Kontraktilität inflammatorisch veränderter boviner Uteri - eine in vitro Studie am isoliert perfundierten Uterus
INAUGURAL – DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer DOKTORIN DER VETERINÄRMEDIZIN
- Doctor medicinae veterinariae - (Dr. med. vet.)
vorgelegt von Julia Volland Bergisch Gladbach
Hannover 2013
Univ. Prof. Dr. med. vet. Christiane Pfarrer Anatomisches Institut
1. Gutachter: Univ. Prof. Dr. med. vet. Heinrich Bollwein
2. Gutachter: Univ. Prof. Dr. med. vet. Anne-Rose Günzel-Apel
Tag der mündlichen Prüfung: 27.05.2013
Meinen Schwestern
2 LITERATUR ... 3
2.1 Das Puerperium ... 3
2.2 Morphologie und Physiologie des Myometriums ... 3
2.3 Kontraktilität des Uterus postpartum ... 5
2.4 Puerperale Uteruserkrankungen ... 6
2.5 Therapie puerperaler Uteruserkrankungen ... 8
2.5.1 Uterotonika ... 9
2.5.1.1 Prostaglandin F2α ... 9
2.5.1.2 Oxytocin ... 12
2.6 Hormonrezeptoren am Uterus ... 13
2.6.1 Der Oxytocin Rezeptor ... 13
2.6.2 Der Prostaglandin F2α Rezeptor... 14
2.6.3 Der Progesteron Rezeptor ... 15
2.6.4 Der Östrogen Rezeptor ... 16
2.7 Methoden zur Messung der uterinen Kontraktilität ... 17
2.7.1 Elektromyographische Untersuchung ... 17
2.7.2 Intrauterine Druckmessung ... 17
2.7.3 Untersuchung mittels Dehnungsmessstreifen ... 18
2.7.4 Sonomikrometrie ... 18
2.8 Isoliert perfundierter Uterus ... 19
2.8.1 Prinzip des isoliert perfundierten Uterus ... 19
2.8.2 Kontraktionsmessungen am isoliert perfundierten Uterus ... 20
3 MATERIAL UND METHODEN ... 22
3.1 Versuchsmaterial ... 22
3.2 Euthanasie und Entnahme des Uterus ... 22
3.3 Einteilung der Versuchsgruppen ... 23
3.6 Sonomikrometrie ... 28
3.6.1 Messgeräte ... 28
3.6.2 Prinzip der sonomikrometrischen Messung und Einstellungen ... 28
3.6.3 Implantation der Kristalle ... 29
3.6.4 Auswertung der Sonomikrometriedaten ... 29
3.7 Vitalität des isoliert perfundierten Rinderuterus ... 30
3.8 Blutprobenentnahme und –untersuchung ... 31
3.8.1 Blutprobenentnahme und –asservierung ... 31
3.8.2 Parameter ... 31
3.9 Uterusproben ... 32
3.9.1 Entnahme und Verarbeitung ... 32
3.9.2 Histopathologische Untersuchung ... 33
3.10 Immunhistochemie ... 34
3.10.1 Immunhistochemische Färbung ... 34
3.10.2 Immunhistochemische Auswertung ... 36
3.10.2.1 Oxytocin Rezeptor ... 36
3.10.2.2 Progesteron Rezeptor ... 36
3.10.2.3 Östrogen α Rezeptor... 37
3.10.2.4 Prostaglandin F2α Rezeptor ... 37
3.11 Statistische Auswertung ... 38
4 ERGEBNISSE ... 39
4.1 Versuchsmaterial ... 39
4.1.1 Gruppeneinteilung... 39
4.1.2 Rasse, Alter und Laktationsstand ... 40
4.1.3 Gewicht und Größe der Uteri sowie Funktionsgebilde auf den Ovarien ... 40
4.2 Histopathologische Befunde an den Uterusproben der Gruppe mE ... 42
4.3 Vitalität der isoliert perfundierten Uteri ... 42
4.3.1 Glukoseverbrauch ... 42
4.3.2 Laktatproduktion ... 43
4.5 Blutparameter... 47
4.5.1 Calcium ... 47
4.5.2 Gesamtöstrogen ... 47
4.5.3 Progesteron ... 47
4.6 Sonomikrometrie ... 48
4.6.1 Spontankontraktionen ... 48
4.6.2 Kontraktionen der Uteri der Gruppen oM und mM nach Stimulation ... 51
4.6.2.1 Stimulation mit Oxytocin ... 51
4.6.2.2 Stimulation mit Prostaglandin F2α... 57
4.6.3 Einfluss der Stimulation mit Oxytocin und Prostaglandin F2α ... 60
4.6.4 Zusammenhang zwischen der Kontraktilität und den Tagen nach der Abkalbung ... 62
4.6.5 Kontraktionen nach Stimulation in Gruppe oE und mE ... 62
4.7 Immunhistochemie ... 65
4.7.1 Oxytocinrezeptor ... 65
4.7.2 Prostaglandin F2α Rezeptor ... 68
4.7.3 Progesteronrezeptor ... 71
4.7.4 Östrogen Rezeptor α ... 74
4.8 Zusammenhang zwischen der Rezeptorexpression und den Progesteron- und Gesamtöstrogenspiegeln im Blutplasma ... 77
4.8.1 Gruppe oM und mM ... 77
4.8.2 Gruppe oE und mE ... 77
5 DISKUSSION... 78
5.1 Modell des isoliert perfundierten Uterus ... 78
5.1.1 Glukoseverbrauch ... 79
5.1.2 Laktatproduktion ... 80
5.1.3 Perfusionsbedingte Veränderungen ... 80
5.2 Versuchsmaterial ... 81
5.2.1 Zuordnung zu den Gruppen ... 81
5.2.2 Alter und Uterusinvolution ... 82
5.3 Sonomikrometrie ... 83
5.3.1 Spontankontraktion ... 83
5.3.2 Wirkung der Uterotonika in der frühpuerperalen Phase ... 84
5.3.2.1 Oxytocin ... 84
5.3.2.2 Prostaglandin F2α ... 87
5.4.4 Östrogen α Rezeptor ... 94
5.4.5 Zusammenhänge zwischen den Blutparametern und der Rezeptorexpression ... 94
5.5 Schlussfolgerung und Ausblick ... 95
6 ZUSAMMENFASSUNG ... 96
7 SUMMARY ... 98
8 LITERATURVERZEICHNIS ... 100
9 ANHANG ... 116
9.1 Einteilung der Endometritiden ... 116
9.2 Immunhistochemischen Färbung der Hormonrezeptoren ... 117
9.2.1 Prostaglandin F2α Rezeptor ... 117
9.2.2 Progesteron Rezeptor ... 118
9.2.3 Oxytocin Rezeptor ... 119
9.2.4 Östrogen α Rezeptor ... 120
9.3 Puffer ... 121
9.3.1 Waschpuffer ... 121
9.3.2 Puffer zur Antigenmaskierung ... 121
9.4 Befunde der Beurteilung des Uterusinhaltes ... 122
9.4.1 Uteri mit Metritis ... 122
9.4.2 Uteri mit Endometritis ... 122
9.5 Sonomikrometrie ... 123
9.5.1 Vergleich der Strecken ... 123
9.5.1.1 Uteri ohne Metritis ... 123
9.5.1.2 Uteri mit Metritis ... 125
9.5.2 Vergleich der Wirkung von Oxytocin und Prostaglandin F2α ... 126
9.5.3 Einfluss der Reihenfolge der Stimulation ... 129
A. Arteria
Aa. Arteriae
Abb.
Ak A. dest.
BSA
Abbildung Antikörper Aqua destillata
Bovines Serum Albumin Ca
CaCl2
Calcium
Calciumchlorid
DAB Chromogen 3,3´ Diaminobenzidin
Eges Gesamtöstrogen
E. coli Escherichia coli
EDTA Ethylendiamintetraacetat
ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay
ER Östrogen Rezeptor
F. necropherum Fusobacterium necropherum FP
fpG gH
Prostaglandin F2α Rezeptor Frühpuerperale Gruppe Ehemals gravides Horn H.E.
HCl
Hämatoxylin-Eosin Salzsäure
HRP Horseradish Peroxidase
IgG Immunglobulin G
i.m. Intramuskulär
i.v. Intravenös
ICC Interstitial Cells of Cajal
IE Internationale Einheiten
m-ICLC Myometrial Cajal-like interstitial Cells MAD
MHK MgCl2
mittlere absolute Abweichung (Median absolute deviation) minimale Hemmstoffkonzentration
Magnesiumchlorid N
NaCl NaHCO3
NaOH NaH2PO4
ngH
Anzahl
Natriumchlorid
Natriumhydrogencarbonat Natriumhydroxid
Natriumhydrogenphosphat Ehemals nicht-gravides Horn
OXTR Oxytocin Rezeptor
p Irrtumswahrscheinlichkeit
P4 Progesteron
PBS PGE
Phosphat-gepufferte Salzlösung (phospate buffered saline) Prostaglandin E
PGF2α Prostaglandin F2α
PGFM 15-Keto-13,14-Dihydro-Prostaglandin-F2α-Metabolit PMN polymorphkernige neutrophile Granulozyten
p.p. post partum
PR Progesteron Rezeptor
r Korrelationskoeffizient
RIA Radioimmunoassay
s.c.
spG
subcutan
Spätpuerperale Gruppe
spp. Subspezies
Tab.
