Molekularbiologische Untersuchungen an Hautpilzen der Arten
Microsporum canis und Microsporum equinum
INAUGURAL - DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer
Doktorin der Veterinärmedizin (Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von
Alexandra-Sabine Alpheis
aus Hildesheim
Hannover 2001
Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. K.H. Böhm
Erster Gutachter: Prof. Dr. K.H. Böhm Zweiter Gutachter: Prof. Dr. Ring
Tag der mündlichen Prüfung: 22. 11. 2001
Meinen Eltern
1 Einleitung 9
2 Schrifttum 10
2.1 Taxonomie und Phylogenese von M. canis und M. equinum 10 2.2 Epidemiologie und Verbreitung der Mikrosporie der Katze 12 2.3 Auseinandersetzung von Dermatophyt und Wirt 14 2.3.1 Faktoren für das Auftreten einer manifesten Infektion 14 2.3.2 Pathogenitätsfaktoren der Dermatophyten 15 2.4 Pathogenese 15
2.5 Klinik 17
2.6 Immunität 18 2.6.1 Unspezifische Abwehr 18 2.6.2 Spezifische Abwehr 20 2.6.2.1 Humorale Abwehr 20 2.6.2.2 Zelluläre Abwehr 20 2.7 Bekämpfungsmaßnahmen bei der Katze 22 2.8 Mikrosporie beim Menschen 24 2.9 Mikrosporie des Pferdes durch M. equinum 25 2.10 Phänotypische Differenzierung von M. canis-Stämmen 26 2.11 Molekularbiologische Differenzierung von Dermatophyten 28 2.12 Genotypische Differenzierung von M. canis und M. equinum 32
3 Material und Methoden 34
3.1 Material 34
3.1.1 Herkunft der untersuchten Isolate 34 3.1.2 Typ- und Referenzstämme 38 3.1.3 Aufbereitung der Isolate 38
3.1.4.2 Kulturelle Untersuchung 39 3.1.5 Differenzierung der Dermatophyten 39
3.2 Methoden 40
3.2.1 Isolierung und Anzucht von M. canis und M. equinum 40 3.2.2 DNA-Präparation von Dermatophyten
(mod. nach GRÄSER 1993) 40 3.2.3 Gelelektrophorese der chromosomalen DNA 42 3.2.4 Absorptionsmessung zur quantitativen und qualitativen
DNA-Bestimmung 43 3.2.5 RAPD-PCR 44 3.2.5.1 Primer 45 3.2.5.2 PCR-Protokoll 45 3.2.5.3 Spezifität der Primer 46 3.2.6 Elektrophorese der PCR-Produkte 47
4 Ergebnisse 48
4.1 Anzucht von M. canis und M. equinum 48 4.1.1 Kulturmorphologie von M. canis 48 4.1.2 Kulturmorphologie von M. equinum 49 4.1.3 Mikroskopische Untersuchung von M. canis und M. equinum 49 4.2 DNA-Präparation von Dermatophyten (mod. nach GRÄSER 1993) 52 4.2.1 Gelelektrophorese der chromosomalen DNA 52
4.2.2 Absorptionsmessung zur quantitativen und qualitativen
DNA-Bestimmung 52
4.3 RAPD-PCR 54
4.3.1 Eignung der Primer 54
4.3.2 PCR-Protokoll 54 4.3.3 Differenzierung der M. canis- und M. equinum-Isolate 54
5.2 DNA-Präparation 68 5.3 Gelelektrophorese der chromosomalen DNA 70
5.4 Absorptionsmessung zur quantitativen und qualitativen
DNA-Bestimmung 70
5.5 RAPD-PCR 71
5.6 Schlußfolgerung und Ausblick 75
6 Zusammenfassung 79
7 Summary 81
8 Literaturverzeichnis 83
9 Anhang 99
9.1 Chemikalien und Reagenzien 99
9.2 Geräte 100
9.3 Kulturmedien und Lösungen 101 9.3.1 Kulturmedien und Lösungen für die
mykologische Untersuchung 101 9.3.2 Lösungen für die DNA-Präparation 101 9.3.3 Lösungen für die RAPD-PCR 104 9.3.4 Lösungen für die Agarose-Gelelektrophorese 104
A Adenin A. Arthroderma Abb. Abbildung abs Absorptionswert
(AC)10 Primer, der an die „simle repeat“-Sequenz (AC)10 bindet AP-PCR engl. arbitrary primed polymerase chain reaction
bp Basenpaare
C Cytosin
c(DNA) DNA-Konzentration
CTAB Cetyltrimethylammoniumbromid dATP 2´-Desoxy-Adenosin-5´-Triphosphat dCTP 2´-Desoxy-Cytosin-5´-Triphosphat dGTP 2´-Desoxy-Guanosin-5´-Triphosphat
DNA engl. desoxyribonucleidacid (Desoxyribonucleinsäure) dNTP 2´-Desoxy-Nukleosid-5´-Triphosphat
dTTP 2´-Desoxy-Thymidin-5´-Triphosphat E. Epidermophyton
EcoRI Restriktionsendonuklease aus Escherichia coli EDH Eppendorfhütchen
EDTA Ethylendiamintetraacetat EHH Europäisch Kurzhaar Fa. Firma
FT-IR Fourier-Transform-Infrarot-Spektroskopie
g Gramm
G Guanin
HindIII Restriktionsendonuklease aus Haemophilus influenzae Ig Immunglobulin
ITS-Region „Internal spacer“-Sequenz kb Kilobasenpaare
kg Kilogramm
M13 Primer, der an die Nucleus-Sequenz des Phagen M13 bindet µg Mikrogramm
µl Mikroliter mg Milligramm ml Milliliter mod. modifiziert
mol relative Molmasse NaCl Kochsalz
OD Optische Dichte
PCR Polymerase-Kettenreaktion
RAPD-PCR engl. randomly amplified polymorphic DNA – PCR rRNA ribosomale Ribonucleinsäure
SDS engl. sodium-dodecylsulfate (Dodecylsulfat-Natriumsalz)
T Thymin
T. Trichophyton Tab. Tabelle
Taq Thermus aquaticus
TBE Pufferlösung aus Tris, Borat und EDTA
T3B Primer, der an die „intergenetische tDNA spacer“-Region bindet
TE Pufferlösung aus Tris und EDTA Tm Schmelztemperatur
Tris Tris(hydroxymethyl)-aminomethan VDNA DNA-Verdünnung
v/v Volumen pro Volumen w/v Gewicht pro Volumen z.A. zur Analyse
1 Einleitung und Aufgabenstellung
Der Mikrosporie-Erreger Microsporum (M.) canis ist der häufigste Dermatophyt bei der Katze, der aufgrund seiner Zoonoseeigenschaft auch eine Gefahr für den Menschen darstellt.
Als besonderes Problem wird die große Anzahl latent infizierter Tiere angesehen. M. canis kann aus dem Fell von etwa jeder fünften klinisch gesunden Katze isoliert werden. Diese latent infizierten Tiere erlangen zunehmende Bedeutung hinsichtlich des Infektionsrisikos für die Menschen und die Tierbestände.
Ziel der vorliegenden Arbeit ist die molekulargenetische Differenzierung von klinischen M. canis-Isolaten zur Klärung epidemiologischer Fragestellungen. Die Unterscheidung der Dermatophytenstämme soll mit der RAPD-PCR anhand von 40 felinen und caninen Isolaten unterschiedlicher geographischer Herkunft und verschiedener Rassen durchgeführt werden.
Bei den felinen Isolaten erfolgt hierbei eine Unterteilung in die Herkunft aus Tierheimen und -kliniken, Rassezuchten und Einzeltierhaltung.
Mit Hilfe der Methode der RAPD-PCR sollen die Voraussetzungen für die Klärung der regionalen Verteilung und für eine eventuelle räumliche Einteilung der M. canis-Isolate geschaffen werden. Hiermit können Übertragungswege zurückverfolgt und Infektionsursachen analysiert werden und somit das Infektionsrisiko für die Katze selbst und die entsprechenden Personengruppen vermindert werden. Bei einer erneuten Infektion im Tierbestand wird durch Vergleich der M. canis-Isolate der Therapieerfolg kontrollierbar bzw.
die Herkunft einer Reinfektion feststellbar. Im Falle der Erkrankung eines Menschen oder eines Rassekatzenbestandes hat die Herkunft eines M. canis-Isolates auch forensische Bedeutung. Zudem können wirtschaftliche Verluste in den Katzenzuchten mit der Aufdeckung der Infektionsquelle verringert werden.
Weiterhin sollen die Dermatophyten-Arten M. canis und M. equinum mit Hilfe der RAPD- PCR differenziert werden, um erneut der Frage nachzugehen, ob es sich bei ihnen um die gleiche oder zwei unterschiedliche Arten handelt.
2. Schrifttum
2.1 Taxonomie und Phylogenese von M.canis und M. equinum
Die Hautpilze werden in die drei Gattungen Microsporum (M.), Trichophyton (T.) und Epidermophyton (E.) eingeteilt, von denen bei unseren Haustieren nur Microsporum und Trichophyton Bedeutung haben (SEELIGER u. HEYMER 1981, DE HOOG u. GUARRO 1995). Einerseits besteht die taxonomische Einordnung in folgende Systematik:
Nach MÜLLER u. LOEFFLER (1992) gehören die imperfekten Formen dieser Gattungen zu der Familie der Moniliaceae, der Ordnung der Hyphomycetales (Moniliales), der Klasse der Hyphomycetes und der Unterabteilung Deuteromycotina (Fungi imperfecti).
Die bekannten perfekten Formen der Arten Microsporum und Trichophyton werden in die Gattung Arthroderma (A.) (alte Bezeichnung: Nannizia) eingeordnet. Diese zählt zu der Familie der Arthrodermataceae, der Klasse Euascomycetes und der Unterabteilung Ascomycotina (MÜLLER u. LOEFFLER 1992).
Nach DE HOOG u. GUARRO (1995) lauten die geltenden Bezeichnungen der beiden hier behandelten Arten der Gattung Microsporum Gruby 1843:
-M. canis Bodin 1902
-M. equinum (Delacroix et Bodin) Gueguen 1904
Andererseits können die Dermatophyten nach ihrer Wirtsspezifität in anthropophile, zoophile und geophile Hautpilze eingeteilt werden (SEELIGER u. HEYMER 1981, MÜLLER u.
