schluss, dass die Leistung bei Tieren, die MOS bekamen insgesamt besser war, als bei den Kontrolltieren. Außerdem deuteten die Daten darauf hin, dass vor allem bei Ferkeln mit einer geringen Wachstumsrate in den ersten beiden Wochen nach dem Absetzen positive Effekte durch die Einnahme von MOS verzeichnet werden konnten.

ROSEN (2006) verglich 69 Veröffentlichungen aus den Jahren 1997 bis 2003 aus zehn verschiedenen Ländern (71 % aus den USA) zum Thema MOS als Futterzusatz für Schweine. Als effektive Dosis wurden rund 2 kg MOS pro Tonne Schweinefutter ermittelt. MOS ist laut dieser Studie vor allem bei Ferkeln wirksam und weniger häufig bei Mastschweinen. Der leistungsfördernde Effekt von MOS soll mit dem von Antibiotika vergleichbar sein. Der Autor empfiehlt, dass weitere Untersuchungen zur Wirksamkeit von MOS bei Mastschweinen folgen sollten und vermutet, dass eine Anpassung der MOS-Dosis bei Mastschweinen erfolgen muss.

MOS im Gastrointestinaltrakt des Schweines

MOS können theoretisch zu der Gruppe der Praebiotika gezählt werden. Praebiotika sind laut Definition von GIBSON und ROBERFROID (1995) „nichtverdauliche Nahrungsmittelbestandteile, die den Wirt durch selektive Stimulation von Wachstum und/oder Aktivität einzelner oder einer begrenzten Zahl von Bakterienspezies der residenten Flora im Dickdarm günstig beeinflussen und die Gesundheit des Wirtes verbessern“.

Nach CRITTENDEN und PLAYNE (1996) und VAN LOO et al. (1999) zählen zu den Praebiotika unter anderem Fructooligosaccharide, Galactooligosaccharide, Sojabohnenoligosaccharide Inulin, Lactulose und noch einige mehr. Neuere Arbeiten

(36)

von SWANSON et al. (2002) und KARR-LILIENTHAL et al. (2004) führen Mannanoligosaccharide ebenfalls als praebiotische Substanz auf.

Mannanoligosaccharide werden in der Tierernährung als Futteradditive verwendet.

Als zwei wesentliche Aktivitäten von MOS wurden die Pathogenadsorption und die Modulation des spezifischen und unspezifischen Immunsystems beschrieben (SPRING 1996; PARKS et al. 2001; SWANSON et al. 2002). Pathogene Bakterien, die Typ-1-Fimbrien besitzen, binden an die Mannose der Mannanoligosaccharide, anstatt sich an die intestinalen Epithelzellen anzuheften. Die Erreger werden so durch den Darm befördert, ohne ihn zu besiedeln (FERKET, 2003). In den Arbeiten von STRICKLING et al. (2000) und BRANNER (2005) konnte jedoch keine signifikante Beeinflussung der mikrobiellen Zusammensetzung in Chymus oder Kot durch die Verabreichung von MOS nachgewiesen werden. Auch nicht bei E. coli, welche ebenso wie Salmonella spp. Typ-1-Fimbrien besitzen. Bei SWANSON et al.

(2002) blieb die Gesamtzahl von E. coli durch eine MOS-Supplementierung ebenfalls unbeeinflusst.

Untersuchungen von BRANNER (2005) zur praecaecalen und faecalen Verdaulichkeit von praebiotischen Kohlenhydraten beim Schwein haben gezeigt, dass ein erheblicher Anteil der Praebiotika bereits im Dünndarm abgebaut und absorbiert wird. Der Anteil, der die Ileocaecalklappe passiert, wird anschließend im Dickdarm vollständig verwertet. Die Tatsache, dass die zugeführten Praebiotika zum großen Teil die Passage durch das Ileum des Schweines nicht überstehen, lässt eine sehr hohe Fermentationsleistung im Dünndarm des Schweines vermuten. Da die praebiotischen Kohlenhydrate beim Schwein bereits im Dünndarm verstoffwechselt werden, stehen sie im Dickdarm kaum noch zur Verfügung, um positiv Effekte für die Tiergesundheit erzielen zu können. Es ist laut BRANNER (2005) daher eher unwahrscheinlich, dass das praebiotische Konzept in ausreichendem Maße beim Schwein als Ersatz für antibiotische Leistungsförderer geeignet ist.

