M. equinum-Stämme von Pferden
5.6 Schlußfolgerung und Ausblick
Obwohl von Methoden wie der RAPD-PCR bekannt ist, daß sie sowohl inter- als auch intraspezifische DNA-Polymorphismen bei Pilzen widerspiegeln können, konnten allgemein bei Differenzierungsversuchen von Hautpilzen nur wenige Intraspezies-Unterschiede festgestellt werden (LIU et al.1997, KANO et al. 1998, GRÄSER et al. 1998). In einer Untersuchung von GRÄSER et al. (1997), die ebenfalls mit der hier angewandten RAPD-PCR-Methode und den gleichen Primern durchgeführt wurde, konnten vier von sechs Varianten von T. menta-grophytes durch ihr Bandenmuster unterschieden werden (vgl. Kap.
2.11). LIU et al. (1996) und GRÄSER et al. (1999) konnten teilweise Intraspezies-Unterschiede innerhalb von Trichophyton-Arten entdecken (vgl. Kap. 2.11). Diese Ergebnisse zeigen, daß die tier- und human-assoziierten Dermatophyten-Spezies sehr eng verwandt sind und eine Differenzierung in den meisten Fällen nur auf Speziesebene möglich ist (LIU et al.
1996,1997, KANO et al. 1998a,b, GRÄSER et al. 1998,1999). Die Erklärung liegt wahrscheinlich in der primär klonalen Reproduktion solcher Arten, die oft mit dem Verlust ihrer teleomorphen Form einhergeht (HASEGAWA u. USUI 1975, WEITZMAN u.
PADHYE 1978).
Im Gegensatz dazu können sich M. canis-Stämme jedoch prinzipiell sexuell vermehren und sind somit zur meiotischen Rekombination befähigt, die wiederum zu einer höheren Biodiversität innerhalb der Art führen sollte (HASEGAWA u. USUI 1975, WEITZMAN u.
PADHYE 1978).
GRÄSER et al. (1998) entdeckten mit der RAPD-PCR auch ein klinisches M. canis-Isolat, dessen PCR-Profil zwar Ähnlichkeit mit dem des M. canis-Referenzstamms hatte, jedoch nicht mit ihm identisch war. In Untersuchungen von GRÄSER et al. (2000) wurden neben der Analyse der ITS-Sequenzen für die Klärung phylogenetischer Zusammenhänge zwischen den Spezies des M. canis-Komplexes auch die RAPD-PCR und die AFLP-Analyse (amplified fragment length polymorphism) einbezogen (vgl. 2.11). In diesen Versuchen zeigte sich auch, daß die (+)- und (-)-Kreuzungstypen von A. otae mit diesen Methoden unterschieden werden können. In der Tatsache, daß die vorgenommene Differenzierung mit der RAPD-PCR möglich ist, liegt auch die Motivation für die Verwendung dieser Methode mit dem gleichen PCR-Protokoll und den gleichen Primern in der vorliegenden Arbeit.
Zudem wurde in den bisherigen Differenzierungsversuchen mit höchstens sechs M. canis-Isolaten eine zu geringe Anzahl von Stämmen untersucht. Daher sollten in der vorliegenden Arbeit 40 M. canis-Isolate und im Falle hoher Diskriminierungsfähigkeit die 200 im hiesigen Institut zur Verfügung stehenden M. canis-Isolate genanalytisch miteinander verglichen werden. Die einzige Studie, in der eine größere Anzahl von Stämmen, 54 M. canis-Isolate von Menschen, Katzen und Hunden aus Neuseeland, untersucht wurde, war die Analyse von Isoenzymen von SIMPANYA et al. (1998).
Nach den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit kann jedoch gesagt werden, daß die Differenzierung von M. canis-Stämmen mit der hier angewandten RAPD-PCR und den verwendeten Primern nicht möglich ist. Die Untersuchung von 40 Isolaten aus verschiedenen Jahren, verschiedenen Alters der Kultur und unterschiedlicher Herkunft ergab damit das gleiche Ergebnis wie die Untersuchungen und KANO et al. (1998). von GRÄSER et al.
