In vitro Studie über den Einfluss von Lipopolysacchariden und Metritiden auf die uterine Kontraktilität von Milchkühen im puerperalen Zeitraum

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Tierärztliche Hochschule Hannover

In vitro Studie über den Einfluss von

Lipopolysacchariden und Metritiden auf die uterine Kontraktilität von Milchkühen im puerperalen

Zeitraum

INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer

Doktorin der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae -

(Dr. med. vet.)

vorgelegt von Maraike Wiebe

Hannover

Hannover 2018

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Univ. Prof. Dr. med. vet. Christiane Pfarrer Anatomisches Institut

1. Gutachterinnen: PD Dr. med. vet. Maike Heppelmann

Univ. Prof. Dr. med. vet. Christiane Pfarrer

2. Gutachterin(nen)/Gutachter: Prof. Dr. Harald Sieme

Tag der mündlichen Prüfung: 08.05.2018

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Meinen Eltern

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Inhaltsverzeichnis

1 EINLEITUNG... 1

2 LITERATUR ... 3

2.1 DAS PUERPERIUM ... 3

2.2 DER UTERUS ... 4

2.3 KONTRAKTILITÄT DES MYOMETRIUMS P.P. ... 5

2.3.1 Hormonelle Einflüsse ... 6

2.4 PUERPERALE UTERUSERKRANKUNGEN... 7

2.4.1 Definition, Pathogenese und Erreger ... 8

2.4.2 Therapie ... 10

2.4.2.1 Uterotonika ... 10

PGF2a... 11

Oxytocin ... 11

2.5 METHODEN DER UTERINEN KONTRAKTILITÄ TSMESSUNG ... 12

2.5.1 In vivo ... 12

2.5.2 In vitro ... 13

2.5.2.1 Kontraktionsmessung am isoliert perfundierten Uterus ... 13

2.5.2.2 Isometrische Kontraktionsmessung an Myometriumsstreifen ... 14

3 MATERIAL UND METHODEN ... 19

3.1 VERSUCHSMATERIAL ... 19

3.2 HALTUNG UND FÜTTERUNG ... 19

3.3 STUDIENDESIGN ... 19

3.4 BLUTENTNAHME UND ANALYSE... 21

3.5 MYOGRAPHIE... 21

3.5.1 Präparation der Proben und Geräte ... 21

3.5.2 Aufzeichnungssequenzen der myometrialen Aktivität ... 23

3.5.3 Datenanalyse ... 24

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4 ERGEBNISSE... 28

4.1 GRUPPE 1... 28

4.1.1 Versuchsmaterial ... 28

4.1.2 Blutparameter... 28

4.1.3 Kontraktilität ... 28

4.1.3.1 Kontraktilität T1 bis T5 ... 29

4.1.4 Beziehung zwischen den Blutparametern und der Kontraktilität ... 41

4.2 GRUPPE 2... 41

4.2.1 Versuchsmaterial ... 41

4.2.1.1 Gewicht und Größe der Uteri und Ovarien ... 41

4.2.2 Blutparameter... 43

4.2.3 Kontraktilität ... 43

5 DISKUSSION ... 70

5.1 EIGNUNG DES IN-VITRO SYSTEMS ... 70

5.2 VERSUCHSMATERIAL ... 71

5.2.1 Tragzeit und Alter ... 72

5.2.2 Gewicht und Größe der Uteri ... 72

5.3 5.3.BLUTPARAMETER ... 73

5.3.1 17-β-Östradiol ... 73

5.3.2 Progesteron ... 73

5.3.3 Ionisiertes Calcium ... 74

5.4 KONTRAKTILITÄT... 74

5.4.1 Gruppe 1 ... 76

5.4.1.1 Einfluss der LPS-Konzentration ... 76

5.4.1.2 Einfluss der Zeit bzw. der Konzentration und der Stimulation mit Oxytocin ... 80

5.4.1.3 Beziehung zwischen den Blutparametern und der Kontraktilität ... 81

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5.4.2 Gruppe 2 ... 82

5.4.2.1 Einfluss der Gruppe (oM und mM)... 82

5.4.2.2 Einfluss der Muskelschicht... 84

5.4.2.3 Einfluss der Zeit bzw. Konzentration und der Stimulation ... 85

5.5 SCHLUSSFOLGERUNG ... 87

6 ZUSAMMENFASSUNG ... 89

7 SUMMARY ... 92

8 LITERATURVERZEICHNIS ... 94

9 ANHANG ...120

9.1 MODIFIZIERTE KREBS-LÖSUNG (PRO LITER)...120

9.2 KORRELATIONEN ZWISCHEN BLUT- UND KONTRAKTILITÄTSPARAMETERN...121

9.3 BEFUNDE DER BEURTEILUNG DES UTERUSINHALTES ...124

9.4 VERZEICHNIS DER VERWENDETEN ABKÜRZUNGEN ...125

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EINLEITUNG

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1 Einleitung

Eine ungestörte uterine Kontraktilität beim Rind ist nicht nur während der Geburt von entscheidender Bedeutung, sondern auch für den physiologischen Ablauf des Puer- periums. Sie bewirkt die Austreibung der Nachgeburt postpartum (p.p.) und spielt eine große Rolle im Zuge der uterinen Involution. Störungen des Puerperiums, wie Metritiden und Nachgeburtsverhaltungen, sind häufige Erkrankungen in der moder- nen Milchviehhaltung und haben einen negativen Einfluss auf die Fertilität [1].

Für die Behandlung von Metritiden haben sich verschiedene Therapieansätze eta- bliert. Neben der lokalen und systemischen Antibiose werden auch Uterotonika, wie Prostaglandin F2α (PGF2α) und Oxytocin eingesetzt. Die durch Uterotonika gesteigerte uterine Motilität soll die Größenreduktion des Uterus und dessen Entleerung wäh- rend des Puerperiums beschleunigen und sich damit positiv auf die Uterusinvolution und die zukünftige Fruchtbarkeit auswirken [2]. Untersuchungen zum Einfluss von PGF2α und Oxytocin auf die Kontraktilität des Myometriums und die nachfolgende Fertilität ergaben allerdings widersprüchliche Ergebnisse [3]. Weiterhin konnte eine Studie bei Tieren mit Nachgeburtsverhaltung eine gesteigerte Kontraktilität des My- ometriums nachweisen [4]. Sollte sich dies auch für Tiere mit einer Metritis bestäti- gen, könnten sich neue Ansätze für die Therapie von inflammatorischen Erkrankun- gen des Uterus ergeben.

Eine Messung der Kontraktilität des bovinen Myometriums kann in vivo und in vitro durchgeführt werden. Der Vorteil von in-vitro Verfahren liegt zum einen in der Ver- meidung von invasiven Eingriffen am lebenden Tier und zum anderen in der Aus- schaltung diverser Einflussfaktoren, wie dem metabolischen und hormonellen Status, sowie Haltung, Fütterung oder Manipulation des Tieres [5; 6]. Ein häufig eingesetztes in-vitro Verfahren zur Messung der uterinen Kontraktilität ist die isometrische Kon- traktionsmessung. Dabei wird die Kraftänderung von aus dem Myometrium isolierten Muskelstreifen in einem mit Nährlösung gefüllten und oxygenierten Organbad gemessen. Diese Methode wurde beim Rind bisher eingesetzt, um die uterine Motilität bei zyklischen [7; 8] und tragenden [9; 10] Tieren, sowie den Effekt verschiedener

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Substanzen, wie Meloxicam und Gentamycin, auf die Kontraktilität [11; 12] zu untersuchen.

Ziel dieser Studie war es, durch isometrische Kontraktilitätsmessung im Organbad an isolierten Myometriumstreifen von puerperalen Kühen den Einfluss einer Inflammati- on auf die uterine Kontraktilität als Teil der uterinen Involution zu untersuchen.

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LITERATUR

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2 Literatur

2.1 Das Puerperium

Das Puerperium umfasst die postpartale Periode von der Abkalbung bis zum A b- schluss der uterinen Involution und dauert beim Rind ungefähr 40 bis 42 Tage. In dieser Zeitspanne läuft neben der Größenreduktion des Uterus auch die Regenerati- on des Endometriums, die Elimination der bakteriellen Kontamination und Inflamma- tion und das Wiedereinsetzen der Ovaraktivität ab [13].

Nach dem Ausstoßen der Frucht folgt die etwa sechsstündige Nachgeburtsphase, in der sich die Eihäute vom Endometrium ablösen und ausgeworfen werden [14]. Daran schließt sich das zehntägige Frühpuerperium an, das sich vor allem zu Beginn durch eine hohe uterine Kontraktilität und einen vermehrten Lochialfluss auszeichnet [14].

In den ersten fünf Tagen p.p. verkleinert sich der Uterus durch Muskelkontraktionen, Gewebeabbau und Auswurf der Nachgeburt. Er halbiert dabei sein Gewicht von etwa zehn auf fünf kg [13; 15]. Ab dem 10. Tag p.p. lässt die Kontraktilität deutlich nach und der Lochialfluss versiegt [14; 15]. Etwa 21 Tage nach der Geburt ist bei der transrektalen Palpation meist keine Asymmetrie der Uterushörner mehr feststellbar [15]. Dies markiert das Ende des klinischen Puerperiums [14]. Lediglich sonographisch und histologisch lassen sich bis zu acht Wochen p.p. noch graviditätsbedingte Veränderungen im Uterus nachweisen [14-16].