(37)

2.7 Diagnostik

Die diagnostischen Möglichkeiten, Salmonellen direkt oder indirekt nachzuweisen, sind vielfältig. Im Rahmen dieser Arbeit wurde der Schwerpunkt auf serologische, mikrobiologische und molekularbiologische Verfahren gelegt.

2.7.1 Serologie

Der kulturelle Nachweis von Salmonellen im Kot unterliegt einer gewissen Ergebnisunsicherheit aufgrund der intermittierenden Ausscheidung des Erregers. Es ist nicht möglich, zu jeder Zeit Salmonellen mikrobiologisch im Kot nachzuweisen, und so können Tiere dann fälschlicherweise als gesund eingestuft und bei Verkauf oder Transport zum Schlachthof zu einer Weiterverbreitung der Salmonellen in andere Tierbestände oder in Lebensmittel führen. Aus diesem Grund wurden serologische Screeningverfahren zum Nachweis von Antikörpern gegen Salmonellen entwickelt (PENNER 2004).

Die serologische Untersuchung von Blut- oder Fleischsaftproben von Mastschweinen auf Salmonellen-Antikörper wird im Rahmen des Salmonellenmonitorigs der Qualität und Sicherheit GmbH (QS) seit 2003 für alle teilnehmenden Betriebe verbindlich vorgeschrieben (ANONYMUS 2010) und ist seit 2007 in der Schweine-Salmonellen- Verordnung verankert. Das Salmonellenmonitoring- und –reduzierungsprogramm für das QS-Prüfzeichen hat die schrittweise Senkung der Häufigkeit der Kontamination von Schweinefleisch und Schweinefleischprodukten mit lebensmittelhygienisch relevanten Salmonellen zum Ziel (BLAHA 2004).

Die einmalige Untersuchung auf Salmonellen-Antikörpern innerhalb des Programms kann jedoch keinen Aufschluss über den aktuellen Infektionsstatus geben. Die Abwesenheit von Antikörpern schließt eine erst kürzlich stattgefundene Infektion nicht aus, und der Nachweis von Antikörpern besagt nicht, dass der Erreger an sich noch im Organismus anwesend ist. Die Mastschweine/Schlachtkörper aus einem Bestand, der im QS-Salmonellenmonitoring in die Kategorie III eingestuft wurde, müssen demnach

(38)

nicht zwingend ein lebensmittelhygienisch höheres Risiko darstellen. Es dürfen sich also keine lebensmittelhygienerechtlichen Konsequenzen für den einzelnen Schlachtkörper nach sich ziehen (BLAHA 2004).

Beurteilung serologischer Ergebnisse

Die Entscheidung, ob eine serologisch untersuchte Probe als negativ oder als positiv zu bewerten ist, erfolgt anhand eines Grenzwertes, dem so genannten Cut-off. Der Cut-off kann dabei nicht mit absoluter Sicherheit zwischen infizierten und nicht infizierten Tieren unterscheiden, sondern markiert den Punkt, an dem eine sinnvolle Unterscheidung getroffen wird (VONNAHME 2005). Für den für diese Untersuchungen verwendeten SALMOTYPE^® Pig Screen-ELISA der Firma Labor Diagnostik GmbH Leipzig (LDL) wird angenommen, dass ELISA-Werte bis 10 OD% auf einer unspezifischen Reaktion beruhen, während ELISA-Werte zwischen 10 und 40 OD% in den meisten Fällen eine vorangegangene Auseinandersetzung des Organismus mit Salmonellen vermuten lassen. Proben mit OD%-Werten zwischen 10 und 20 werden als fraglich und Proben mit OD%-Werten ≥ 20 laut Hersteller als positiv bewertet.

STEINBACH et al. (2002) gehen davon aus, dass Tiere mit einem serologischen Ergebnis von über 30 OD% sich im Vorfeld mit Salmonellen auseinandergesetzt haben. Ab einem Cut-off von 40 OD% sind höhere Übereinstimmungen mit bakteriologischen Untersuchungen zu erwarten (NIELSEN et al. 1995; STEGE et al.

1997). Im Rahmen des QS-Salmonellenmonitorings werden Ergebnisse von ≥ 40 OD% als positiv angesehen.