TBS
Tabelle
Tris-gepufferte Salzlösung (Tris buffered saline)
TEC Tris-EDTA-Citrat Lösung
Vv. Venae
Z Zytoplasma
1 Einleitung
Puerperalstörungen, wie Nachgeburtsverhaltungen und Metritiden, zählen zu den bedeutendsten Erkrankungen in der Milchviehhaltung [1, 2]. Dabei entstehen hohe finanzielle Verluste durch eine reduzierte Fertilität, steigende Behandlungskosten, verminderte Milcherträge und erhöhte Merzungsraten [2, 3, 4].
Bei gestörtem Puerperalverlauf werden vielfach Uterotonika, wie Prostaglandin F2α
(PGF2α) und Oxytocin eingesetzt, um durch Steigerung der Uteruskontraktilität die Entleerung des Inhalts und Reduktion der Größe zu fördern und somit die Uterusinvolution zu beschleunigen und die nachfolgende Fertilität zu verbessern.
Untersuchungen zur Wirksamkeit dieser Therapien lieferten jedoch widersprüchliche Ergebnisse [5]. So zeigte sich in einigen Studien nach Gabe von PGF2α bzw.
Oxytocin ein positiver Effekt auf die Uterusinvolution und die nachfolgende Fruchtbarkeit [6, 7], in anderen Studien hingegen wurde durch Uterotonika keine Verbesserung der Uterusinvolution und Fertilität erzielt [8, 9, 10]. Untersuchungen über den Effekt von PGF2α bzw. Oxytocin bei Tieren mit Puerperalstörungen liegen allerdings nicht vor. Außerdem beschreiben verschiedene Studien eine abnehmende Ansprechbarkeit des Myometriums gegenüber Oxytocin und PGF2α in den ersten Tagen post partum (p.p.) [5, 11, 12, 13]. Als Ursache hierfür wird ein Rückgang der Konzentration der entsprechenden Rezeptoren (Oxytocinrezeptor, OXTR und PGF2α
Rezeptor, FP) angegeben [11, 13]. Studien über den Verlauf der Expression dieser Rezeptoren in der postpartalen Periode beim Rind fehlen jedoch bisher [12].
Die Perfusion isolierter Organe stellt eine Ersatz- und Ergänzungsmethode zu Tier- versuchen dar und bietet die Möglichkeit eines kontrollierten Eingriffs und einer Fokussierung auf einzelne vom gesamten Organismus losgelöste Aspekte [14].
Verschiedene Studien konnten zeigen, dass das Modell des humanen [15, 16], porcinen [17, 18] und bovinen [19] isoliert perfundierten Uterus zur Messung von Uteruskontraktionen sowie zur Untersuchung des Effektes von Tokolytika und Uterotonika geeignet zu sein scheint. Im Vergleich von drei Modellen (isoliert
Übereinstimmung zwischen den damit erhaltenen Resultaten fest. In den zuvor genannten Studien wurden die Uteruskontraktionen mittels intrauteriner Druckkatheter oder Elektromyographie erfasst. Eine weitere Methode zur Darstellung von Uteruskontraktionen ist die Sonomikrometrie, die Ultraschallwellen zur Messung von Distanzen in Weichteilgeweben nutzt. Die Sonomikrometrie wurde in vivo am Rind bereits erfolgreich zur Untersuchung der Größenänderungen des Uterus im Puerperium eingesetzt [20, 21].
Das Ziel der vorliegenden Studie war es, durch sonomikrometrische Messungen an isoliert perfundierten Uteri die Auswirkungen der Applikation von Oxytocin und PGF2α
auf die Kontraktilität inflammatorisch veränderter Uteri zu untersuchen. Weiterhin sollten mögliche Zusammenhänge zwischen der Kontraktilität und der Hormonrezeptorexpression am Uterus dargestellt werden.
2 Literatur
2.1 Das Puerperium
Das Puerperium umfasst den Zeitraum von der Abkalbung bis zur vollständigen morphologischen und funktionellen Wiederherstellung des Uterus [22] und ist nach etwa 40 bis 42 Tagen abgeschlossen [22, 23, 24]. Während des Puerperiums finden die uterine Involution, die Elimination bakterieller Kontaminationen, die Regeneration des Endometriums und das Einsetzen der zyklischen Ovaraktivität statt [25].
Das Gesamtpuerperium kann in mehrere Abschnitte unterteilt werden und beginnt mit dem Nachgeburtsstadium, das mit dem Abgang der fetalen Plazenta etwa 6 Stunden p.p. abgeschlossen ist. In dem daran anschließenden Frühpuerperium mit einer Dauer von etwa 10 Tagen kommt es durch Vasokonstriktion und peristaltische Muskelkontraktionen [26] zu einer deutlichen Reduktion der Uterusgröße [22, 26]. Mit Abschluss des klinischen Puerperiums nach 21 Tagen ist in etwa die prägravide Uterusgröße wiederhergestellt [22]. Das Gewicht des Uterus reduziert sich in diesem Zeitintervall von ungefähr 9 kg nach der Geburt auf etwa 1 kg [26]. Bis 21 Tage p.p.
sind graviditätsbedingte Änderungen am Uterus histologisch noch zu erfassen [22].
In den folgenden Wochen erfolgt bis zum Ende des Gesamtpuerperiums die Wiederherstellung einer intakten Uterusmukosa [27].
2.2 Morphologie und Physiologie des Myometriums
Das Myometrium ist ein phasischer glatter Muskel, der die Fähigkeit zur Spontankontraktion besitzt [28]. Die glatten Muskelzellen sind nach der Single-Unit Hypothese zu einem Zellverband, einem „funktionellen Synzytium“, zusammengelagert und stehen über Kontaktstellen der Zellmembran, den so genannten gap junctions, miteinander in Verbindung. Hierdurch werden synchrone Kontraktionen ermöglicht [29, 30]. Die Kontraktionen des Uterus sind myogen. Das bedeutet, dass sich die Muskelzellen auch in Abwesenheit von neuralen und
Am Uterus sind spontane Depolarisationen von Schrittmacherzellen der Ursprung von myogenen Kontraktionen [29]. Welche Zellen im Myometrium die Rolle von Schrittmacherzellen übernehmen ist bislang ungeklärt [32].
Im Myometrium und Eileiter wurden jedoch Zellen identifiziert, die eine strukturelle Ähnlichkeit zu den Interstitial Cells of Cajal (ICC) des Magen-Darm Traktes aufweisen [33]. Bislang konnte eine mit den ICC vergleichbare Schrittmacherfunktion für die m-ICLC jedoch nicht eindeutig nachgewiesen werden. Allerdings wurden Schwankungen des intrazellulären Calciums in Zellen innerhalb des fibromuskulären Septums exakt an der Lokalisation der m-ICLC registriert. Diese Beobachtung könnte durchaus darauf hindeuten, dass die Signale für die myometrialen Kontraktionen von den m-ICLC herrühren [34]. Die Anwesenheit von Steroidhormonrezeptoren auf den m-ICLC könnte ein Hinweis darauf sein, dass die Modulation der Uteruskontraktilität hormonell kontrolliert wird [33].
Hormone spielen in der Regulation der uterinen Kontraktilität eine entscheidende Rolle [35, 36]. Die Muskelzellen des Uterus besitzen hochaffine Rezeptoren für Östrogene, Progesteron, Oxytocin und Prostaglandin sowie für Adrenalin und Noradrenalin [37].
Östrogene und Progesteron haben am Myometrium gegenteilige Effekte. Östrogene wirken kontraktionsfördernd, während Progesteron eine ruhig stellende Wirkung auf das Myometrium hat [36, 38]. Unter dem Einfluss von Östrogenen kommt es im Myometrium zu einer Senkung des Membranruhepotentials [39], zu einer vermehrten Ausbildung von gap junctions [40], einer Sensibilisierung des Myometriums gegen- über Oxytocin und Prostaglandin [11] sowie einer gesteigerten Synthese von kontraktilen Proteinen [36]. Progesteron hingegen erhöht das Membranruhepotential [39], reduziert die Verfügbarkeit von intrazellulärem Calcium [41], führt zu einer Abnahme der gap junctions [40] und desensibilisiert den Uterus gegenüber Oxytocin [42]. Auch Adrenalin und Noradrenalin zeigen gegenteilige Effekte. Während Adrenalin hemmend auf das Myometrium wirkt, fördert Noradrenalin Uteruskontraktionen [43]. Oxytocin und PGF2α induzieren ebenfalls Uteruskontraktionen (näheres siehe Kapitel 2.5.1).
Die Innervation des bovinen Uterus erfolgt in der longitudinalen Muskelschicht über adrenerge und in der zirkulären Muskelschicht über nonadrenerge und noncholinerge sowie in geringerem Ausmaß adrenerge Nervenfasern des autonomen Nerven- systems [44]. Vegetative Nervenfasern können die Frequenz und Stärke von Uteruskontraktionen beeinflussen, sind jedoch im Vergleich zu hormonellen und myogenen Mechanismen eher von untergeordneter Rolle [36].