(1998, 2000). Aufgrund dessen besteht auch bei M. canis eine hohe Wahrscheinlichkeit der vorwiegend klonalen Vermehrung und des daraus folgenden identischen Genoms. Wie bei HASEGAWA u. USUI (1975) und WEITZMAN u. PADHYE (1978) beschrieben, produziert die Mehrheit der Stämme vermutlich nur den (-)-Matingtyp von A. otae, während der (+)-Matingtyp auf bestimmte Regionen Japans beschränkt ist. WEITZMAN u. PADHYE (1978) schlagen als drei mögliche Erklärungen für diese ungleiche Verteilung der Matingtypen Selektivfaktoren, Pathogenitätsfaktoren und die geographische Ausbreitung vor. HIRONAGA et al. (1980) halten die dritte Möglichkeit der räumlichen Verteilung für die wahrscheinlichste. Ihrer Ansicht nach haben die variierenden epidemiologischen Faktoren, die während der weltweiten Ausbreitung dieses vom Tier abhängigen Pilzes auf ihn eingewirkt haben, vermutlich diese ungleiche Verteilung der Kreuzungspartner von A. otae und anderer zoophiler Dermatophyten verursacht. Die Autoren deuten an, daß die Geschwindigkeit, Größe und die geographische Streuung der wandernden Tierpopulationen sowie die Häufigkeit des Kontaktes zwischen den diesen Tierengruppen und deren Überlebensfähigkeit eine Rolle spielt (HIRONAGA et al. 1980) (vgl. Kap.2.1).
In Untersuchungen von GRÄSER et al. (2000) mit der RAPD-PCR, der AFLP-Analyse und der Sequenzierung der ITS-Region wurde außerdem festgestellt, daß innerhalb des gesamten Microsporum-Komplexes sehr enge Verwandtschaftsverhältnisse bestehen. Diese Ergebnisse zeigten, daß etliche Dermatophytenspezies konspezifisch sind, d.h. zu einer Art
zusammengefaßt werden können. So sollten nach GRÄSER et al. (2000) die 7 Spezies des M. canis-Komplexes nach Einteilung in drei Gruppen auf die ursprünglichen Arten M. canis, M. audouinii und M. ferrugineum reduziert werden und die übrigen Arten als Synonym verwendet werden. Diese Erkenntnis steht im Gegensatz zu der Suche nach weitestgehender Differenzierung der einzelnen M. canis-Stämme (GRÄSER 2000).
In der Untersuchung der Sequenzanalyse der ribosomalen ITS-Region von GRÄSER et al.
(1999) ergaben sich entsprechend zu den drei o. g. Arten drei Verwandtschaftsgruppen, wobei die (+)- und (-)-Kreuzungspartner in verschiedenen Gruppen zu finden waren. Während in die Gruppe A die zoophilen Arten M. canis, M. distortum und M. equinum zusammen mit dem (-)-Matingtyp von A. otae eingeteilt wurden, enthielt die Gruppe B die dem (+)-Matingtyp von A. otae am nähesten stehenden Arten M. audouinii, M. langeronii und M. rivalieri. Auf der Basis der ITS-Sequenzen gehören die in der Gruppe C enthaltenen M. ferrugineum-Stämme und die Arten um M. audouinii (Gruppe B) jedoch zu der gleichen biologischen Art wie A. otae, denn die Verwandtschaftsunterschiede zwischen den Gruppen sind genauso oder kleiner als zwischen den beiden Matingtypen von A. otae.
Mit dem im Rahmen dieser Untersuchungen von GRÄSER et al. (2000) durchgeführten RAPD-PCR-Versuch und der AFLP-Analyse konnten die gleichen Verwandtschaftsgruppen gebildet werden wie in der ITS-Sequenz-Analyse. Der in der oben genannten Textstelle beschriebene Vorschlag der Verwendung von M. equinum als Synonym von M. canis steht aufgrund der geringen genetischen Unterschiede auch im Einverständnis mit dem Ergebnis der vorliegenden Arbeit, in der die beiden Arten mit der RAPD-PCR nicht differenziert werden können. Bei den beiden letztgenannten Methoden stand jedoch der (+)-Matingtyp von A. otae den Arten der M. canis-Gruppe (Gruppe A) verwandtschaftlich am nähesten (GRÄSER et al. 1998). Deshalb kann die Zuordnung des (+)-Kreuzungspartners von A. otae noch nicht sicher erfolgen. Da sich allerdings auch in diesen beiden Verfahren seine enge Verwandtschaft zu allen drei Gruppen zeigt, stellt sich die Frage, ob dem Teleomorph A. otae neben M. canis auch M. audouinii und M. ferrugineum zugeordnet werden sollten (GRÄSER et al. 2000). Ob es sich bei M. canis, M. audouinii und M. ferrugineum um ein und dieselbe, um verschiedene Arten oder um Subpopulationen von A. otae handelt, kann jedoch nur durch eine aufwendige Analyse ihres Reproduktionsmodus geklärt werden.