2.7.2 Molekularbiologie

Durch die Entwicklung molekularbiologischer Untersuchungsverfahren, wie der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ist es möglich geworden, Salmonellen, bzw. deren DNA, innerhalb kürzester Zeit nachzuweisen. Vor allem die real-time-PCR (rt-PCR) liefert sehr schnell zuverlässige Untersuchungsergebnisse. Diese Ergebnisse zeichnen

(39)

sich laut RODRIGUEZ-LAZARO et al. (2003) durch eine hohe Sensitivität, eine hohe Spezifität und im Vergleich zur klassischen PCR durch ein verringertes Maß an Kreuz- Kontaminationen im Labor aus.

In der Dissertationsschrift von SOMYANONTANAGUL (2009) wurde die rt-PCR mit dem klassischen kulturell-mikrobiologischen Untersuchungsverfahren, welches nach wie vor als Standardmethode gilt, verglichen. Alle Proben, die mikrobiologisch als positiv getestet wurden, waren per rt-PCR ebenfalls positiv (187 von 906). Darüber hinaus detektierte die rt-PCR positive Proben, welche im klassischen Verfahren als negativ bewertet wurden. Insgesamt ergaben die Untersuchungen per rt-PCR 37,19 % positive Proben und die kulturell-mikrobiologischen Untersuchungen 20,64 % positive Proben. Diese Diskrepanz ist damit zu erklären, dass im molekularbiologischen Verfahren lediglich die Bakterien-DNA und keine nativen Bakterien nachgewiesen werden, welche im kulturellen Verfahren angezüchtet werden könnten. Bakterielle DNA-Fragmente sind demnach öfter in Proben nachweisbar als noch lebende, vermehrungsfähige Bakterien. Dennoch macht die Verringerung des Zeit- und Arbeitsaufwandes die sensitive und spezifische rt-PCR laut SOMYANONTANAGUL (2009) zu einer hervorragenden Alternative zu dem traditionellen kulturellen Verfahren.

Die rt-PCR soll zudem eine sehr effiziente Methode für die Durchführung von Salmonellenmonitoring und Salmonellenkontrolle in Schweinebeständen sein.

KRASCSENICSOVÁ et al. (2007) untersuchten vier verschiedene rt-PCR Methoden zum Nachweis von Salmonella enterica in Lebensmitteln vergleichend. Zur Kontrolle wurde parallel die mikrobiologische Standartmethode EN ISO 6579 durchgeführt. Mit dem unter anderem verwendeten TaqMan^®Salmonella enterica Detection Kit wurden, bis auf eine, alle nachweislich kontaminierten Proben auch als positiv getestet. Die nicht als positiv erkannte Probe war auf „natürlichem“ Wege kontaminiertes Hackfleisch. Das fehlerhafte Ergebnis wurde einer ungenügenden Anreicherung zugeschrieben. Zwei weitere rt-PCR Methoden lieferten weniger positive Proben und mit einer laboreigenen Methode konnten alle positiven Proben detektiert werden.

Im Rahmen dieser Arbeit wurde der TaqMan^®Salmonella enterica Detection Kit der Firma Applied Biosystems^TMverwendet.

(40)

2.7.3 Kulturelle Mikrobiologie

Der kulturelle Nachweis von Salmonellen in Probenmaterialien gilt nach wie vor als Standartmethode. In der internationalen Norm ISO 6579:2002 wird ein horizontales Verfahren zum Nachweis von Salmonellen festgelegt, welches je nach Produkt, bzw.

Probenmaterial modifiziert werden kann (ANONYMOUS 2007). Die Isolierung von Salmonellen ist von dem zu untersuchenden Material (z. B. Kot, Umgebungsproben, Futter oder Fleisch) abhängig, welches in unterschiedlich hohem Maße verschiedene Begleitkeime enthalten kann, die die Salmonellen während des Isolierungsprozesses hemmen können (VOOGT et al. 2002).

Salmonellen stellen keine hohen Ansprüche an Nährmedien. Sie können in nicht- selektiven Medien, wie z. B. in Peptonwasser, vorab angereichert werden, so dass auch subletal geschädigte Bakterien aktiviert werden und sich vermehren können. Als Folgeschritt kommt meist eine Anreicherung in flüssigen Selektivmedien zum Einsatz.

Hierfür empfehlen sich Anreicherungsmedien auf der Basis von Tetrathionat und Selenit sowie die Bouillon nach Rappaport-Vassiliadis.

