Aus der Klinik für Pädiatrische Hämatologie und Onkologie der Medizinischen Hochschule Hannover
Leukämogenes Potential CRISPR-Cas9 induzierter KMT2A-Translokationen in humanen hämatopoetischen
Stammzellen in vitro und in vivo
Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin in der Medizinischen Hochschule Hannover
vorgelegt von
Jana Gellrich, geb. Reimer aus Frunse
Hannover 2019
Angenommen vom Senat der Medizinischen Hochschule Hannover am 25.11.2019
Gedruckt mit Genehmigung der Medizinischen Hochschule Hannover
Präsident: Prof. Dr. med. Michael P. Manns Betreuer/in der Arbeit: PD Dr. rer. nat. Dirk Heckl
1. Referent/in: Prof. Dr. med. Michael Heuser 2. Referent/in: Prof.‘in Dr. med. Gudrun Göhrin g
Tag der mündlichen Prüfung: 25. 11. 2019 Prüfungsausschuss
Vorsitz: Prof. Dr. med. Thomas Werfel
1. Prüfer/in: Prof. Dr. med. Georg Scheumann
2. Prüfer/in: Prof. Dr. med. Torsten Witte
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung ... 3
1.1. Zielsetzung der Arbeit ... 3
1.2. Die Hämatopoese ... 4
1.3. Akute Leukämien ... 4
1.4. Leukämogenese – die 2-Hit-Hypothese zur Transformation ... 6
1.5. Die Rolle der Translokationen in der Leukämogenese ... 7
1.6. KMT2A-Gen ... 8
1.7. MLL-ENL Translokation ... 10
1.8. Werkzeuge zur Genom-Editierung ... 11
1.8.1. CRISPR-Cas9-System zur Modifikation von eukaryoten Zellen (Typ II) ... 12
1.8.2. Anwendung von CRISPR-Cas9 in der Onkologie ... 14
2. Publikation ... 16
3. Diskussion ... 25
3.1. Vektoroptimierung ... 25
3.2. Reziproke Translokation in hämatopoetischen Stammzellen ... 28
3.3. Leukämieentstehung im Mausmodell ... 31
4. Zusammenfassung ... 34
5. Referenzen ... 35
6. Danksagung ... 47
7. Anhang ... 48
7.1. Curriculum vitae ... 48
7.2. Erklärung nach § 2 Abs. 2 Nrn. 6 und 7 ... 49
7.3. Präsentationen aus dieser Arbeit ... 50
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1. Einleitung
1.1. Zielsetzung der Arbeit
Unter Leukämien werden alle malignen Entartungen des Blutes und des blutbildenden Systems zusammengefasst. In der Pädiatrie handelt es sich dabei um die häufigste maligne Erkrankung mit einem Anteil von ca. 30% (Kaatsch, Spix, 2014). Leukämien bei Kindern weisen gehäuft chromosomale Translokationen auf (Zeisig et al., 2012), welche häufig das KMT2A-Gen (MLL1, MLL) auf dem Chromosom 11q23 betreffen und teils mit einer schlechten Prognose assoziiert sind (Wang et al., 2011, Winters, Bernt, 2017). Das KMT2A- Gen besitzt über 60 Translokationspartner (Wang et al., 2011, Meyer et al., 2018), von denen der dritthäufigste Fusionspartner das eleven-nineteen leukemia-Gen (ENL) auf dem Chromosom 19 ist (Winters, Bernt, 2017). Die KMT2A-MLLT1 (MLL-ENL) Translokation ist mit akuten lymphatischen und myeloischen Leukämien assoziiert (Drynan et al., 2005).
Trotz der langen Forschungsgeschichte bleiben die genauen Pathomechanismen der leukämischen Transformation durch MLL-ENL nicht gänzlich verstanden. Um die genauen Mechanismen zu ergründen wurden in der Forschung zahlreiche Mausmodelle entwickelt.
Die jüngste Methode zur Modellierung chromosomaler Translokationen ist das Genom- Editieren (Jinek et al., 2013, Cong et al., 2013, Mali et al., 2013). Ziel dieser Arbeit ist die Erforschung des onkogenen Potentials der MLL-Translokationen in der Pathogenese der akuten Leukämien mit CRISPR-Cas9-induzierten Modellen in vitro und in vivo.
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1.2. Die Hämatopoese
Die Hämatopoese beschreibt die vorwiegend im Knochenmark stattfindende Bildung der Zellen des Blutes. Diese Zellen übernehmen essenzielle Aufgaben, wie Blutgerinnung, Sauerstofftransport und immunologische Funktionen. Die Hämatopoese wirkt dem normalen Blutkörperchenumsatz, der bei einem 70 kg schweren Mann 1 Billion Zellen pro Tag umfasst, entgegen und ist zudem in der Lage sich an besondere Umstände, wie Infektionen, in kürzester Zeit durch Ausdifferenzierung der Stammzellen anzupassen (Ogawa, 1993). Die Hämatopoese ist ein hierarchisch aufgebautes System, an dessen Spitze die multipotente hämatopoetische Stammzelle (HSC) steht (Chao, Seita & Weissman, 2008, Doulatov et al., 2012). Diese Zelle besitzt lebenslange Selbsterneuerungskapazität und kann sich in alle Blutkörperchen differenzieren (Multiliniendifferenzierungspotential), dabei gibt es zwei Differenzierungszweige: die Lympho- und die Myelopoese. Bei der Lymphopoese entstehen Lymphozyten (B-, T-, NK-Zellen). Die Myelopoese ist für die Bildung der Erythrozyten, Granulozyten, Monozyten und Thrombozyten verantwortlich (Mikkola, Orkin, 2006).
1.3. Akute Leukämien
Unter dem Krankheitsbild akuter Leukämien werden maligne Störungen der Hämatopoese, die die lymphatische oder myeloische Zellreihe betreffen, zusammengefasst, in deren Verlauf es durch das übermäßige Wachstum von unreifen Vorläuferzellen (Blasten) zur Verdrängung gesunder Zellen im Knochenmark und im weiteren Verlauf zur Freisetzung dieser aus dem Knochenmark ins Blut kommen kann.