Bei der Regeneration des Endometriums fallen nach der Geburt die oberflächlichen Gewebeschichten der Karunkeln nach Ablösung der Nachgeburt Nekrose und Dege- neration zum Opfer [15; 16]. Das abgestorbene Material wird resorbiert und mit den Lochien ausgeschieden [15]. Um den 23. Tag p.p. sind die Karunkeln erstmals wieder mit Epithel bedeckt, die vollständige Reepithelisierung ist aber erst nach sechs bis acht Wochen abgeschlossen [14; 16].

Die bakterielle Kontamination der Uterushöhle in den ersten zwei Wochen p.p. beim Rind ist durch die relaxierte Vagina und die geöffnete Zervix nach der Geburt fast ubiquitär [13]. Vermehrte Sekretion der Uterindrüsen, in Kombination mit erhöhter uteriner Motilität, sowie Immunmechanismen sind die treibenden Kräfte der bakteriel-

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len Elimination [17], die physiologischer Weise innerhalb von zehn Tagen abgeschlossen ist [1; 18]. Immunzellen, vor allem neutrophile Granulozyten, wandern p.p.

vermehrt in den Uterus ein und phagozytieren die eingedrungenen Erreger [1]. Auch unspezifische Moleküle der Immunabwehr, wie Akute-Phase-Proteine, Lactoferrin und Defensine tragen zur Elimination bei [1]. Diese Mechanismen sind entscheidend, um die Manifestation einer uterinen Infektion und deren negativen Auswirkungen auf die Fertilität zu verhindern [13].

An den Ovarien setzen die ersten Follikelwellen schon sechs bis acht Tage nach der Geburt wieder ein. Ab Tag zehn p.p. ist der erste dominante Follikel zu erkennen, der entweder atretisch wird, persistiert, oder ovuliert [13]. Das Intervall zwischen Abkal- bung und erster Ovulation beträgt durchschnittlich 21-30 Tage [19-21]. Während des Östrus sorgt der erhöhte Östrogenspiegel für eine gesteigerte Immunabwehr des Uterus, was zusammen mit der gesteigerten myometrialen Kontraktilität die Elimina- tion der Inflammation unterstützt [18]. Eine hohe Plasma-Progesteron-Konzentration bei frühem Wiedereinsetzen des Zyklus kann die Immunabwehr hemmen und damit infektionsfördernd wirken [1].

2.2 Der Uterus

Der bovine Uterus besteht aus zwei Uterushörnern und einem Uteruskörper, der in die Zervix mündet [22]. Die Wand des Uterus ist aus drei Schichten aufgebaut: En- dometrium, Myometrium und Perimetrium [23]. Das Myometrium besteht hauptsäch- lich aus glatten Muskelfasern [23] und setzt sich aus der inneren zirkulären und der äußeren longitudinalen Schicht zusammen, die durch ein mächtiges Lager aus Ge- fäßen getrennt werden [22]. Die longitudinale und zirkuläre Muskelschicht unterscheiden sich nicht nur im Faserverlauf [23], in der funktionellen Innervation [24] und ihren biochemischen Eigenschaften [24], sondern auch in Kontraktionsstärke und -muster [7; 8; 25; 26].

Die glatte Muskulatur im Myometrium stellt einen Zellverband vom single-unit Typ dar, ein sogenanntes funktionelles Synzytium, in dem die einzelnen Muskelzellen über Gap Junctions miteinander verbunden sind. Somit können die Kontraktionen

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LITERATUR

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synchron ablaufen [27]. Die uterinen Myozyten gehören zu einem Typ von glatten Muskelzellen, die spontane Kontraktionen zeigen, die auch ohne hormonelle und nervale Stimuli ablaufen können [28]. Es wird vermutet, dass spontane Depolarisati- onen von Schrittmacherzellen den Ursprung solcher Kontraktionen bilden [27; 28]. Im Myometrium wurden Zellen entdeckt, die den Schrittmacherzellen im Gastrointesti- naltrakt, den Interstitial Cells of Cajal (ICC), strukturell ähneln [29; 30]. In der Literatur werden sie als myometrial Interstitial Cajal-Like Cells (m-ICLC) [30; 31] oder Telozy- ten [32] beschrieben. Diese spindelförmigen Zellen bilden mit ihren langen Fortsät- zen ein Netzwerk, worüber sie in Kontakt mit den glatten Muskelzellen, Nervenfa- sern, Gefäßen und Immunzellen stehen [29; 30]. Außerdem besitzen sie in-vitro Öst- rogen- und Progesteron-Rezeptoren, weshalb auch eine Funktion als Hormon- Sensor diskutiert wird [33; 34]. Aufgrund von gegensätzlichen Ergebnissen ist bislang unklar, ob diese interstitiellen Zellen eine elektrische Aktivität aufweisen und ob sie in die Prozesse der uterinen Kontraktilität involviert sind. Allerdings konnte eine der Kontraktion vorausgehende Fluktuation der intrazellulären Calcium-Konzentration an der Lokalisation der m-ICLC beobachtet werden [31]. Ob die m-ICLC eine Schrittma- cher-Funktion haben, kann auf Grund unzureichender Untersuchungen bisher nur vermutet werden [30-32].

2.3 Kontraktilität des Myometriums p.p.

Die Kontraktilität des Myometriums ist entscheidend für die Größenreduktion des Uterus, den Auswurf des Uterusinhaltes und die Reinigung der Uterushöhle und spielt somit eine wichtige Rolle für den Verlauf des Puerperiums [17].

Direkt nach der Geburt können am Uterus sehr regelmäßige und kräftige Kontrakti o- nen mit einer Frequenz von 20-30 Kontraktionen pro Stunde (K/h) und Amplituden von 100-200 mmHg, die hauptsächlich in tubozervikaler Richtung verlaufen, gemessen werden [35]. Nach Abgang der Nachgeburt zwischen drei und acht Stunden p.p.

ist eine drastische Abnahme der Spontankontraktilität zu beobachten [35; 36], sodass nach circa zwölf Stunden nur noch Frequenzen von etwa 10 K/h zu messen sind [17; 37; 38]. In den ersten vier Tagen p.p. ist die uterine Aktivität von schwachen

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Einzelkontraktionen oder kräftigen, langanhaltenden Kontraktionswellen mit bis zu 120 mmHg in Abständen von 5 bis 60 Minuten geprägt [35]. Ab der zweiten Woche nach der Geburt nimmt die Uterusmotorik weiter stark ab [36]. Zwischen Tag vier und zwölf p.p. sind vereinzelte, schwache (20-50 mmHg) Kontraktionen mit einer Fre- quenz von 0,2-0,5 K/h zu finden [35]. Zeitlich zusammenhängend mit dem Wieder- einsetzen der Ovaraktivität und somit dem Einwirken der Sexualhormone auf den Uterus um den 12. bis 13. Tag p.p. ist wieder eine vorübergehende Steigerung der uterinen Aktivität zu erkennen [35; 36; 39].

2.3.1 Hormonelle Einflüsse

Die Steuerung der Uterusmotorik basiert auf myogenen Mechanismen, die haupt- sächlich endokrin über das Zusammenspiel verschiedener Hormone reguliert werden. Der Einfluss des vegetativen Nervensystems ist dabei von untergeordneter Be- deutung [40].

Die Steroidhormone Progesteron und Östrogen haben eine gegensätzliche Wirkung auf das Myometrium. Während sich Progesteron hemmend auf die uterine Kontrakti- lität auswirkt, hat Östrogen eine kontraktionsfördernde Wirkung [3; 27]. Progesteron inhibiert den die Kontraktion initiierenden intrazellulären Calciumanstieg, die Berei t- stellung von Calcium aus den intrazellulären Speichern [41-43] und die Ausbildung von Gap Junctions [44-46]. Weiterhin führt Progesteron über eine Hyperpolarisation der Muskelzellmembranen zu einer Aktivierung von Kaliumkanälen und damit zu verminderter elektrischer Leitfähigkeit der Membran, beziehungsweise verminderter Erregbarkeit und Reizweiterleitung [27; 47]. Auch die Expression der Rezeptoren an- derer Hormone wird durch Progesteron beeinflusst. So wird die Ausbildung des Öst- rogenrezeptors reduziert, dessen transkriptionelle Aktivität unterdrückt und der Öst- rogenmetabolismus gesteigert [48; 49]. Progesteron entfaltet vor allem während der Gravidität und im Diöstrus durch hohe Hormonspiegel seine hemmende Wirkung auf die uterine Kontraktilität [27].

Vor und während der Geburt und im Östrus liegen hohe Östrogenkonzentrationen vor [27]. Östrogene induzieren verschiedene Veränderungen am Myometrium, die dessen Ansprechbarkeit auf kontraktile Reize erhöhen [3]. Zum einen hat Östradiol

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LITERATUR

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einen positiven Effekt auf die Ausbildung von Gap Junctions [27; 46], zum anderen steigert es die Wirkung von Oxytocin durch Erhöhung der Oxytocin-Rezeptor- Expression [50-52], der Oxytocin-Synthese [53] und Steigerung der Oxytocin- induzierten PGF2α-Produktion [54]. Weiterhin führt es zu einer Hyperplasie des Myo- metriums [3], einer Reduktion des Membranpotentials der Muskelzellen [55] und zu vermehrter Expression von PGF2α-Rezeptoren [56]. Es hat auch einen stimulieren- den Effekt auf die Synthese und Funktion der kontraktilen Proteine Aktomyosin und Calmodulin [27; 57].

