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Aus dem anatomisch-biologischen Institut der Universit~,t Berlin.
Uber die V e r w e n d u n g der Paraffin- einbettung bei Markscheidenf rbung.
Von
Dr. O e o r g e L. S t r e e t e r .
Obschon in der Litteratur haufig auf die Anwendung und Abanderung, des W e i g e r t ' schen Markscheidenverfahrens hin- gewiesen wird, scheint doch die Frage "nach der Benutzung anderer Einbettungsmittel als des urspriinglich vorgeschlagenen Celloidin relativ wenig berfihrt worden zu sein. Dieses fiber- rascht urn so mehr, als Paraffin im Gegensatz zum Celloidin das ideale Einbettungsmittel ffir die hnfertigung yon Serienschnitten ist, die gerade bei der Markscheidenmethode besonders erwfinscht sind. Die Schwierigkeiten, mit Celloidin befriedigende Serien yon kleineren Reptilien- und Fischgehirnen herzustellen, kSnnen kaum iibertrieben werden und machen fast die Anwendung dei prachtvollen W e i g e r t ' s c h e n Methode auf diesem Gebiet un- brauchbar.
Versucht ist die Anwendung des Paraffins yon C i a g 1 i n s k i (1) S t r a s s e r (2), v a n W a 1 s e m (3), und H a u g h (4) ;sie alle richteten ihr Bestreben auf die aufgeklebten Schnitte. huch K5 p p e n (5), weist auf Versuche mit Paraffin hin, schreibt aber nichts yon yon Einzelheiten oder Resultaten. B e e v o r (6) bettete vorher in toto gefarbtes und differenziertes Material in Paraffin ein, machte davon Schnitte und schloss sie ohne weitere Behandlung ein. Auf diese Weise gelang es ihm, Praparate herzustellen, die wohl den groben Unterschied zwischen grauer und weisser Substanz zeigten, aber ffir feineres Studium untauglich waren.
Merkwfirdigerweise ist in den Kompendien und in den ausffihrlicheren Bfichern der Mikroskopischen Technik weder etwas ffir noch gegen die hnwendung des Paraffins als Einbettungs- mittel erwahnt. Deshalb bettete Verfasser gelegentlich wert- volles Material in Paraffin ein, wodurch die Objekte sofort un- brauchbar wurden. Dieser Misserfolg veranlasste eine Reihe yon Versuchen um den unbefriedigenden Erfolg der Paraffineinbettung zu ermitteln.
Die ersten Praparate wurden nach ahnlichen Methoden gemacht, wie sie yon C i a g l i n s k i , S t r a s s e r , v a n W a l s e m , und H a u g h angewandt wurden, aber stets mit enttauschenden Resaltaten. Obgleich in diesen Praparaten die Haupttopo- graphie dargestellt war, war doch bei genauerer Betrachtung keine feinere Faser zu sehen, und die grOberen Fasern sahen statt dicker Ringe und Cylinder wie eine Reihe feiner unregel- massiger Blaschen aus.
Es wurde bald wahrnehmbar, dass hier die Schwierigkeit nicht in der Unfarbbarkeit des Myelins zu suchen war, sondern in der Tatsache, dass das Myelin teilweise entfernt worden war;
das Myelin der feineren Fasern war sogar vollstandig ver- schwunden und yon dem der grSberen Fasern war bloss ein kleiner Rest hinterlassen. - - Die Schuld an diesen Veranderungen scheint also in der Einbettung zu suchen zu sein, und allem An- schein nach entweder in der das Myelin auflSsenden Wirkung des Xylols oder in dem zerstSrenden Einfluss der Hitze, oder vielleicht auch in beiden. Der Versuch wurde deshalb gemacht, das Verweilen des Materials im Xylol so viel wie m0glich zu verktirzen, und um die Temperatur herabzusetzen sehr weiches Paraffin angewandt. Schnitte yon so behandeltem Material zeigten nach Farbung und Differenzierung jedoch noch einen erheblichen Myelin-Verlust.
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~Nun war es klar, dass eine Anderung des Verfahrens vor der Einbettung erfolgen musste, und zwar musste das M y e l i n - wenigstens jener Teil des Myelins, der an der Farbung beteiligt ist - - i n irgend einer Weise so gebeizt und fixiert werden, dass es in dem Vorharze unl0slich blieb. Da nun bekanntlich das Hamatoxylin mit chromgebeiztem Myelin eine Verbindung ein- geht, die in Xylol usw. unl0slich ist, so wurde versucht, das ganze Sttick mit Hamatoxylin zu durchtranken, bevor es in Xylol und Paraffin kam, aber abweichend yon den erwahnten Experimenten yon B e e v o r wurde die Differenzierung an den Schnitten statt am ganzen Block vorgenommen. Differenzierte Schnitte yon so vorbehandeltem Material bestatigten die Vermutung, dass auf diese Weise ein befriedigendes Resultat erzielt werden konnte, und es bedurfte bloss der Ausarbeitung verschiedener Einzelheiten, um Praparate anzufertigen, welche dasselbe pracht-
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volle, charakteristische Bild gelungener Celloidin-Praparate darst.ellten.