Die Mechanismen der Leukämogenese sind noch nicht abschließend geklärt und ein aktuelles Thema der Forschung. Es wurde herausgefunden, dass bei diesem Prozess in einer hämatopoetischen Stammzelle oder einer Vorläuferzelle mehrere Veränderungen wie Mutationen, Translokationen oder Deletionen auftreten, die einen Differenzierungsblock und klonale Expansion verursachen (Rocquain et al., 2010). Handelt es sich bei den entarteten Zellen der lymphatischen Zellreihe, wird die Leukämie als akute lymphatische Leukämie (ALL) bezeichnet. Sind Zellen der myeloischen Reihe betroffen, wird das Erkrankungsbild als akute myeloische Leukämie (AML) bezeichnet.
Charakteristisch für akute Leukämien ist die unkontrollierte klonale Vermehrung der hämatopoetischen Stammzellen und unreifen Vorläuferzellen im Knochenmark. Dabei
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verlieren sie die Fähigkeit sich in weitere Zelltypen auszudifferenzieren und unterdrücken durch Akkumulation im Knochenmark die Bildung restlicher Zellen, was zu den typischen Symptomen führt (Vardiman, Harris & Brunning, 2002).Die Patienten leiden unter Anämie und Müdigkeit durch fehlende Erythrozyten, unter Fieber und Infektionen durch fehlende Leukozyten und unter Bauchschmerzen und Appetitlosigkeit als Zeichen der Milz- /Lebervergrößerung. 20% leiden unter Hämorrhagien durch fehlende Thrombozyten, Gelenk- und Knochenschmerzen und geschwollene Lymphknoten. Sehr selten (weniger als 10% der Patienten) können Gingivahyperplasie, Hodenvergrößerung, Dyspnoe, Kopfschmerzen, Sehstörungen und Erbrechen als Zeichen des Nervensystembefalls oder bläulich gefärbte Leukämiezellansammlungen in der Haut auftreten. Insgesamt ist das Erscheinungsbild vielfältig, oft unspezifisch und kann sich individuell stark unterscheiden (Brandts, Kim & Serve, 2010, Alvarnas et al., 2015).
Zu den Risikofaktoren, die in der Lage sind genetischen Mutationen zu verursachen, gehören physikalische/chemische Substanzen (z.B. Benzole, Pestizide), radioaktive Strahlung, Chemotherapeutika (z.B. Anthrazykline, Taxane), Viruserkrankungen, genetische Erkrankungen (z.B. Down-, Klinefelter-, Pätau-, Kostmann-Syndrom), hohes Alter und vorherige leukämische Erkrankungen (Sandler, Collman, 1987, Pui, 1995, Aquino, 2002, Deschler, Lubbert, 2006). Bekannt sind über 300 chromosomale Translokationen und andere Mutationen, die mit AML assoziiert sind (Reilly, 2005).
Leukämien gehören zu den häufigsten pädiatrischen malignen Erkrankungen mit einem Anteil von ca. 30% (Linet et al., 1999, Kaatsch, Spix, 2014). Die ALL kommt fünfmal häufiger als die AML vor und ist mit einem Anteil von 60% die häufigste pädiatrische Leukämieform (Pui, 1995, Pui, Robison & Look, 2008). Die zweithäufigste pädiatrische Leukämieform bei Kindern unter 15 Jahren ist die AML mit 15-20% (Aquino, 2002). Bei den Erwachsenen kommt AML mit 25% aller Leukämien am häufigsten vor, hat jedoch die niedrigste 5-Jahres-Überlebensrate (Deschler, Lubbert, 2006, Dohner, Weisdorf &
Bloomfield, 2015). Die durchschnittliche Heilungsrate für die pädiatrische ALL liegt bei 75- 80%, für die pädiatrische AML laut der AML-BFM04-Studie bei 64-76% (Pui et al., 2003, Schweitzer et al., 2015).
Die therapeutischen Behandlungsmöglichkeiten setzten sich aus Chemotherapie, allogener Stammzelltransplantation und zielgerichteter molekularbiologischer Therapie zusammen (Bassan, Hoelzer, 2011). Das Standardtherapieregime einer AML unterteilt sich in die Induktionstherapie (7+3-Schema) mit dem Ziel einer Komplettremission, welche sich aus
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siebentägiger Gabe von Cytarabin und dreitägiger Gabe eines Anthrazyklins zusammensetzt, und in die Konsolidierungstherapie mit dem Ziel der Remissionserhaltung, welche aus einem hochdosierten Cytarabin oder einer allogenen Stammzelltransplantation besteht (Dombret, Gardin, 2016, Rubnitz, 2017). Je nach Vorliegen bestimmter zytogenetischer Merkmale findet eine Anpassung des Therapieschemas statt, da der therapeutische Erfolg von mehreren Faktoren abhängig ist. Hierzu zählen zytogenetische und molekulare Risikofaktoren, wie MLL-Translokationen, klinische und biologische Faktoren, wie Erkrankungsalter, Geschlecht, Rasse (Papaemmanuil et al., 2016). Ein besonderes Augenmerk wird auch auf die supportive Therapie gelegt, die ebenfalls das Outcome durch Vermeidung von chemotherapiebedingten Komplikationen und Infektionen verbessert (Im, 2018). Das Bestreben der Forschung liegt in der Anwendung der sogenannten „personalisierten Medizin“, das heißt, dass der therapeutische Ansatz speziell an jeden Patienten unter Bezugnahme der vorliegenden Risikofaktoren angepasst wird. Hierzu sollten die durchgeführten Behandlungsansätze zur Weiterentwicklung der Therapien evidenzbasiert ausgewertet werden und neue Behandlungsmöglichkeit in Anbetracht neuer zytogenetischer und molekularbiologischer Erkenntnisse entwickelt werden (Inaba, Greaves & Mullighan, 2013, Papaemmanuil et al., 2016). Zum Erreichen dieses Zieles sind experimentelle Karzinommodelle zu entwickeln, mit dessen Hilfe die Leukämien patientenspezifisch analysiert werden können.