Eine in der phylogenetischen Forschung der Dermatophyten weiterführende Methode wäre die Mikrosatelliten-Analyse. Nach Untersuchungen von GRÄSER (pers. Mitteilung, vom 15.
Dezember 1999) ist mit ihrer Hilfe die genotypische Differenzierung von M. canis-Isolaten möglich. Mit diesem Verfahren werden tandemartig angeordnete „Repeats“ wie (AC)n, (GTG)n oder (GACA)n, die genomweit vorkommen, detektiert und zur Stammdifferenzierung herangezogen. Da erstens DNA-Mengen im µg-Bereich gebraucht werden und zweitens nach erfolgter Restriktion und Auftrennung der Genomfragmente im Agarosegel eine Hybridisierung mit den entsprechenden Mikrosatellitensonden durchgeführt werden muß, ist sie viel zeit- und materialaufwendiger als die RAPD-PCR. Daher eignet sie sich nicht für die routinemäßige Diagnostik im Labor, hingegen jedoch für phylogenetische Untersuchungen innerhalb der Dermatophytenarten. In der hier vorliegenden Arbeit könnte sie eine Hilfe bei der phylogenetischen Einteilung der Stämme sein. Nach NEWTON u. GRAHAM (1994) verspricht diese Methode eine höhere Diskriminierungsfähigkeit als die RAPD-PCR.
Während bei der RAPD-PCR die Regionen zwischen den Mikrosatelliten amplifiziert werden, können bei dieser Methode die Mikrosatelliten direkt nachgewiesen werden (GRÄSER, pers.
Mitteilung vom 15. Dezember 1999).
Sollten sich die Mikrosatelliten tatsächlich als eine geeignete Region für die epidemiologische Typisierung herausstellen, könnte man die flankierenden Bereiche solcher
„Repeats“ sequenzieren. Aus diesen Sequenzen könnten dann wiederum Primer abgeleitet werden, die die o. g. Mikrosatelliten auf direktem Wege amplifizieren können (GRÄSER, pers. Mitteilung vom 15. Dezember 1999).
6 Zusammenfassung
Ziel der vorliegenden Arbeit war die molekularbiologische Differenzierung von M. canis-Stämmen unterschiedlicher geographischer und tierartlicher Herkunft, um epidemiologische Untersuchungen zu ermöglichen. M. canis ist der Erreger der Mikrosporie. Aufgrund seiner Eigenschaft als Zoonoseerreger und der großen Anzahl latent infizierter Katzen stellt er ein großes Infektionsrisiko für Menschen und Tiere dar. Da die konventionelle Taxonomie von Dermatophyten aufgrund fehlender stabiler Merkmale Schwierigkeiten bereitet, wurde die RAPD-PCR als genanalytische Methode zur Differenzierung der M. canis-Isolate verwendet.
Weiterhin wurden 20 M. equinum-Isolate von Pferden eingesetzt, die mit Hilfe dieser Methode von M. canis unterschieden werden sollten. Ob es sich bei den beiden um die gleiche Art handelt, wird von einigen Autoren in Frage gestellt.
Allgemein konnten in Differenzierungsversuchen von Dermatophyten mit RAPD-PCR-Methoden nur wenige intraspezifische Unterschiede nachgewiesen werden, wobei vermutlich die primär klonale Reproduktion dieser Arten ursächlich ist.
Bei M. canis ist erstens jedoch der teleomorphe Kreuzungspartner, Arthroderma otae, vorhanden. Daher hat er prinzipiell die Möglichkeit zur sexuellen Vermehrung und zur meiotischen Rekombination, obwohl der (+)-Matingpartner bisher nur in Japan gefunden wurde. Zweitens ist die RAPD-PCR in der Lage, den (+)- und (-)-Kreuzungspartner von A. otae, der teleomorphen Form von M. canis, zu differenzieren. Drittens wurden in den Differenzierungsversuchen mit der RAPD-PCR bis jetzt höchstens sechs M. canis-Stämme miteinander verglichen, während in der vorliegenden Arbeit 40 Isolate differenziert werden sollten.
Die RAPD-PCR wurde mit den unspezifischen Primern (AC)10, T3B und M13 durchgeführt.