LOEFFLER 1992, DE HOOG u. GUARRO 1995). Als wichtige Vertreter dieser drei Gruppen sind beispielsweise zu nennen:
-anthropophile Gruppe: M. audouinii, M. ferrigineum, T. rubrum, E. floccosum -zoophile Gruppe: M. canis, M. equinum, T. mentagrophytes, T. verrucosum -geophile Gruppe: M. gypseum, M. cookei, T. terrestre, T. ajelloi
(SEELIGER u. HEYMER 1981, MÜLLER u. LOEFFLER 1992, HOOG u. DE GUARRO 1995).
Nach MÜLLER u. LOEFFLER (1992) zeichnen sich die Pilze durch ihre besondere Lebensform als nicht mobile Eukaryonten mit absorptiver, kohlenstoffheterotropher
Ernährung, chitinhaltigen Zellwänden und Sporen als Dauer- und Verbreitungsorgane aus. Sie werden in ein eigenes Reich “Echte Pilze / Fungi” eingeordnet (MÜLLER u. LOEFFLER 1992).
Zu einer Art gehören morphologisch ähnliche Individuen einer genetischen Linie, die sich unabhängig von anderen Arten vermehren können (BRASCH 1990).
Nach MÜLLER u. LOEFFLER (1992) kann die Fortpflanzung der Pilze auf zwei verschiedene Arten geschehen: Bei der ungeschlechtlichen, vegetativen Vermehrung werden die Fruchtformen ohne Kernphasenwechsel gebildet. Diese asexuellen, imperfekten Fruktifikationsstadien bezeichnet man als “anamorph”. Bei den Hautpilzen erfolgt diese Vermehrung durch Bildung von Arthrosporen, die durch Zerfall von Hyphen in Einzelzellen entstehen. Diese stellen für die Pilze Überlebenseinrichtungen und Verbreitungsorgane dar.
Die geschlechtliche Fortpflanzung ist in der Regel mit einem Kernphasenwechsel verbunden.
Die sexuelle Fruchtform wird als “teleomorph” bezeichnet. Die in diesem perfekten Stadium gebildeten Sporen dienen der Erhaltung der Art. Die sexuelle Fortpflanzung findet durch die Kreuzung der (+)- und (-)-Kreuzungstypen von zwei Stämmen einer Art bzw. von zwei Teleomorphen statt. Die taxonomische Einteilung wird dann nach dem Aufbau der Fruchtkörper dieser Teleomorphen vorgenommen. Da bei vielen Dermatophyten-Arten jedoch nur die vegetative Fruchtform vorzufinden ist, werden diese anhand der Morphologie ihrer Konidien in die Gruppe der Fungi imperfecti (Deuteromycina) eingeordnet (MÜLLER u. LOEFFLER 1992).
Aufgrund der ungeschlechtlichen Fortpflanzung und der Adaptation an den Parasitismus dieser Hautpilz-Arten gelang es vermutlich einem der (+)- und (-)-Kreuzungstypen, sich selektiv zu vermehren und die Dominanz über seinen Partner zu erlangen (TUCKER u.
NOBLE 1990). Der durch die Evolution benachteiligte Kreuzungstyp ist aufgrund dessen entweder völlig verschwunden oder auf bestimmte Regionen beschränkt (HIRONAGA et al.
1980, BRASCH 1990). Nach HASEGAWA u. USUI (1975) ist A. otae die teleomorphe Form von M. canis. Den Untersuchungen zufolge scheint allerdings die Mehrheit der Isolate nur den (-)-Matingtyp zu produzieren, während der (+)-Matingtyp bisher nur noch in wenigen Regionen Japans mit einem Anteil von 3% der M. canis-Population gefunden wurde (HASEGAWA u. USUI 1975, HIRONAGA et al. 1980).
In einer weiteren Studie von TAKATORI u. HASEGAWA (1985) wurden 56 M. canis-Isolate von Hunden und Katzen in Japan mit den beiden Kreuzungspartnern von A. otae gepaart.
Dabei konnten 27 Isolate dem (-)-Kreuzungspartner und nur zwei Isolate dem (+)-Kreuzungspartner von A. otae zugeordnet werden, während von den restlichen Arten
keine Fruchtformen gebildet wurden (TAKATORI u. HASEGAWA 1985).
Nach HIRONAGA et al. (1980) sind ähnlich ungleiche Verteilungen der beiden Matingtypen auch bei anderen beim Tier vorkommenden Hautpilzarten zu finden, so bei A. benhamiae, A. vanbreuseghemii und T. mentagrophytes. Aufgrund dieser Feststellung bezeichnen HIRONAGA et al. (1980) dieses Phänomen als ein charakteristisches Merkmal der zoophilen Dermatophyten.
Nach MÜLLER u. LOEFFLER (1992) erschwert das ungleiche Vorkommen bzw. das Fehlen eines Kreuzungstypes die Zuordnung der Teleomorphen zu den imperfekten Dermatophyten.
Hinzu kommt das Problem, daß einer anamorphen Form in einigen Fällen mehrere teleomorphe Formen zugeteilt worden sind (MÜLLER u. LOEFFLER 1992).
Diese Schwierigkeiten bei der taxonomischen Bestimmung der Hautpilze führten dazu, daß man andere Methoden wie den Vergleich extrazellulärer Proteine und der Genome bevorzugte (SIMPANYA u. BAXTER 1996, GRÄSER et al. 1998).
2.2 Epidemiologie und Verbreitung der Mikrosporie der Katze
M. canis ist der am häufigsten isolierte Dermatophyt bei der Katze (MEDLEAU u. RISTIC 1992, MORIELLO u. DE BOER 1995b, 1998), durch den bis zu 98% der felinen Hautpilzinfektionen hervorgerufen werden (DE BOER u. MORIELLO 1995a, BÖHM et al.
1996, ROMANO 1999). Darüber hinaus handelt es sich bei M. canis um einen Zoonose- erreger, der eine hohe Infektiosität auch für den Menschen besitzt (BÖHM 1994). Er ist der häufigste anthropozoophile Dermatophyt, der beim Menschen ursächlich für die präpubertäre Tinea capitis sowie für die Tinea corporis und die Tinea faciale bei Erwachsenen verantwortlich ist (SIMPANYA u. BAXTER 1996).
Die Katze gilt als der natürliche Wirt von M. canis. Ein sehr hoher Anteil der Katzen ist latent infiziert (MALE et al. 1980, MEDLEAU u. RISTIC 1992, MIGNON et al. 1999). Als latent infiziert werden vollkommen hautgesunde Tiere oder solche mit kaum erkennbaren Veränderungen bezeichnet (BÖHM u. BISPING 1968). Häufig bleiben Katzen nach überstandener Infektion latent infiziert. Diese gesund erscheinenden Katzen sind eine mögliche Infektionsquelle (BÖHM et al. 1996, MIGNON 1999). Die M. canis-Infektionen stehen an der Spitze der latenten Dermatophytosen (BRUMM 1985, MIGNON u. LOSSON 1997, BÖHM et al. 1998). Bei 19,2% der von BRUMM 1985 untersuchten Katzen konnte eine latente Infektion mit M. canis festgestellt werden. Die Prävalenz der symptomlosen Träger von M. canis lag bei den Katzen in anderen Ländern bei bis zu 88%, abhängig von Faktoren wie den individuellen Charakteristika der Katzen, den geographischen Gegebenheiten und der Dichte der Katzenpopulationen (MEDLEAU u. RISTIC 1992, DE BOER u. MORIELLO 1995, MIGNON u. LOSSON 1997). So war der prozentuale Anteil bei langhaarigen Katzen, bei Katzen mit einem Alter von über zwei Jahren und Katzen aus dichtbesiedelten Landstrichen höher als in der Gesamtpopulation (BÖHM et al. 1998).
Ebenso spielen klimatische und regionale Einflüsse eine Rolle: DE BOER u. MORIELLO konnten 1995 feststellen, daß in südlichen Klimaten eine signifikant höhere Zahl an Katzen latent mit M. canis besiedelt waren. In der Hauskatzenpopulation ist das Trägertum von Hautpilzen im Haarkleid seltener als dort, wo viele Katzen auf engem Raum leben, wie z. B.
auf Ausstellungen, in Katzenzuchten, Katzenpensionen, Tierheimen, Versuchstierhaltungen und bei streunenden Katzen (BRUMM 1985, DE BOER u. MORIELLO 1995, BÖHM et al.
1996). In Katzenzuchten, in denen dieser Hautpilz endemisch vorkommt, kann er von 100%
der Tiere isoliert werden (MORIELLO 1990). Diese latent infizierten Tiere stellen ein meist unerkanntes, aber dauerhaftes Erregerreservoir und damit eine Infektionsgefahr für andere Tiere und auch für den Menschen dar (BÖHM 1996, MIGNON u. LOSSON 1997).
Latent infizierte Katzen werden vom Dermatophyten als Vehikel benutzt, um einen besser geeigneten und eher disponierten Wirt zu erreichen, den sie klinisch manifest infizieren können (BRUMM 1985). Somit fungieren die latent infizierten Tiere als Vektoren, da der Hautpilz oft erst entdeckt wird, wenn andere Lebewesen aus dem Umkreis erkranken (BRUMM 1985, MEDLEAU u. RISTIC 1992).
2.3 Auseinandersetzung von Dermatophyt und Wirt
2.3.1 Faktoren für das Auftreten einer manifesten Infektion
Klinisch manifeste Hautläsionen sind bei adulten Katzen nicht oft zu beobachten, da bei dieser Tierart selten deutliche Entzündungsreaktionen der Haut gegen M. canis verursacht werden (MORIELLO 1990, PETERS 2000). Der Hautpilz ist derart gut an Katzen adaptiert, daß er auf deren Haut leben kann, ohne Entzündungsreaktionen hervorzurufen (MEDLEAU u. RISTIC 1992). Aufgrund dieser mangelhaften oder ganz fehlenden Antwort des Wirtes auf den Dermatophyten kann man von einem symbiotischen Verhältnis sprechen (KIRK 1977, BRUMM 1985). Das Auftreten und das Ausmaß einer klinisch manifesten Mikrosporie hängt daher einerseits von der Erregermenge und -virulenz, andererseits von der individuellen Disposition ab (LEIMBECK 1977). Nach MORIELLO 1990 können bei Katzenwelpen M. canis-Infektionen sogar lebensbedrohlich sein. Bei ihnen sind die Entzündungsreaktionen oft viel deutlicher ausgeprägt als bei ausgewachsenen Tieren (MORIELLO 1990). Dabei spielt auch der geringe Gehalt an Körperfettsäuren in der Haut von Jungtieren eine Rolle, die eine fungistatische Wirkung haben (MORIELLO 1990, BRUHN 1992). Zudem besitzen adulte Katzen oft schon eine erworbene Immunität (DE BOER u. MORIELLO 1993, MIGNON et al. 1999). Von BRUHN (1992), MORIELLO u. DE BOER (1995b) sowie PATERSON (2000) werden weitere wichtige Dispositionsfaktoren beschrieben:
resistenzmindernde Erkrankungen, verminderte zellvermittelte Immunität, Mangel- und Fehlernährung wie z. B. Vitamin-A-Mangel, Belastung durch Trächtigkeit oder Laktation, mangelhafte Pflege und Hygiene und fehlendes Sonnenlicht. Ebenso können Ektoparasiten wie z. B. Flöhe und Cheyletiella-Milben durch Juckreiz Beschädigungen der Haut hervorrufen, da die zerstörte Epidermis viel empfänglicher für die Penetration von M. canis ist (BÖHM u. BISPING 1968, MALE et al. 1980, MORIELLO 1990). Eine geringgradige Hautläsion ist wahrscheinlich die Vorraussetzung für eine klinisch manifeste Infektion (BRUHN 1992). Zudem gibt es einen saisonalen Anstieg der Mikrosporie von September bis Januar, z.T. auch bedingt durch die unterschiedlichen Lebensgewohnheiten der Katzen zu dieser Jahreszeit (KIRK 1977).