1.4. Leukämogenese – die 2-Hit-Hypothese zur Transformation
In der Forschung gibt es zahlreiche Bestrebung mithilfe von Hypothesen eine Vorstellung von der Leukämogenese zu bekommen und die Leukämien in genetische Kategorien einzuteilen. Gilliland und Griffin präsentierten in ihrer Arbeit eine „2-Hit-Hypothese“
(Gilliland, Griffin, 2002). Dieses Modell besagt, dass zur Entstehung einer AML zwei „Hits“
oder Mutationen notwendig sind. Die Grundlage der Theorie bildet die Umwandlung einer hämatopoetischen Stammzelle oder einer hämatopoetischen Vorläuferzelle in eine leukämische Stammzelle (LSC). Hierfür sind die Treibermutationen und die von diesen abhängigen sekundären Mutationen verantwortlich. Diese halten in den leukämischen Stammzellen die Proliferation aufrecht, geben ihnen dadurch einen Überlebensvorteil, oder führen durch den meyloischen Differenzierungsblock zur Erhaltung der Selbsterneuerungskapazität (Dash, Gilliland, 2001) (Abb.1). Es ist ein wichtiger
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mithilfe des Single-Strand Annealing (SSA) bei homologen Sequenz-Wiederholungen auf beiden Seiten des Bruchs oder des Non-homologous end-joining (NHEJ) unabhängig von den Sequenzen miteinander verbunden (Kanaar, Hoeijmakers & van Gent, 1998, Weinstock et al., 2006, Meaburn, Misteli & Soutoglou, 2007).
Chromosomale Translokationen sind in 20% aller Malignome zu finden, dabei wurden 358 Genfusionen festgestellt, die in der Entstehung der Tumoren eine entscheidende Rolle spielen (Mitelman, Johansson & Mertens, 2007). Das bei den chromosomalen Translokationen entstehende Produkt führt zur Aktivierung eines Onkogens, das entweder als Transkriptionsfaktor fungiert, mit anderen Transkriptionsfaktoren interagiert oder die Transkriptionskontrollmechanismen einer Zelle ausschaltet (Rabbitts, 1994, Rowley, 2001, Zeisig et al., 2003). Die Genexpression wird in den meisten Fällen durch eine Störung der Acetylierung/Deacetylierung der Histone und durch Methylierung der Histone sowie der DNA desreguliert (Uribesalgo, Di Croce, 2011). Beispielsweise erhöht die Überexpression der H3K79 Methyltransferase Dot1L das Vorkommen der chromosomalen Translokation TMPRESS2-ETS, die mit Prostatakarzinomen assoziiert ist (Lin et al., 2009).
Viele chromosomale Translokationen sind mit einem speziellen Tumortyp assoziiert, deren Erforschung wichtige Erkenntnisse zur Diagnose, Behandlung und Prognose liefert (Lin, Yang & Rosenfeld, 2012). Das bekannteste Beispiel für die Rolle der Translokationen in der Leukämogenese ist die Entdeckung des Philadelphia-Chromosoms, der Fusion des BCR- Gens auf dem Chromosom 22 und des ABL-Gens auf dem Chromosom 9. Dieses Fusionsprotein aktiviert eine Tyrosinkinase, die zur Entstehung von chronisch myeloischen Leukämien (CML) führt (Kuppers, 2005). Als Erstlinientherapie wurden BCR-ABL spezifische Inhibitoren, wie Imatinib, entwickelt, die signifikant das Outcome der CML- Patienten verbessern (Deininger, Buchdunger & Druker, 2005).
Chromosomale Translokationen, die das KMT2A-Gen betreffen, sind in ungefähr 10% aller Leukämien zu finden und haben meist eine schlechtere Prognose als Leukämien, bei denen dieses Gen nicht betroffen ist (Winters, Bernt, 2017). In dieser Arbeit werden diese Translokationen näher beleuchtet.
1.6. KMT2A-Gen
Das KMT2A-Gen auf dem Chromosom 11q23, auch bekannt als mixed-lineage leukemia 1- Gen (MLL), ALL1, ALL0 oder HRX reguliert die Differenzierung der hämatopoetischen
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H3K79 Histon-Methyltransferase DOT1L aktivieren (Bitoun, Oliver & Davies, 2007). Die direkte Bindung des KMT2A-Gens an DOT1L führt zu einer leukämischen Transformation (Okada et al., 2005). Vielversprechend zeigten sich in präklinischen Studien zur Therapie von Leukämien, bei denen das KMT2A-Gen mutiert ist, DOT1L-Inhibitoren, die aktuell in weiteren klinischen Studien getestet werden (Stein, Tallman, 2015).
Die KMT2A-Fusionsproteine aktivieren unabhängig von dem Fusionspartner die Expression der HOX-Gene und unterdrücken dadurch die Differenzierung der Zelle, die sich folglich leukämisch transformiert (De Braekeleer et al., 2005, Wang et al., 2011) (Abb.2).HOX- Gene haben eine wichtige Rolle in der Organisation und Regulation der Hämatopoese, indem sie ein Gleichgewicht zwischen Proliferation und Differenzierung einstellen. In den hämatopoetischen Stammzellen und Vorläuferzellen sind die HOX-Gene hochreguliert, während sie in der Differenzierung und Reifung der Blutzellen herunterreguliert werden (De Braekeleer et al., 2014). Das KMT2A-Fusionsgen kann als stille Mutation persistieren bis es durch einen bestimmten Differenzierungsschritt aktiviert wird und die Leukämogenese initiiert (De Braekeleer et al., 2005).
Die KMT2A-Fusionsgene sind nicht nur in der Lage hämatopoetische Stammzellen zu transformieren, sondern auch die weiterdifferenzierten gemeinsamen myeloischen Vorläuferzellen (CMP) und die granulozytär-monozytären Vorläuferzellen (GMP) (Cozzio et al., 2003), die ebenfalls zu einem leukämischen Bild führen (Jude et al., 2007).
1.7. MLL-ENL Translokation
Die MLL-ENL-Translokation t(11;19) ist nach MLL-AF9-(t(9;11)) und MLL-AF4- Translokation (t(4;11)) die dritthäufigsten MLL-Fusion (Zeisig et al., 2003, Meyer et al., 2018). t(11;19) ist sowohl mit AML als auch mit ALL assoziiert (Lavau et al., 1997), dabei macht der Anteil der MLL-ENL-Translokation 18% der AML-Fälle und 4% der ALL-Fälle aus (Meyer et al., 2018). Es wurde zudem im xenogenen Mausmodell gezeigt, dass MLL- ENL in den humanen HSC eine B-ALL oder AML induzieren kann (Barabe et al., 2007).