2.3 Kontraktilität des Uterus postpartum
Postpartal spielt die Kontraktilität der glatten Muskulatur des Uterus eine bedeutende Rolle für die Entleerung des Uterusinhalts, der Reinigung der Uterushöhle und Reduktion der Uterusgröße [13]. Störungen in der uterinen Kontraktilität erhöhen das Risiko einer Kontamination mit opportunistischen Keimen, die den Prozess der Uterusinvolution verzögern können [8].
Unmittelbar nach der Kalbung laufen starke, koordinierte und frequente Myome- triumskontraktionen ab [37]. Die Frequenz, Amplitude und Dauer der Kontraktionen sind eine Stunde nach der Geburt am höchsten und fallen danach kontinuierlich ab [45]. Unmittelbar nach der Geburt beträgt die Kontraktionsfrequenz 20 bis 30 pro Stunde [37] und sinkt innerhalb der nächsten 24 Stunden p.p. um mehr als 50 % [46].
In den ersten Stunden nach der Geburt verlaufen die uterinen Kontraktionen überwiegend in tubozervikaler Richtung und sind nur gelegentlich von unkoordinierten und zervikotubalen Kontraktionswellen unterbrochen [5, 37, 46].
Die Hauptfunktion der tubozervikal gerichteten Kontraktionswellen ist die Ablösung und Entfernung der fetalen Plazenta aus dem Uterus [5, 46]. Ein Abgang der Nachgeburt 3 bis 8 Stunden p.p. bewirkt einen raschen Abfall der Spontanmotorik [37, 47], während eine Retentio secundinarum zu einer gesteigerten Frequenz der Uteruskontraktionen führt [45, 46].
Vom 1. bis 4. Tag p.p. laufen sowohl schwache Einzelkontraktionen, als auch kräftige, länger anhaltende Kontraktionswellen ab [37]. Um den 4. bis 5. Tag p.p.
unabhängig voneinander [48]. Bis zum 7. Tag p.p. können noch schwache myometriale Kontraktionen erfasst werden, wobei die Frequenz und Ausbreitung der Kontraktionen mit fortschreitender Zeit sinkt [5].
Unter dem kontraktionsfördernden Einfluss der Östrogene bei wiedereinsetzendem Zyklusgeschehen um den 12. / 13. Tag p.p. steigt die Frequenz der Kontraktionen wieder an [37, 47].
2.4 Puerperale Uteruserkrankungen
Puerperale Uteruserkrankungen sind mit erheblichen finanziellen Einbußen ver- bunden. Verluste entstehen durch steigende Behandlungskosten, sinkende Milch- erträge durch verringerte Milchleistung und Wartezeiten nach der Behandlung sowie durch sinkende Fertilitäts- und gesteigerte Merzungsraten [1, 49].
Bei mehr als 90 % aller Kühe kommt es im Frühpuerperium infolge einer aufsteigenden Infektion zu einer bakteriellen Kontamination des Uterus [50, 51].
Dabei handelt es sich überwiegend um ubiquitäre Keime, die bei Kühen mit ungestörtem Puerperalverlauf innerhalb der ersten 6 Wochen nach der Geburt schrittweise eliminiert werden [52].
Die Gefahr der Entwicklung einer klinischen Erkrankung ist von der Anzahl und Pathogenität der Bakterien, dem Verlauf von Geburt und Puerperium sowie der Immunabwehr des Rindes abhängig [53]. Escherichia (E.) coli, Arcanobacterium (A.) pyogenes, Prevotella subspezies (spp.) und Fusobacterium (F.) necropherum sowie Bacteroides spp. sind die bei Uterusinfektionen am häufigsten beteiligten Bakterien [25, 50]. Die synergistische Wirkung von A. pyogenes, F. necropherum, Bacteroides spp. und Prevotella spp. erhöht die Häufigkeit und Schwere einer uterinen Erkrankung [54]. Prädisponierende Faktoren für das Auftreten von Metritiden sind Retentio secundinarum, Dystokien, Zwillingsgeburten, Schwergeburten, Totgeburten und Stoffwechselstörungen, wie Hypocalcämie und Ketose [3, 51].
Angaben zur Inzidenz von Puerperalstörungen schwanken in der Literatur zwischen 3 % und 45 % [1, 4, 55]. Diese hohe Diskrepanz liegt unter anderem an der
Anwendung unterschiedlicher diagnostischer Methoden [3] und einer fehlenden einheitlichen Definition der puerperalen Uterusinfektionen [56].
Eine prinzipielle Übereinstimmung besteht bei der anatomischen Definition der Begriffe Endometritis (Entzündung des Endometriums) und Metritis (Entzündung aller Wandabschnitte des Uterus) [3, 57]. Jedoch werden die Begriffe Metritis und Endometritis im klinischen Gebrauch häufig synonym verwendet [58].
Sheldon et al. [59] haben die Puerperalerkrankungen nach klinischen und zytologischen Kriterien neu definiert. Sie unterscheiden zwischen Metritis, klinischer Endometritis und subklinischer Endometritis. Die Metritis tritt innerhalb der ersten 21 Tage p.p. auf und ist durch einen vergrößerten Uterus und einen übelriechenden Vaginalausfluss gekennzeichnet. Sheldon et al. [60] nehmen eine Unterteilung der klinischen Metritis in drei Grade vor. Kühe mit Metritis vom Grad 1 weisen einen vergrößerten Uterus mit eitrigem Vaginalausfluss ohne Anzeichen einer systemischen Erkrankung auf. Bei zusätzlichen Krankheitsanzeichen, wie reduzierter Milchleistung, Schwäche und Fieber über 39,5 °C lie gt eine klinische Metritis vom Grad 2 vor. Tiere mit Metritis vom Grad 3 zeigen Anzeichen einer Toxämie, wie Inappetenz, kalte Extremitäten, Depression und / oder Kollaps.
Die klinische Endometritis ist gekennzeichnet durch einen purulenten Vaginalausfluss nach dem 21. Tag p.p. oder einen mucopurulenten Vaginalausfluss nach dem 26. Tag p.p.. Eine Einteilung in die Grade 0 bis 3 der klinischen Endometritis erfolgt anhand der Art des Vaginalausflusses. Diese Klassifizierung korreliert mit dem Vorhandensein pathologischer Bakterien und dem Ausmaß der uterinen Erkrankung. Die subklinische Endometritis ist durch eine Entzündung des Endometriums ohne klinische Anzeichen einer Erkrankung charakterisiert und kann über eine zytologische Untersuchung einer Uterusspülprobe oder eines endometrialen Abstrichs, der mit Hilfe eines Uterusbürstchens (Cytobrush) gewonnen wurde, nachgewiesen werden. Eine subklinische Endometritis liegt vor, wenn in diesen Proben der Anteil an polymorphkernigen neutrophilen Granulozyten (PMN) mindestens 5,5 bis 10 % beträgt [60].
2.5 Therapie puerperaler Uteruserkrankungen
Ziele der Therapie von puerperalen Uterusinfektionen sind die Elimination patho- gener Bakterien sowie die Steigerung der Abwehr und Reparation des Uterus [61].
Zur Behandlung von Uterusinfektionen werden lokale Therapeutika (Antibiotika und chemische Antiseptika), systemische Antibiotika, Antiphlogistika und Uterotonika ein- gesetzt. Die systemisch antibiotische Therapie der Metritis bei Vorliegen von Störungen des Allgemeinbefindens ist weitestgehend unbestritten [62].
Da bei den puerperalen Uterusinfektionen häufig Mischinfektionen vorliegen, sollten die eingesetzten Antibiotika ein breites Wirkungsspektrum aufweisen [51, 63]. Das Ergebnis einer Untersuchung von Drillich et al. [1] zeigte, dass die Keime im Uterus häufig gegenüber Tetrazyklinen, Ampicillin und Cloxacillin resistent und gegenüber dem Cephalosporin Ceftiofur sensibel sind. Sheldon et al. [64] untersuchten die minimalen Hemmstoffkonzentrationen (MHK) verschiedener Antibiotika gegenüber E. coli, A. pyogenes und anaeroben Bakterien. Die Cephalosporine hatten gegen- über A. pyogenes und anaeroben Bakterien die niedrigste MHK-Konzentration, was sie zur Behandlung von uterinen Infektionen prädisponiert. Widersprüchliche An- sichten bestehen hinsichtlich des Nutzens einer intrauterinen antibiotischen oder antiseptischen Behandlung bei Vorliegen einer Metritis [25]. Als Nachteile einer solchen Therapie werden eine zweifelhafte Verteilung in tieferen Gewebsschichten, eine geringe Effektivität in der Umgebung von Zelldetritus und eitrigem Uterusinhalt, eine Hemmung der lokalen Immunität [63, 65], sowie bei einigen Mitteln ein gewebeirritierender Effekt auf das Endometrium genannt [66]. Bei schweren Fällen von Metritis sollten ergänzend nichtsteroidale Antiphlogistika und Infusionstherapien eingesetzt werden [54].
2.5.1 Uterotonika
Eine herabgesetzte myometriale Aktivität p.p. führt zu einer Stagnierung und Ansammlung von Lochien und erhöht so das Risiko einer bakteriellen Komplikation [54]. Zur Steigerung der Uterusmotilität im Puerperium werden Uterotonika, wie Oxytocin und PGF2α, eingesetzt, um die Entleerung des Uterusinhalts zu fördern und die Uterusinvolution zu beschleunigen [12]. Der Einsatz von uterotonen Mitteln in der puerperalen Phase ist weit verbreitet, beruht jedoch häufig eher auf Tradition und praktischen Erfahrungen von Tierärzten, als auf Ergebnissen von wissenschaftlichen Studien über den direkten und längerfristigen Effekt auf den Uterus und die weitere Fertilität [67].