2.3.2 Pathogenitätsfaktoren der Dermatophyten
Dermatophyten besitzen verschiedene Mechanismen, mit deren Hilfe sie in der Lage sind, in die Haut des Wirtes einzudringen und eine Infektion zu verursachen:
1. Um in die toten, keratinisierten Anteile der Haut und Hautanhangsorgane eindringen zu können, werden vom Hautpilz keratinolytische Enzyme, sog. Keratinasen, gebildet. Diese Keratinasen lösen auch eine zelluläre Immunantwort aus (SIESENOP 1993, GEBHARDT 1996).
2. Einige Dermatophyten sind in der Lage, antibiotisch wirksame Substanzen zu produzieren, um in der Anfangsphase der Infektion gegen die Mikroorganismen der gesunden Hautflora konkurrieren zu können. (JANSSEN-MÜLLER 1988, BRUHN 1992). BIBEL u. SMILJANIC (1979) beobachteten die Synthese von Antibiotika bei einem T. mentagrophytes-Stamm. In Untersuchungen von LAPPIN-SCOTT et al. (1985) produzierten 13 von 48 Dermatophyten-
Isolaten ß-Lactamantibiotika, und 7 Isolate bildeten andere Antibiotika. Von zwei T. mentagrophytes-Stämmen und einem Microsporum canis-Stamm wurden Penicillin X und
Penicillin G hergestellt, während von einem T. mentagrophytes-Stamm nur Penicillin X produziert wurde.
3. Hautpilze sind mit Hilfe ihrer Arthrosporen befähigt, lange Zeiträume zu überdauern. Unter günstigen Umweltbedingungen können die Sporen über 4 Jahre infektiös bleiben (MORIELLO u. DE BOER 1995, RYCROFT u. MC LAY 1991).
2.4 Pathogenese
Die Inkubationszeit kann 1 bis 4 Wochen betragen, je nachdem, ob sich sofort nach der Infektion eine klinisch manifeste Erkrankung entwickelt oder ob die Keime erst längere Zeit auf inapparente Weise im Fell persistieren (BÖHM 1981, SPARKES et al. 1995, PETERS 2000). In diesem Zeitraum ist jedoch schon eine Sporenübertragung möglich (KIELSTEIN 1966, BÖHM 1994, PATERSON 2000).
Nach MORIELLO (1990) und MEDLEAU u. RISTIC (1992) kommt es bei der Katze zu einer klinisch manifesten Infektion, wenn es dem Dermatophyten gelingt, erfolgreich mit der physiologischen Hautflora und anderen Abwehrmechanismen zu konkurrieren. Er penetriert dann in die keratinisierten Schichten der Epidermis, in die Haarbälge und Haare. Die Pilzsporen wachsen dabei zu verzweigten und septierten Hyphen aus. Während seines Wachstums bildet M. canis keratinolytische Enzyme, mit deren Hilfe er das Stratum corneum und die Haarkutikula durchdringt. Er wächst innerhalb von etwa 7 Tagen am Haarschaft entlang in die Tiefe und umgibt dabei als ektotrich wachsender Hautpilz das Haar mit einem dichten Sporenmantel (MORIELLO 1990, MEDLEAU u. RISTIC 1992). An der oberen Grenze des Haarbulbus, der „Adamsonschen Quaste“, endet sein Wachstum (WEBER u.WEISS 1985). Hier befinden sich Zellen mit mitotischer Aktivität; Dermatophyten können jedoch nur in keratinisierten Zellen von Haut, Haaren und Nägeln wachsen (WEBER u.WEISS 1985).
KIRK (1977) beobachtete, daß das Wachstum der Hautpilze zudem nur auf Haaren möglich ist, die sich in der anagenen, d.h. in der Wachstumsphase befinden. In die Kutikula telogener Haare, die im Wachstums-Ruhestadium stehen und somit nicht mitotisch aktiv sind, können sie nicht eindringen. Möglicherweise benötigen sie hierfür neben dem Keratin noch bestimmte Metaboliten des wachsenden Haares (KIRK 1977).
Nach den Beschreibungen von BRUMM (1985), BRUHN (1992) sowie KRAFT u. DÜRR (1985) wird der Dermatophyt von dem wachsenden Haarschaft passiv an die Hautoberfläche geschoben, welches aufgrund der Umlagerung durch den Sporenmantel spröde wird und abbricht. Die vom Hautpilz produzierten Stoffwechselprodukte führen zu einer entzündlichen Reaktion der Haut des Wirtes. Das Ausmaß der Entzündung ist neben Menge und Art der produzierten Stoffe stark vom Immunstatus der Katze abhängig (BRUMM 1985, BRUHN 1992, KRAFT u. DÜRR 1985).
Histopathologisch beobachtet man Follikulitis, Perifollikulitis, Furunkulose, perivaskuläre Dermatitis und Hyperkeratose (MEDLEAU u. RISTIC 1992).
Nach BRUMM (1985), MORIELLO (1990) und WILLEMSE (1999) wandert M. canis einerseits durch die Wachstumshemmung infolge dieser Reaktionen und andererseits durch die begrenzte Menge an Hornschichtmaterial an der Eintrittspforte in die Peripherie zu den
benachbarten Haaren. Dieses Verhalten wird als Perinomodie bezeichnet. Die anfangs im Zentrum bestehende Entzündungsreaktion nimmt langsam ab, während sie zum Rande hin zunimmt. Dadurch entsteht das klassische Bild der Mikrosporie mit zentraler Heilzone und erythematösem Ringwall (BRUMM 1985, MORIELLO 1990, WILLEMSE 1999).
2.5 Klinik
BRUMM (1985), KRAFT u. DÜRR (1985), DE BOER u. MORIELLO (1995a), WILKINSON u. HARVEY (1997) und ACKERMAN (1999) beschrieben das klinische Bild der Mikrosporie bei der Katze als sehr unterschiedlich und oft nicht von anderen Hauterkrankungen zu differenzieren. Pruritus ist in den meisten Fällen nur schwach ausgeprägt oder fehlt gänzlich. Die Veränderungen können aus geringgradigem Haarausfall, unauffälligen leicht pulvrigen Schuppen und Erythemen oder fleckenförmiger Alopezie mit mottenfraßähnlichem Aussehen und abgebrochenen Haaren bestehen. Die Prädilektionsstellen sind Gesicht, Ohrränder und Vorderextremitäten. Eine Generalisierung ist seltener zu finden.
Das klinische Erscheinungsbild der Mikrosporie ist nur bei 8-9% der adulten mit M. canis infizierten Katzen zu finden Die typischen kreisrunden bis unregelmäßig konfluierenden, entzündlichen Alopezieherde mit erythematösem Ringwall treten meist bei Jungtieren auf.
Manchmal sind auch miliare Dermatitiden mit zahlreichen Krusten zu finden (BRUMM 1985, KRAFT u. DÜRR 1985, DE BOER u. MORIELLO 1995a, WILKINSON u. HARVEY 1997, ACKERMAN 1999).
Bei Perserkatzen können sich durch M. canis verursachte Pseudomycetome bilden, d.h.
knotige Veränderungen von Haut und Unterhaut mit Infiltration des intermuskulären kollagenen Bindegewebes (MORGANTI et al. 1992, FLAIG et al. 1999, PETERS 2000).
2.6 Immunität
Nach einer überstandenen Erstinfektion mit M. canis baut die Katze für eine gewisse Zeit eine starke humorale und zelluläre Immunantwort gegen diesen Hautpilz auf (LEIMBECK 1977, DE BOER u. MORIELLO 1993, MIGNON et al. 1999). Diese hat große Bedeutung für die Epidemiologie der Mikrosporie (BRUMM 1985). Es handelt sich um eine erworbene, relative Immunität gegen Reinfektionen, die sich in einem verkürzten Infektionsverlauf mit schnellerer Ausheilung äußert (WEISS et al. 1977, TAGAMI et al. 1989, SIESENOP 1993).
Die Intensität und Dauer der Immunität ist wie bei allen Hautpilzen bei M. canis abhängig von Faktoren wie dem Dermatophytenstamm, dem Wirt und der Lokalisation der Erstinfektion (GRAPPEL et al. 1974).
Daneben konnten POULAIN et al. (1980) eine lokale auf die Infektionsstelle beschränkte Immunität nachweisen, wobei sich an diesen Stellen im Verlaufe einer Reinfektion schwächere Läsionen zeigen als bei einer Erstinfektion.
Nach den Erkenntnissen von GRAPPEL et al. (1974) bildet auch der Mensch eine relative Immunität aus, die jeweils abhängig vom Verlauf der Erkrankung ist. Nach einer schweren entzündlichen Form, verursacht durch einen zoophilen Dermatophytenarten, gibt es regelmäßig eine erhöhte Immunität. Dagegen muß eine chronische Infektion durch anthropozoophile Hautpilze nicht unbedingt eine Immunität bewirken (GRAPPEL et al.
1974).