Das Verfahren besteht also in Beizung, Farbung, Ein- bettung, Schneiden, Differenzierung, und Einschluss. Es kann auf folgende Weise beschrieben werden:
Be i z u n g . Das frische Material wird gleich in die W e i g e r t ' sche Mischung (7) yon 5% Kaliumbichromat und 2%
Fluorchrom hineingebracht, und in dieser L~sung bleibt e s - einmal g e w e c h s e l t - bei Zimmer-Temperatur 4 - 8 Tage. Ge- hirne kleinerer Tiere ftir Serien-Zwecke werden nut teilweise prapariert, ehe sie in die L(isung kommen; gentigende Him- schale wird darum gelassen, um die nattirliche Form zu er- halten. Das nervsse Gewebe wird nach 12 Stunden hinreichend hart, um die weitere Entfernung des Gehirns zu gestatten.
Anstatt dieser Schnellhartungs'Fltissigkeit kann man ein- laches 5% iges Kaliumbichromat, oder die ~[ti 11 e r ' sche Fltissigkeit, 2--3 Monate anwenden, und diese Hartungsart ist trotz der langeren Zeitdauer wegen ihrer gr0sserer Gleich- massigkeit im Durchdringen zu empfehlen.
Die vorherige Hartung im Formol und besonders die sekundare Beizung in essigszurem Kupferoxyd wirken st(irend auf den Erfolg der Farbung.
F a r b u ng. Bevor d a s Material in die Farbefitissigkeit kommt, ist es mit Rticksicht auf das erfolgreiche Eindringen des Hamatoxylins sehr niitig, dass das ~bermass der Chrommischung yon dem Praparat grtindlich entfernt wird. Zu diesem Zweck gentigt es die Objekte 1--2 Wochen in oft gewechseltem 80 o hlkohol zu lassen; dennoch wirkt ein langeres ¥erweilea im Al- kohol nicht st6rend auf das Resultat. Chromiertes Material, das sogar fiber ein Jahr im Alkohol gewesen ist, oder das in Celloidin schon eingebettet war, ist nach der Entfernung des Celloidins noch vollkommen zur Farbung geeignet.
Das Material ist nach diesem grtindlichen Absptilen in A l k o h o l - vielleicht kSnnte statt Alkohol fiiessendes Wasser dazu gebraucht w e r d e n - dann bei Zimmertemperatur, 4 - 6 Tage, ,in toto" zu farben in der W e i g e r t' schen Fltissigkeit (.8), bestehend aus i gr. Hamatoxylin, i ccm Lithium Carbonicum- LSsung, 10 ccm 960 Alkohol und 90 ccm Wasser. Diese L(isung sollte nach 24 und 72 Stunden gewechselt werdeJa.
E i n b e t t u n g . Das Material wird jetzt 48 Stunden in 700 Alkohol abgespiilt, dann in steigende'm Alkohol wasserfrei gemacht, im Chloroform oder Xylol aufgehellt und im Paraffin yon 50 o C. Schmelzpunkt eingebettet.
S c h n it t e. Zum Markscheidenstudium bei kleineren Tieren eignet sich die Schnittdicke yon 10--15 ~ am besten. Diese Schnitte werden mit Eiweiss-Glycerin aufgeklebt, und durch Xylol, 950 und 70 o hlkohol in Wasser gebracht und sind dann fertig zum differenzieren.
Bei der Serienanfertigung lohnt es sich, zur Vermeidung des mSglichen zufalligen Verlusts eines Schnittes, nach dem 95 ° hlkohol die aufgekiebten Schnitte durch eine Mischung yon gleichen Teilen absoluten hlkohol und Ather zu bringen, und dann mit einer sehr dtinnen Schicht yon Photoxylin oder Celloidin zu tibergiessen, welches nachher ftir einige Stunden in 700 Alkohol gehartet wird.
D i f f e r e n z i e r u n g . Die Schnitte kSnnen in der yon W e i g e r t angegebenen Fltissigkeit, bestehend aus Ferridcyan- kalium 2~/~%, und Borax 2% in Wasser differenziert werden.
Bei Serien ist es empfehlenswert, diese LOsung zehnmal zu ver- dfinnen, allerdings braucht man dann einige Stunden zum ent- farben der Praparate, doch sind die Resultate gleichmassiger.
Statt dessen kann man auch das yon P a l ( 9 ) empfohleno Verfahren anwenden und zwar auf folgende Weise: Die Objekt- trager mit aufgeklebten Schnitten werden in eine flache Glas- schale, enthaltend eine ~/~50 L(isung yon Kalium hypermanganicum, hineingebracht, und die Differenzierungsprozedur wird mit dem Mikroskope verfolgt. Bei Schnitten yon 15 ~ treten nach un- gefahr zehn Minuten die Nervenfasern deutlich hervor. Die Schnitte werden dann kurz in Wasser abgesptilt und der Hinter- grund kann nach dem Geschmack des Praparators in einer Mischung yon Kalium sulfurosum und Oxalsaure zu je ~/4 % in Wasser gebleicht werden.