In der Vergangenheit wurden vielfach Östrogene zur Steigerung der eigenen Abwehr und der Kontraktilität des Uterus eingesetzt. Östrogene steigern den Blutfluss zum Uteruslumen, wodurch die Gefahr einer Toxämie erhöht ist [25], zudem verbessern sie die Immunität nicht beständig und steigern in manchen Fällen bakterielle Kon- taminationen [25, 68]. Für die Indikation der Behandlung von puerperalen Uterus- erkrankungen ist in der EU für lebensmittelliefernde Tiere allerdings auch kein Östrogenpräparat zugelassen.
2.5.1.1 Prostaglandin F2α
PGF2α gehört zu der Gruppe der Prostaglandine und wird in fast allen Zellen des Körpers durch Cyclooxygenase aus Arachidonsäure gebildet [69]. Im weiblichen Reproduktionsapparat bewirkt PGF2α neben der Luteolyse auch eine Stimulation von Kontraktionen der uterinen glatten Muskelzellen [70]. Im Myometrium bindet PGF2α
an seinen spezifischen Rezeptor und aktiviert den Phosphatidylinositol-Weg, wodurch Ca2+ aus dem intrazellulären Speicher und extrazellulären Raum mobilisiert wird [71, 72]. Indirekt wirkt PGF2α über eine Steigerung der Oxytocinausschüttung und eine Erhöhung der Sensitivität des Uterus gegenüber Oxytocin [73, 74, 75].
Die kontraktionsfördernde Eigenschaft auf die Uterusmuskulatur wird durch den
Minute [5] und wird bereits nach einer einzigen Lungenpassage fast vollständig enzymatisch zu dem unwirksamen PGFM (15-Keto-13,14-Dihydro-Prostaglandin F2α
Metabolit) abgebaut [76]. Daher ist umstritten, ob exogen zugeführtes Prostaglandin einen direkten Einfluss auf die peripartale Uterusaktivität hat [5]. Synthetische Analoga des natürlichen PGF2α wurden mit dem Ziel entwickelt, Nebenwirkungen zu verringern und die Wirkungsdauer zu verlängern [70].
Kundig et al. [11] untersuchten im Frühpuerperium in vivo mittels antepartal in die Uteruswand des graviden Horns implantierter Druckmesssonden und Elektroden die Wirkung von PGF2α auf die Uteruskontraktilität. In den ersten 4 Tagen p.p. konnten 15 mg des natürlichen PGF2α Dinoprost nach intravenöser (i.v.) Applikation, wenn auch mit verzögertem Wirkungseintritt, die Uteruskontraktilität deutlich steigern. Ab dem 5. Tag p.p. nahm die uterotone Wirkung von Dinoprost deutlich ab. Die Autoren erachten daher eine Behandlung mit PGF2α nur in den ersten 5 Tagen p.p. als sinnvoll. Das synthetische Analogon Cloprostenol führte nur am 1. Tag p.p. nach i.v.
Applikation von 0,25 mg zu einer schwachen Steigerung der Uterusmotorik. Die intramuskuläre (i.m.) Verabreichung von 25 mg Dinoprost war jedoch zu keinem Zeitpunkt des Puerperiums wirksam.
Studien über den Einsatz von PGF2α zur Verbesserung der Fertilität liefern wider- sprüchliche Ergebnisse [6, 7, 9, 10, 77]. In einer Arbeit von Young et al. [7] bewirkte eine einmalige PGF2α-Applikation im Zeitraum von 14 bis 28 Tagen p.p. in Abwesenheit eines funktionellen Gelbkörpers eine Verbesserung der Trächtig- keitsrate nach der ersten Besamung. Die Autoren vermuten einen direkten Effekt von PGF2α auf das Myometrium. Nakao et al. [6] stellten nach Behandlung mit PGF2α 7 bis 10 oder 14 bis 28 Tage nach der Abkalbung ein früheres Einsetzen des Zyklusgeschehens und eine schnellere Uterusinvolution fest. Auch bei Tieren mit gestörtem Puerperalverlauf konnte eine Behandlung mit PGF2α die postpartale Re- produktionsleistung verbessern.
Brüggemeier [9] lehnt dagegen aufgrund ihrer Ergebnisse einen strategischen Einsatz von PGF2α im Frühpuerperium ab. Weder eine zweimalige Applikation von Cloprostenol an den Tagen 1 und 5 p.p. noch eine einmalige Gabe von PGF2α an Tag 10 p.p. hatte einen signifikanten Einfluss auf die Uterusinvolution. Auch Tian und
Noakes [10] konnten durch einen einmaligen Einsatz von 25 mg Dinoprost i.m. an Tag 2 p.p. keinen Effekt auf den Verlauf des Puerperiums und die Fertilität feststellen. Melendez et al. [77] untersuchten den Effekt einer zweimaligen Applikation von 25 mg PGF2α i.m. an Tag 8 im Abstand von 8 Stunden auf die Uterusinvolution und die Fertilität bei Tieren mit toxischer Metritis im Frühpuerperium und stellten lediglich bei primiparen Tieren einen positiven Effekt fest. Als eine mögliche Ursache nennen sie das erhöhte Risiko der Entwicklung einer Hypocalcämie bei multiparen Tieren. Da Calcium eine Schlüsselrolle für die Uteruskontraktilität spielt [32], können Uterotonika, wie PGF2α, bei hypocalcämischen Kühen die Uteruskontraktilität weniger effektiv steigern [77].
Die geringe Wirksamkeit der Behandlung von Metritiden mit PGF2α im frühen Puerperium könnte durch postpartal generell hohe Spiegel an endogenem Prosta- glandin sowie durch die in den ersten 3 bis 5 Tagen nach der Geburt deutlich abnehmende Ansprechbarkeit des Myometriums auf PGF2α oder dessen Analoga zu erklären sein [78]. Zwei von einander unabhängige Studien zeigten, dass Kühe mit puerperalen Uterusinfektionen höhere PGFM-Spiegel aufweisen als gesunde Kühe [79, 80]. Auch in einer Studie von Nakao et al. [6] war der PGFM-Spiegel bei Tieren mit Puerperalstörungen in den ersten 4 Tagen p.p. signifikant höher als bei Tieren mit normalem Puerperalverlauf. Bei Letzteren blieb der PGFM-Spiegel jedoch länger erhöht als bei den Tieren mit Puerperalstörungen. Die Autoren fanden nur bei Tieren ohne Puerperalstörungen einen Zusammenhang zwischen den PGFM-Werten und der Dauer bis zum Abschluss der Uterusinvolution. Tiere ohne Puerperalstörungen mit länger anhaltenden hohen PGFM-Werten benötigten signifikant weniger Zeit bis zum Abschluss der Uterusinvolution als Tiere, bei denen die Werte früher abfielen [6].
In einer Studie von Thun et al. [78] bewirkte eine postpartale Suppression der endogenen PGF2α-Produktion durch Flunixin Meglumin zwar eine deutliche Abnahme der Spontanmotorik des Uterus und Reduktion der Ansprechbarkeit des Myome- triums auf Oxytocin und PGF2α, wohingegen kein Effekt auf die Uterusinvolution und das Wiedereinsetzen der Zyklusaktivität beobachtet wurde.
2.5.1.2 Oxytocin
Oxytocin wird überwiegend im Hypothalamus und in geringeren Mengen auch im Ovar synthetisiert [81]. Es ist das stärkste bekannte uterotone Mittel und ein potenter Regulator der myometrialen Kontraktilität [28, 82]. Oxytocin stimuliert die myometriale Kontraktilität über zwei Mechanismen. Direkt wirkt es über eine Akti- vierung von Oxytocinrezeptoren der Myometriumszellen und einer damit verbun- denen Erhöhung des intrazellulären Calcium-Spiegels. Indirekt wirkt es über die Stimulierung der Freisetzung von PGF2α aus dem Endometrium [82, 83]. Die Halbwertszeit von Oxytocin nach i.v. Infusion liegt beim Rind lediglich bei 7 bis 9 Minuten [84]. Die Wirksamkeit des Oxytocins wird vom Östrogen / Progesteron- Verhältnis beeinflusst. Die Ansprechbarkeit des Myometriums gegenüber Oxytocin ist unter Östrogeneinfluss erhöht, während Progesteron die Empfindlichkeit des Myometriums herabsetzt (siehe Kapitel 2.2).