2.6.1 Unspezifische Abwehr
Die unspezifische Abwehr ist zusammen mit der spezifischen Abwehr an der Beschränkung der Dermatophytose auf die keratinisierten Anteile der Haut und Hautanhangsorgane sowie an der Vernichtung des Hautpilzes beteiligt (MEDLEAU u. RISTIC 1992). Neben den schon in Kap. 2.2.1 beschriebenen Resistenzfaktoren der Haut spielen dabei noch weitere Faktoren eine Rolle:
1. Serumfaktor
Nach GRAPPEL (1981) gibt es im Serum von gesunden Menschen und Tieren eine fungistatische Substanz, einen sogenannten Serumfaktor, der auch schon bei Neugeborenen gefunden werden konnte. Dieser Stoff beschränkt das Wachstum der Hautpilze auf die keratinisierten Schichten der Haut und Hautanhangsorgane und verhindert somit das Eindringen in lebendes Gewebe. Fehlt der Serumfaktor, können die Dermatophyten in alle Schichten der Epidermis eindringen und sogar auf inneren Organen leben (GRAPPEL 1981).
Bei biochemischen Untersuchungen dieser Substanz wurde ein ungesättigtes Transferrin gefunden, das durch die Bindung von Eisen das Wachstum der Dermatophyten hemmt (GRAPPEL u. BLANK 1972). Zudem wurde ein alpha2-Makroglobulin im Serum von Menschen gefunden (YU et al. 1972, BRUMM 1985, SIESENOP 1993).
2. Komplementaktivierung über den alternativen Reaktionsweg
Nach den Beschreibungen von SVEJGAARD (1986) und TAGAMI et al. (1989) sind verschiedene Dermatophytenarten befähigt, das Komplementsystem über den alternativen Weg zu aktivieren. Möglicherweise werden aufgrund der dadurch zunehmenden Entzündungsreaktionen vermehrt Anaphylatoxine, Opsonine und Chemotoxine gebildet und infolge dessen das Wachstum der Hautpilze gehemmt (SVEJGAARD 1986, TAGAMI et al.
1989).
3. Gesteigerte Zellproliferationsrate
Nach SVEJGAARD (1986) trägt auch eine gesteigerte Zellproliferationsrate der Haut dazu bei, daß Dermatophyten schneller eliminiert werden können. Bei T. rubrum, der beim Menschen chronische Infektionen verursacht, konnte festgestellt werden, daß er die Proliferation der Keratinozyten hemmen konnte (SVEJGAARD 1986).
Auf diesem Wege könnte eine persistierende, chronische Dermatophytose entstehen (CABRERA et al. 1991).
4. Der Hauttalg hat außerdem fungistatische Eigenschaften (MEDLEAU u. RISTIC 1992, BRUHN 1992).
2.6.2 Spezifische Abwehr
2.6.2.1 Humorale Abwehr
Nach BRUHN (1992) und DE BOER u. MORIELLO (1995a) läuft bei der humoralen Abwehr eine Überempfindlichkeitsreaktion vom Soforttyp ab. Dabei werden Antigen- Antikörper-Komplexe mit dem Dermatophyten-Antigen gebildet (BRUHN 1992, DE BOER u. MORIELLO 1995a).
Bei spontan mit M. canis infizierten Katzen konnte nur eine Erhöhung der IgG und IgM beobachtet werden (SPARKES 1993). Auch in Untersuchungen von MIGNON et al. (1999) waren bei allen mit einem bestimmten M. canis-Antigen inkubierten Katzen die Werte der spezifischen IgG Antikörper signifikant höher als bei Katzen, die kulturnegativ oder nur mechanische Sporenträger waren. Sie konnten jedoch keinen Unterschied im Antikörper-Titer zwischen symptomatisch und symptomlos infizierten Tieren feststellen. Daraus schlossen sie, daß die Anwesenheit von IgG unabhängig vom klinischen Status der Katze ist (MIGNON et al. 1999). Auch DE BOER und MORIELLO (1994, 1995a) erkannten in Untersuchungen einer Zellwandvakzine, daß hohe Serumtiter von IgG und IgM Antikörpern nicht gegen eine natürliche Infektion schützen. Eine direkte Beziehung zwischen Antikörpertiter und Grad der Immunität konnte auch von anderen Autoren nicht nachgewiesen werden (KIELSTEIN 1968, CALDERON und HAY 1984,WOODFOLK u. PLATTS-MILLS 1998, PATERSON 2000).
Die Meinung von PIER et al. (1993), daß auch humorale Antikörper an der Abwehr von Dermatophyten-Läsionen beteiligt sind, kann damit als widerlegt gelten.
2.6.2.2 Zelluläre Abwehr
Die zellulären Abwehrmechanismen spielen bei der Ausheilung einer Infektion sowie beim Aufbau einer erworbenen Immunität eine große Rolle (CALDERON 1989, DE BOER und MORIELLO 1995a, SPARKES et al. 1996).
Hierbei spielt sich eine Überempfindlichkeitsreaktion vom Spättyp (Typ VI) ab (CALDERON 1989, BRUHN 1992, WOODFOLK u. PLATTS-MILLS 1998). In Arbeiten von CALDERON und HAY (1984) konnte festgestellt werden, daß es eine zeitliche
Verbindung zwischen dem Bestehen einer Immunität und der Ausbildung dieser Reaktion vom Typ VI (DTH - Delayed Type hypersensitivity) gibt.
Bei chronischen Dermatophytosen ist die zellvermittelte Immunität hingegen aufgrund verminderter Reaktionsfähigkeit der Abwehrzellen bzw. Aktivierung von Suppressorzellen gestört (KAAMAN 1985, CALDERON 1989, WOODFOLK u. PLATTS-MILLS 1998). Die Erstinfektion zeichnet sich durch einen langsameren und heftigeren Verlauf als die nachfolgenden Infektionen aus, während bei chronischen Erkrankungen aufgrund der verminderten zellulären Immunität nur schwache klinische Hautveränderungen ausgebildet werden (JONES 1986, DE BOER u. MORIELLO 1993).
Nach den Untersuchungen von TAGAMI (1982) und CALDERON und HAY (1984) spielen die neutrophilen Granulozyten eine große Rolle bei der Ausbildung einer zellvermittelten Immunität. Durch ihre transepidermale Emigration wird eine Kontaktallergie gegen die Hautpilzantigene hervorgerufen, und die Proliferationsrate der Epidermis wird gesteigert (TAGAMI 1982, CALDERON und HAY 1984).
Die Langerhans-Zellen können durch Präsentation des als Antigen wirkenden Dermatophytenmycels eine Stimulation der zellulären Abwehr bewirken (KAAMAN 1985, BRUHN 1992). Sie sind zudem in der Lage, Entzündungsmediatoren (z.B. Interleukine) zu sezernieren und aus der Haut über die Blutbahn in lymphatische Gewebe zu emigrieren (CALDERON 1989). Trotz der hohen Toxizität von neutrophilen Granulozyten und Makrophagen gegenüber Hautpilzen können sie keine Abtötung, sondern nur eine Wachstumshemmung der Dermatophyten erreichen (SVEJGAARD 1986). Hiermit stellen sie einen weiteren Faktor für die Begrenzung der Hautpilze auf die unbelebten Anteile der Haut dar (CALDERON 1989).
Nach HAY et al. (1993) sind bei akuten Infektionen hauptsächlich Makrophagen und polymorphkernige Granulozyten an der zellulären Abwehr beteiligt, während im chronischen Krankheitsgeschehen im überwiegenden Maße Mastzellen anzutreffen sind. Diese können durch Freisetzung von Serotonin und anderen vasoaktiven Substanzen eine Kontraktion der Gefäßwände mit Austritt von Entzündungszellen und seröser Flüssigkeit auslösen (HAY et al.
1993).
Bei Dermatophytenarten, die sich an einen bestimmten Wirt angepaßt haben, wie M. canis an die Katze, gibt es in der Regel keine oder nur eine schwache Immunantwort (MORIELLO 1990, MEDLEAU u. RISTIC 1992, DAHL 1994).
2.7 Bekämpfungsmaßnahmen bei der Katze
Zur Eliminierung der Mikrosporie in einem Katzenbestand muß viel Zeit, Geld und Anstrengung in ein umfangreiches „Bekämpfungs-Programm“ investiert werden (MORIELLO 1990).
Der wirtschaftliche Aspekt der Katzenmikrosporie ist bedeutend: Durch den Tierwechsel und die latent infizierten Katzen besteht die Gefahr, daß Katzenpopulationen z. B. in Katzenzuchten, Versuchstierhaltungen und Tierheimen immer wieder infiziert werden (RYCROFT u. MC LAY 1991, MIGNON 1996). Dadurch entstehen in wiederholtem Maße erhebliche Kosten für die Behandlung der Katzen selbst und für die Desinfektion der Räume und Gegenstände (GRIFFIN 1993). Dabei bleibt es nicht bei der Behandlung der Katzen mit klinischen Symptomen, denn aufgrund der Möglichkeit einer latenten Infektion müssen alle Katzen mitbehandelt werden (MORIELLO u. DE BOER 1995b, PETERS 2000). Empfohlen wird für klinisch erkrankte Katzen eine kombinierte Behandlung, die aus einer vierwöchentlichen Gabe von Griseofulvin (40-60 mg/kg Körpergewicht und Tag) oder Ketokonazol (10 mg/kg Körpergewicht und Tag) und einer 5-maligen Ganzkörperwaschung mit Enilkonazol besteht. Zudem sollte bei allen Katzen des Bestandes eine 5-malige Ganzkörperwaschung mit Enilkonazol vorgenommen werden (BRUMM 1985). Da Griseofulvin jedoch nur fungistatisch wirkt, können Rezidive entstehen (BRUMM 1985).
Aufgrund der starken Nebenwirkungen der Antimykotika sind Tierverluste nicht auszuschließen (MORIELLO 1990). In der Literatur sind folgende von BRUMM 1985 zusammengestellte Nebenwirkungen zu finden: Fetusanomalien, Totgeburten bei Einnahme in der ersten Hälfte der Gravidität, allergische Reaktionen, gastrointestinale Störungen, Ikterus, Anämie, Leukopenie und Knochenmarkssuppression. Bei Ketokonazol ist die am
häufigsten beobachtete Nebenwirkung besonders bei Katzen Anorexie (MORIELLO 1990).
Dieses Imidazolderivat ist nur für die Therapie beim Hund zugelassen und muß daher auf die Katze umgewidmet werden (LÖSCHER et al. 1999). Nach MANCIANTI et al. (1999) und PETERS (2000) besitzt Terbinafin eine gute Wirksamkeit und eine bessere Verträglichkeit, ist jedoch noch nicht bei vielen Katzen angewandt worden.