Die Sensitivität des Myometriums gegenüber Oxytocin nimmt zum Trächtigkeitsende hin durch einen Anstieg der Rezeptoren im Myometrium und in der Plazenta stark zu [58; 59]. Oxytocin initiiert und erhält die Kontraktilität des Myometriums während der Wehentätigkeit. Es aktiviert G-Protein-vermittelt die Phospholipase C, wodurch Inosi- toltriphosphat gebildet wird, was wiederum zu einer Ausschüttung von Calcium aus den intrazellulären Speichern führt [60-62]. Weiterhin führt Oxytocin zu einer Aus- schüttung von Arachidonsäure und einer Erhöhung der Produktion von PGF2α und Prostaglandin E2 (PGE2) in Endometrium und Plazenta [54; 62; 63].

Das Hormon PGF2α initiiert die Luteolyse und fördert direkt und indirekt die Kontrakti- lität des Myometriums [3]. Wenige Stunden antepartum steigt die PGF2α Konzentrati- on stark an [27] und bleibt zwei bis drei Wochen p.p. erhöht [64; 65]. Die direkte Wir- kung auf die Muskelzelle entfaltet es über die Aktivierung des Phosphatidylinositol- Signalweges, die in einer Erhöhung des Calcium-Einstroms aus dem Extrazellular- raum und den intrazellulären Speichern resultiert [60; 66]. Indirekt wirkt PGF2α über die Heraufregulierung von Oxytocin-Rezeptoren und somit einer gesteigerten Sensi- tivität des Uterus Oxytocin gegenüber [58; 63; 67].

2.4 Puerperale Uteruserkrankungen

Die pathogene Inflammation des Uterus stellt eine der Hauptstörungen des Puer- peralverlaufes dar. Neben einer verzögerten uterinen Involution und folgend negativen Auswirkungen auf die Fruchtbarkeit, hat sie auch finanzielle Verluste zur Folge [1]. Diese resultieren vorrangig aus verminderten Milcherträgen, höheren Merzungs-

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raten, anfallenden Behandlungskosten und den Einbußen durch Subfertilität [1; 68;

69].

2.4.1 Definition, Pathogenese und Erreger

Die Metritis ist nach Sheldon et al. [70] eine uterine Infektion innerhalb der ersten 21 Tage p.p., die durch rotbraunen und wässrigen bzw. eitrigen und meist übelri e- chenden Lochialfluss gekennzeichnet ist. Je nach Schwere der systemischen Krank- heitssymptome kann die Metritis in 3 Grade unterteilt werden. Bei einer Metritis Grad 1 ist die Erkrankung lokal auf den Uterus begrenzt. Treten bspw. Fieber und Milch- rückgang auf, handelt es sich um Grad 2. Bei Anzeichen einer Toxämie, wie Inappe- tenz, kalten Extremitäten und Depression bis hin zum Kollaps, um Grad 3 [71]. Es werden Inzidenzen von 18,5% bis zu 36% beschrieben [68; 72-76]. Zwald et al. [75]

beschreiben sogar herdenabhängig maximale Inzidenzen von bis zu 50%.

Es ist wichtig, zwischen bakterieller Kontamination der Uterushöhle und einer tat- sächlichen uterinen Infektion zu unterscheiden. Bei dieser heften sich pathogene Mikroorganismen an die Schleimhaut an, vermehren sich dort, penetrieren die Muko- sa und lösen selber, oder durch Toxinproduktion, eine Entzündungsreaktion aus [70].

Während der Geburt und im Puerperium kommt es zu einer bakteriellen Kontamina- tion des Uterus [1], die in der ersten Woche p.p. bei etwa 90% der Kühe nachweisbar ist [77; 78]. Die Entstehung einer Infektion und somit einer Metritis ist abhängig von der Immunkapazität des Tieres, aber auch von der Anzahl und Virulenz der eingedrungenen Erreger und dem Verlauf des Partus und des Puerperiums [3]. Schwer- geburten [72; 73; 79], Nachgeburtsverhaltungen [72; 80; 81] und Milchfieber [73] stel- len Risikofaktoren für die Entstehung einer Metritis dar.

Die uterine Flora p.p. besteht aus einer Bandbreite an Bakterien [77]. Streptokokken, Staphylokokken, Enterobakterien, Trueperella (T.) pyogenes, Fusobakterien, Clostri- dien, Bacillus spp. und Bacteroides spp. sind häufige Besiedler des puerperalen Ute- rus [68; 77; 80; 82-84]. Als pathogene Mikroorganismen, assoziiert mit einer patholo- gischen uterinen Inflammation, können vor allem Escherischia (E.) coli und T. pyo- genes genannt werden [71; 85]. Aber auch gramnegative Anaerobier wie Fusobac-

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LITERATUR

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terium necrophorum, Prevotella melaninogenicus und Bacteroides spp. gehören zu den uteruspathogenen Erregern [77; 84; 86-90].

E. coli kann vor allem in den ersten Tagen nach der Geburt nachgewiesen werden und ist Wegbereiter für Infektionen mit anderen Erregern im späteren Puerperalver- lauf [86; 91; 92]. Laut Kassé et al. [93] liegt die Prävalenz von E. coli in Uterusabstri- chen in der ersten Woche p.p. bei 42%. Diese Besiedlung steigert das Metritisrisiko etwa um das Dreifache. Mit dem Vorhandensein von E. coli ist auch das Auftreten von Lipopolysacchariden (LPS) im Uteruslumen verbunden [86]. Gramnegative Bak- terien, wie E. coli, haben eine äußere Membran, die aus LPS aufgebaut ist. LPS be- stehen aus dem Lipid A, das auch als Endotoxin bezeichnet wird, einer Kern- Polysaccharidregion und einer O-spezifischen Seitenkette, die als Antigen fungiert und die Bildung von spezifischen Antikörpern durch das Immunsystem auslöst [94].

Bei Metritiden und Nachgeburtsverhaltungen liegen LPS-Konzentrationen zwischen 6 und 70.000 Endotoxin Units (EU) /ml in den Lochien vor [86; 92; 95; 96]. Weiterhin korreliert das Vorkommen von LPS in den Lochien positiv mit übelriechendem Aus- fluss, erhöhter Rektaltemperatur und dem Vorhandensein von E. coli und gramnega- tiven Anaerobiern im Uterus [86].

Immunzellen erkennen Endotoxine über Toll-like-Rezeptoren (TLR) [97]. Der TLR-4, auch LPS-binding-Protein genannt, bildet mit LPS einen hochaffinen Komplex [98].

Dadurch wird eine Signalkaskade ausgelöst, die in der Produktion von proinflamma- torischen Cytokinen und Chemokinen und der Mobilisierung und Aktivierung von weiteren Immunzellen resultiert [99; 100]. Auch der IgG-Anti-LPS-Antikörper trägt zur Detoxifizierung bei [86]. Außerdem stimulieren LPS die Prostaglandinsynthese mit einer Verschiebung des Verhältnisses von PGF2α und PGE2 zugunsten von PGE2. LPS-induziert liegen im Endometrium, im Plasma [101] und in den Lochien [96] von Rindern erhöhte PGE2-Konzentrationen vor.

Des Weiteren führen LPS zu einer Steigerung der uterinen Kontraktilität bei tragenden Kaninchen, Mäusen [102] und Ratten [103] und lösen Frühgeburten bei Mäusen aus [104]. Bei tragenden Ratten steigern LPS nicht nur die Spontankontraktionen, sondern über Prostaglandine vermittelt auch die Oxytocin-generierten Kontraktionen, sowie den Calciuminflux in die Myometriumzellen [103]. Außerdem wird der präovu- latorische LH-Anstieg und auch die Ovulation durch LPS gehemmt [1; 105-107].

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10 2.4.2 Therapie

Ziel der Behandlung von Metritiden ist die Elimination der pathogenen Erreger, sowie die Steigerung der uterinen Abwehr und die Reparation des Endometriums [108]. Zur Elimination der Erreger wird vor allem die antibiotische Therapie eingesetzt. Dabei kann abhängig von der Störung des Allgemeinbefindens eine lokale, intrauterine oder eine systemische Antibiose angewandt werden. Bei Metritiden Grad 2 und 3 ist die parenterale Antibiose die wichtigste Behandlungsstrategie [1; 109]. Der intrauterine Einsatz von Antibiotika ist dagegen umstritten [1]. Dies wird mit einer zweifelhaften Verteilung des Antibiotikums in tiefere Gewebeschichten, einer möglichen Effektivi- tätsminderung in der Umgebung von Eiter und Zelldetritus im Uterus und einer even- tuellen Hemmung der lokalen Immunität begründet [110]. Das häufig eingesetzte Oxytetrazyklin ist nach neueren Erkenntnissen weniger gut geeignet, da relativ viele Resistenzen vorliegen und hohe Konzentrationen bei der Behandlung benötigt werden [1]. Bei Cephalosporinen sind die minimalen Hemmstoffkonzentrationen für die häufigsten uteruspathogenen Erreger am niedrigsten [111]. Für Ceftiofur sind ver- besserte Heilungsraten beschrieben [112; 113]. Allerdings ist ein positiver Einfluss auf die Reproduktionsparameter umstritten [112; 114].