In einer Studie von Eiler et al. war der uterotone Effekt von Oxytocin auf den post- partalen Uterus stärker als der von Prostaglandin [85]. In der frühen puerperalen Periode führt Oxytocin zu einem signifikanten Anstieg der Uterusmotilität. Die Frequenz, Amplitude und Dauer der Salven von Aktionspotentialen (so genannte Aktionspotential-Bursts) sind unter dem Einfluss von Oxytocin erhöht [47]. Auch der Anteil an Kontraktionswellen, die komplett vom Uterushorn zum Uteruskörper wandern, wird durch die Applikation von Oxytocin gesteigert [5, 46]. Die Stärke des Anstiegs der Uterusmotilität hängt von der verabreichten Dosis und dem Tag der Behandlung ab [5, 86]. In einer Studie von Kundig et al. [11] bewirkte eine Applikation von 5 internationalen Einheiten (IE) Oxytocin i.v. in den ersten 2 bis 3 Tagen p.p. eine rasche und starke Steigerung der Kontraktilität. Ab dem 4. bis 5. Tag p.p. nahm die uterotone Wirkung jedoch deutlich ab, die Amplitude und Dauer der Kontraktionen sanken von diesem Zeitpunkt ab [11]. Eine letzte nachweisbare Reaktion auf eine Gabe von 40 IE Oxytocin i.v. ist nach Frazer [5] am 10. Tag p.p. zu erzielen. Zudem ist unklar, ob Oxytocin bei Kühen mit toxischer Metritis wirksam ist [5].
In einer Studie von Mollo et al. [87] bewirkte die zweimalige Applikation von 30 IE Oxytocin i.m. unmittelbar nach der Kalbung und erneut 2 bis 4 Stunden später eine signifikante Verbesserung der Reproduktionsparameter.
Tian und Noakes [10] konnten hingegen bei Tieren mit unkomplizierter Kalbung und ohne Nachgeburtsverhaltung nach einer einmaligen Stimulation 48 Stunden p.p. mit Carbetocin i.m., einem mit bis zu 6 Stunden deutlich länger wirkendem Oxytocin- Analogon [88], mittels Ultraschalluntersuchung weder eine Beschleunigung der uterinen Involution, noch eine Verkürzung des Intervalls bis zur ersten Ovulation p.p.
feststellen. Auch in einer Studie von Barrett et al. [8] zeigte die Behandlung mit 25 IE Oxytocin i.m. innerhalb von 6 Stunden nach der Geburt weder einen Einfluss auf die Inzidenz von Endometritiden noch auf die Fertilität.
2.6 Hormonrezeptoren am Uterus
Damit Hormone ihre Wirkung an Zielzellen ausüben können, müssen sie an dort vorhandene Rezeptoren binden. Eine spezifische Bindung des Hormons an seinen Rezeptor löst die für das Hormon charakteristischen Reaktionen aus [89]. Die Wirksamkeit der Hormone ist somit nicht nur von den Hormonkonzentrationen, sondern auch von der Rezeptorausstattung im Zielorgan abhängig [27].
2.6.1 Der Oxytocin Rezeptor
Der OXTR gehört zusammen mit den drei Vasopressin Rezeptor-Subtypen V1a, V1b
und V2 zur Familie der Oxytocin-Vasopressin Rezeptoren [90]. OXTR ist ein G- Protein gekoppelter Membranrezeptor [28]. Er ist sowohl im Endometrium als auch im Myometrium des Rindes exprimiert [91, 92]. Beim Schaf war der OXTR in einer Untersuchung von Wu et al. [82] im Zytoplasma von Myometriumszellen, in glatten Muskelzellen entlang der Blutgefäße und in glandulären Epithelzellen lokalisiert. Die Autoren vermuten, dass die Lokalisation des OXTR in der glatten Muskulatur und in
der glatten Muskelzellen und der endometrialen Prostaglandin Produktion widerspiegelt.
Der OXTR ist im humanen Uterusgewebe unter anderem in den Endothelzellen exprimiert, was eine Rolle von Oxytocin in der Regulation des vaskulären Tonus und Blutdruckes durch calciumabhängige Vasodilatation nach Stimulation des Stickstoff- monoxid (NO)-Pfades vermuten lässt [93].
Östrogene und Glucocorticoide führen zu einer Steigerung, Progesteron und Oxytocin jedoch zu einer Reduktion der OXTR Konzentration [82]. Im Östrus kommt es innerhalb kürzester Zeit zu einer Hochregulierung der Konzentration des Rezeptors [94, 95]. Nach erfolgter Konzeption steigt beim Rind die Konzentration im Myometrium vom 50.- 150. Tag der Gravidität an und bleibt dann bis zur Geburt auf konstantem Niveau. Im Endometrium steigt die Konzentration während der Trächtigkeit kontinuierlich an. In den ersten 24 Stunden nach der Geburt kommt es im Endo- und Myometrium zu einem raschen Abfall der Rezeptorkonzentration [96].
Veränderungen der OXTR-Konzentration haben einen entscheidenden Einfluss auf die Sensitivität gegenüber Oxytocin [95].
Bislang fehlen jedoch Daten über die weitere Entwicklung der OXTR-Dichte im Uterus in den ersten Tagen p.p., die eine abnehmende Ansprechbarkeit gegenüber Oxytocin erklären könnten [13].
2.6.2 Der Prostaglandin F2α Rezeptor
Die Aktivität von PGF2α wird über seinen spezifischen Rezeptor (FP) vermittelt [97].
Der FP Rezeptor ist ein G-Protein gekoppelter Membranrezeptor. Die Bindung des PGF2α an seinen Rezeptor führt durch Aktivierung der Phospholipase C und des Inositoltrisphosphat (IP3)-Transduktionsweges zu einer Steigerung des intrazellulären Ca2+ Spiegels [71, 72]. Der Anstieg der intrazellulären Ca2+- Konzentration führt zu Kontraktionen der glatten Muskulatur [72].
Wehbrink et al. [98] wiesen den FP Rezeptor beim Rind im achten und neunten Trächtigkeitsmonat und unmittelbar nach der Abkalbung in allen Schichten der
glandulären Epithelzellen und in den Stromazellen war der FP im Zytoplasma exprimiert, während er in den glatten Muskelzellen des Myometriums sowohl im Kern, als auch im Zytoplasma lokalisiert war. In einer Studie am humanen Uterus war der FP zudem in den glatten Muskelzellen der Blutgefäße exprimiert, was darauf hinweisen könnte, dass der Rezeptor einen vasokonstriktiven Effekt vermittelt [99].
Östrogene und Progesteron sind in die Regulation des FP Rezeptors involviert, dabei steigern Östrogene die Expression, während Progesteron diese hemmt [99, 100].
Untersuchungen zur Expression des FP im Myometrium bei Ratte und Schaf zeigten einen Anstieg der Rezeptordichte mit fortschreitender Trächtigkeit [52, 101, 102]. In der postpartalen Periode kommt es bei der Ratte zu einem signifikanten Abfall der Rezeptordichte [52, 101]. Die Autoren vermuten, dass der FP eine Rolle in der Vermittlung von Uteruskontraktionen bei der Geburt spielt.
Angaben über die postpartale Entwicklung der Expression des FP im Uterus des Rindes fehlen in der Literatur bislang [12].
2.6.3 Der Progesteron Rezeptor
Der Progesteron Rezeptor (PR) ist ein kernständiger Steroidhormonrezeptor.
Untersuchungen an zyklischen und trächtigen Uteri zeigten eine Expression des PR im Stroma, in glandulären Epithelzellen und im Myometrium [103, 104, 105].
Während der PR in Studien an zyklischen Rinderuteri stellenweise auch im luminalen Epithel exprimiert war [103, 106], fehlte er in diesem Kompartiment in der Trächtigkeit und unmittelbar nach der Abkalbung [104, 105]. Östrogene bewirken eine Stimulation des Progesteronrezeptors, während Progesteron seinen eigenen Rezeptor hemmt. So ist der PR im Diöstrus schwächer exprimiert als im Östrus [103].
Während der Trächtigkeit und zum Zeitpunkt der Geburt ist die Rezeptorkonzentration des PR relativ konstant [105]. Schäubli et al. [104]
untersuchten die Rezeptorexpression des PR in der späten Trächtigkeit und unmittelbar nach der Abkalbung beim Rind und stellten lediglich Unterschiede
der PR an den Tagen 7 bis 28 p.p. im luminalen Epithel kaum bis gar nicht vorhanden und fehlte in tieferen glandulären Epithelzellen. Im Stroma, Myometrium und in den oberflächlichen Drüsen war der PR in diesem Zeitraum jedoch moderat bis stark exprimiert [107].
2.6.4 Der Östrogen Rezeptor
Die Effekte der Östrogene werden in den Zielorganen über spezifische kernständige Steroidhormonrezeptoren vermittelt. Es gibt zwei Subtypen von Östrogen Rezeptoren (ER) alpha und beta (ERα und ERβ) [108]. Die ER sind in luminalen und glandulären Epithelzellen, im Stroma [103, 104, 105, 106], in den glatten Muskelzellen der Gefäße [103, 105] sowie im Myometrium lokalisiert [104, 105, 109].
Die Lokalisation des ERα in der Tunica media der Blutgefäße von Endo- und Myometrium lässt einen direkten Einfluss der Östrogene auf den uterinen Blutfluss vermuten [105].
Progesteron führt zu einer Herunterregulierung, während Östrogene eine Hochregu- lierung des ER bewirken und damit einen proliferativen Effekt auf das luminale Epithel ausüben [109, 110]. Vom Beginn der Trächtigkeit bis zur Geburt kommt es zu einem signifikanten Abfall der Östrogenrezeptordichte [105].
In einer Studie von Gray et al. [107] über die postpartale Expression des ERα beim Schwein war der Rezeptor an Tag 1 p.p. im Epithel, Stroma und den Myome- triumszellen exprimiert. Ab Tag 7 p.p. stieg die Konzentration des ERα im glandulären und luminalen Epithel, Stroma und Myometrium deutlich an.