Nach PETERS (2000) und ASEMISSEN (2001) ist für die Immunprophylaxe der inaktivierte Impfstoff Insol Dermatophyton® (Fa. Boehringer Ingelheim) für verschiedene Tierarten zugelassen. Dieser bietet jedoch keinen hundertprozentigen Schutz gegen eine Infektion. Zur Vakzination eines größeren Katzenbestandes ist er vergleichsweise sehr kostenaufwendig (PETERS 2000, ASEMISSEN 2001). Zudem können durch diesen Impfstoff die Sporen nicht aus dem Fell der Katze beseitigt werden (DE BOER u. MORIELLO 1995b, MORIELLO u.
DE BOER 1995a, ASEMISSEN 2001).
Die hohe Tenazität der Sporen stellt ein weiteres Problem dar, da diese eine gründliche und langwierige Prozedur der Desinfektion unumgänglich machen (RYCROFT u. MC LAY 1991, MIGNON u. LOSSON 1997, PATERSON 2000). Eine vollständige Entfernung aller Keime ist ausgesprochen schwierig, aber möglich (GRIFFIN 1993, BÖHM 1996).
Nach BRUMM (1985) sollte z.B. auch in Katzenzuchten im Falle einer Enzootie bis zur vollständigen Eliminierung aller Sporen weder weiter gezüchtet, noch sollten Jungkatzen abgegeben werden. Für die Züchter bedeutet dies einen weiteren wirtschaftlichen Verlust.
Hinzu kommt die empfohlene kulturelle Untersuchung des Haarkleides zugekaufter Katzen (BRUMM 1985).
Auch der zeitliche und arbeitstechnische Aspekt darf hier nicht außer Acht gelassen werden:
Insgesamt bedeutet eine M. canis-Infektion in einem Tierbestand eine sehr zeit- und arbeitsaufwendige Situation für die Tierbesitzer (MORIELLO 1996, MANCIANTI 1998).
Dazu gehören therapieflankierende Maßnahmen wie die Säuberung und Desinfektion der Umgebung der Katze, das Auskochen von Bürsten und Kämmen, bzw. die unschädliche Vernichtung von entbehrlichen Gegenständen (BRUMM 1985, MORIELLO u. DE BOER 1995b, PATERSON 2000). Die bei langhaarigen Katzen empfohlene Schur des Felles birgt wiederum die Gefahr, daß infolge von gesetzten Mikrotraumen neue Infektionsherde entstehen (DE BOER u. MORIELLO 1995a, GRIFFIN 1993, PETERS 2000).
2.8 Mikrosporie beim Menschen
In Deutschland nimmt die Bedeutung von M. canis seit einigen Jahren wieder deutlich zu (TIETZ et al. 1999). Dieses Phänomen wird auch in anderen europäischen Ländern beobachtet: M. canis wird als ein häufiger und weitverbreiteter Erreger von zoophilen Dermatomykosen beschrieben und stellt die Hauptursache von Dermatomykosen in verschiedenen Regionen dar (SANCHEZ et al. 1989, ROMANO et al. 1999). In einigen Ländern wurden drei von vier menschlichen Dermatomykosefällen von Katzen verursacht (BÖHM 1994). MORIELLO und DE BOER (1995b) berichteten über die zunehmenden Probleme der felinen Dermatomykosen in den USA, wo mit steigender Popularität der Katzenhaltung auch die Verbreitung der Dermatomykosen und die Zahl der M. canis- Infektionen bei Kindern und Erwachsenen zunahm.
Für den Menschen ist M. canis eine besondere Gefahr (ROMANO 1999). Die starke Verbreitung des Zoonoseerregers in der Katzenpopulation und der enge Kontakt des Menschen zu den Tieren sind oftmals Ursache der Ansteckung, insbesondere durch latent infizierte Katzen (BÖHM et al. 1996). Der direkte Kontakt zwischen Mensch und Katze spielt bei der Übertragung auf den Menschen die größte Rolle, gefolgt von der Übertragung durch sporentragende isolierte Haare (BÖHM 1994). Betroffen sind überwiegend Kinder (JEHN 1997), die neben dem noch nicht so gut entwickelten Immunsystem (MORIELLO u. DE BOER 1995b) ein zusätzlich erhöhtes Risiko tragen, da sie altersgemäß einen sehr engen Kontakt zu den Tieren haben (BÖHM 1994). Die Mikrosporie kann in Kindergärten, Schulen und Internaten endemisch auftreten (JEHN 1997).
Weiterhin gelten abwehrschwache Personen allgemein als besonders empfänglich für M.
canis-Infektionen (MORIELLO u. DE BOER 1995).
Nach BÖHM (1994) ist die Gefahr der Übertragung von M. canis auf den Menschen in Tierheimen, Katzenpensionen und Katzenzuchten aufgrund des häufigen Tierwechsels besonders groß. Betroffen sind vor allem Züchter, Tierpfleger und Kleintierpraktiker (BÖHM 1994).
In der Literatur wurden viele Fälle von Mikrosporie-Endemien beim Menschen beschrieben (BRUMM 1985, SANCHEZ et al. 1989, SPARKES 1993, ROMANO et al. 1999, TIETZ et al. 1999).
Die für den Menschen notwendige Therapie ist wie bei den Tieren sehr langwierig und mit möglichen starken Nebenwirkungen behaftet (TIETZ et al. 1999). Bei der Infektion mit zoophilen Hautpilzen werden im Gegensatz zu der Infektion mit anthropophilen Dermatophyten zum Teil längere Therapiezeiten, höhere Dosierungen und zusätzlich ein Lokalantimykotikum empfohlen (TIETZ u. STERRY 1999). Therapiebegleitend ist bei einer M. canis-Erkrankung des Menschen ebenso wie bei einer Infektion der Katze ein erheblicher zeitlicher und finanzieller Aufwand für die Desinfektion der Umgebung, Kleidung und anderer Gegenstände erforderlich (BRUMM 1985).
Die Zusammenarbeit zwischen Human- und Veterinärmedizinern ist aufgrund der Existenz dieser Anthropozoonose sehr wichtig (BÖHM 1983, WEBER u. WEISS 1985). Die Haut- und Tierärzte haben die Verantwortung, Patienten und Tierbesitzer über die Gefahren der Krankheitsübertragung und Reinfektion zu informieren (WEBER u. WEISS 1985, MORIELLO u. DE BOER 1995a).
2.9 Mikrosporie des Pferdes durch Microsporum equinum
Der beim Pferd vorkommende Dermatophyt M. equinum wird von zahlreichen Autoren als Synonym von M. canis angesehen, und es ist nicht vollständig geklärt, ob es sich hierbei um zwei unterschiedliche Arten handelt (TUCKER und NOBLE 1991, GRÄSER et al. 1999).
M. equinum ist nach T. equinum der häufigste Dermatophyt beim Pferd (BÖHM 1998). Er konnte in verschiedenen Untersuchungen bis zu einem Anteil von 25% der Dermatophyten nachgewiesen werden (MEYER 1983, HAACK 1985, BÖHM 1998).
M. canis in Katzenpopulationen entsprechend, stellen nach GEBHARDT (1996) und DIETZ u. HUSKAMP (1999) besonders die latent infizierten Pferde eine Ansteckungsquelle dar. Die Erkrankung tritt wie bei den meisten Hautpilzerkrankungen saisonabhängig überwiegend in den späten Herbst- und frühen Wintermonaten auf. Zu dieser Zeit befinden die Pferde sich im Stall, und der Hautpilz kann durch kontaminierte Stalleinrichtungen, Putz, Geschirr- und Sattelzeug übertragen werden. Sogar das Auftreten von Enzootien ist möglich. Das klinische
Bild ist erkennbar durch kreisrunde Läsionen im Haarkleid mit mottenfraßähnlichem Aussehen, die sich innerhalb von einigen Wochen bis Monaten vergrößern und konfluieren können. Die bevorzugten Lokalisationen sind Hals, Schultern, Rücken und Flanken (GEBHARDT 1996, DIETZ u. HUSKAMP 1999).
In einigen Fällen kann es auch zu einer Superinfektion durch Staphylokokken kommen (BÖHM 1969, WEISS u. BÖHM 1978).
2.10 Phänotypische Differenzierung von M. canis-Stämmen
Um erneute und weitere Infektionen anderer Tiere oder des Menschen zu verhindern, ist es im Falle einer diagnostizierten Mikrosporie der Katze wichtig, daß eine sehr intensive Quellenermittlung stattfindet und eine Erfassung aller Kontakttiere und -personen durchgeführt wird. Dafür ist es notwendig, die Infektkette von M. canis im Einzelfall herauszufinden, um die Infektionsquelle festzustellen und um diese dann gezielt bekämpfen zu können (BÖHM u. LANGBEIN 1982, HOWELL et al .1999). Für diese Maßnahmen wäre eine Stammdifferenzierung sehr hilfreich (HOWELL et al.1999). Auch für die Untersuchung, ob das Wiederkehren einer Hautpilzinfektion durch mißlungene Therapiemaßnahmen oder durch einen neuen Hautpilzstamm verursacht worden ist, wird eine effektive Methode für die Stammdifferenzierung der Dermatophyten benötigt (HOWELL et al.1999, JACKSON et al.
1999). In der Literatur wird über zahlreiche Arten der phänotypischen Unterscheidung der verschiedenen M. canis-Stämme berichtet:
Die Differenzierung von M. canis-Stämmen nach morphologischen Kriterien bringt nicht immer epidemiologisch verwertbare Aussagen, da die Isolate oft unterschiedliche und atypische Wuchsformen aufweisen und deshalb phänotypisch nicht differenziert werden können (WOLF et al. 1996, MOCHIZUKI et al. 1997, GRÄSER et al. 1998, JACKSON et al.
1999). Das Vorkommen von atypischen und dysgonischen M. canis-Stämmen wird von ENGLISH u. TUCKER (1978a,b), SANCHEZ et al. (1989), MATA ESSAYAG u.
HARTUNG DE CAPRILES (1991) und TUCKER (1992) beschrieben (s. Kap. 5.1).
Nach BRUMM (1985), ACKERMAN (1991), MEDLEAU u. RISTIC (1992) DE BOER u.
MORIELLO (1995) und PATERSON (2000) fluoreszieren bei der Untersuchung von M. canis-infizierten Haaren mit der Wood`schen Lampe nur etwa 50 % der M. canis-Stämme.