2.4.2.1 Uterotonika

Ein weiterer Therapieansatz ist die Steigerung der uterinen Kontraktilität im Puer- perium durch Uterotonika, wie PGF2α und Oxytocin, von denen man sich eine Entlee- rung des Uterusinhaltes und eine beschleunigte uterine Involution verspricht [2]. Der Einsatz von uterotonen Mitteln in der puerperalen Phase ist weit verbreitet, beruht jedoch häufig eher auf Tradition und praktischen Erfahrungen von Tierärzten, als auf Ergebnissen von wissenschaftlichen Studien über den direkten und längerfristigen Effekt auf den Uterus und die weitere Fertilität [115]. Wissenschaftliche Untersu- chungen zum Einfluss der Uterotonika auf die Kontraktilität und die Fruchtbarkeit lie- fern widersprüchliche Ergebnisse [2; 3]. Weiterhin wurde in einer Studie an Tieren mit einer Nachgeburtsverhaltung eine ohnehin schon gesteigerte Kontraktilität des Myometriums 48 Stunden nach der Geburt festgestellt [4].

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LITERATUR

11 PGF2a

Das natürliche PGF2α-Analogon, Dinoprost, hat eine sehr kurze Halbwertszeit, da es vor allem in der Lunge schnell metabolisiert wird [116]. Deshalb werden zum Teil synthetische Analoga, wie Cloprostenol, Luprostiol oder Fenprostalen, eingesetzt, die eine gezieltere luteolytische Wirkung und eine längere Wirkdauer besitzen [117]. In einer Studie, in der die uterine Aktivität bei zyklischen Tieren mittels in ein Uterus- horn implantierten Druckumwandlern in vivo gemessen wurde, erzielte Dinoprost ei- ne gute Steigerung der myometrialen Aktivität, während Luprostiol einen schwäche- ren und Cloprostenol gar keinen Effekt erzielte [118].

Der Effekt von PGF2α auf die uterine Kontraktilität im Puerperium wurde vielfach untersucht. Die Ergebnisse zeigen sowohl eine Kontraktionssteigerung [36; 119], als auch keinen Effekt auf die Kontraktilität [119; 120]. Laut Kündig et al. [119] hat die intravenöse Applikation von PGF2α in den ersten vier Tagen nach der Geburt einen positiven Einfluss auf die Uterusmotorik. Nach intramuskulärer Gabe von PGF2α war kein Effekt auf die uterine Kontraktilität zu verzeichnen [119]. Die Wirksamkeit von PGF2α bei gestörtem Puerperalverlauf ist bisher wenig untersucht. Eine Untersu- chung von Burton et al. [121] ergab bei Kühen mit Nachgeburtsverhaltung keinen Einfluss auf die Uterusmotorik. In einer Studie von Heppelmann et al. [122] zeigte PGF2α bei Uteri mit Metritis keine kontraktionsfördernde Wirkung im Vergleich zu Oxytocin. Auch zu dem Effekt von PGF2α auf die weitere Fertilität gibt es divergieren- de Ergebnisse. Getestet wurden Dinoprost, Cloprostenol und Luprostiol, appliziert ein- oder zweifach zu unterschiedlichen Zeitpunkten innerhalb von 12 Stunden bis 35 Tagen p.p.. Dabei ergaben sich sowohl positive Auswirkungen [123-126], als auch keine Beeinflussung der Fertilitätsparameter [127-131]. Auch bei Kühen mit Dystokie, Metritis, Endometritis und Nachgeburtsverhaltung ergaben sich positive [132-135]

bzw. keine Effekte auf die weitere Fruchtbarkeit [136-139].

Oxytocin

Oxytocin hat eine kurze Halbwertszeit von 0,55 bis 3,6 min [140; 141], weshalb zum Teil das stabilere synthetische Derivat Carbetocin eingesetzt wird [142].

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Oxytocin hat eine gute kontraktionssteigernde Wirkung [2; 36; 119; 143]. Nach Kün- dig et al. [119] erzielt die intravenöse Applikation von Oxytocin in den ersten vier Ta- gen p.p. einen stark kontraktionsfördernden Effekt auf das Myometrium, der danach deutlich abfällt. In einer Studie von Bajcsy et al. [2] führte die intramuskuläre Injektion von Oxytocin oder Carbetocin 14 bis 16 Stunden p.p. nur zu einem kurzen positiven Effekt auf die uterine Kontraktilität. Es konnte kein Unterschied zwischen Oxytocin und Carbetocin festgestellt werden [2]. Bei Magata et al. [144] führte Oxytocin in- tramuskulär verabreicht an Tag zwei p.p. zu einer Kontraktionssteigerung, gemessen über die Veränderung im Blutfluss der Aa. uterinae, während an Tag fünf p.p. kein Effekt zu erzielen war. Bei Tieren mit Nachgeburtsverhaltung konnte kein kontraktionssteigernder Effekt durch Oxytocin nachgewiesen werden. Im Gegensatz dazu konnten Heppelmann et al. [122] bei in vitro perfundierten Uteri mit Metritiden und Nachgeburtsverhaltungen eine deutlich gesteigerte Sensitivität gegenüber Oxytocin im Vergleich zu gesunden Uteri zeigen. Dies konnte unter anderem durch eine er- höhte Genexpression von Oxytocinrezeptoren bei diesen Tieren erklärt werden.

Auch für Oxytocin liegen unterschiedliche Ergebnisse für die Auswirkungen auf die Fertilität vor. Bei Mollo et al. [145] hat eine zweimalige Applikation in den ersten vier Stunden nach der Geburt einen positiven Effekt auf die Prävalenz von Nachgeburts- verhaltungen und die Güstzeit [145], während in anderen Studien durch die Verab- reichung von Carbetocin innerhalb der ersten zwei Tage p.p. kein Effekt auf die Re- produktionsparameter ermittelt werden konnte [130; 146]. Bei der Behandlung von akuten puerperalen Metritiden mit Carbetocin an Tag drei bis fünf p.p. war kein Effekt auf die Fertilität zu verzeichnen [137].

2.5 Methoden der uterinen Kontraktilitätsmessung

2.5.1 In vivo

Für die Messung von Uteruskontraktionen in vivo werden in der Literatur unterschied- liche Methoden angegeben. Mittels Elektroden kann die elektrophysiologische Aktivi- tät gemessen werden [35; 59]. Druckschwankungen lassen sich intrauterin mit

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LITERATUR

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Quecksilberröhren oder Ballonkathetern erfassen [4; 5; 35; 147]. Auch die Sonomik- rometrie eignet sich als Messmethode am lebenden Tier. Dabei werden mehrere Piezokristalle in die Uteruswand implantiert, deren kontraktionsbedingte Abstands- änderungen dann über die Zeit sonographisch gemessen werden können [39; 148].

Außerdem können Dehnungsmessstreifen, die auf die Oberfläche des Uterus aufge- bracht werden, die myometriale Kontraktilität erfassen [149].

2.5.2 In vitro

Um die uterine Kontraktilität in vitro zu messen kann entweder das gesamte Organ oder einzelne Streifen des Myometriums verwendet werden, da das myogen gesteu- erte Myometrium auch isoliert ohne äußere nervale oder hormonelle Reize spontane Kontraktionen zeigt [28; 40].

2.5.2.1 Kontraktionsmessung am isoliert perfundierten Uterus

Der isolierte, mit Nährlösung perfundierte Uterus wurde bisher in einigen Studien zur Messung der uterinen Kontraktilität, mittels intrauteriner Druckkatheter oder Ballonka- theter, herangezogen. Dabei wurden verschiedene Stoffe mit der Perfusionslösung über die Gefäße in das Organ appliziert und ihre Wirkung auf humane, porzine und bovine Uteri untersucht.

An humanen, nicht-graviden Uteri beobachteten Bulleti et al. [150] einen kontrakti- onssteigernden Effekt von Östradiol und einen gegenteiligen Effekt von Progesteron, während Richter et al. [151] eine Verstärkung des kontraktilen Effekts von Östrogen durch das Zusammenwirken mit Oxytocin erzielen konnten.

An Schweineuteri wurden die Effekte von Uterotonika, Tokolytika und Seminalplasma untersucht. In mehreren Studien konnte Oxytocin den intrauterinen Druck (IUP) steigern [152-154] und bei wiederholter Gabe entwickelten sich Oxytocin-generierte rhythmische Kontraktionen [152], die vom Uteruskörper in Richtung Zervix verliefen [154]. Auch die Prostaglandine E1, E2 und F2α steigerten den IUP [153-155]. Dieser Effekt wurde durch Progesteron antagonisiert [156; 157]. Die Prostaglandine der E- Reihe generierten vom Korpus zur Zervix gerichtete Kontraktionen, während PGF2α

entgegengerichtete Kontraktionen zeigte [154; 157]. Auch Östrogen steigerte den

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IUP durch von der Zervix zum Korpus gerichtete Kontraktionen [158; 159], die durch Progesteron gehemmt wurden [158; 160]. Außerdem beobachteten Müller et al. [160]

einen Seiteneffekt des Östrogens vom dominanten Follikel eines Ovars auf das ipsi- laterale Horn, was dem gerichtetem Spermientransport zugesprochen wurde. Malta- ris et al. [155] untersuchten die Wirkung von diversen Tokolytika auf die uterine Kon- traktilität beim Schwein, dabei ergab sich für Fenoterol der stärkste hemmende Ef- fekt. Künzel et al. [161] testeten ebenfalls Spasmolytika in ihrer Wirkung auf die Ute- rusmotorik. Hier entwickelte das muskulotrope Denaverin die stärkste Motorik- Hemmung im Vergleich zu neurotropen parasympathomimetischen Substanzen und muskuloneurotropischen Analgetika. Bei Untersuchungen des Einflusses von Semi- nalplasma, intraluminal verabreicht, auf die porzine Uteruskontraktilität ergab sich ebenfalls eine Steigerung des IUP [162], die durch Progesteron gehemmt werden konnte [163].

