Hypoxie-induzierte Genexpressionsveränderungen in Lascr-mikrodisseziierten Lungenkompartimenten
INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades eines
Doktors der Medizin des Fachbereichs Humanmedizin der Justus-Liebig-Universität Gießen
vorgelegt von
Stephanie Wolff, geb. Kohlhoff
aus Wiesbaden
Gießen, 2005
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Inhhaltsverzeichnis Seite
Abkürzungsverzeichnis V-IX 1 Einleitung 1-15
1.1 Hypoxie-bedingte Reaktionen der Lunge und die Folgen für den 1 Organismus
1.2 Ursachen der pulmonalen Hypertension 2 1.3 Morphologische Veränderungen bei der pulmonalen Hypertension 4 1.4 Hypoxie-assoziierte Genexpressions Veränderungen der Lunge, Lungen- 5
gefäße und isolierter pulmonaler Gefäßzellen
1.5 Definition, Funktion und Regulation der Angiogenese 8 1.6 Hypoxie-induziertes pulmonal-vaskuläres Remodeling 9 1.7 Funktion und Regulation der Mitogen-aktivierenden Protein (MAP)- 9
Kinasen und Transkriptionsfaktoren bei Hypoxie
1.8 Genexpressions-Analysen 12 1.8.1 Untersuchungen von Gewebehomogenaten 12 1.8.2 Untersuchungen von Mikrodissektaten 13 1.8.3 Quantitative Analysen 13 1.9 Kombination von Mikrodissektion, RNA-Präamplifikation und cDNA- 14
Arrays
1.10 Fragestellungen und Ziele der Arbeit 15
2 Materialien und Methoden 16-41
2.1 Materialien 16 2.1.1 Lungenpräparation 16 2.1.1.1 Präparation der normoxischen und hypoxischen Lungen 16 2.1.1.2 Präparation von LPS- und INFy- stimulierten Lungen 17 2.1.2 Kleinmaterial 17 2.1.3 Geräte 18 2.1.4 Reagenzien 19 2.2 Methoden 21 2.2.1 Anfertigung von Gefrierschnitten 21 2.2.2 Hämalaunfärbung von Kryoschnitten 21 2.2.3 Hämtoxylin-Eosin (HE)- / Elastica-Färbung von Kryoschnitten 21
II 2.2.4 Mikrodissektionsverfahren 2.2.5 Zell-Lyse
2.2.6 RNA-Extraktion aus mikrodisseziiertem Zellmaterial 2.2.6.1 Phenol-Chloroform-Extraktion
2.2.6.2 RNA-Extraktion nach RNAzol-Lyse
2.2.7 DNase I-Verdau zur Elimination genomischer DNA 2.2.8 RNA-Präamplifikationsmethoden
2.2.8.1 PCR-basierte RNA-Präamplifikation (SMART™) 2.2.8.1.1 SMART-cDNA-Synthese
2.2.8.1.2 SMART-PCR
2.2.8.1.3 Säulenaufreinigung der cDNA 2.2.8.2 Ty-Amplifikation von RNA
2.2.8.3 Vergleich der SMART-PCR mit der T7-Amplifikation von RNA 2.2.9 Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR)
2.2.9.1 TaqMan: „real-time" quantitative PCR mit sequenzspezifischer Sonde
2.2.9.2 TaqMan: „real-time" quantitative PCR mit SYBR® Green 2.2.9.2.1 Reverse Transkription
2.2.9.2.2 SYBR® Green-PCR 2.2.10 Agarose-Gelelektrophorese 2.2.11 Radioaktive Markierung
2.2.11.1 Radioaktive Markierung während der reversen Transkription 2.2.11.2 Radioaktive Markierung der SMART-PCR-Produkte
2.2.12 Array-Hybridisierung
2.2.13 Exposition der Phosphorimager-Fotoplatte 2.2.14 Auswertung der Arrays
2.2.15 Stripping der Arrays
3 Ergebnisse
3.1 Vergleich zwischen RNazol-Lyse und GTC-Lyse 3.2 Quantitative Verluste durch die Säulenreinigung
3.3 Erhaltung des Expressionsprofils nach RNA-Präamplifikation, Effek- tivitäts-Vergleich zwischen der T7-RNA-Amplifikation und der LD-PCR
22 23 24 24 25 25 26 26 26 26 27 28 30 30 30
31 32 32 33 34 34 35 36 38 39 40
42-60 42 42 43
III
3.4 Festlegung der optimalen Zahl an Präamplifikationszyklen bei der 44 SMART™-PCR
3.5 Bestimmung des Amplifikationsfaktors 46 3.6 Abhängigkeit der Amplifikationsfaktoren vom Alter der Mauslungen 46 3.7 Korrelation der Ergebnisse der quantitativen PCR mit der Stärke des radio- 47
aktiven Einbaus
3.8 Zusammenhang zwischen radioaktiver Markierung, Effektivität der 48 Hybridisierung und Expositionsdauer
3.9 Auswertung der Arrays 50 3.9.1 Vergleich der Expressionsprofile von Mauslungenhomogenat mit 50
dem von mikrodisseziierten Arterien
3.9.2 Vergleich von mikrodisseziierten Arterien, Reproduzierbarkeit der 51 Ergebnisse
3.9.3 Vergleich von mikrodisseziierten Gefäßen: Normoxie versus Hypoxie 51 3.9.4 Vergleich von mikrodisseziierten Alveolarzellen normoxischer und 56
hypoxischer Lungen
3.10 Bestätigung der Ergebnisse durch „real-time"-PCR 59 3.11 Überprüfung ausgewählter Gene mit Hypoxie-Regulation durch „real-time" 59
-PCR
4 Diskussion 61-91
4.1 Allgemeine und Methoden-basierte Diskussion 61 4.2 Wichtige Hypoxie-regulierte Gene 65 4.2.1 12 kDa-FK506-Bindungsprotein la (FKBP12) 65 4.2.2 CD36 66 4.2.3 Lipocalin2 71 4.2.4 Adiponektin 72 4.2.5 Extrazelluläre Matrix-Proteine 73 4.2.5.1 Prokollagene 73 4.2.5.2 Matrix-y-Carboxyglutamat-Protein (MGP) 75 4.2.6 DNA-Bindungs-Inhibitor 1 (Id-1) 77 4.2.7 Selen 78
4.2.8 Cytochrom b245 80
4.3 Zeitliche Einordnung des Hypoxie-induzierten Angiogenese- und Remode- 81 ling-Prozesses
IV
4.4 Denkbare präventive und therapeutische Ansatzpunkte 83 4.5 Mechanismen der Genregulation 87 4.6 Zusammenfassung und Ausblick 90 4.7 Abstract 91
5 Literatur 92-110
Anhang 111 Erklärung 118 Publikationen 119 Danksagung 122 Lebenslauf 123