Die Fluoreszenz wird durch einen Tryptophan-Metaboliten der Pilze im Haarschaft hervorgerufen. Durch topische Behandlung der Haut mit Cremes, Salben, Shampoos, etc. ist jedoch eine Unterdrückung der Fluoreszenz möglich. Andererseits kann auch durch Salbenbehandlung oder durch das bläulich-weiße Leuchten bei einigen bakteriellen Infektionen eine Fluoreszenz vorgetäuscht werden (ACKERMAN 1991, MEDLEAU u.
RISTIC 1992, DE BOER u. MORIELLO 1995, PATERSON 2000). Hier stellt sich die Frage, ob die Fluoreszenz von Unterschieden im Erbgut abhängig ist oder den äußeren Umwelteinflüssen unterliegt (DE BOER u. MORIELLO 1995).
Nach MORGANTI et al. (1992) sowie FLAIG et al. (1999) breitet sich M. canis im Falle des Dermatophyten-Pseudomycetoms bei den Perserkatzen auf die subkutanen und tieferen Schichten der Haut aus, und es entstehen solitäre oder multiple Knoten in der Kutis oder Subkutis. Bei dieser atypischen Dermatophytose ist es nicht auszuschließen, daß eine bestimmte Variante von M. canis dafür verantwortlich ist (MORGANTI et al. 1992, FLAIG et al. 1999). Von MORGANTI et al. (1992) wurden aus dem Untersuchungsmaterial von Pseudomycetomen bei Mensch und Katze Stämme isoliert, die Trypsin, Casein, Harnstoff und Gelatine wesentlich schneller abbauen als Stämme, die bei anderen Hautveränderungen im Fell der Katze gefunden wurden.
Mittels der Fourier-Transform-Infrarot-Spektroskopie (FT-IR), mit der Isolate von T. rubrum, T. mentagrophytes und M. canis untersucht wurden, konnten nur teilweise phänotypische Unterschiede zwischen M. canis-Stämmen festgestellt werden (BASTERT et al. 1999).
SIMPANYA et al. (1998) zeigten, daß auch mit Hilfe der Analyse von Isoenzymen M. canis- Isolate unterschieden werden können. Die 54 von ihnen untersuchten Stämme, die von Menschen und Tieren (Katzen und Hunde aus Neuseeland) isoliert wurden, zeigten variable Muster; es konnte jedoch keine Korrelation zur geographischen Herkunft oder zum pathogenetischen Potential der Isolate gefunden werden (SIMPANYA et al. 1998).
Des weiteren wurden biochemische Untersuchungen zur Differenzierung von M. canis- Stämmen eingesetzt: Die dabei erzielten Ergebnisse waren jedoch widersprüchlich und zum Teil nicht reproduzierbar (PHILPOT 1977, KREMPL-LAMPRECHT et al. 1984,
MORGANTI et al. 1992, BRASCH u. ZALDUA 1994, SIMPANYA u. BAXTER 1996, MIGNON et al. 1998, GRÄSER et al. 1999a).
Eine Differenzierung der (+)- und (-)-Kreuzungstypen von A. otae war mit Hilfe der isoelektrischen Fokussierung von JEFFRIES et al. (1984) und mit einer Zellprotein-Analyse
von TUCKER u. NOBLE (1990) möglich. Die M. canis-Isolate konnten hier dem (-)-Kreuzungstyp zugeordnet werden, waren jedoch untereinander nicht zu unterscheiden
(JEFFRIES et al. 1984, TUCKER u. NOBLE 1990).
Da die Expression der phänotypischen Merkmale sehr stark von Umweltbedingungen (wie Temperatur, pH-Wert, Nährmedium) beeinflusst werden kann (GRÄSER et al. 1998), sind die o. g. morphologischen und biochemische Untersuchungen sowie die FT-IR-Methode zur Differenzierung der M. canis-Stämme nicht geeignet Im Gegensatz dazu sind genotypische Merkmale stabiler und zeigen deshalb auch eine höhere Reproduzierbarkeit (GRÄSER et al.
1998). Daher erscheint es sinnvoll, eine Dermatophytendifferenzierung auf genotypischer Ebene vorzunehmen (BOCK et al. 1997, DE BOER u. MORIELLO 1995, GRÄSER et al.
1998).
2.11 Molekularbiologische Differenzierung von Dermatophyten
Untersuchungen auf der molekularbiologischen Ebene zur Differenzierung von Hautpilzen sind bereits von mehreren Autoren beschrieben worden:
BOCK et al. (1997) entwickelten für die PCR die Primer TR1 und TR2, die ein 581 Basenpaare langes Fragment flankieren, das für die kleine ribosomale Untereinheit (18S rRNA) kodiert. Damit konnte die DNA von 7 häufigen Dermatophytenarten, inclusive eines klinischen M. canis-Isolates, amplifiziert werden. Zur Überprüfung der Spezifität des Verfahrens für Pilze wurden zusätzlich die DNA menschlicher Haut, tierische und pflanzliche DNA getestet. Es fand keine Amplifizierung der DNA mit diesem Primersystem statt. Zur Differenzierung der Dermatophyten wurde eine Hybridisierung mit Detektionsoligonukleotiden und eine Restriktionsanalyse vorgenommen. Da die bekannten 18S rRNA-Sequenzen der zu untersuchenden Dermatophyten nur geringe Unterschiede
aufwiesen, waren die Differenzierungsmöglichkeiten auf der Spezies- bzw. Stammesebene eingeschränkt. Eine Unterscheidung von Dermatophyten einerseits und Hefe- bzw.
Schimmelpilze andererseits war zwar möglich, nicht jedoch eine Differenzierung auf Spezies- Ebene (BOCK et al. 1997).
LIU et al. (1997) untersuchten 8 Microsporum-Spezies einschließlich eines M. canis-Isolates, ferner 16 Trichophyton-Spezies bzw. -Subspezies und Epidermophyton floccosum mit Hilfe der AP-PCR. Durch den kombinierten Gebrauch der beiden unspezifischen Primer OPAA11 und OPD18 konnten sie zwar die meisten Arten durch deren verschiedene Bandenmuster differenzieren, jedoch wurden keine Unterschiede innerhalb einer Art gefunden (LIU et al.
1997).
KANO et al. (1997) setzten zur molekularen Differenzierung die RAPD-PCR und Southern Hybridisierungsanalysen mit der Genom-DNA von sechs Arthroderma (A.)-Arten ein.
Darunter befand sich auch A. otae, die teleomorphe Form von M. canis. Bei der RAPD- Analyse ergaben sich für jede der sechs Arten unterschiedliche Bandenmuster. Es konnten auch kleinere Unterschiede in den PCR-Profilen zwischen den (+) und (-) Kreuzungstypen von A. gypseum, A. fulvum und A. incurvatum gefunden werden (KANO et al. 1997).
Dieser Untersuchung von KANO et al. (1998a) folgte eine Differenzierung der gleichen sechs sowie weiterer zwölf Microsporum- bzw. Arthroderma-Arten mit den gleichen Methoden.
Darunter befanden sich die (+) und (-) Kreuzungstypen von A. otae und zwei klinische M. equinum-Stämme. In der RAPD-Analyse besaßen alle 18 Arten verschiedene Bandenmuster. Die Southern- Hybridisierungsanalyse wurde mit einer C3-Sonde, die aus einer RAPD-Bande von Arthroderma otae entwickelt wurde, durchgeführt. Es entstanden spezifische Bandenmuster für 14 der 18 Microsporum bzw. Arthroderma-Arten beim EcoRI- und HindIII-Verdau. Hier ist jedoch nur eine Interspezies-Differenzierung möglich. Bei 11 dieser Arten war die Größe der Banden spezifisch für die Art, während die drei Arten A. otae (M. canis), M. equinum und M. ferrugineum Banden der gleichen Größe bildeten. Deshalb werden diese drei Arten als eine Gruppe mit enger Verwandtschaft unter den Microsporum- Arten betrachtet (KANO et al. 1998a).
KANO et al. (1998b) nahmen auch eine Identifizierung klinischer M. canis- und M. gypseum- Isolate von Mensch, Katze und Hund mittels RAPD-PCR und Southern Hybridization vor.
Die RAPD-Bandenmuster der sechs M. canis-Stämme waren identisch mit denen der
Standard-Stämme von A. otae, der teleomorphen Form von M. canis. Die Southern Blot- Analyse mit der Sonde C3 von der A. otae-DNA zeigte ebenfalls, daß die sechs M. canis- Stämme die gleichen Banden wie die Standard-Stämme von A. otae besaßen. Hier wurden also keine Unterschiede innerhalb der Arten entdeckt (KANO et al. 1998b).
BUZINA et al. (1998) stellten an der Universitätsklinik Graz molekularbiologische Untersuchungen zur schnelleren und sicheren Unterscheidung von sechs humanpathogenen Dermatophyten-Arten einschließlich sechs verschiedener M. canis-Stämme an. Die PCR- Amplifikate, die mit den Primern ITS1 und ITS4 gebildet wurden, waren in ihrer Länge bei den Trichophyton-Arten einheitlich, während bei den beiden Arten M. canis und M. gypseum eine deutliche Unterscheidung aufgrund der Fragmentlänge möglich war. Bei dem Verdau mit vier Restriktionsenzymen gab es DNA-Fragmente unterschiedlicher Länge; und die sechs untersuchten Arten ließen sich mit der Kombination von nur zwei Restriktionsenzymen zuverlässig voneinander unterscheiden. Eine intraspezifische Differenzierung war jedoch nicht möglich (BUZINA et al. 1998).
GRÄSER et al. (1998) untersuchten Dermatophyten-Arten mit der RAPD-PCR-Methode. Mit den vier unspezifischen Primern (AC)10, (GTG)5, M13 und AP3 wurden charakteristische PCR-Profile für 17 Arten einschließlich eines M. canis-Stammes erzeugt. Einerseits entstanden dabei drei Paare von Arten, die ein sehr ähnliches Muster aufwiesen:
M. audouinii und M. canis
M. gallinae und M. vanbreuseghemii
Trichophyton (T.) verrucosum und T. mentagrophytes var. erinacei
Andererseits konnten innerhalb der sechs Varianten von T. mentagrophytes vier klar durch ihr charakteristisches Bandenmuster unterschieden werden.
Bei dem Versuch der Identifizierung von fünf klinischen Isolaten mit der RAPD-PCR konnte auch ein klinisches M. canis-Isolat gefunden werden, das dem M. canis-Referenzstamm ähnlich, jedoch nicht mit ihm identisch war (GRÄSER 1998).
In Untersuchungen von GRÄSER et al. (2000) wurden jedoch mit Hilfe der RAPD-PCR und der Analyse der ITS-Region Unterschiede zwischen M. canis- und A. otae-Isolaten gefunden.