Dabei soll die Ausdifferenzierung in eine Zelllinie von der Mikroumgebung der Zellen abhängig sein (Wei et al., 2008).
Die bekannten essenziellen Gene in der Entstehung der MLL-ENL-Leukämie sind HoxA9 und sein Cofaktor Meis 1 (Zeisig et al., 2004, Wang et al., 2011). Ein Tamoxifen- induzierbares MLL-ENL-Modell ermöglichte die Identifizierung weiterer MLL-ENL-
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Zielgene und deren Einteilung in zwei voneinander unabhängige Gruppen: die erste Gengruppe bindet zusammen mit der H3K79 Histon-Methyltransferase DOT1L am Promotor und führt zur Hochregulierung von Transkriptionsfaktoren (Garcia-Cuellar et al., 2016), was einen Differenzierungsblock zur Folge hat (De Braekeleer et al., 2014). Die zweite Gengruppe bindet zusammen mit dem positive transcription elongation factor (P- TEFb) an der Transkriptions-Terminierungsstelle, was durch die Aktivierung der RNA Polymerase II (Pol II) Proteinsynthese erhöht (Garcia-Cuellar et al., 2016). Diese beiden Gengruppen ermöglichen unterschiedliche pharmakologische Ansatzpunkte zur Therapie der MLL-ENL induzierten Leukämie durch P-TEFb und DOT1L-Inhibitoren (Garcia- Cuellar et al., 2016).
Die Translokation t(11;19) ist ein beliebtes Forschungsobjekt, um die Leukämieentstehung zu verstehen. Dabei bleibt noch unklar, welchen Einfluss sekundäre Mutationen haben. Die Arbeit von Horton et al. zeigt, dass Mäuse mit MLL-ENL-Leukämie durch Entfernung des MLL-ENL Transkripts geheilt werden können (Horton et al., 2009). Dadurch wird eine Möglichkeit eröffnet neue Therapien für MLL-assoziierte Leukämien zu entwickeln. Hierfür sind möglichst realitätsnahe Leukämiemodelle erforderlich.
1.8. Werkzeuge zur Genom-Editierung
Unter Genom-Editierung werden molekularbiologische Techniken zur zielgenauen Veränderung der DNA zusammengefasst. Das Grundprinzip beruht auf dem Einsatz einer Endonuklease, die an einer bestimmten DNA-Sequenz einen Doppelstrangbruch generiert.
Die Bruchstellen werden mithilfe des zelleigenen Reparaturmechanismus, beispielsweise der Nicht-homologen Endverknüpfung (NHEJ) oder homologer Rekombination (HR), zusammengefügt (Hsu, Lander & Zhang, 2014).
Die bekanntesten Systeme sind die Zinkfinger-Nukleasen (ZFN), Transcription Activator- like Effector Nucleases (TALENS) und Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR-Cas9) (Christian et al., 2010, Carroll, 2011, Jinek et al., 2012). ZFN und TALENS bestehen aus künstlichen Proteinen, die die DNA lokusspezifisch erkennen und Doppelstrangbrüche verursachen. CRISPR-Cas9 besteht aus einem natürlichen Protein, das RNA-geleitet die passende Sequenz findet (Jinek et al., 2012).
Allerdings bringen die einzelnen Werkzeuge verschiedene Limitationen mit sich: in der Zinkfinger-Technologie ist die Erkennung der DNA durch einen Zinkfinger nur in
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Nukleotid-Tripletten möglich, da jede Domäne aus drei Zinkfingern besteht, beschränkt sich die Erkennung auf neun Basenpaare (Bibikova et al., 2003). Um die Spezifität der Sequenzerkennung, die erst ab 18 Basenpaaren im humanen Genom gewährleistet ist, wurde der Gebrauch zweier Domänen entwickelt (Liu et al., 1997). Da es zwischen den einzelnen Zinkfingern zu Interaktionen kommen kann, musste erst eine Bibliothek entwickelt werden, die das Gesamtverhalten der Zinkfingerkombinationen beschreibt (Maeder et al., 2008).
Aufgrund der zahlreichen Kombinationen muss vor jeder Anwendung die Spezifität der ZFN-Domäne untersucht werden. Zudem ist es schwierig einige Domänen zu konstruieren (Gaj et al., 2016). Diese Aspekte erschweren die Arbeit mit den ZFNs und machen sie kostspielig.
Anders als ZFN erkennen TALENS jedes einzelne Basenpaar und bringen den Vorteil schneller und einfacher Entwicklung mit sich. Zudem weisen sie erhöhte Affinität zu der DNA und erhöhte Spezifität mit geringerer Toxizität auf (Gaj et al., 2016). Ein Nachteil der TALENs besteht in der Proteinlänge, die das Einschleusen in die Zielzelle erschweren kann.
Eine in der Handhabung einfache und effiziente Methode ist das CRISPR-Cas9-System (Jinek et al., 2013, Hsu et al., 2013, Cong et al., 2013, Mali, Esvelt & Church, 2013), das in der vorliegenden Arbeit verwendet worden ist und im Folgenden beschrieben wird.
1.8.1. CRISPR-Cas9-System zur Modifikation von eukaryoten Zellen (Typ II)
Das CRISPR-Cas9-System ist eine Technologie zur Modifikation des genetischen Materials der Zellen. CRISPR-Cas wurde ursprünglich als bakterieller Immunabwehrmechanismus gegen die Phagen entdeckt, bei dem die Cas9-Endonuklease geleitet von kurzen RNA Abschnitten fremdes Erbgut abbaut (Horvath, Barrangou, 2010, Bhaya, Davison &
Barrangou, 2011).
Abhängig von der Zusammensetzung der Cas-Gene lassen sich die Abwehrmechanismen verschiedener Organismen in mehrere Typen aufteilen, die häufigsten sind Typ I, II und III.