Eiler et al. [164] führten Kontraktilitätsmessungen an isolierten Uterushörnern des Rindes durch. Dabei entwickelten Oxytocin und das PGF2α-Analogon Fenprostalen, über die Organbadlösung appliziert, beide eine Kontraktionssteigerung mit einem gesteigerten Effekt nach abwechselnder Verabreichung. Auch Heppelmann et al.

[122] verwendeten in ihrer Studie nicht-gravide Rinderuteri, die mit Tyrode-Lösung perfundiert wurden. Die Uteri wurden unterteilt in eine Gruppe mit Metritis und eine ohne Metritis. Die Kontraktilität wurde an Hand intramyometrial platzierter Sonomik- rometriekristalle gemessen. Auch hier ergab sich für Oxytocin und PGF2α ein kontraktionssteigernder Effekt, der bei den Tieren mit Metritis stärker ausgeprägt war. Bock [147] untersuchte die uterine Kontraktilität vergleichend in vivo und in vitro, einmal am isolierten perfundierten Uterus und durch isotonische Kraftmessung an Myomet- riumsstreifen. Dabei zeigte sich bei Oxytocin eine Kontraktionssteigerung und bei dem Sympathomimetikum Isoxsuprin eine Relaxation. Bei allen drei Messmethoden ergaben sich sehr ähnliche Ergebnisse, sodass sich die in-vitro Verfahren hier als geeignete Modelle zur Kontraktilitätsmessung am Uterus erwiesen.

2.5.2.2 Isometrische Kontraktionsmessung an Myometriumsstreifen

In vitro entwickeln Muskelstreifen nach Äquibrilierung in einer oxygenierten und auf Körpertemperatur erwärmten Nährlösung spontane Kontraktionen. Diese Kontrakti o-

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LITERATUR

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nen können isotonisch, über Längenänderung, oder isometrisch, über Kraftänderung, gemessen werden.

Die isometrische Kontraktilitätsmessung des Myometriums wurde in zahlreichen Un- tersuchungen angewandt, um dessen Physiologie und die Reaktion auf verschiedene Wirkstoffe und Hormone zu testen. Dabei wurden Uterusproben der Frau [165; 166]

aber auch unterschiedlicher Tierarten, wie Ratte [167; 168], Schaf [169; 170], Schwein [171] und Rind [7; 8; 26; 172] untersucht.

Bei zyklischen Rindern (Östrus und Diöstrus) untersuchten Hirsbrunner et al. [7] die spontane Kontraktilität an Muskelstreifen aus der longitudinalen und der zirkulären Schicht des Myometriums. Nach Äquilibrierung wurde die Kontraktilität über drei Stunden, unterteilt in sechs 30-minütige Zeitperioden (T1-T6), aufgezeichnet und das Integral, die mittlere Amplitude und die Frequenz der Kontraktionen bestimmt. Dabei zeigte sich ein unterschiedliches Kontraktionsmuster für die longitudinale und zirkulä- re Muskelschicht des bovinen Myometriums, mit höheren Werten für die longitudinalen Streifen. Ein Einfluss des Zyklusstands konnte nur für die zirkulären Streifen nachgewiesen werden. Hier ergaben sich höhere Werte im Östrus im Vergleich zum Diöstrus. Kaufmann et al. [8] untersuchten ebenfalls zirkuläre und longitudinale Mus- kelstreifen von zyklischen Tieren, entnommen von unterschiedlichen Lokalisationen des Uterus (Uteruskörper und Uterushornspitze), um den Einfluss von Zyklusstand, Uteruslokalisation und Muskelschicht zu bestimmen. Auch hier konnten bei der longitudinalen Schicht höhere Werte für die minimale Amplitude erzielt werden, als bei der zirkulären Muskelschicht. Der Zyklusstand hatte keinen signifikanten Einfluss, aber numerisch ergaben sich im Östrus höhere Werte als im Diöstrus. Bei dem Ver- gleich der Lokalisation konnte eine stärkere Kontraktilität für Proben aus der Horn- spitze im Vergleich zu Proben aus dem Uteruskörper beobachtet werden.

Piccinno et al. [10] untersuchten die Kontraktilität zwischen Tag 0 und 270 der Träch- tigkeit beim Rind, unterteilt in Intervalle von 30 Tagen. Sie fanden spontane Kontrak- tilität in allen untersuchten Zeitintervallen. Während der Frühträchtigkeit zeigte sich eine geringe Kontraktilität (1.-30. Tag), die mit fortschreitender Gravidität immer weiter zunahm, zwischen Tag 150 und 180 die höchsten Werte erzielte, und danach wieder abfiel. Zwischen Tag 240 und 270 stieg die Kontraktilität erneut an und Kon- trakturen bestimmten das Kontraktionsmuster. Weitere Untersuchungen bei tragen-

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den Rindern ergaben spontane Kontraktionen und eine Steigerung durch PGF2α im frühen und mittleren Stadium der Trächtigkeit (1.-7. Trächtigkeitsmonat) [9; 173], aber keine Kontraktilität im Endstadium (271.-290. Trächtigkeitstag). Hier wirkte Oxy- tocin kontraktionsfördernd [174].

Zu puerperalen Rindern gibt es bisher nur eine Studie, bei der Myometriumsproben von Kühen am ersten Tag p.p. nach einer intrauterinen LPS-Infusion untersucht wurden. Allerdings war hier keine gesunde Kontrollgruppe vorhanden. Vier longitudinale und vier zirkuläre Muskelstreifen wurden, nach Äquilibrierung und 150-minütiger Messung der Spontankontraktilität, mit steigenden Dosen von Oxytocin, oder PGF2α, oder Calcium stimuliert. Dabei ergab sich ein stark kontraktionsfördernder Effekt für Oxytocin und schwächer auch für PGF2α und Calcium. Die zirkulären Muskelstreifen erzielten p.p. höhere Kontraktilitätswerte als die longitudinalen. Zusätzlich wurde auch die Kontraktilität von antepartalen Tieren (275. Trächtigkeitstag), die einer Sec- tio caesarea unterzogen wurden, auf die gleiche Weise untersucht. Hier konnte ebenfalls ein kontraktionssteigernder Effekt von Oxytocin, PGF2α, und Calcium ge- zeigt werden, mit dem stärksten Effekt durch Oxytocin. Allerdings ergaben sich antepartum höhere Kontraktilitätswerte für die longitudinalen Muskelstreifen als für die zirkulären Muskelstreifen [172]. Messungen an hochtragenden Uteri nahe dem Ge- burtstermin und Probenentnahme während einer Sectio caesarea wurden in einigen Studien an humanen [175; 176] und von Nagern stammenden Uteri [177; 178]

durchgeführt. Cole et al. [175] untersuchten die Wirkung von Oxytocin und Carbe- tocin am antepartalen, humanen Myometrium. Uterusgewebe wurde während einer Sectio caesarea entnommen und longitudinale Muskelstreifen präpariert. Die Streifen wurden mit Oxytocin oder Salzlösung als Kontrolle vorbehandelt und nach zwei Stunden mit Oxytocin oder Carbetocin in aufsteigenden Dosen stimuliert. Dabei erzielte Oxytocin durchgehend höhere Kontraktilitätswerte als Carbetocin. Der Motili- täts-Index war bei beiden Uterotonika durch die Oxytocin Vorbehandlung reduziert. In einer Studie an tragenden Ratten, die kurz vor der Geburt euthanasiert wurden, konnte ebenfalls eine Reduktion der Oxytocin-induzierten Motilität von longitudinalen Muskelstreifen durch eine Oxytocin Vorbehandlung beobachtet werden. Diese Re- duktion konnte bei Prostaglandin-induzierten Kontraktionen nicht beobachtet werden [177].

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LITERATUR

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Ein Vergleich der in-vitro-Kontraktilität von Muskelstreifen von frühpuerperalen, in- flammatorisch veränderten Uteri zu gesunden Uteri wurde beim Rind bisher noch nicht durchgeführt. Eine Studie untersuchte Myometriumsstreifen von Tieren mit En- dometritis, deren Abkalbung länger als 45 Tage zurücklag [26]. Der Einfluss von Zyk- lusstand, Muskelschicht und Uteruslokalisation auf die Kontraktilität wurde ermittelt.