Auf Universalmedien, wie z. B. auf Blutagar, sind Salmonellen nicht von anderen Enterobacteriaceae zu unterscheiden, so dass zusätzlich feste Selektivmedien, wie beispielsweise Gassner-Agar, XLD-Agar oder Rambach-Agar, eingesetzt werden.

Diese Medien sind auf die charakteristischen biochemischen Eigenschaften der Salmonellen abgestimmt.

Wachsen auf den Selektivnährmedien salmonellenverdächtige Bakterienkolonien, so kann im Anschluss per Objektträgeragglutination mit omni- und/oder polyvalenten Seren auf die Zugehörigkeit zur Gattung Salmonella hin untersucht werden. Die positive Agglutination und das biochemische Verhalten zeigen mit ausreichender Sicherheit die Zugehörigkeit zur Gattung Salmonella an (ROLLE u. MAYR 2007).

(41)

37 Material und Methoden

3 Material und Methoden

3.1 Teilnehmende Betriebe

Die Untersuchungen zur Wirkung von Mannanoligosacchariden (MOS) gegen Salmonella spp. wurden in vier verschiedenen Schweinemastbetrieben in Nordwest- Niedersachsen durchgeführt. Es wurden Betriebe ausgewählt, welche die Möglichkeit zur separaten Fütterung vergleichbarer Tiergruppen hatten und zum Beginn der Untersuchungen mindestens in Kategorie II des Salmonellenmonitorings eingestuft waren.

Das deutschlandweite Salmonellenmonitoring sieht eine Kategorisierung aller Betriebe, die Mastschweine zur Schlachtung abgeben, vor. Bei größeren Betrieben müssen jährlich 60 Schlachtkörper, verteilt auf möglichst alle Ablieferungen des betreffenden Jahres, auf Salmonellen-Antikörper untersucht werden. Eine Kategorisierung erfolgt anhand der quartalsweise entnommenen und untersuchten Proben. Werden 20 % bis 40 % der Proben positiv auf Salmonellen-Antikörper untersucht, so wird der entsprechende Betrieb in die Kategorie II (= mittleres Risiko einer Salmonellenbelastung), bei über 40 % positive Proben in Kategorie III (= hohes Risiko einer Salmonellenbelastung) eingestuft.

Zudem wurde bei der Auswahl der Betriebe darauf geachtet, dass alle Tiere (Versuchs- und Kontrollgruppe) den gleichen Bedingungen, wie betreuende Personen, Futter, Wasser, Räumlichkeit etc., ausgesetzt waren. Die Belegung fand in allen Mastställen im Rein-Raus-Verfahren statt.

Betrieb A ist ein reiner Mastbetrieb. Die Ferkel stammen aus einem Ferkelerzeugerbetrieb aus Dänemark und werden mit ca. 28 kg Körpergewicht zur Mast eingestallt. Zum Versuchsbeginn befand sich der Betrieb mit 68 % positiv getesteten Fleischsaftproben in der Kategorie III des Salmonellenmonitorings. Das Stallgebäude, in dem die Untersuchungen durchgeführt wurden, fasst 1.060 Mastplätze in acht Abteilen mit je acht Buchten zuzüglich eines Krankenabteils mit vier

(42)

Material und Methoden 38

Buchten. In jeder Bucht sind 16 bis 17 Tiere untergebracht. Die Mastschweine aus zwei Buchten haben jeweils Zugang zu einem gemeinsamen Futterautomaten. An die Fütterungstechnik sind drei Silos angeschlossen, aus denen je nach Programmierung individuell für jeden Futterautomaten unterschiedliche Futtermischungen abgerufen werden können. Diese Technik machte es möglich, im Betrieb A neben der Kontrollgruppe zwei Versuchsgruppen einzurichten, die Futter mit unterschiedlichen MOS-Dosierungen (1,5 kg/t und 3 kg/t) erhielten. Hierfür wurde das Mastfutter für die Gruppe, die 1,5 kg MOS pro Tonne Futter erhalten sollte, aus zwei verschiedenen Silos zu je 50 % angemischt. In dem einen Silo befand sich das kommerziell erhältliche Schweinemastfutter ohne MOS-Zusatz, welches auch die Tiere der Kontrollgruppe erhielten, in dem anderen Silo befand sich dasselbe Grundfutter, welchem jedoch im Vorfeld in der Futtermühle 3 kg/t MOS zugemischt wurde. Die drei Tiergruppen waren jeweils in einem baugleichen Abteil innerhalb des Stalles untergebracht. Für die Untersuchungen und regelmäßigen Probenentnahmen wurden je Abteil in sechs der acht Buchten jeweils vier der sechzehn Tiere (24 Tiere pro Gruppe) mit individuellen Ohrmarken markiert. Es wurden zwei Mastdurchgänge von der Einstallung bis hin zur Schlachtung regelmäßig beprobt.