Während Typ I und Typ III homologe Cas-Proteine aufweisen, findet man beim Typ II CRISPR-Cas-System das Cas9 Protein, welches nur in diesem System zu finden ist und mehrere Funktionen wie die Prozessierung des CRISPR Transkripts und die Nukleaseaktivität in sich vereint (Makarova et al., 2011, Deltcheva et al., 2011). Der Streptococcus pyogenes Typ II CRISPR-Lokus wurde adaptiert, um das Genom der eukaryoten Zellen modifizieren zu können. Der CRISPR-Lokus wurde auf ein minimales
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Genomeditierungstools einfache Generierung von Indel-Mutationen, Deletionen, Translokationen (Abb.3) und Insertionen. Um die Genomeditierung zu vereinfachen wurde eine kombinierte crRNA-tracrRNA Chimäre entwickelt, die sogenannte short guide RNA (sgRNA), eine Imitation der natürlichen crRNA-tracRNA-Hybride, bei der die Spacersequenz sehr einfach benutzerdifferenziert ausgetauscht werden kann (Jinek et al., 2012, Mali, Esvelt & Church, 2013, Cong et al., 2013, Hsu et al., 2013).
1.8.2. Anwendung von CRISPR-Cas9 in der Onkologie
In der Forschung gibt es zahlreiche Anwendungsbeispiele für CRISPR-Cas9. In der Onkologie ist es ein sehr beliebtes Modell, um schnell und kostengünstig Genmodifikationen, wie Mutationen (Heckl et al., 2014), Deletionen (Cong et al., 2013), Translokationen und Inversionen sowohl im Bereich der soliden als auch der hämatologischen Tumoren durchzuführen (Choi, Meyerson, 2014).
CRISPR-Cas9 eignet sich dabei zur schnellen Generierung von Mausmodellen, in denen mehrere Gene gleichzeitig genetisch verändert werden können. Heckl et al. beschreibt ein lentiviral-vermitteltes CRISPR-Cas9 Mausmodell einer AML mit bis zu fünf gleichzeitig inaktivierten Tumorsupressorgenen zur Erforschung der gleichzeitig auftretenden Mutationen (Heckl et al., 2014).
Choi et al. zeigte in seiner Arbeit die erfolgreiche Anwendung von CRISPR-Cas9 zur Generierung von Translokationen und Inversionen am Beispiel von lungenkarzinom- spezifischen chromosomalen Aberrationen (Choi, Meyerson, 2014). Blasco et al.
entwickelte ein lentiviral-basiertes CRISPR-Cas9-Mausmodell eines Nicht-kleinzelligen- Lungenkarzinoms mit der endogenen Translokation Eml4-Alk (Blasco et al., 2014).
Chen et al. benutzten eine CRISPR-Cas9 basierte Technik zur sequenzspezifischen Visualisierung von Genen in humanen Zellen, die die Möglichkeit eröffnet, die Chromatinorganisation während eines Zellzyklus oder die Veränderungen der Telomerlängen in vivo zu beobachten (Chen et al., 2013).
Ebenfalls im Bereich der Hämatologie gibt es zahlreiche Anwendungsbeispiele, die das Potenzial von CRISPR-Cas9 zum Ausdruck bringen. Mandal et al. zeigte in seiner Arbeit die erfolgreiche Ausschaltung von Genen in humanen T-Zellen und hämatopoetischen Stammzellen (Mandal et al., 2014). Torres et al. demonstrierte die Generierung der AML
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t(8,21)-Translokation in Zelllinien und humanen hämatopoetischen Stammzellen mithilfe der Nukleofektion (Torres et al., 2014).
Die oben aufgeführten Beispiele bilden nur eine kleine Übersicht über die unterschiedlichen Anwendungsmöglichkeiten. Die CRISPR-Cas9-Technologie stellt aktuell ein wichtiges, häufig angewendetes Werkzeug in der Genomeditierung dar.
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Die Originalpublikation wurde mit Genehmigung des Verlages Haematologica abgedruckt.
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Die Pathogenese der leukämischen Zelltransformationen bleibt trotz der langjährigen Forschungsgeschichte in Ihrer Gesamtheit unzureichend verstanden. Ursächlich für die Entstehung einer Leukämie werden genetische Veränderungen, wie Mutationen, Deletionen, Insertionen und Translokationen angesehen, die letztendlich zur unkontrollierten Zellteilung und Entartung der Blutzellen führen. Chromosomale Translokationen sind in 50% aller hämatologischen Krebserkrankungen zu finden (Mitelman, Johansson & Mertens, 2007).
Insbesondere bei pädiatrischen Leukämien bedarf es weiterer gründlicher Abklärung, um die genaue Rolle der chromosomalen Translokationen in der Pathogenese der Leukämie zu ergründen und therapeutische Optionen zu erschließen.
In dieser Arbeit wurde der Fokus auf die chromosomale Translokation t([11;19]/MLL-ENL) gelegt. Mit Hilfe des CRISPR-Cas9 Systems zur Genom-Editierung konnten wir eine erfolgreiche Generierung der MLL-ENL Translokation erwirken und dessen Rolle in hämatopoetischen Stammzellen in vitro und in vivo erstmals vollständig endogen untersuchen. Die dadurch generierten in vivo Modelle präsentierten leukämische Krankheitsbilder, die auf diese Translokation zurückzuführen sind und das Spektrum der kindlichen Leukämie (AML & ALL) präzise rekapitulieren. Diese Modelle werden in zukünftigen Studien helfen, die Rolle der MLL-Translokationen in der leukämischen Transformation nachzuvollziehen.
3.1 . Vektoroptimierung
In dieser Arbeit wurde ein in früheren Arbeiten (Heckl et al., 2014) beschriebener lentiviraler Vektor verwendet, der eine sgRNA mit der Zielsequenz, die Endonuklease Cas9 und den Marker für das Fluoreszenzprotein eGFP kodiert. Diesem Abschnitt ging ein humaner U6 Promotor voran, dieser wurde zur Optimierung ausgetauscht. Zur Verfügung standen die Promotoren des Rous-Sarkom-Virus (RSV), Zytomegalievirus (CMV) und Simian-Virus 40 (SV40), die als Transkriptionsverstärker in den lymphatischen Zelllinien wirken (Zarrin et al., 1999). Im Einklang mit den Arbeiten von Schambach et al. und Wu et al. zeigte sich auch in dieser Arbeit die Kombination des RSV Promotors mit dem CMV und SV40 am wirksamsten, dadurch wurde die Virusproduktion um das 2-3 fache erhöht (Schambach et al., 2006, Wu, Lu, 2010).