Hier erzielten, im Vergleich zu den obengenannten Ergebnissen bei zyklischen gesunden Tieren [7; 8], die zirkulären Muskelstreifen und Streifen aus dem Uteruskör- per von Tieren mit Endometritis höhere Kontraktilitätswerte als die longitudinalen Muskelstreifen und Proben aus der Uterushornspitze. Es gab einen ansteigenden Effekt über die Zeit. Die Zyklusphase (Östrus und Diöstrus) hatte keinen Effekt auf die Kontraktilität. Der generelle Einfluss der Endometritis auf die spontane Kontraktili- tät konnte auf Grund des Fehlens einer Kontrollgruppe mit gesunden Tieren nicht ermittelt werden.

Die lokale Wirkung von E. coli beziehungsweise LPS auf den Uterus wurde in vitro bei zyklischen Sauen [179] und tragenden Ratten [180] und Mäusen [181] untersucht. Gesunden Sauen wurde am dritten Tag des Östrus eine E. coli-Suspension oder Natriumchlorid-Lösung per Laparotomie intrauterin verabreicht und sieben Tage später die Kontraktilität isometrisch gemessen. Bei Stimulation der Muskelstreifen mit Acetylcholin ergab sich für die infizierten Tiere eine stärkere Steigerung der Kontrak- tionsintensität als bei den Kontrolltieren. Noradrenalin senkte die Intensität bei den Kontrolltieren und steigerte sie bei den infizierten Tieren [179]. In einem ähnlichen Versuchsaufbau wurde der Einfluss von Leukotrienen nach intrauteriner E. coli- Suspension ermittelt. Dabei zeigte sich kein Unterschied zwischen mit E. coli und mit Salzlösung infundierten Uteri in der basalen Kontraktilität. Beide untersuchten Leuko- triene (Leukotrien C4 und D4) steigerten die Kontraktionsintensität, bei Leukotrien C4 war dieser Effekt bei den mit E. coli vorbehandelten Uteri etwas schwächer ausge- prägt. In einer Studie von Okawa et al. [180] wurde Ratten an Tag 17 der Trächtigkeit intraperitoneal eine LPS-Lösung oder eine Natriumchlorid-Lösung appliziert und drei Stunden später longitudinale Myometriumsstreifen präpariert und untersucht. Dabei ergab sich für die mit LPS behandelten Tiere eine Steigerung der kontraktionsför- dernden Wirkung von Oxytocin auf die uterine Aktivität. In einer anderen Studie von Mackler et al. [181] wurden Mäuse an Tag 15 der Trächtigkeit getötet und aus dem

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entnommenen Uterus longitudinale Muskelstreifen präpariert, die erst mit antii n- flammatorischen Zytokinen und dann mit LPS inkubiert wurden. Bei den mit LPS behandelten Streifen steigerte sich die Kontraktionsamplitude nach zwei Stunden im Vergleich zur Kontrolle. Dieser Effekt konnte durch die Inkubation mit Zytokinen etwas früher erzielt werden.

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MATERIAL UND METHODEN

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3 Material und Methoden

3.1 Versuchsmaterial

Die Studie wurde an Myometriumsproben von Kühen der Klinik für Rinder der Sti f- tung Tierärztliche Hochschule Hannover durchgeführt. Dabei wurden Kühe aus zwei verschiedenen Tiergruppen zur Probenentnahme herangezogen. In der ersten Grup- pe (Gruppe 1) wurden bei 17 gesunden, hochtragenden Kühen die Proben während einer Sectio caesarea entnommen. Die anderen 16 Kühe der zweiten Gruppe (Grup- pe 2) waren aus unterschiedlichen Gründen euthanasierte Tiere aus dem Patienten- gut der Klinik, die sich in dem Zeitraum zwischen Tag 1 bis 21 p.p. befanden.

3.2 Haltung und Fütterung

Die Tiere wurden in der Klinik für Rinder der Stiftung Tierärztliche Hochschule Han- nover in mit Stroh eingestreuten Einzel- oder Doppelboxen gehalten. Die Tiere der Gruppe 1 wurden mit Heu ad libitum sowie zweimal täglich mit 6 kg Maissilage und 1 kg Kraftfutter gefüttert. Bei der 2. Gruppe erfolgte die Fütterung entsprechend der Milchleistung. Alle Tiere hatten freien Zugang zu Wasser und einem Salzleckstein.

3.3 Studiendesign

Bei den hochtragenden Kühen der Gruppe 1 wurde in den Tagen vor dem errechne- ten Geburtstermin die Progesteronkonzentration im Blut der Tiere ermittelt. Bei Abfall des Progesteronwertes unter 1 ng/ml bzw. bei Einsetzen der Geburt wurden die Tie- re im Rahmen einer Studentenübung einer Sectio caesarea unterzogen. Vor Beginn der Operation wurde den Tieren 0,3 mg Clenbuterolhydrochlorid (Planipart^®; Boeh- ringer Ingelheim Vetmedica GmbH, Ingelheim, Deutschland) intramuskulär appliziert.

Nach Entwicklung des Kalbes wurde eine 10x10 cm große Probe, die alle Schichten

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der Uteruswand umfasste, aus der großen Kurvatur des graviden Uterushorns rese- ziert.

Für die Euthanasie der Kühe der Gruppe 2 wurde eine Braunüle (Vasofix^® Braunüle^®, 2,2x50mm, Braun^®, Melsungen, Deutschland) in eine der beiden Vv. jugulares gelegt. Nach Entnahme der Blutproben erfolgte die Euthanasie mittels Applikation von 30.000 mg Pentobarbital-Natrium (Release^®; WDT eG, Garbsen, Deutschland).

Nach Eintritt des Todes wurde der Tierkörper an den Hinterbeinen in die Höhe gezogen. Die Bauchhöhle wurde etwa 5 cm kranial des Euteransatzes durch einen etwa 30 cm langen transversalen Schnitt eröffnet. Der Uterus mitsamt Ovarien wurde durch diese Öffnung kaudal der Zervix und entlang der Ligamenta lata uteri herausgetrennt. Nachdem spontan abfließender Uterusinhalt über die Zervix abgeflossen war, wurde das Gewicht des Uterus mit einer Digitalwaage (Design Küchenwaage, 10 kg, Caso^®, Arnsberg, Deutschland) bestimmt. Anschließend wurde mit Hilfe eines Maßbandes die Größe des Uterus erfasst. Hierbei wurde die Länge des ehemals graviden und des nicht-graviden Uterushornes entlang der großen Kurvatur vom kranialen Rand der Zervix bis zur Uterushornspitze gemessen. Die Breite von Uteruskörper und –hörnern wurde jeweils auf Höhe des weitesten Umfangs bestimmt. Der Uterusinhalt wurde nach Menge, Farbe, Geruch, Konsistenz und Beimengung beurteilt und anhand dessen wurden die Uteri nach Sheldon et al.

[70] in eine Gruppe mit (Gruppe mM; Metritis) und eine Gruppe ohne Metritis (Gruppe oM; gesund) unterteilt. Mit einer Schiebelehre (POWERFIX Profi^®, Electronic Digital Caliper, Deutschland) wurden Länge, Breite und Höhe der Ovarien vermessen. Die Funktionskörper wurden nach Art, Anzahl und Durchmesser erfasst.

Aus der großen Kurvatur des ehemals graviden Horns wurde entsprechend den Tieren der Gruppe 1 eine 10x10 cm große Gewebeprobe entnommen. Diese Gewebeprobe wurde für die Kontraktilitätsmessung in ein Gefäß mit präoxygenierter (95% O2 und 5% CO2) modifizierter Krebs-Lösung (siehe Anhang 9.1.) gelegt.

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3.4 Blutentnahme und Analyse

Vor dem Kaiserschnitt bzw. der Euthanasie der Tiere wurden Blutproben aus einer der Vv. jugulares entnommen und in zwei Serumröhrchen (Röhre 10 ml, Sarstedt AG

& Co., Nümbrecht, Deutschland) und zwei EDTA-Röhrchen (Röhre 4 ml, Sarstedt AG

& Co., Nümbrecht, Deutschland) gefüllt. Die Serum- und EDTA-Röhrchen wurden bei 4°C und 1500 g für 10 Minuten zentrifugiert. Serum und Plasma wurden getrennt, in Eppendorf-Gefäße überführt, eingefroren und bei -20°C bis zur Analyse gelagert. Im Endokrinologischen Labor der Klinik für Rinder der Stiftung Tierärztlichen Hochschu- le Hannover wurden im Serum die 17-β-Östradiol-Konzentration der Gruppe 1 und die Progesteron-Konzentrationen beider Gruppen mittels Festphasen-Radioimmuno- assay (RIA; Coat a count, TKE21, Siemens Diagnostics, Eschborn, Deutschland) ermittelt. Die Plasma-17-β-Östradiol-Konzentration der Gruppe 2 wurde im Endokri- nologischen Labor der Klinik für Geburtshilfe, Gynäkologie und Andrologie der Groß- und Kleintiere der Justus-Liebig-Universität Gießen mit Hilfe eines Sequenztestes bestimmt [182-184]. Weiterhin wurde ein Epoc-Röhrchen (Care-Fill^TM Capillary Tu- bes, Epocal, Ottawa, Canada) mit Blut gefüllt, um die Konzentration des ionisierten Calciums zu bestimmen. Dieser Parameter wurde umgehend nach der Blutentnahme mittels eines automatischen Analysegeräts (epoc^® Blood Analysis System, Epocal, Ottawa, Canada) bestimmt.