Hier konnten die verschiedenen Microsporum-Arten nach dem Verwandtschaftsgrad in drei Gruppen eingeteilt werden. Der (-)-Kreuzungspartner von A. otae stand in der gleichen
Gruppe wie die M. canis-Isolate, während der (+)-Matingtyp einer anderen Gruppe zugeordnet wurde (GRÄSER et al. 2000).
Von MOCHIZUKI et al. (1997) wurden die anthropophilen Dermatophyten T. ment. var.
Interdigitale, T. rubrum und Epidermophyton floccosum mit Hilfe der RAPD-Analyse differenziert. Zwischen den Isolaten von T. ment. var. Interdigitale konnten geringe Intraspezies-Polymorphismen entdeckt werden.
HOWELL et al.(1999) untersuchten T. ment. und T. rubrum mit der Restriktionsenzym- Analyse (REA), der Hybridisierung mit einer DNA-Sonde, der Restriktions-Analyse eines rDNA-Segmentes und der RAPD-PCR. Die RAPD-PCR erbrachte nur einige wenige Variationen zwischen T. ment.-Isolaten (HOWELL et al.1999).
Auch LIU et al. (1996) und GRÄSER et al. (1999b,c,d) war es mit Hilfe der RAPD-PCR teilweise möglich, Intraspezies-Differenzierungen bei Trichophyton-Arten vorzunehmen.
Epidemiologische Studien bei Tieren, Bakterien, Protozoen, aber auch anderen Pilzen (ALI et al. 1986, GRÄSER et al. 1993, SCHÖNIAN et al. 1993a,b) konnten zeigen, daß für die Stammdifferenzierung auf molekularer Ebene Methoden wie die RAPD-PCR bestens geeignet sind. Sie sind in der Lage, sogenannte hypervariable DNA Regionen nachzuweisen.
Diese Methoden wurden wie oben beschrieben auch für die Stammdifferenzierung bei Dermatophyten eingesetzt. Dabei wurde jedoch festgestellt, daß die Dermatophyten-Spezies sehr nah verwandt und in sich homogen sind und somit nur eine Differenzierung auf Speziesebene möglich ist (MOCHIZUKI et al. 1996, LIU et al. 1996, 1997, KANO et al.
1998a,b, GRÄSER et al. 1998, 1999)
Im Gegensatz dazu können sich nach HASEGAWA u. USUI (1975) sowie HIRONAGA et al.
(1980) die M. canis Stämme jedoch prinzipiell sexuell vermehren. Somit sind sie zur meiotischen Rekombination befähigt, die wiederum zu einer höheren Biodiversitat innerhalb der Art führen sollte, obwohl der (+)-Matingtyp von A. otae bisher nur in Japan gefunden wurde (HASEGAWA u. USUI 1975, HIRONAGA et al. 1980).
In Untersuchungen von GRÄSER et al. (2000) wurde neben der Analyse der ITS-Sequenzen für die Klärung phylogenetischer Zusammenhänge zwischen den Spezies des M. canis- Komplexes die RAPD-PCR und die AFLP-Analyse (amplified fragment length
polymorphism) einbezogen. Die Ergebnisse zeigen, daß die (+)- und (-)-Kreuzungstypen von A. otae mit diesen Methoden unterschieden werden können.
In weiteren Versuchen, die mit Hilfe der Mikrosatelliten-Analyse durchgeführt wurden, wird bestätigt, daß eine genotypische Differenzierung von M. canis-Isolaten möglich ist (GRÄSER, pers. Mitteilung vom 15. Dezember 1999). Bei dieser Methode werden hochrepetitive Sequenzmotive wie (AC)n, (GTG)n oder (GACA)n nachgewiesen, die im Genom von Eukaryonten und Prokaryonten tandemartig angeordnet und weit verbreitet sind (GRÄSER, pers. Mitteilung vom 15. Dezember 1999).
2.12 Genotypische Differenzierung von M. canis und M. equinum
Da hinsichtlich der Differenzierung von M. canis und M. equinum verschiedene Ergebnisse vorliegen, soll der Frage, ob es sich bei den beiden um die gleiche Art handelt, hier erneut nachgegangen werden (TUCKER und NOBLE 1991, GRÄSER et al. 1999).
DOWDING und ORR (1939) entdeckten einen M. canis-Stamm mit Makrokonidien, die ähnlich klein waren wie die von M. equinum. Aufgrund dieser geringen Größenunterschiede ihrer Makrokonidien bezeichneten sie M. canis und M. equinum als Synonyma.
Auch bei der Untersuchung der isoelektrischen Fokussierung der Kulturfiltrate von M. canis und M. equinum konnten keine Unterschiede in den Proteinmustern gefunden werden (JEFFRIES et al. 1984).
Von TUCKER und NOBLE wurde 1991 eine elektrophoretische Auftrennung der Kulturüberstände von verschiedenen Microsporum-Arten einschließlich M. canis und M.
equi-num vorgenommen. Ihr Ziel war eine Unterscheidung der einzelnen Microsporum-Arten und deren Stämme. Eine Trennung der Proteinmuster von M. canis und M. equinum war jedoch nur schwer möglich (TUCKER u. NOBLE 1991).
Die genanalytischen Untersuchungen zur Differenzierung von M. canis und M. equinum hatten verschiedene Ergebnisse:
Von KANO et al. (1998a) wurde eine Unterscheidung von 18 Microsporum-Arten mit Hilfe der RAPD-PCR und der Southern Hybridization durchgeführt. Die beiden zu untersuchenden
A. otae-(+) und (-)-Kreuzungstypen, die beiden klinischen M. equinum- Stämme und die zwei M. ferrugineum-Stämme besaßen zwar verschiedene RAPD-Muster, aber sie zeigten Fragmente der gleichen Größe in der Southern Hybridisierungsanalyse (KANO et al. 1998a).
Bei Untersuchungen der ITS-Region verschiedener Dermatophyten zur Überprüfung der Taxonomie durch GRÄSER et al. (1999a) zeigte sich eine sehr enge Verwandtschaft von M. canis und M. equinum.
Dagegen kamen SEELIGER u. HEYMER (1981) in ihren Untersuchungen zu der Ansicht, daß M. equinum und M. canis zwei verschiedene Arten sind: M. canis bildete auf SABOURAUD-Glucose-Agar mehr gelbes Pigment auf der Kolonieunterseite als M.
equinum. Die Makrokonidien wurden bei M. equinum als etwas kleiner beschrieben. Im Gegensatz zu M. equinum-Isolaten reagierten A. otae-Stämme positiv im Haarperforationstest. Die von ihnen durchgeführten Kreuzungsversuche verliefen negativ (SEELIGER u. HEYMER 1981).
Nach der Entdeckung von A. otae durch HASEGAWA und USUI (1975) konnten PADHYE et al. (1979), TAKATORI und HASEGAWA (1985) sowie AHO (1987) durch Kreuzungsversuche an M. canis und M. equnum feststellen, daß eine Kreuzung der beiden nicht möglich war, und zogen daraus den Schluß, daß es sich um zwei verschiedene Spezies handelt.
3 Material und Methoden
3.1 Material
3.1.1 Herkunft der untersuchten Stämme
Die in dieser Arbeit eingesetzten 40 M. canis-Isolate wurden von 200 zur Verfügung stehenden Isolaten von Hunden und Katzen unterschiedlicher Rassen und geographischer Her-kunft in Deutschland ausgewählt. Bei den felinen Isolaten gibt es eine Unterteilung in die Herkunft aus Tierheimen und -kliniken, Rassezuchten und Einzeltierhaltung.
Diese M. canis-Stämme wurden im Rahmen der Routine-Diagnostik des Instituts für Mikrobiologie und Tierseuchen und von Prof. Böhm aus dem zur mikrobiologischen Untersuchung eingesandten Probematerial sowie innerhalb verschiedener Dissertationsvorhaben in den Jahren 1996 bis 2000 isoliert.
Weiterhin standen 20 M. equinum-Isolate von Pferden zur Verfügung, die ebenfalls im Rahmen der o. g. Diagnostik gesammelt wurden.
Die ausgewählten Isolate sind in Tab. 1 aufgelistet.
Tab. 1: Herkunft und Bezeichnung der untersuchten M. canis- und M. equinum-Stämme M. canis-Stämme von Katzen und Hunden:
Bezeichnungen Tierart/-rasse Jahr Herkunftsort
Isolate aus der Institutsdiagnostik/ Einzeltierhaltungen
K 948 EKH 1996 Hamburg
K 961 EKH 1996 Eutin
Isolate von Patienten aus der Kleintierklinik/ TiHo Hannover
H 138 Exotic Short 1997 Hameln
H 279 Siam 1997 Hannover
Isolate aus Katzenzuchten
R 098 Perser 1997 Hannover
Isolate aus Tierheimen
T 033 EHK 1997 Hildesheim
T 066 EHK 1997 Braunschweig
T 134 EHK 1997 Neuenkirchen (Westf.)
T 169 EHK 1997 Peine
T 205 EHK 1997 Ahaus (Westf.)
T 287 EHK 1997 Drakenburg (Nienburg)
Isolate aus der Institutsdiagnostik/ Einzeltierhaltungen Katze
K 1514 EKH 1998 Metzingen
K1537 EKH 1998 Bürstedt
K 54 Perser 1999 Bünde
K 248 EKH 1999 Celle
K 304 Perser 1999 Wuppertal
K 364 Karthäuser 1999 Hamburg
K 370 Ragdoll 1999 Metzingen
K 496 Siam 1999 Duisburg
K 1174 Afrik. KH 1999 Berlin
E 527 EKH 1999 Göttingen-Gleichen
E 815 EKH 1999 Düsseldorf
E 1599 EKH 1999 Hannover
Hund
K 857 Hund 1999 Bottrop
K 1083 Hund 1999 Hamburg
K 1087 Hund 1999 Zeven
K 1230 Hund 1999 Husum
E 841 Hund 1999 Osnabrück-Belm
E 1440 Hund 1999 Reinfeld-Holstein
Isolate aus den von ASEMISSEN (2001) untersuchten Katzenzuchten
B 1/2.2 EKH 1999 Tierheim BadSalzuflen
B 2/2.1 EKH 1999 Köln
B 2/4.1 EKH 1999 Köln
B 3/2.1 Maine Coon 1999 Köln
B14/3.1 Perser 1999 Radolfzell
B44/5 Perser 1999 Gelsenkirchen
Isolate aus der Institutsdiagnostik/ Einzeltierhaltungen
K 172 EKH 2000 Duisburg-Homburg
K 279 EKH 2000 Einbeck
K 604 EKH 2000 Uthlede
K 917 Siam 2000 Lohfelden/ Kassel
K 971 EKH 2000 Lohfelden/ Kassel
M. equinum-Stämme von Pferden
K 486 1984 Remscheid
K 51 1984 Paderborn
K 1456 1984 Mechernich
E 902 1984 Hannover
E 979 1996 Hannover
E 1221 1996 Hannover
E 1745 1996 Bamberg
K 887 1996 Ritterhude
K 980 1996 Hamburg
K 1025 1996 Vierhöfen
E 1337 1998 Büren
E 1338 1998 Büren
E 589 1999 Ebstorf
E 590 1999 Uthlede
K 844 1999 Heiligenhaus
K 925 1999 Heiligenhaus
K 1100 1999 Bremerhaven
K 1116 1999 Vierhöfen
K 1151 1999 Heiligenhaus
62623 2000 Coppenbrügge
3.1.2 Typ- und Referenzstämme
Als Referenz wurden mir freundlicherweise die M. canis-Stämme Nr. 24 und Nr. 6 sowie der A. otae-(+)-Kreuzungstyp Nr. 51 und der A. otae-(-)-Kreuzungstyp Nr. 52 von Frau Dr.