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Zur weiteren Effizienzsteigerung des CRISPR-Cas9-Systems etablierten wir einen „all-in- one-Vektor“, der beide für die Translokation t([11;19]/MLL-ENL) benötigten sgRNAs auf einem Vektor exprimiert. Kabadi et al. präsentiert ein ähnliches lentivirales System mit bis zu vier sgRNAs auf einem Vektor, der mithilfe der Golden Gate Klonierung generiert wurde (Kabadi et al., 2014). Mit diesem System können bis zu vier Zielgene simultan modifiziert werden. Die Golden Gate Klonierung zeichnet sich durch ihre Anwendungsfreundlichkeit und Zeitersparnis aus, dadurch, dass alle sgRNAs in einem Schritt in den Vektor hineinkloniert werden (Kabadi et al., 2014).
Bei der konventionellen Co-Transfektion mit mehreren Vektoren zur Generierung von Translokationen tritt das Problem auf, dass die sgRNAs von mehreren Vektoren unterschiedlich hohe Expressionslevel aufweisen. Dieses könnte zur Folge haben, dass die Wahrscheinlichkeit der gewünschten Translokation durch ungleiche Menge an geschnittener DNA gesenkt wird (Kabadi et al., 2014). Dieser unerwünschte Effekt wird aufgrund von simultaner Modifizierung beider Chromosomen mit gleicher Effizienz durch den „all-in- one-Vektor“ umgangen.
Weitere positive Effekte des kombinierten Einsatzes mehrerer sgRNAs sind die minimierte zytotoxische Wirkung aufgrund der reduzierten zur Transduktion eingesetzten Virusmenge und reduziertes Risiko unerwünschter Mutationen. Durch die Minimierung der zur Transduktion verwendeten DNA-Menge lässt sich die Off-Target-Aktivität (Schneiden an strukturell ähnlichen DNA-Abschnitten außerhalb des gewünschten Lokus) drastisch senken. Dieses bedingt allerdings auch geringere On-Target-Aktivität (Hsu et al., 2013, Fu et al., 2013). Somit ist es notwendig eine Titration durchzuführen, um eine gerade noch für die Transduktion ausreichende Cas9 und sgRNA-DNA-Menge herauszufinden. Es wurde gezeigt, dass die Off-Target-Aktivität auch von der Nukleotidzusammensetzung der sgRNA abhängig ist. Beispielsweise stabilisiere ein hoher CG-Anteil die sgRNA/genomische DNA Hybride (Sugimoto et al., 1995) und mache sie dadurch toleranter gegenüber Mismatches.
Zusätzlich zur Reduktion der zytotoxischen Wirkung und zum Erreichen höherer Infektionsraten wurde die Ultrazentrifugation zur Konzentrierung des Virusüberstandes und Durchflusszytometrie (FACS) zur Anreicherung der transduzierten Zellen eingesetzt. In der Durchflusszytometrie werden die Zellen herausgefiltert, die erfolgreich das lentivirale System integriert haben (Duda et al., 2014).
Neben der in dieser Arbeit verwendeten lentiviralen Transduktion sind alternative Methoden zur Modifikation hämatopoetischer Stammzellen mit dem CRISPR-Cas9 System in der
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Literatur zu finden: Plasmid-DNA-Transfektion (Mandal et al., 2014), Einsatz von chemisch modifizierter RNA zur Steigerung der Indel-Mutationsfrequenzen (Hendel et al., 2015), direkte Elektroporation von RNA-guided engineered nucleases (RGENs)- Ribonucleoproteinen (RNPs) (Kim et al., 2014, Gundry et al., 2016) und Einsatz von transienten retroviral-basierten CRISPR-Cas9-All-in-one Partikel (Knopp et al., 2018).
Der Einsatz der RNPs erwies sich im Vergleich zum lentiviralen System als schnell, da keine Klonierung der lentiviralen Vektoren und Herstellung des Virusüberstandes notwendig sind (Gundry et al., 2016), effizient in der Genomeditierung der Stammzellen mit Erfolgsraten von bis zu 20% und reduzierter Off-Target-Aktivität (Kim et al., 2014). In unserer Arbeit lag der Anteil an erfolgreich modifizierten hämatopoetischen Stammzellen bei 16%, diese wurden mithilfe eines Fluoreszenzprotein-Markers selektiert, diese Möglichkeit ist beim Einsatz der RNPs nicht gegeben. Die absolut gesehen niedrige Genomeditierungsquote führt dazu, dass für die Experimente sehr große Mengen an hämatopoetischen Stammzellen benötigt werden, um letztendlich ausreichend Zellen für weitere Experimente zu gewinnen.
In unserer Arbeit untersuchten wir mithilfe des SURVEYOR Assays (Guschin et al., 2010) die Off-Target-Aktivität der verwendeten sgRNAs, die sowohl bei ENL als auch MLL nicht detektierbar waren. Die sgRNAs wurden nach der höchsten On-Aktivität (Heckl et al., 2014) und geringer vorhergesagter Off-Target Aktivität (Stemmer et al., 2015) selektiert. Hendel et al. optimierten die Indel-Mutationsfrequenzen durch chemische Modifizierung der sgRNA, die dabei erreichten Indel-Mutationsfrequenzen sind mit den Ergebnissen aus unserer Arbeit zu vergleichen (Hendel et al., 2015). Als Nebenwirkung wird aber auch eine gleichzeitige Steigerung der Off-Target-Aktivität beschrieben (Hendel et al., 2015). Um diesen negativen Effekt zu eliminieren, modifizierten Forschungsgruppen das Backbone der sgRNA chemisch an spezifischen Stellen, sodass die Off-Target-Aktivität ohne Veränderung der On-Target-Aktivität gesenkt werden konnte (Ryan et al., 2018).