3.5 Myographie

3.5.1 Präparation der Proben und Geräte

Die Gewebeprobe für die Kontraktilitätsmessung wurde kurzzeitig in einem Behälter mit präoxygenierter (95% O2 und 5% CO2), modifizierter Krebs-Lösung bei etwa 37°C gelagert. Die Transportzeit zum Labor betrug etwa zehn Minuten. Im Labor wurden die Blutreste mit Krebs-Lösung von der Probe gewaschen und die Ränder so zugeschnitten, dass ein etwa 6x6 cm großes Stück entstand. Das Uterusgewebe wurde in eine mit 37°C warmer Krebs-Lösung gefüllte Präparierschale, deren Boden mit fes-

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tem Silikon überzogen war, gepinnt. Mit einer anatomischen Pinzette und einer Prä- parierschere wurde das Endometrium und die Serosa vorsichtig abpräpariert. In Gruppe 1 wurden acht Streifen parallel zu den longitudinalen Fasern des Myometri- ums, und in Gruppe 2 vier Streifen parallel zu den zirkulären Fasern und vier parallel zu den longitudinalen Fasern zugeschnitten, sodass ungefähr 1 x 0,3 x 0,2 cm (Län- ge x Weite x Tiefe) große Streifen entstanden. An beiden Enden des Muskelstreifens wurde ein handelsüblicher Nähfaden mit einem doppeltem chirurgischem Knoten fi- xiert. Das Ende, das an dem Haken am Boden des Organbades befestigt werden sollte, wurde durch eine Schlaufe ergänzt. Nachdem die Schlaufe um den Haken gelegt war, wurde der Faden des anderen Endes mit einem isometrischen Kraftum- wandler (TRI 201, LETICA^® scientific instruments, PanLab s. l., Cornellà, Barcelona, Spanien) verbunden. Die acht Muskelstreifen wurden einzeln in Organbadkammern (Model Nr. LE 01-086, LETICA^® scientific intruments, PanLab s. l., Cornellà, Barcelona, Spanien) aufgehängt. Die Kammern waren mit 10 ml oxygenierter Krebs- Lösung befüllt. Ein Thermostat (Thermostat Unit LE 13206, LETICA^® scientific intruments, PanLab s. l., Cornellà, Barcelona, Spanien) sorgte für die durchgängige Ein- haltung der vorbestimmten Temperatur von 37°C. Weiterhin wurde eine kontinuierli- che Oxygenierung der Kammern mit 95% O2 und 5% CO2 durchgeführt, um einen konstanten pH von 7,3 – 7,4 zu sichern.

In Gruppe 1 wurde bei sechs der acht Kammern die Krebs-Lösung zusätzlich mit ge- reinigten Lipopolysacchariden von E. coli (LPS, E. coli, O55:B5; 10mg, Sigma Aldrich Chemie GmbH, München, Deutschland) versetzt, sodass je zweimal eine Konzentra- tion von 0,1 µg/ml (LPS0,1), 1 µg/ml (LPS1) und 10 µg/ml (LPS10) entstand. Die restli- chen zwei Kammern wurden nur mit Krebslösung befüllt und dienten als Kontrolle.

Das mechanische Signal von jedem der acht Kanäle wurde digitalisiert, verstärkt (PowerLab 8/30 und Octal Bridge Amp, ADINSTRUMENTS GmbH, Spechbach, Deutschland), und an ein Datenerfassungsprogramm (LabChart7^®, ADINSTRU- MENTS GmbH, Spechbach, Deutschland) auf einem Computer übermittelt.

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3.5.2 Aufzeichnungssequenzen der myometrialen Aktivität

Zur Äquilibrierung wurde in den ersten 30 min in beiden Gruppen keine Spannung an die Muskelstreifen angelegt. Dann wurde eine Spannung von 1 g angelegt und nach 15 min noch 1 g, sodass insgesamt eine Spannung von 2 g angelegt war. Anschlie- ßend konnten sich die Muskelstreifen weitere 15 min äquilibrieren, bevor die Auf- zeichnungsperiode begann. Über 2,5 Stunden wurden die spontanen Kontraktionen gemessen, unterteilt in fünf Perioden von je 30 min.

Darauffolgend wurde in Gruppe 1 je ein Muskelstreifen von jeder LPS Konzentration und ein Kontrollstreifen mit Oxytocin (Oxytocin^® 10 IU/mL, Cp pharma Handelsge- sellschaft mbH, Burgdorf, Deutschland) stimuliert. Die jeweils nicht stimulierten Strei- fen dienten als Kontrollen. In Gruppe 2 wurden drei der zirkulären und drei der longitudinalen Muskelstreifen jeweils mit Oxytocin, mit PGF2α (Dinolytic^®, 5 mg/mL, Zoe- tis Deutschland GmbH, Berlin, Deutschland) und mit Calciumchlorid (Calciumchlorid, Sigma Aldrich Chemie GmbH, München, Deutschland) stimuliert. Der vierte zirkuläre und longitudinale Streifen diente als Kontrolle und wurde nicht stimuliert. Die Kon- zentrationen wurden gesteigert von 10^-10 auf 10^-7 mol/L für Oxytocin, von 10^-7 auf 10^-4 mol/L für PGF2α und von 2,6 auf 20,8 mmol/L für Calciumchlorid. Vor jeder Stimulati- onsperiode wurde die vorherige Lösung abgelassen und das Organbad zweifach mit Krebs-Lösung durchgespült. Jede Stimulationsperiode dauerte 30 min. Um einen Effekt der Spülung des Organbads auszuschließen, erfolgte, den Konzentrations- wechseln zeitlich entsprechend, auch eine Spülung der nicht stimulierten Streifen.

Am Ende der Messungen wurde eine Spülung aller Streifen mit doppeltdestilliertem Wasser durchgeführt, um die Kontraktionsfähigkeit zu überprüfen. Dies war beson- ders wichtig bei den Streifen, die nur kontraktile Aktivität, aber keine Kontraktionen zeigten. Nach Abschluss der Aufzeichnungen wurden die Muskelstreifen mit leichtem Druck für fünf Sekunden zwischen zwei Zellstofftücher gelegt. Um die Querschnitts- fläche zu erhalten, wurde die Länge und das Gewicht der Streifen bestimmt. Die Querschnittsfläche wurde mit folgender Formel berechnet: Fläche = Gewicht / (Dichte x Länge). Die Gewebedichte wurde dabei auf 1.056 g/cm³ geschätzt [185; 186].

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24 3.5.3 Datenanalyse

Folgende Parameter wurden für jeden Kanal und jede Zeitperiode einzeln kalkuliert:

Minimale Amplitude (minA), maximale Amplitude (maxA), mittlere Amplitude (mean- A), Fläche unter der Kurve (AUC) und Frequenz (FR). Für die Analyse wurden nur die letzten 20 min von jeder Zeitperiode (T) einbezogen. MinA, maxA, meanA und AUC wurden automatisch für jeden Kanal getrennt durch ein Makro mit Hilfe der Software LabChart7^® (ADINSTRUMENTS GmbH, Spechbach, Deutschland) bestimmt. Dieses Makro bestand aus mehreren Programmabläufen, die in den Mes- sungen eines Kanals einen minimalen Signalpunkt (absolute minA) während T1 – T5 und einen während T6 – T9 lokalisieren konnten. MinA, maxA und meanA für T1 – T5 wurden kalkuliert mit der in T1 – T5 ermittelten absoluten minA als Referenzwert.

Bei minA, maxA und meanA für T6 – T9 diente die absolute minA von T6 – T9 als Referenz. Die AUC wurde als Integral des gewählten Zeitabschnitts bestimmt. Die Werte für diese Parameter wurden in g (minA, maxA, meanA) oder g x sec (AUC) angegeben. Die Frequenzen wurden manuell ausgezählt und in der Einheit peaks/20 min ausgedrückt. Die Daten wurden in eine Excel-Tabelle (Microsoft Excel 2010, Microsoft Office^®, Redmond, USA) exportiert. Die Werte von minA, maxA, meanA und AUC wurden mit den Querschnittsflächen Werten des zugehörigen Muskelstrei- fens korrigiert. Die Daten wurden von g in mN (minA, maxA, meanA), beziehungsweise von g x sec in mN x sec (AUC) umgewandelt, indem sie mit 9,8 multipliziert wurden. Die Daten von Muskelstreifen, die auch nach Spülung mit doppeltdestilliertem Wasser keine Kontraktionen aufwiesen, wurden nicht in die Analyse mit einbezogen.

3.6 Statistische Auswertung

Alle statistischen Auswertungen wurden mit SAS V9.1 (SAS Institute Inc., Cary, USA) durchgeführt. Für die Überprüfung auf Normalverteilung der Daten wurde der Shapiro-Wilk Test (PROC UNIVARIATE) verwendet. Um eine Normalverteilung für minA, maxA, meanA, AUC und FR zu erreichen wurden die Daten mit dem dekadi-

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schen Logarithmus logarithmiert. Hierfür wurden vorher bei minA alle Null-Werte durch die Hälfte des jeweils kleinsten Wertes ersetzt.

3.6.1 Gruppe 1

Tragzeit, Blutkonzentration von 17-β-Östradiol und ionisiertem Calcium, minA, maxA, meanA und AUC waren in Gruppe 1 normalverteilt und wurden als Mittelwert ± Stan- dardabweichung (Stabw) dargestellt. Für Alter, Blut-Progesteron-Konzentration und FR wurde der Median und die mittlere Abweichung vom Median (MAD) berechnet.