Gräser aus dem Institut für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene (Charité) der Humboldt-Universität Berlin überlassen.
3.1.3 Aufbereitung der Isolate
Aus den untersuchten Stämmen wurden Lyophilisate hergestellt. Dafür wurde jeder Stamm auf vier Actidion-Platten bei 30° C für etwa eine Woche bebrütet. Die Pilzkultur wurde dann mit etwa 3 ml “Kälberserum mit 6 % Glucose” überschwemmt und mit einem sterilen Glasspatel abgeschwemmt. Etwa 1-1,5 ml dieser Lösung wurden danach von der Platte in ein steriles kleines Injektionsfläschchen aus Glas, ein sog. Penicillinfläschchen gegeben, bei - 20°C eingefroren und bei -70°C bis zur Lyophilisation aufbewahrt.
Bei Bedarf wurden die Isolate bei Raumtemperatur durch Zugabe von 1 ml Nährbouillon aufgetaut und erneut auf einer Actidion-Platte angezüchtet.
3.1.4 Mykologische Untersuchung
3.1.4.1 Fluoreszenzmikroskopische Untersuchung
Im Rahmen der mykologischen Routinediagnostik des hiesigen Institutes wurden einige Haare und Schuppen des Probenmaterials mit einer Blankophor-Lösung auf einem Objektträger mit Deckgläschen inkubiert und für etwa 12 Stunden in einer feuchten Kammer zum Schutz vor dem Austrocknen aufbewahrt. Das Präparat wurde mit einem Fluoreszenzmikroskop unter UV-Lichtanregung (340-380 nm) bei 100 bzw. 400-facher Vergrößerung untersucht. Die Pilzelemente stellen sich durch eine hellblaue Fluoreszenz dar, die durch die Bindung des Blankophors an das Chitin der Dermatophyten zustande kommt.
3.1.4.2 Kulturelle Untersuchung
Die kulturelle Untersuchung der Isolate wurde im Rahmen der mykologischen Routinediagnostik des hiesigen Instituts durchgeführt. Ein Teil des Hautgeschabsels wurde in einem kleinen Fläschchen mit 4 ml Würzebouillon und 4 Glasperlen etwa 20 Minuten geschüttelt. Das Material aus der Würzebouillon wurde nun auf einer Hamburger-Testagar- Platte ausgestrichen. Die Haare und Schuppen wurden direkt auf eine Actidion-Platte gelegt, und eine weitere Actidion-Platte wurde mit 4 Tropfen der Bouillon versetzt. Die Bebrütung der Nährböden wurde bei 30°C über die Dauer von 7 Tagen durchgeführt.
3.1.5 Differenzierung der Dermatophyten
Die mykologische Differenzierung geschah aufgrund der makro- und mikroskopischen Merkmale der Kultur.
Bei der Kulturmorphologie waren von Bedeutung die Wachstumsgeschwindigkeit, Größe, Form und Oberflächenbeschaffenheit der Kolonien, Pigmentbildung auf Oberfläche und Rückseite der Kolonien und die Diffusibilität des Pigmentes.
Bei der mikroskopischen Prüfung des Koloniematerials war vor allem auf das Vorhandensein von Makro- und Mikrokonidien, auf die Form, Art der Verzweigung und sonstige Besonderheiten von Hyphen sowie auf das Vorliegen von Chlamydosporen zu achten. Hierfür wurde ein Laktophenol-Wasserblau-gefärbtes Tesafilmpräparat hergestellt.
3.2 Methoden
3.2.1 Isolierung und Anzucht von M. canis und M. equinum
Nach Isolierung der Hautpilze aus dem eingesandten Hautgeschabsel auf einer Hamburger- Testagar-Platte und zwei Actidionplatten (Abschnitt 3.1.4) wurde eine weitere Actidionplatte an 5 Stellen mit einem mykologischen Haken beimpft und bei 30°C für sieben Tage bebrütet.
Die einzelnen Kolonien standen dann für die nachfolgende DNA-Präparation zur Verfügung.
3.2.2 DNA-Präparation von Dermatophyten (mod. nach Gräser 1998)
Die DNA-Präparation wurde nach der Methode von GRÄSER et al. (1999) (siehe Abb. 1) durchgeführt und später in einigen Schritten modifiziert. Dieses abgewandelte Verfahren wurde wie im folgenden beschrieben angewandt:
Eine Pilzkolonie mit einem Durchmesser von 0,5-1 cm wurde mit einem sterilen Skalpell von der Actidionplatte abgenommen und in einem bei -20°C tiefgekühlten Mörser mit flüssigem Stickstoff zerrieben. Das entstandene Pulver wurde in ein 2 ml- Eppendorffhütchen (EDH) gegeben, mit 1ml CTAB-Puffer (s. Anlage) versetzt und anschließend gemischt. Dann folgte ein dreimal zu wiederholender Wechsel zwischen dem Verbringen in flüssigen Stickstoff und Tauen im Wasserbad bei 80°C, um den Zellverband zu lösen und einen Zellaufschluß zu erreichen. Nach 10-minütigem Zentrifugieren bei 13000 g wurde der Überstand in ein neues EDH überführt, 6 µl Proteinase K (20 mg/ml) und 60 µl SDS-Lösung (10% (w/v)) zum Zwecke der Eiweißdenaturierung hinzugefügt und für 4 Stunden im 55°C-Wasserbad inkubiert. Nach Beginn der Zellyse wurde beim Mischen oder Pipettieren sehr vorsichtig und teilweise mit abgeschnittener Spitze vorgegangen, um die Degradation der DNA durch Scherkräfte zu minimieren.
Nach Zentrifugation für 15 Minuten bei 7000 g erfolgte eine Extraktion mit 1 ml einer Mischung aus Phenol: Chloroform: Isoamylalkohol (25:24:1), die der Lösung zugesetzt wurde.
100 mg Pilzmaterial im tiefgekühlten Mörser mit flüssigem Stickstoff zerreiben
Zugabe von 1ml CTAB-Puffer
3-4 x abwechselndes Frieren in flüssigem N2 und Tauen im Wasserbad
10 Minuten Zentrifugation bei 13000 g Abnehmen des Überstandes
Zugabe von 1 mg Proteinase K 90 Min. Inkubation bei 60°C im Wasserbad
5 Min. Zentrifugation bei 13000 g
Phenol-Chloroform-Extraktion (siehe 3.2.2)
Zugabe von 100 µl Natriumacetat-Lsg. (4 mM) und 1 ml Isopropanol Lagerung bei –20°C über Nacht
25 Min. Zentrifugation bei 13000 g Zugabe von 1 ml Ethanol (70%)
10 Min. Zentrifugation bei 13000 g
DNA-Pellet lufttrocknen, in 250 µl A. bidest. Resuspendieren
Abb. 1: Fließdiagramm der DNA-Präparation nach GRÄSER et al. (1998)
Anschließend wurde eine Zentrifugation für 5 Minuten bei 13000 g durchgeführt, um eine Phasentrennung zu bewirken. Die obere, wäßrige, DNA-enthaltende Phase wurde vorsichtig abgenommen. Die untere, organische Phase, die die denaturierten Proteine und die Lipide enthielt, und die dazwischenliegende Interphase, in der sich auch denaturierte Proteine befanden, wurde hingegen verworfen. Dieser Vorgang wurde nun dreimal wiederholt, bis keine Interphase mehr zu sehen war. Die letzte Extraktion wurde mit 500 µl reinem Chloroform durchgeführt. Da Phenol gleichzeitig Wasserstoffbrücken bilden und hydrophobe Wechselwirkungen mit Aminosäure-Seitenketten eingehen kann, dissoziiert es Protein- Nucleinsäure-Komplexe in ihre Komponenten. Die freigewordenen Proteine werden denaturiert und reichern sich in der Phenolphase an. Chloroform dient dazu, Proteine zu denaturieren, das restliche Phenol aus der Nucleinsäurephase zu entfernen und die Phasentrennung zu erleichtern. Isoamylalkohol hat die Aufgabe, das Schäumen und die Ausbildung einer intensiven Interphase zu verhindern.
Der von Proteinen gereinigte Überstand wurde mit 100 µl Natriumacetat-Lösung (4 mM) und 1 ml eiskaltem Isopropanol versetzt und bei -20°C über Nacht inkubiert.
Die DNA-Lösung wurde am nächsten Tag 30 Minuten lang bei 12000 g zentrifugiert und das Pellet mit 1 ml 70%igem Ethanol gewaschen, um störende Salze zu entfernen. Schließlich fand die Lufttrocknung bei Raumtemperatur bzw. bei 40°C und danach die Resuspendierung des Pellets in 250 µl A. bidest statt.
3.2.3 Gelelektrophorese der chromosomalen DNA
Um die vorliegende DNA-Lösung auf das Vorhandensein von DNA zu prüfen, wurde eine Gelelektrophorese für 1 h bei 100 mV durchgeführt. Hierbei wurden 10 µl der Probe auf ein 0,8 %iges Agarose-Gel aufgetragen und durch Ethidiumbromid-Färbung (0,2 µg/ ml) auf einem UV-Tisch sichtbar gemacht und mit Hilfe des Computerprogramms Bio-Rad Multi- AnalystTM/PCVersion 1.1 dokumentiert.