Trotz der vielen Vorteile des Einsatzes der RNPs sollte man die durch Elektroporation ausgelöste spannungsabhängige Zelltoxizität nicht ausblenden (Mello de Queiroz et al., 2012). Knopp et al. fanden heraus, dass ebenfalls stabile, hohe Expression des Cas9 Enzyms eine zytotoxische Wirkung auf die modifizierten Zellen hat (Knopp et al., 2018). Dieses kann durch den Einsatz von transienten retroviral-basierten CRISPR-Cas9-All-in-one-Partikel oder von Integrase-defizienten lentiviralen Vektoren erreicht werden (Ortinski et al., 2017, Knopp et al., 2018). Persistenz Cas9 exprimierender muriner hämatopoetischer Stammzellen mit neutraler sgRNA nach lentiviraler Transduktion deutet jedoch auf geringe Toxizität des
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lentiviralen Vektorsystems hin, welches als Basis für diese Arbeit gedient hat (Heckl et al., 2014). Die Persistenz humaner hämatopoetischer Stammzellen und Entwicklung leukämischer Klone in dieser Studie scheint das Ergebnis zu unterstützen (Reimer et al., 2017).
Aus der Zusammenschau wird deutlich, dass jede Methode ihre Vor- und Nachteile mit sich bringt. Insgesamt erreicht das lentivirale Modell vergleichbar gute Ergebnisse in der Genomeditierung mit sehr geringen Off-Target-Effekten. Die variablen Transduktionsraten müssten in nachfolgenden Studien optimiert werden. Nicht auszuschließen ist das Risiko der unerwünschten lentiviralen Integration (Dull et al., 1998). Im Vergleich zu den oben beschriebenen Methoden ist das lentivirale CRISPR-Cas9-Konstrukt als gleichwertig anzusehen.
3.2. Reziproke Translokation in hämatopoetischen Stammzellen
Zur Untersuchung von Leukämien mit bestimmten Translokationen wurden Zelllinien entwickelt, die das Translokationsprodukt exprimieren, beispielsweise die humane chronisch myeloische Zelllinie mit dem positiven Philadelphia-Chromosom (Lozzio, Lozzio, 1975) oder die murine akute myeloische Zelllinie mit dem MLL-ENL-Fusionsgen (Ninomiya et al., 2006). Diese Modelle sind wichtig für die Erforschung der Leukämien, doch dabei vernachlässigt man den Entstehungsprozess einer Translokation und die somit fehlenden reziproken Translokationsprodukte und das Wildtyp-Allel beider betroffener Gene, die eine wichtige Bedeutung in der Leukämogenese haben können (Torres, Martin et al. 2014).
Chromosomenaberrationen können erfolgreich mit Genomeditierungstechniken generiert werden, hierzu zählen ZFN (Zinkfinger-Nukleasen) (Carroll, 2011, Miller et al., 2007), TALENs (Transcription Activator-Like Effector Nuclease) (Mussolino et al., 2011, Miller et al., 2011) und CRISPR-Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) (Cong et al., 2013, Jinek et al., 2013). Die Methoden basieren auf zielgenauer Veränderung der DNA durch Einsatz von spezifischen Nukleasen (Wood et al., 2011, Sanjana et al., 2012, Choi, Meyerson, 2014, Feng, Zhang & Huang, 2014, Kabadi et al., 2014, Torres et al., 2014, Piganeau et al., 2016). Das jüngste Genomeditierungswerkzeug CRISPR-Cas9 überzeugt im Vergleich mit ZFN und TALENs durch seine Einfachheit, schnelle Anwendbarkeit und höhere Effizienz mit weniger Off-Target-Effekten (Kabadi et
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al., 2014, Khan, 2019). Bei ZFN und TALENs muss für jedes neue Target ein neues Protein designt werden, was den Prozess aufwendig und kostspielig gestaltet (Khan, 2019). Bei CRISPR-Cas9 hingegen müssen nur 20 Basenpaare entsprechend der Zielsequenz ausgetauscht werden (Jinek et al., 2012).
Die Genomeditierungstechniken ZFN uns TALENs werden bereits im klinischen Umfeld zu Gentherapiezwecken getestet (Tebas et al., 2014, Hotta, 2015), auch der Einsatz von CRISPR-Cas9 in Bereich der Sichelzellanämie und ß-Thalassämie wird in nächster Zukunft folgen (Cornu, Mussolino & Cathomen, 2017, Antoniani et al., 2018).
In unserer Arbeit zeigten wir erstmals, dass mithilfe des „all-in-one-Vektors“ in hämatopoetischen Zellen die Translokation t([11;19]/MLL-ENL) erfolgreich generiert werden kann. Im ersten Schritt transduzierten wir erfolgreich K562-Zellen, die das MLL- ENL-Translokationsprodukt auf der DNA- und der RNA-Ebene erfolgreich exprimierten.
Als Nachweis einer echten reziproken Translokation wurde ebenso das reziproke ENL- MLL-Transkript detektiert. Die Arbeit von Bursen, Schwabe et al. zeigt, dass das reziproke Onkoprotein ebenfalls in der Lage ist, eine Leukämie auszulösen (Bursen et al., 2010). Diese mögliche aktive Rolle in der Leukämiepathogenese sollte in den Modellen berücksichtigt werden, aufgrund dessen sich beispielsweise die retrovirale Genommodifikation weniger eignet, da dabei das reziproke Translokationsprodukt fehlt (Barabe et al., 2007, Chen et al., 2008). In der Literatur findet sich erfolgreiche Generierung von MLL-Translokationen mit dem reziproken Translokationsprodukt in Zelllinien mithilfe der TALENs (Breese et al., 2015, Buechele et al., 2015).