Für den zweiten Mastdurchgang wurden die Fütterung der Gruppen getauscht um ggf.

vorhandene bauliche oder arbeitstechnische Unterschiede, die die Gruppen unterschiedlich beeinflussen könnten ausschließen zu können.

Während des ersten Mastdurchganges (A.1) wurde in der zweiten und in der achten Mastwoche, während des zweiten Mastdurchganges (A.2) nur in der fünften Mastwoche jeweils das Antibiotikum Tylosin therapeutisch bei den Schweinen eingesetzt (siehe 10.6).

(43)

Abb. 2: Skizze des Stallgrundrisses Betrieb A, die dargestellte Gruppenaufteilung entspricht dem ersten Mastdurchgang (A.1).

GRUNDRISS

Kranken- stall

schleuse

Hygiene- Technik Futterküche

(44)

In Betrieb B werden 380 Schweine in einem Stall mit zwei Abteilen und je acht Buchten zuzüglich der Krankenbuchten gemästet. In jeder Bucht sind 20 Tiere untergebracht, die Zugang zu einem buchteneigenen Futterautomaten haben. Die Tiere stammen aus einem Ferkelaufzuchtbetrieb in Süddeutschland und werden mit ca. 30 kg Körpergewicht zur Mast eingestallt. Zum Versuchsbeginn befand sich der Betrieb mit 70 % positiv getesteten Fleischsaftproben in der Kategorie III des QS-Salmonellenmonitorings. Das Stall- gebäude ist in der Mitte durch einen Quergang in zwei Abteile unterteilt und konnte somit für die Untersuchungen in zwei Gruppen mit je 190 Tieren aufgeteilt werden. Für jede Tiergruppe stand ein separates Silo zur Verfügung. Es konnten somit eine Kontrollgruppe und eine Versuchsgruppe, welche das Mastfutter mit einem Zusatz von 3 kg MOS pro Tonne Futter erhielt, eingerichtet werden. Für die Probenentnahme wurden in sechs der jeweils acht Buchten fünf der zwanzig Tiere (30 Tiere pro Gruppe) mit individuellen Ohrmarken markiert und für die Dauer eines Mastdurchganges regelmäßig beprobt.

In Betrieb B erhielten die Schweine in der ersten Woche metaphylaktisch Chlortetracyclin, Amoxycillin, Neomycin und Lincomycin (siehe 10.6).

schleuse Hygiene-

Abb. 3: Skizze des Stall- grundrisses Betrieb B

(45)

Zum Versuchsbeginn befand sich der Betrieb C mit 50 % positiv getesteten Fleischsaftproben in der Kategorie III des Salmonellenmonitorings. Die Mastschweine stammen aus der hofeigenen Ferkelproduktion und werden mit ca. 40 kg Körpergewicht in das Mastgebäude eingestallt. Der Maststall fasst drei Abteile mit je acht Buchten, in denen jeweils 20 Tiere untergebracht sind (160 Tiere pro Abteil).

Hinzu kommt ein stallinternes Krankenabteil. Jede Bucht verfügt über einen eigenen Futterautomaten. Die Abteile werden im Abstand von einer Woche und im Rein-Raus- Verfahren mit Läufern belegt. An die Fütterungsautomatik sind zwei Silos angeschlossen, so dass die Tiere in einem Abteil separates Futter mit einem Zusatz von 3 kg MOS pro Tonne erhalten konnten. Die anderen beiden Abteile wurden mit herkömmlichem Mastfutter versorgt. Die Tiere eines dieser Abteile dienten als Kontrollgruppe. Für die Untersuchungen wurden im Versuchs- sowie im Kontrollabteil in vier der acht Buchten jeweils fünf der zwanzig Tiere pro Bucht individuell mit Ohrmarken markiert (20 Tiere pro Gruppe) und für die Dauer eines Mastdurchganges regelmäßig beprobt.

In der sechsten Mastwoche wurden in Betrieb C die Antibiotika Tetracyclin und Marbofloxacin therapeutisch eingesetzt (siehe 10.6).