Die zweite yon den beiden Differenzierungsmethoden scheint sich bei diesem so stark tiberfarbten Material etwas bequemer anwenden zu lassen.
W e i t e r e B e h an d lu ng. Die Praparate stehen nach Entfarbung 24---48 Stunden in fliessendem Wasser, werden dann
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in Alkohol entwassert, in Carbol-Xylol aufgehellt, in Xylol ab- gesptilt, und in Balsam eingeschlossen.
Vermittels des oben beschriebenen Verfahrens sind Prlt- parate von folgendem Material yon dem Verfasser angefertigt worden: Ratte, Rfickenmark und Ganglion Gasseri; Torpedo, Rtickenmark ; Leuciscus rutilus, Gehirnserien; Leuciscus rutilus, Gehirn- (insitu) Serien; Frosch, Gehirnserien; Stier, Grosshirnrinde ; Erwachsener Mensch, Medulla oblongata (Diese Praparate wurden in der anatomischen Gesellschaft in Heidelberg, Mai 1903, demonstriert.)
Die Resultate sind h(ichst befriedigend. Es war mSglich, mit Leichtigkeit und Schnelligkeit tadellose Serien mit jeder beliebigen Schnittdicke zu machen; und eine Vergleichung dieser Praparate, durchgeffihrt mit Celloidin-Kontrollschnitten bei Stier- Grosshirnrinde, Mensch-Medulla, und Torpedo-Rtickenmark, zeigte, dass das Myelin selbst bei den feinsten Fasern vollstandig er- halten und gef,~rbt worden war.
Dieses Verfahren verspricht also einigen Dienst bei der Verfertigung yon Praparaten des Nervensystems der gr6sseren Saugetiere, inklusive Mensch, zu leisten. Stfickel 1/.~ cm dick, k6nnen, einmal auf diese Weise eingebettet, unendlich lang auf- bewahrt werden, und Schnitte nach Belieben zu irgend einer Zeit abgeschnitten und differenziert werden -- eine Eigenschaft, besonders wtinschenswert bei Kursusmaterial.
Die dankbarsten Resultate sind aber da zu erwarten, wo ltickenlose, gleichmassige Serien yon kleineren Gehirnen, z. B. yon Fischen, hmphibien, Reptilien, kleinsten V6geln und Saugetieren erforderlich sind, oder mit anderen Worten, wo Paraffin mit Riicksicht auf die Griisse vorzuziehen ist.
Es ware mSglich, dass mit Veranderung der alkalischen Beschaffenheit und Konzentration der HamatoxylinlSsung ihre Eindringungs-Fahigkeit noch gesteigert werden k6nnte. Dieses~
vereinigt mit verbesserten Mikrotomen, kOnnte vielleicht die An- fertigung yon Serien yon viel gr6sserem Material erm6glichen.
Diese Frage und ebenso die fiber die notwendigen Veranderungen bei der Entkalkungsprozedur sind noch auszuarbeiten.
L i t t e r a t u r .
1. C i a g l i n s ki. Ein Beitrag zur mikroskopischen Technik bei der Unter- suchung des Riickenmarks und der peripheren Nerven. Zeit. f. wiss.
Mikr., Bd. 8. 1891.
2. S t r a s s e r. Uber die l~achbehandlung yon Serienschnitten bei Paraffin- einbettung. Zeit. f. wiss. Mikr., Bd. 3. 1886.
D e r s e l D e : W e i t e r e Hitteilungen usw. Zeit. f. wiss. Mikr., Bd. 9.
1892.
D e r s e l b e . W e i t e r e Mitteilungen usw. Zeit. f. wiss. Mikr., Bd. 12.
1895.
3. v a n W a l sere. Beitrag zur Technik des Schneidens und der weiteren Behand[ung der Paraffinschni~tb~inder. Zeit. f. wiss. l~Iikr., Bd. 11. 1894.
4 H a u g h. ~)ber eine einfache verl~issige M e t h o d e der Darstellung tier nervSsen Elemente des Riickenmarkes. Zeit. f. wiss. M i k r , Bd. 7. 1890.
5. K S p p e n . Zur Anatomie des Froschgehirns. Arch. f. Anat. u. Physiol., Anat. Abt. 1888.
6. B e e v o r. On staining ,in toto ~ the central nervous system with W e i g e r t ' s Hiimatoxylin. Brain, Vol. 8. 1886.
7. W e i g e r t . Die Markscheidenfiirbung. Merkel-Bonnet, Anatom. Hefte, Ergebnisse, Bd. 6. 1896.
8. D e r s e l b e : Neue Fiirbungsmethoden fiir das Zentralnervensystem.
Fortschritte der Medizin, 1884.
9. P a l . Ein Beitrag zur Nervenf~rbetechnik. Wien Med. Jahrb. 1886.
Zeit. f. wiss. Mikr., Bd. 4. 1887.