2.7 Methoden zur Messung der uterinen Kontraktilität
Es sind verschiedene Methoden zur Messung der uterinen Kontraktilität am Tier verfügbar [47]. Kontraktionen können direkt und indirekt über die Messung der myoelektrischen Aktivität durch Elektromyographie [67, 111], durch Messung des intrauterinen Druckes (IUP) [42, 48], durch Messung von mechanischen Kräften mittels Dehnungsmessstreifen [112, 113] sowie über die Messung von Distanzen in der Sonomikrometrie [20, 21] dargestellt werden.
2.7.1 Elektromyographische Untersuchung
Die elektromyographische Aufzeichnung basiert auf der Messung elektrischer Potentialdiffererenzen, die durch die Kontraktion der glatten Muskelzellen innerhalb der Uteruswand hervorgerufen werden [67]. Hierfür werden mittels Laparatomie Elektroden in die Tunica muscularis des Uterus implantiert [11, 111]. Die Elektro- myographie ist für Langzeitaufnahmen geeignet [114]. Ein Nachteil dieser Mess- methode ist jedoch, dass von der elektrischen Aktivität nicht ohne weiteres auf die Kontraktionskraft geschlossen werden kann [115].
2.7.2 Intrauterine Druckmessung
Der IUP wird im Uteruslumen mittels Kathetern gemessen und über Transducer in ein elektrisches Signal umgewandelt. Änderungen der uterinen Kontraktilität spiegeln sich in einer Veränderung des IUP wieder [67]. Die eigentliche Messung des intrauterinen Druckes kann über Mikrotransducer oder über flüssigkeitsgefüllte Katheter erfolgen. Bei den Mikrotransducern geschieht die Umwandlung in elektri- sche Signale innerhalb des Uteruslumens. Sie besitzen am Ende eines Katheters einen Sensor, der den Druck über eine Silikonmembran ermittelt [116]. Bei den flüssigkeitsgefüllten Kathetern hingegen erfolgt die Umwandlung des Druckes in ein
Enden des flüssigkeitsgefüllten Katheters nicht verschlossen, während sich bei dem geschlossenen System am Ende eine Membran oder ein flüssigkeitsgefüllter Ballon befinden [117, 118].
2.7.3 Untersuchung mittels Dehnungsmessstreifen
Die Muskelaktivität des Uterus und anderer Hohlorgane kann auch mittels Dehnungsmessstreifen gemessen werden [119, 120]. Eine Dehnung oder Stauchung des Messstreifens führt zu einer Änderung des elektrischen Widerstandes, die proportional zu der einwirkenden Kraft ist [120]. Zur Messung von Uteruskontraktionen werden Dehnungsmessstreifen mittels Laparatomie an der Serosa der Gebärmutter befestigt [112, 120]. Allerdings können Dehnungsmessstreifen lediglich die Kraftänderungen parallel zum Sensor aufzeichnen [119], wodurch der elektrische Impuls von der Position des Dehnungsmessstreifens abhängig ist [121].
2.7.4 Sonomikrometrie
Die Sonomikrometrie nutzt Ultraschallwellen zur Messung von Distanzen in Weich- teilgeweben. Für die Messung werden mindestens zwei Piezokristalle benötigt, die über Kabel an eine Messeinheit angeschlossen sind. Jeder Piezokristall emittiert durch angelegte Spannung Schall und wird durch auftreffenden Schall unter Erzeu- gung von messbarer Spannung deformiert. Der Kristall dient während eines Mess- zyklus als Sender und Empfänger der Schallsignale anderer Kristalle. Es wird die Übertragungszeit (t), die der Schall für die Strecke (s) zwischen Sende- und Empfangskristall benötigt, gemessen [122].
Da die Schallgeschwindigkeit in Weichteilgeweben (v) konstant bei 1540 m/s liegt [8], kann so die Strecke zwischen zwei Kristallen mit Hilfe der Formel s = v * t berechnet werden [122]. Nach Adelson und Million [122] ist mit der Sonomikrometrie eine Messgenauigkeit von 0,016 mm zu erzielen. Aufgrund der physikalischen Eigenschaften des Schalls können mit dieser Messmethode nur gerade Strecken
[123] gemessen werden. Außerdem ist zu beachten, dass Gas Schallwellen reflektiert, und Knochen und Knorpel den Schall fast vollständig absorbieren [124].
Die Sonomikrometrie wurde in der Vergangenheit vor allem zur Messung der myokardialen Aktivität [125, 126, 127] und zur Darstellung der Magen-Darmmotilität [122, 128] eingesetzt. Breevald- Dwarkasing et al. [129] nutzten die Sonomikrometrie an der Zervix des Rindes zur Messung der Dilatation während der Geburt. Benz [20]
etablierte dieses Verfahren zur Darstellung der Uterusinvolution und Messung von Uteruskontraktionen beim Rind in vivo. In einer Folgearbeit untersuchte Krach [21]
mittels sonomikrometrischer Messung den Einfluss des Insulin-like Growth Faktor- Systems auf die Uterusinvolution.
2.8 Isoliert perfundierter Uterus
2.8.1 Prinzip des isoliert perfundierten Uterus
Isoliert perfundierte Organe haben gegenüber anderen in vitro Modellen den Vorteil, dass elektrische und mechanische Aktivitäten des gesamten Organs erfasst werden, da das Organ in seiner Funktionalität und Struktur erhalten bleibt [130]. Allerdings kann auch in diesem Modell der Einfluss von nervalen und humoralen Mechanismen nicht berücksichtigt werden [19].
Erste Versuche an isoliert perfundierten Uteri als in vitro Modell führten Pierce et al.
[131] bei tragenden Schafen durch. Der Uterus wurde hierzu in einem thermostabilen künstlichen Abdomen fixiert und über die Aa. uterinae mit heparinisiertem Vollblut des Muttertieres perfundiert. Das Modell diente der Untersuchung der Blutzirkulation und des Blutdruckes der fetoplazentaren Einheit. Bulletti et al. [132] nutzten in ihrem Modell erstmals oxygenierte Krebs-Ringer-Bicarbonat-Glukose-Pufferlösung zur Perfusion von humanen Uteri. In Anlehnung an das Modell des isoliert perfundierten Rindereuters [133] etablierte Mertens [134] ein Modell des isoliert mit Tyrode perfundierten Rinderuterus und untersuchte dabei die Schleimhautverträglichkeit von Testsubstanzen.
2.8.2 Kontraktionsmessungen am isoliert perfundierten Uterus
Da der Uterus einen myogenen Muskeltonus besitzt, kann er sich ohne nervalen oder hormonellen Einfluss kontrahieren [32]. Aus diesem Grund können Messungen von Uteruskontraktionen auch am isoliert perfundierten Uterus durchgeführt werden [135].
Bulleti et al. [16] studierten erstmals die uterine Kontraktilität mittels Elektroden und intrauterinen Druckkathetern an isolierten nicht-graviden humanen Uteri. Sie beobachteten einen positiven Effekt von Östrogenen auf Frequenz und Dauer uteri- ner Kontraktionen und einen gegenteiligen Effekt von Progesteron. Richter et al. [15]
nutzten das von Bulletti et al. [132] beschriebene Modell, um am humanen Uterus die Beeinflussbarkeit uteriner Kontraktionen durch Östrogen und Oxytocin mittels intrauteriner Druckmessung zu bestimmen. Die stärksten uterotonen Effekte konnten durch eine Behandlung mit 17 β- Östradiol und zusätzlicher Stimulation mit Oxytocin erzielt werden.
An isoliert perfundierten Schweineuteri wurden ebenfalls intrauterine Druckkatheter zur Messung von Uteruskontraktionen eingesetzt, um die Wirkung von Tokolytika und Uterotonika zu überprüfen [17, 18, 130, 135]. Dittrich et al. [130] untersuchten die Effekte von Oxytocin und Prostaglandin E2 (PGE2) auf die Kontraktilität. Beide Substanzen konnten uterine Kontraktionen induzieren, wobei die durch PGE2
hervorgerufenen rhythmischen Kontraktionen zwar eine kleinere Amplitude, aber eine höhere Frequenz aufwiesen. Müller et al. [18] haben die Reaktion des Uterus auf PGF2α, Prostaglandin E1 (PGE1) und PGE2 im Vergleich zu Oxytocin getestet.
PGF2α und Oxytocin riefen einen ähnlichen Effekt auf die Uteruskontraktilität hervor, wobei der Anstieg des intrauterinen Druckes dosisabhängig war und in höheren Dosen ein Plateau erreichte. PGE1 und PGE2 erzeugten hingegen unterschiedliche Kontraktionsverläufe; bei steigender Dosis kam es zu einem Abfall des intrauterinen Druckes.
Eiler et al. [136] studierten an einem in Nährlösung eingelegten Uterushorn des Rindes den Effekt von Fenprostalen. Die intrauterine Druckmessung erfolgte mittels Ballonkatheter. Bock [19] überprüfte in ihrer Studie die Eignung des isoliert mit
Tyrode perfundierten Rinderuterus als Modell zur Messung von Kontraktionen am Uterus. Hierbei waren die Ergebnisse der intrauterinen Druckmessung mittels Mikro- Tip-Katheter nach Stimulation mit Oxytocin und Isoxsuprin mit den Resultaten anderer Methoden zur Kontraktionsmessung (in vivo und in vitro am Myometriumsstreifen) vergleichbar, so dass dieses Modell für Untersuchungen zur pharmakologischen Beeinflussung der myometrialen Aktivität geeignet erschien.