(46)

Abb. 4: Skizze des Stallgrundrisses Betrieb C

Betrieb D.1 ist ebenso wie die Betriebe A und B ein reiner Mastbetrieb. Die Ferkel stammen aus dem gleichen Ferkelerzeugerbetrieb in Dänemark wie bei Betrieb A und werden ebenfalls mit ca. 28 kg Körpergewicht zur Mast eingestallt. Zum Versuchsbeginn befand sich der Betrieb mit 30 % positiv getesteten Fleischsaftproben in der Kategorie II des Salmonellenmonitorings. Das Stallgebäude, in dem die

schleuseHygiene- Kranken-

stall Kranken-

stall

(47)

Untersuchungen durchgeführt wurden, fasst 580 Mastplätze in vier Abteilen mit je vier Buchten, wobei eine Bucht in einem Abteil aus baulichen Gründen kleiner ausfällt und demnach weniger Tiere untergebracht werden können. In den übrigen 15 Buchten werden jeweils 38 Tiere gemästet, die Zugang zu einem buchteneigenen Futterautomaten haben. An die Fütterungsautomatik sind zwei Silos angeschlossen, die jeweils zwei Abteile versorgen. Es konnten also zwei Kontrollgruppen und zwei Versuchs- gruppen, die 3 kg MOS pro Tonne Futter erhielten, eingerichtet werden.

Da die Abteile und Buchten in denen die zu beprobenden Tiere standen, innerhalb des Stallgebäudes alle baugleich waren, wurden die Tiere zu einer Versuchs- und einer Kontrollgruppe zusammengefasst. Es wurden pro Abteil in zwei der vier Buchten jeweils zehn von den 38 Mastschweinen, sprich 40 Tiere in der Kontroll- und 40 Tiere in der Versuchsgruppe, mit individuellen Ohrmarken markiert und regelmäßig von der Einstallung bis hin zur Schlachtung beprobt.

Metaphylaktisch wurden in der ersten Woche beim ersten Mastdurchgang in Betrieb D Tetracyclin und Lincomycin eingesetzt (siehe 10.6).

Abb. 5: Skizze des Stallgrundrisses Betrieb D.1

Hygiene- schleuse

(48)

Bei Betrieb D.2 handelt es sich grundsätzlich um den gleichen Betrieb wie bei D.1.

Der Betrieb wurde jedoch während des ersten Mastdurchganges erweitert und ein baugleiches Stallgebäude direkt neben dem bereits bestehenden errichtet. Hierfür wurde die Fütterungstechnik umgestellt, so dass nun jeweils ein Silo pro Stall zur Verfügung steht. Da die Gebäude nahezu identisch sind (das neue Stallgebäude hat 16 identische Buchten, in dem alten Gebäude ist eine Bucht verkleinert), dem gleichen Management unterstehen und die Tiere unter den gleichen Bedingungen gehalten werden, wurde ein weiterer Mastdurchgang unter diesen neuen Gegebenheiten in die Studie mit einbezogen. Hierbei dienten die Tiere in dem neuen Stall als Kontrollgruppe und die Tiere in dem alten Stall als Versuchsgruppe, welche 1,5 kg MOS pro Tonne Mastfutter erhielt. Die Tiere stammten aus der gleichen Herkunft aus Dänemark wie bei den Betrieben A und D.1 und wurden ebenfalls mit einem Gewicht von ca. 28 kg zur Mast eingestallt. Pro Stallgebäude wurden in den spiegelgleichen fünf Buchten jeweils fünf der 38 Tiere (25 Tiere pro Gruppe) wie gewohnt markiert und regelmäßig bis zur Schlachtung beprobt.

Beim zweiten Mastdurchgang in Betrieb D wurden in der ersten Mastwoche bei der Versuchsgruppe Tetracyclin und bei der Kontrollgruppe Chlortetracyclin, Lincomycin und Neomycin verabreicht. In der fünften Mastwoche erhielten die Tiere der Versuchsgruppe Tetracyclin und Trimethoprim-Sulfadiazin. Die Kontrollgruppe bekam in dieser Woche Amoxycillin und Chlortetracyclin. Eine Woche später erhielten die Schweine in der Versuchsgruppe Doxycyclin und Tylosin, die Tiere in der Kontrollgruppe bekamen Lincomycin und Chlortetracyclin verabreicht (siehe 10.6).