Der Effekt der Zeit und der LPS Konzentration in Gruppe 1 auf die Kontraktilitätspa- rameter (minA, maxA, meanA, AUC) wurde getrennt für die Spontan Kontraktion (T1- T5) und die Stimulation (T6-T9) als wiederholte Messungen mit PROC MIXED analysiert. Für beide Messperioden wurden die Zeit, die LPS Konzentration und die Kom- bination dieser Parameter als fixe Effekte definiert. Bei T6 bis T9 gehörte die Stimula- tion und Kombinationen ebenfalls zu den fixen Effekten. Die Kuhnummer wurde für beide Messperioden als zufälliger Effekt festgelegt. Das Bayesian Schwarz Kriterium und das Akaike Information Kriterium wurden verwendet, um die optimale Kovarianz- struktur Matrix (T1-T5: maxA, meanA, AUC = Autoregressiv, minA = Toeplitz; T6-T9:

minA, maxA, meanA, AUC = Toeplitz) zur Verwendung im repeated Statement zu ermitteln [187]. Der Vergleich der Kontraktilitätsparameter (minA, maxA, meanA, AUC) bei den verschiedenen LPS Konzentrationen untereinander und mit der Kon- trolle wurde für jede Zeitperiode getrennt mit dem gepaarten t-Test (PROC MEANS) durchgeführt. Unterschiede der FR zwischen den LPS-Konzentrationen wurde für jede Zeitperiode einzeln mit dem Wilcoxon-Vorzeichen-Rang-Test (PROC UNIVARI- ATE) getestet. Unterschiede der Kontraktilitätsparameter (minA, maxA, meanA, AUC) zwischen den jeweils aufeinander folgenden Zeitperioden wurden für jede LPS Konzentration und die Kontrolle und für T6 bis T9 zusätzlich in stimuliert und unsti- muliert unterteilt mit dem gepaarten t-Test (PROC MEANS) getestet. Der Einfluss der Zeit, bzw. Oxytocin-Konzentration auf die FR wurde für T1 bis T5 und T6 bis T9 getrennt mit dem Friedman Two Way ANOVA berechnet. Mit dem gepaarten t-Test (PROC MEANS) wurden die Unterschiede zwischen den mit Oxytocin stimulierten und den unstimulierten Muskelstreifen innerhalb einer LPS-Konzentration berechnet.

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Die Beziehung zwischen Blutparametern und Kontraktilitätsparametern (minA, maxA, meanA, AUC, FR) wurde für 17-β-Östradiol und Calcium mit der Korrelation nach Pearson und für Progesteron mit der Korrelation nach Spearman (PROC CORR) berechnet.

3.6.2 Gruppe 2

In Gruppe 2 waren Alter, Tage p.p., die Konzentration von 17-β-Östradiol und ionisiertem Calcium im Blut, Länge und Breite des ehemals graviden Uterushorns, Breite des Corpus uteri, Höhe der Ovarien, minA, maxA, meanA und AUC normalverteilt und wurden als Mittelwert ± Stabw angegeben. Nicht normalverteilt waren die Pro- gesteron-Konzentration im Blut, Gewicht der Uteri, Länge und Breite der ehemals nicht-graviden Uterushörner, Länge und Breite der Ovarien und FR und wurden als Median ± MAD dargestellt. Der Vergleich zwischen den Gruppen oM und mM wurde bei den normalverteilten Daten mit dem Student t-Test (PROC TTEST) und bei den nichtnormalverteilten Daten mit dem Wilcoxon-Rangsummen-Test (PROC NPAR1WAY) durchgeführt.

Der Effekt der Zeit und der Gruppe auf die Kontraktilitätsparameter (minA, maxA, meanA, AUC) wurde in Gruppe 2 als wiederholte Messungen mit PROC MIXED getrennt für die Spontankontraktion (T1-T5) und die Stimulation (T6-T9) analysiert. Für beide Messperioden wurden die Zeit bzw. Konzentration, die Gruppe, die Muskel- schicht und die Kombinationen aus diesen Parametern als fixe Effekte definiert. Bei T6 bis T9 gehörte die Stimulation und Kombinationen ebenfalls zu den fixen Effekten.

Als zufälliger Effekt wurde die Kuhnummer für beide Messperioden festgelegt. Das Bayesian Schwarz Kriterium und das Akaike Information Kriterium wurden verwendet, um die optimale Kovarianzstruktur Matrix (T1-T5 und T6-T9: minA, maxA, mea- nA, AUC = Autoregressiv) zur Verwendung im repeated Statement zu ermitteln [187].

Der Vergleich der Kontraktilitätsparameter (minA, maxA, meanA, AUC) zwischen den Gruppen wurde für jede Zeitperiode getrennt und zusätzlich aufgeteilt in die longitudinale und zirkuläre Muskelschicht mit dem Student t-Test (PROC TTEST) durchge- führt und für T6 bis T9 außerdem getrennt nach Stimulation. Für die FR wurden die Unterschiede zwischen den Gruppen insgesamt und getrennt nach Muskelschicht,

(35)

27

sowie getrennt nach Stimulation mit dem Wilcoxon-Rangsummen-Test (PROC NPAR1WAY) berechnet. Mit dem gepaarten t-Test (PROC MEANS) wurde der Ver- gleich zwischen den Muskelschichten einzeln für jede Zeitperiode vorgenommen und zusätzlich getrennt für die Gruppe oM und mM und für T6 bis T9 unterteilt nach Sti- mulation. Unterschiede der Kontraktilitätsparameter (minA, maxA, meanA, AUC) zwischen den jeweils aufeinander folgenden Zeitperioden wurden insgesamt und getrennt für die Gruppen oM und mM und für T6 bis T9 zusätzlich unterteilt nach Stimu- lation mit dem gepaarten t-Test (PROC MEANS) getestet. Der Einfluss der Zeit bzw.

Konzentration auf FR wurde für T1 bis T5 und für T6 bis T9 mit der Friedman Two Way ANOVA bestimmt. Der Vergleich zwischen den Stimulationen wurde für T6 bis T9 getrennt für die Gruppen oM und mM mit dem gepaarten t-Test (PROC MEANS) berechnet.

Die Irrtumswahrscheinlichkeit (P) sowie ihr Zusammenhang zur Signifikanz wurde wie folgt beschrieben:

Irrtumswahrscheinlichkeit (P) Signifikanzen P≤0,0001 hoch signifikant

P≤0,05 signifikant 0,05<P≤0,10 tendenziell P>0,10 nicht signifikant

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28

4 Ergebnisse

4.1 Gruppe 1

4.1.1 Versuchsmaterial

In Gruppe 1 wurden Myometriumsstreifen von 17 Kühen für die Versuche herangezogen. Die Tiere gehörten alle der Rasse Holstein Friesian an und waren durchschnittlich 2,0 ± 0,0 (Median ± MAD) Jahre alt. Die Sectio caesarea wurde im Schnitt 278,2 ± 4,3 Tage (Mittelwert ± Stabw) nach der künstlichen Besamung durchgeführt.

4.1.2 Blutparameter

Die Blutkonzentrationen von 17β-Östradiol, Progesteron und ionisiertem Calcium sind in Tabelle 4.1. dargestellt.

Tab. 4.1.: Mittelwerte ± Stabw der Serum-Konzentrationen von 17β-Östradiol und der Blutkonzentrationen von ionisiertem Calcium und Median ± MAD der Serum- Progesteron-Konzentration von Kühen der Gruppe 1 (n=17).

Parameter Blutkonzentration

17β-Östradiol (pg/ml) 271,6 ± 82,0

Progesteron (ng/ml) 0,7 ± 0,2

Ionisiertes Calcium (mmol/L) 1,1 ± 0,1

4.1.3 Kontraktilität

Bei sechs der 136 Muskelstreifen konnte jeweils für eine der neun Zeitperioden (0,5%) die Berechnung von minA, maxA, meanA und AUC auf Grund von manipula- tionsbedingten Fehlmessungen in dieser Zeitperiode nicht durchgeführt werden.

Die im Folgenden beschriebenen Unterschiede zwischen den Werten waren, wie es der P-Wert in Klammern angibt, statistisch signifikant.

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ERGEBNISSE

29 4.1.3.1 Kontraktilität T1 bis T5

Von den 136 longitudinalen Muskelstreifen entwickelten 14 (10,3%) spontane Kon- traktionen innerhalb der ersten 150 Minuten (T1-T5). Dabei zeigten sie überwiegend frequente Kontraktionen mit kleiner Amplitude (Abb. 4.1.) und zum Teil biphasischem Charakter. Einige Streifen zeigten auch einzelne starke Kontraktionen mit hoher Amplitude (Abb.4.2.).

Abb. 4.1.: Spontane kontraktile Aktivität (g) eines Muskelstreifens aus der longitudinalen Schicht des Myometriums, entnommen bei einer Kuh während einer Sectio caesarea. 20-minütiger Ausschnitt der isometrischen Kraftmessung über 150 Minu- ten bei 2g Ruhespannung inkubiert in Krebs Lösung, versetzt mit 0,1 µg LPS/ml, kon- tinuierlich begast mit O2 und CO2 und auf 37°C erwärmt.