3 Material und Methoden
3.1 Versuchsmaterial
Die Studie wurde an der Klinik für Rinder der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover an 50 Uteri von Kühen durchgeführt. Alle Tiere stammten aus dem Patientengut der Klinik und waren aus unterschiedlichen Gründen euthanasiert worden. Gravide Kühe wurden vom Versuch ausgeschlossen. Ebenfalls wurden Tiere, bei denen die Abkalbung weniger als 5 Tage zurück lag, nicht berücksichtigt, da der Umfang der Uteri für die eingesetzte Methode des isoliert perfundierten Uterus zu groß war.
3.2 Euthanasie und Entnahme des Uterus
Zur Euthanasie wurde eine Braunüle (VasoVet®, Braun Melsungen AG, Melsungen, Deutschland) in eine der beiden Vv. jugulares gelegt. Vor der Applikation fand bei den Kühen eine Entnahme von Blutproben statt. Dann erfolgte die Euthanasie mit 30.000 mg Pentobarbital-Natrium (Release®, WDT eG, Garbsen, Deutschland). Nach eingetretenem Tod wurden die Tiere an ihren Hinterbeinen in die Höhe gezogen und die Bauchhöhle etwa 5 cm kranial des Euteransatzes durch einen transversalen Schnitt auf einer Länge von etwa 30 cm eröffnet. Durch diese Öffnung wurde der Uterus mit Ovarien kaudal der Zervix und entlang der breiten Mutterbänder herausgetrennt. Hierbei wurde darauf geachtet, möglichst große Anteile der versorgenden Blutgefäße zu erhalten.
3.3 Einteilung der Versuchsgruppen
Nach dem Zeitpunkt der Euthanasie p.p. wurden die Uteri in zwei Gruppen eingeteilt.
Die frühpuerperale Gruppe bestand aus Uteri, die 5 bis 21 Tage p.p. entnommen wurden. Alle Uteri, die von Kühen nach dem 21. Tag p.p. stammten, wurden der spätpuerperalen Gruppe zugeordnet.
Die Uteri der frühpuerperalen Gruppe wurden weiter in eine Gruppe mit und eine Gruppe ohne Metritis aufgeteilt. Die Zuordnung erfolgte durch eine grobsinnliche Beurteilung des Uterusinhalts nach Sheldon [60]. Die Uteri der spätpuerperalen Gruppe wurden nach den Funktionsgebilden auf den Ovarien eingeteilt. Hier wurde zwischen dem Vorhandensein eines dominanten Follikels (>10 mm), eines Blütegelbkörpers und dem Fehlen beider Funktionskörper unterschieden. Die Tiere mit einem Blütegelbkörper mussten zusätzlich noch einen Plasmaprogesteronwert über 1 ng/ml aufweisen. Weiterhin wurden diese Uteri anhand der histopathologischen Untersuchung des Endometriums in eine Gruppe mit und ohne Endometritis eingeteilt.
3.4 Versuchsaufbau und Versuchsablauf
Die Blutgefäße der abgesetzten Uteri wurden unmittelbar nach der Entnahme über die Aa. uterinae mit 400 ml heparinisierter Tyrodelösung gespült, um eine Blutgerinnung zu verhindern. Nach Ankunft im Versuchsraum erfolgte die Gewichtsbestimmung des Uterus mittels Digitalwaage (Tomopol C 25, Tomopol GmbH, Lindlar, Deutschland). Spontan abfließender Uterusinhalt wurde vor dem Wiegen über die Zervix abgelassen. Anschließend fand dorsal aus dem corpusnahen Bereich des ehemals graviden Horns die Entnahme von Gewebeproben der gesamten Uteruswand für die histopathologischen und immunhistochemischen Untersuchungen statt. Die Entnahmestelle wurde mit einer einstülpenden Matratzennaht nach LEMBERT verschlossen.
Die Bestimmung der Größe des Uterus erfolgte mit Hilfe eines Maßbandes. Hierzu
Bestimmung der Breite der Uterushörner und des Uteruskörpers erfolgte jeweils im Bereich des weitesten Umfangs. Der Uterusinhalt wurde nach Menge, Farbe, Geruch, Konsistenz und Beimengungen beurteilt. Die Ovarien wurden mittels Schiebelehre (Länge, Breite und Höhe) vermessen und Art, Anzahl und Durchmesser vorhandener Funktionskörper erfasst. Anschließend wurden die Aa.
uterinae und Vv. ovaricae über Silikonschläuche kanüliert, wobei der Durchmesser der Schläuche entsprechend dem Durchmesser der zu kanülierenden Gefäße gewählt wurde. Um ein Abrutschen zu verhindern, wurden die Silikonschläuche mittels Fäden an den Gefäßen fixiert.
Je nach Größe des Uterus wurden drei oder vier Sonomikrometriekristalle (Sonometrics Corp., London, Ontario, Canada) in das Myometrium des ehemals graviden Uterushorns implantiert. Anschließend wurde der Uterus auf eine Fixiermatte (CP- Pharma, Burgdorf, Deutschland) in einem auf 39 °C geheizten Inkubator (Incubator S.I.60, Stuart Scientific, United Kingdom) gelegt (Abb.3.1). Der Uterus wurde innerhalb von 45 Minuten nach der Euthanasie an die Perfusionsapparatur angeschlossen.
Zur Äquilibrierung wurde der Uterus zunächst für 30 Minuten mit Tyrode perfundiert.
Anschließend begann der eigentliche Versuch mit der sonomikrometrischen Mes- sung von Spontankontraktionen.
Nach 30 Minuten erfolgte die erste Stimulation mit Oxytocin (Oxytocin®, CP–Pharma, Burgdorf, Deutschland) als Bolus von 0,5 ml (5 IE) pro Uterushorn oder PGF2α
(Dinoprost, Dinolytic®, Pfizer, Berlin, Deutschland) als Bolus von 1 ml (2,5 mg) pro Uterushorn. Die Applikation wurde langsam über einen Dreiwegehahn in den Schlauch, der sich im arteriellen Zugang des Uterus befand, vorgenommen. Nach der Applikation der ersten Substanz erfolgte über 30 Minuten eine Aufzeichnung der Messstrecken. Es folgte die Applikation der zweiten Substanz und eine sonomikro- metrische Messung für weitere 30 Minuten. Die Reihenfolge der Stimulation mit Oxytocin und PGF2αwurde randomisiert durchgeführt.
Für die Bestimmung der Vitalitätsparameter wurden eine Probe der Tyrodelösung als Ausgangswert, sowie in halbstündigen Abständen Proben des abfließenden Perfusa- tes aus den Vv. ovaricae entnommen. Insgesamt lief die isolierte Perfusion des
Uterus über 2 Stunden. Nach Versuchsende wurde der Uterus erneut gewogen, um die Gewichtszunahme des Organs während des Versuchs zu ermitteln.
Abb. 3.1: Isolierter Uterus mit kanülierten Aa. uterinae und vier implantierten Sonomikrometriekristallen. Der blaue Pfeil markiert einen implantierten Kristall; der schwarze Pfeil markiert die kanülierte A. uterina.
. Nach Versuchsende wurde der Uterus erneut gewogen, um die Gewichtszunahme des Organs während des Versuchs zu ermitteln.
Isolierter Uterus mit kanülierten Aa. uterinae und vier implantierten . Der blaue Pfeil markiert einen implantierten Kristall; der markiert die kanülierte A. uterina.
. Nach Versuchsende wurde der Uterus erneut gewogen, um die Gewichtszunahme des Organs während des Versuchs zu ermitteln.
Isolierter Uterus mit kanülierten Aa. uterinae und vier implantierten . Der blaue Pfeil markiert einen implantierten Kristall; der
3.5 Prinzip der isolierten Perfusion
Die Perfusion erfolgte mit Carbogen begaster (95 % O2, 5 % CO2) blutisotoner Tyro- delösung (136,8 mmol/l NaCl; 5,5 mmol/l Glukose * 1 H2O; 11,9 mmol/l NaHCO3; 2,7 mmol/l KCL; 0,416 mmo/l NaH2PO4; 1,05 mmol/l MgCl2 * 6H2O; 1,8 mmol/l CaCl2 * 2 H2O).
Vom unteren Auslass des Vorratsgefäßes (5 l) führte ein Silikonschlauch in ein Wasserbad (Grant OLS 200, Fa. Grant Instruments, Cambridge, United Kingdom), in dem die Tyrode beim Durchfließen einer Glasspirale auf etwa 39 °C angewärmt wurde. Der Silikonschlauch wurde nach Verlassen des Wasserbades mit Hilfe eines Y-Verbindungsstückes geteilt und durch eine mehrkanalige Schlauchpumpe (Fa.
Ismatec, Wertheim-Mondfeld, Deutschland) geführt. Die Schlauchpumpe sorgte für einen konstanten Perfusionsfluss, der je nach Größe des Organs zwischen 8 und 25 ml pro Minute und Horn lag. Bei starker Größendifferenz der Uterushörner ermöglichte der Einsatz von zwei Peristaltik-Schlauchpumpen unterschiedliche Perfusionsraten der Uterushörner. Die Stimulantien wurden über die Schläuche nach Zwischenschaltung eines Dreiwegehahns appliziert und erreichten so die Aa.
uterinae des im Inkubator gelegenen Uterus (Abb. 3.2).