(49)

Abb. 6: Skizze des Stallgrundrisses Betrieb D.2

Hygiene- schleuseHygiene- schleuse

(50)

3.2 Tiere

Die Betriebe A und D erhielten ihre Mastschweine aus Dänemark vom gleichen Lieferanten. Die Ferkel stammen aus dem dänischen DanZucht-Programm, in dem die Rassen Yorkshire, Landrace und Duroc eingesetzt werden (ANONYMUS 2010b). Alle Tiere in Betrieb A und D hatten die gleiche Ohrmarkennummer und wurden jeweils mit ca. 28 kg Körpergewicht zur Mast eingestallt. Tiere aus Süddeutschland, die aus dem deutschen PIC-Zuchtprogramm (PIC Deutschlang GmbH) stammen, wurden mit ca. 30 kg im Betrieb B eingestallt. Betrieb C mästet Tiere aus der eigenen Ferkelproduktion ab 40 kg Körpergewicht, welche von PIC-Hybridsauen der PIC Deutschland abstammen, die mit Samen von Pietrain-Ebern belegt wurden.

3.3 Versuchsgruppen

Für den Versuch wurden die Mastschweine je Bestand in unterschiedliche Gruppen unterteilt (siehe 3.1). Neben den Kontrollgruppen, die ausschließlich das herkömmliche Mastfutter von den Futtermühlen bekamen, wurden Versuchsgruppen gebildet, die entweder 1,5 kg oder 3 kg MOS pro Tonne Mastfutter von Mastbeginn an bis zur Schlachtung erhielten.

Bei der Auswahl der Tiere für den Versuch wurde darauf geachtet, dass eine möglichst repräsentative Stichprobe für die Tiere in den jeweiligen Buchten gewählt und markiert wurde. Sowohl beim Geschlecht, als auch bei dem Gewicht wurde auf eine möglichst homogene Verteilung geachtet.

3.4 Futter

In allen vier Betrieben sind Breiautomaten installiert, die regelmäßig anhand computergestützter Fütterungsprogramme automatisch befüllt werden. Die Rationen sind so bemessen, dass gruppenweise nahezu ad libitum gefüttert wird. An den Automaten können sich die Tiere ihr pelletiertes (Betrieb A) bzw. ihr pelletiert-

(51)

gekrümeltes (Granulat-) Futter (Betriebe B, C, D) selbständig abrufen und mit Hilfe zweier Nippeltränken mit Wasser anmischen. Eingesetzt wurde herkömmliches Schweinemastfutter, welches von ansässigen Futtermühlen bezogen wurde (Zusammensetzung siehe 10.5). Laut Herstellerangaben eines handelsüblichen, kommerziell hergestellten MOS-Präparates wird eine Dosis von 0,5 bis 5 kg pro Tonne Futtermittel empfohlen. Für die Untersuchungen wurden Dosen von 1,5 kg und 3 kg MOS/t Futter eingesetzt. Die Einmischung der MOS in das jeweilige Mastfutter erfolgte durch die Futtermühlen-Firmen, welche die Betriebe auch mit dem herkömmlichen Mastfutter belieferten.

3.5 Probenplan

Im Verlaufe der sechs Mastdurchgänge wurden regelmäßig Blutproben, Sammel- und Einzelkotproben, sowie Fleischsaftproben bei der Schlachtung genommen. Alle Proben wurden in dem akkreditierten Labor der Außenstelle für Epidemiologie in Bakum untersucht.

Da eine fäkale Ausscheidung der Salmonellen nur intermittierend stattfindet, wurden regelmäßig alle 14 Tage Sammelkotproben aus den entsprechenden Versuchsbuchten entnommen, angereichert und molekularbiologisch auf Salmonellen untersucht. Ein Teil der Anreicherung diente als Rückstellprobe, damit im Falle eines positiven rt-PCR Ergebnisses eine zusätzliche kulturelle Untersuchung auf noch lebende und vermehrungsfähige Bakterien folgen konnte.

Bei jedem der sechs Mastdurchgänge wurden an jeweils drei Terminen Blutproben entnommen und anschließend per ELISA serologisch auf Salmonellen-Antikörper untersucht. Die erste Blutentnahme fand einen bis maximal fünf Tage nach der Einstallung statt, die zweite zur Mitte der Mast bei einem Tiergewicht von ca. 60-70 kg und die dritte zum Ende der Mast, im Zeitraum von zwei Wochen bis einen Tag vor der Schlachtung.