In der anschließenden Elektrophorese konnte mit jedem der drei Primer ein unterschiedliches Bandenmuster von 10-15 reproduzierbaren Banden erzeugt werden. Innerhalb der von einem Primer erzeugten PCR-Profile konnten jedoch zwischen den verschiedenen M. canis-Isolaten keine Unterschiede der Amplifikationsprodukte gefunden werden. Die einzige Ausnahme war die größte sichtbare Bande bei etwa 2 kb, die von dem Primer T3B erzeugt wurde. Diese erschien bei den Isolaten unregelmäßig, was jedoch mit dem Einfluß des PCR-Zyklus und dem ersten Ansetzen des Primers erklärt wurde.
Auch beim Vergleich der PCR-Produkte von M. canis-und M. equinum-Isolaten waren keine Unterschiede zwischen den Bandenmustern dieser beiden Microsporum-Arten erkennbar.
Die in dieser Arbeit durchgeführte RAPD-PCR ist daher mit den hier verwendeten Primern weder zur Stammdifferenzierung von M. canis noch zur Unterscheidung zwischen M. canis und M. equinum in der Lage. Die Begründung liegt wahrscheinlich wie bei den anderen Dermatophyten-Arten in der primär klonalen Reproduktion von M. canis und in dem hohen Verwandtschaftsgrad innerhalb des gesamten M. canis-Komplexes. Das Ziel der vorliegenden Arbeit, mit Hilfe der Stammdifferenzierung epidemiologische Nachforschungen über M.
canis anstellen zu können, konnte mit der RAPD-PCR nicht durchgeführt werden.
Die Mikrosatelliten-Analyse wird aufgrund ihrer höheren Diskriminierungsfähigkeit als Methode angesehen, die für die genotypische Differenzierung der Isolate geeignet ist. Da sie viel kosten- und zeitaufwendiger als die RAPD-PCR ist, ist ihr Einsatz jedoch eher für phylogenetische Untersuchungen an dem Hautpilz als für Routine-Untersuchungen der Isolate geeignet.
7 Summary
ALEXANDRA-SABINE ALPHEIS
Molecular examinations of dermatophytes for the species Microsporum canis and Microsporum equinum
Aim of this thesis was the molecular differentiation of 40 M. canis isolates collected from different species with different geographical origin in order to make epidemiological examinations possible.
M. canis is the causative agent of the ringworm. Due to its property of zoonosis and the great number of latently infected cats it represents a high risk of infection for humans and animals.
The conventional taxonomy of dermatophytes is difficult because of absence of stable characteristics. Therefore RAPD-PCR was applied for the differentiation of the M. canis isolates. Besides 20 M. equinum isolates from horses were applied for the differentiation from M. canis by this method. If they belong to the same species is made uncertain by several authors.
In previous differentiation analysis of dermatophytes by the RAPD-PCR minor intraspecific differences were observed. The reason is probably the primary clonal reproduction of these species.
However, firstly A. otae, the teleomorph form of M. canis is existing. Therefore, sexual propagation and the corresponding meiotic recombination is principally possible, though the plus (+) mating type of A. otae has been found only in Japan. In the second place the RAPD-PCR is useful in the differentiation of the plus (+) and minus (-) type of A. otae. Thirdly in previous differentiation experiments there were used at best six M. canis isolates, whereas in this thesis 40 isolates should be distinguished by the RAPD-PCR.
In the PCR experiment the following oligonucleotides were used as single primers: (AC)10, T3B and M13. By each primer a spezific RAPD-PCR pattern could have been produced for the M. canis isolates consisting of 10 to 15 bands. But there were no visible differences between the PCR profiles of the isolates for none of the primers.The only exception consisted in the largest band of the T3B primer, which appeared irregularly in the PCR profile of the different isolates. This could be explained by the progress of the PCR cycle and the first
annealing of the primers. However, comparing the PCR products of M. canis and M. equinum no differences could be found.
In conclusion, in this attempt RAPD-PCR is neither qualified for the differentiation of M.
canis strains nor for the discrimination of M. canis and M. equinum. The reason is probably the primary clonal breeding of M. canis like the other dermatophyte species . Besides, there is a close inter-relatedness among the members of the Microsporum canis complex.
The aim of the thesis to to examine M. canis epidemiologically by RAPD-PCR could not have been attained.
The analysis of microsatellites is considered as a method able to distinguish the isolates because of its high discriminatory power. Since it requires more time and material than the RAPD-PCR, this method is not qualified for the routine application in laboratory, but for phylogenetic analysis of dermatophytes.
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