.
Abb. 3.2: Schematische Darstellung des Modells des isoliert perfundierten Uterus.
3.6 Sonomikrometrie 3.6.1 Messgeräte
Die Piezokristalle mit einem Durchmesser von 2 mm bestanden aus Keramik und waren zur elektrischen Isolierung mit Epoxidharz überzogen. Die Transceiver- bzw.
TRX-Box (Sonometrics Corp., London, Ontario, Kanada) stellte als Sende- und Empfangseinheit die Verbindung zwischen Messcomputer und den Kristallen bzw.
dem Uterus her. Hier erfolgte eine Umwandlung der analogen Messsignale der Kri- stalle in digitale Signale. Zudem waren die Channel-Selector-Box (Sonometrics Corp., London, Ontario, Kanada) und das Oszilloskop (Oscilloscope 54600B 100 MHZ, Hewlett Packard, USA) an die TRX-Box angeschlossen. An der Channel- Selector-Box konnte über zwei Drehknöpfe je ein Sende- und Empfangskristall bzw.
die Messstrecke zwischen diesen beiden Kristallen ausgewählt werden. Eine Beurteilung der Qualität des Signals der eingestellten Messstrecke war mit Hilfe des Oszilloskops möglich. Korrekturen fanden über die Einstellung der Sensitivität der Kristalle am Empfindlichkeitsregler der TRX-Box statt. Für die sonomikrometrischen Messungen wurde das auf dem Sonometrics Data Acquisition Computer installierte Computerprogramm SonoSOFT® (Version 3.4.30 RC1) Interface für SonoLAB und SonoVIEW (Firma Sonometrics Corp., London, Ontario, Canada) verwendet.
SonoLAB diente der Aufzeichnung und Konvertierung der Daten, die anschließend in SonoVIEW dargestellt und analysiert werden konnten.
3.6.2 Prinzip der sonomikrometrischen Messung und Einstellungen
Während eines Messzyklus sendete jeder Kristall einmal und empfing die Signale der anderen drei Kristalle. Auf diese Weise entstanden zeitgleich zwölf Messstrecken.
Die Einstellungen der Länge der einzelnen Sendeimpulse (400 ns) und der Anzahl der Messzyklen pro Sekunde (25 Hz) blieben während der gesamten Versuche unverändert. Die Signalqualität konnte während der Messung über die minimale Zeitdifferenz (als Schwelle für die Sendedauer eines Impulses zwischen Sende- und
Empfangskristall) und über die Sensitivität der Kristalle (als Schwelle für die Signalstärke) optimiert werden.
3.6.3 Implantation der Kristalle
Die Implantation der vier Piezokristalle erfolgte ins Myometrium der großen Kurvatur des ehemals graviden Uterushorns. Bei Uteri, deren ehemals gravides Horn eine Größe von 30 cm nicht erreichte, konnten lediglich drei Kristalle eingesetzt werden.
Der erste Kristall wurde am weitesten kaudal nahe der Bifurkation platziert, die anderen folgten jeweils in Abhängigkeit von der Größe des Organs in etwa gleichen Abständen von einigen cm nach kranial. Mit Hilfe eines Skalpells wurde ein Schnitt durch die Tunica serosa und die äußere longitudinale Muskelschicht der Tunica muscularis, quer zu deren Verlaufsrichtung, durchgeführt. Mit einem nicht- perforierenden Sultan’schen Diagonalheft wurde der Kristallkopf im Myometrium versenkt und fixiert. Die Kristalle wurden von der Uterushornspitze zum Uteruskörper von 1 bis 3 bzw. 4 durchnummeriert.
3.6.4 Auswertung der Sonomikrometriedaten
Die nach jedem Versuch mit SonoLab® gespeicherten Messdaten mussten mit SonoSoft® in zwei SonoSoft® Files konvertiert werden, damit sie in SonoView® lesbar waren. Mittels SonoView® konnten die für die vorliegende Studie entscheidenden Kristallpaarungen (1-2, 2-3 und 3-4) dargestellt werden. Da die Distanz zwischen zwei Kristallen jeweils in beiden Richtungen (z.B. 1-2; 2-1) aufgezeichnet wurde, konnte die jeweils qualitativ bessere Paarung ausgewählt werden. Um die Qualität der Graphen zu erhöhen, wurden mit Hilfe des SonoSoft® Filters einzelne Aus- reißerwerte in den Graphen zurückgeführt. Die Speicherung der Daten erfolgte in Form von ASC-ll Files; hierbei wurde zur Verkleinerung der Datenmenge nur jeder 20. Datenpunkt der 90.180 Messdaten übertragen. Anschließend wurden die Daten in das Programm Excel 2007 (Microsoft Office®, Immeuble Laccolith, Luxembourg
Die Sonomikrometriedaten wurden mittels Shapiro-Wilk-Test auf Normalverteilung überprüft. Da sie nicht normalverteilt vorlagen, wurden die Medianwerte verwendet.
Die Auswertung erfolgte getrennt für die Strecken A (Kristall 1-2), B (Kristall 2-3) und C (Kristall 3-4). Es wurden jeweils von fünf Messeinheiten vor und zehn Messein- heiten nach jeder Stimulation die Medianwerte berechnet. Jede Messeinheit umfasste 3 Minuten. Von den Medianen der fünf Messeinheiten vor der Stimulation wurde ein Gesamtmedian berechnet. Da sich die Strecken zwischen den Kristallen bei den verschiedenen Uteri unterschieden, wurden zur besseren Vergleichbarkeit die relativen Veränderungen (%) der Distanz berechnet. Hierzu wurde die absolute Veränderung als Differenz zwischen dem Gesamtmedian vor der Applikation und der jeweiligen Messeinheit nach der Applikation mit 100 multipliziert und durch den Gesamtmedian vor der Applikation dividiert. So nahm die relative Veränderung bei Vergrößerung der Strecke einen negativen und bei Verkürzung der Strecke einen positiven Wert an. Die Darstellung der Spontankontraktionen des isolierten Organs und der Effekt nach Stimulation erfolgten über die Berechnung des Medians von jeweils 30 Sekunden.
3.7 Vitalität des isoliert perfundierten Rinderuterus
Zur Überprüfung der Vitalität des isolierten Uterus wurden in Anlehnung an das Modell des isoliert perfundierten Rindereuters [133] und an das Modell des mit Tyrode perfundierten Uterus [19, 134, 137] die Parameter Glukoseverbrauch und Laktatproduktion bestimmt. Während des Versuchs wurden in halbstündigen Abständen Perfusatproben (30, 60, 90, 120 Minuten) aus den kanülierten Vv.
ovaricae entnommen und bis zur Analyse bei -20 °C g elagert.
Die Bestimmung des Glukosegehaltes und der Laktatkonzentration erfolgte im Klinisch Chemischen Labor der Klinik für Rinder der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover photometrisch bzw. enzymatisch-kolorimetrisch mit dem Analyseautomaten ABX Pentra 400® (Fa. Horiba, Medical, Kyoto, Japan). Es erfolgte eine Umrechnung der Messergebnisse von mmol/l in die Einheit g/l. Der Glukoseverbrauch je Uterushorn errechnete sich aus der Differenz des
Glukosegehaltes der Tyrode und des Perfusats der jeweiligen Seite. Der Glukoseverbrauch pro Stunde (g/h) ergab sich aus der Multiplikation mit dem Perfusionsfluss pro Stunde. Die Laktatproduktion pro Stunde (g/h) pro Uterushorn errechnete sich aus der Multiplikation des Laktatgehaltes des Perfusats (g/l) mit dem Perfusionsfluss pro Stunde.
3.8 Blutprobenentnahme und –untersuchung 3.8.1 Blutprobenentnahme und –asservierung
Vor der Euthanasie erfolgte bei allen Tieren eine Blutentnahme aus der V. jugularis mittels einer Braunüle. Es wurden ein Ethylendiamintetraacetat- (EDTA) und ein Serumröhrchen zu je 10 ml (Sarstedt AG & Co, Nürnbrecht, Deutschland) befüllt.
Die Blutproben wurden bei 4 °C mit 3500 U über 10 M inuten zentrifugiert (Megafuge 3.OR, Heraeus, Hanau, Deutschland). Das Plasma bzw. Serum wurde in Eppendorfgefäße (2 ml, Eppendorf, Hamburg, Deutschland) pipettiert und bei -20 °C bis zur Analyse zwischengelagert.
3.8.2 Parameter
Im Endokrinologischen Labor der Klinik für Rinder der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover erfolgte die Bestimmung der Progesteron-(P4) und Gesamt- östrogenkonzentrationen (Eges). Der Parameter Eges wurde mittels Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) im Plasma und P4 mittels Radioimmunoassay (RIA) im Serum gemessen.
Die Calcium Gehalte wurden im Klinisch Chemischen Labor der Klinik für Rinder der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover mit einem Analysevollautomaten (Cobas- Mira, Fa. Hoffmann-La Roche & Co. AG Diagnostika, Basel, Schweiz) im Blutserum bestimmt.