Um den Einfluss der t(11;19) weiter zu untersuchen, transduzierten wir aus der Nabelschnur gewonnene CD34+ hämatopoetische Stammzellen. In Sequenzierungsanalysen konnten wir robuste Expression des MLL-ENL und des reziproken ENL-MLL-Produkts nachweisen. Die Transduktionserfolgsrate lag bei durchschnittlich 16%, ähnliche Ergebnisse lieferte die Arbeitsgruppe um Buechele et al. mit einer durchschnittlichen Erfolgsrate von 15,7%
(Buechele et al., 2015). Dabei lag in unserer Arbeit die Translokationseffizienz bei durchschnittlich 1,6x10-3. Unabhängig von unterschiedlichen Genomeditierungsmethoden bleibt die Translokationsrate sehr gering mit Werten zwischen 1x10-3 und 1x10-5 (Choi, Meyerson, 2014, Torres et al., 2014, Piganeau et al., 2016), diese insuffiziente Zellgenerierung erschwert die Modellierung von Leukämien. Auf der anderen Seite dürfen die Translokationslevel der Translokationsgene nicht übermäßig hoch sein, was der Fall beim Einsatz der retroviralen Genommodifikation mit um das 170-fache erhöhten
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Expressionslevel ist (Chen et al., 2008). Beweisend hierfür ist der sich von den Patientenproben unterscheidende resultierende Zellphänotyp (Barabe et al., 2007).
Die Zellen mit retroviral generierten MLL-Onkogenen weisen eine erhöhte Selbsterneuerungsrate auf und zeichnen sich in der Flüssigkultur durch ein stabiles, permanentes Wachstum aus (Chen et al., 2008). Im Unterschied dazu zeigten die transduzierten Zellen aus unserer Arbeit keine vollständige Transformation in den in vitro Versuchen, da sie sowohl in der Flüssigkultur als auch im Methylzelluloseassay nur transientes Wachstum vorwiesen. Diese Ergebnisse korrelieren mit den aktuellen Arbeiten, in denen mit Hilfe von TALENs eine MLL-Translokation in hämatopoetischen CD34+
Stammzellen generiert wurde (Breese et al., 2015, Buechele et al., 2015). Daraus kann man ableiten, dass MLL-Translokationsprodukte als erster Hit den leukämischen Zellen/hämatopoetischen Stammzellen einen Überlebensvorteil bringen, jedoch diese nicht vollständig transformieren können, was durch weitere Mutationen erreicht werden kann (Montes et al., 2011, Montes et al., 2014, Ugale et al., 2014). Als eine andere Erklärung für das Absterben der MLL-ENL exprimierenden Zellen in den in vitro Versuchsreihen müssen die fehlenden oder falschen Wachstumsbedingungen in Erwägung gezogen werden, da die gleichen Zellen in den Mausmodellen in der Lage waren, sowohl eine ALL als auch eine AML hervorzurufen (Wei et al., 2008). Um diesen Aspekt zu ergründen, müssten Versuchsreihen mit unterschiedlichen Zytokin- und Wachstumsfaktorzusammensetzungen durchgeführt werden, was die Arbeitsgruppe um Schneidawind et al. erfolgreich in ihrer Arbeit zeigen konnten: durch die Wahl der Zytokinzusammensetzung kann ein monoklonales Wachstum und Immortalisierung der genetisch modifizierten hämatopoetischen Stammzellen erreicht werden (Schneidawind et al., 2018). Diese Ansätze könnten in Arbeiten aufbauend auf dieser eingesetzt werden.
Im Einklang mit der Arbeit von Chen et al. zeigten sich in unseren transformierten Zellen die Hochregulation der mit MLL-Translokationen assoziierten Gene Hoxa9, Hoxa10, Meis 1 und PBX3. Diese Gene steigern die Selbsterneuerungskapazität der Zellen und verschaffen diesen einen Überlebensvorteil (Chen et al., 2008). Diese Erkenntnis bestätigt uns, dass sich mit unserem Modell die MLL-Translokationen nachbilden lassen, die sich den naturgetreuen Leukämien annähern. Es ermöglicht uns weitere genetische Analysen durchzuführen, um andere an der Leukämie beteiligten Gene zu untersuchen (Meyer et al., 2013, Meyer et al., 2018).
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3.3. Leukämieentstehung im Mausmodell
Um das Verhalten der zellulären Transformation zu untersuchen, bieten sich in vivo Mausmodelle an. Während bereits über syngene Transplantation muriner Zellen weitreichende Rückschlüsse gezogen werden können (Corral et al., 1996, Drynan et al., 2005), gehören Xenotransplantationssysteme zu den besten präklinischen in vivo-Modellen, um die Biologie humaner Leukämien zu untersuchen (Lapidot, Fajerman & Kollet, 1997, Bonnet, 2017).
Aktuelle Studienlage zeigt, dass das NSG-Xenotransplantationsmodell verbesserte Umweltbedingungen für das Wachstum und die Entwicklung humaner Zellen bietet als die NOD/SCID Mäuse (Ailles et al., 1999, Feuring-Buske et al., 2003, Shultz et al., 2005). Diese Bedingungen wurden in der NSGS-Maus vereint, die transgen humanes IL-3, GM-SCF und SF produziert und das IL-2RG Knockout aufweist (Nicolini et al., 2004, Wunderlich et al., 2010). Zahlreiche Studien zeigen, dass die Entstehung einer ALL oder AML von der Transformation unterschiedlicher Progenitorzellen abhängig ist (Hope, Jin & Dick, 2004, Ugale et al., 2014). Ein Beispiel dafür ist das MLL-AF9 Onkogen, das die granulozytären Progenitorzellen zu HSZ-ähnlichen Zellen mit hohem Selbsterneuerungspotential umwandelt (Krivtsov et al., 2006, Buechele et al., 2015).
Der nächste Schritt in unserer Arbeit war frisch transduzierte CD34+ hämatopoetische Stammzellen in NSGS-Mäuse zu transplantieren. Das Aktenzeichen der Tierversuchsgenehmigung lautet 12-0787. Wir untersuchten in der 25, 26 und 27 Woche drei kranke Mäuse, von denen zwei robuste Vektorexpression und ein monozytäres Blutbild mit ausgeprägter Knochenmark- und Leberinfiltration aufwiesen. Das mangelnde Wissen über die additionalen Mutationen bei der Entstehung einer Leukämie (Andersson et al., 2015) wirft die Vermutung auf, dass die Umweltbedingungen nicht nur den Phänotyp der Leukämie beeinflussen (Wei et al., 2008), sondern auch Auswirkungen auf die Transformationskapazität haben. Dieses wird in unseren Experimenten veranschaulicht: die aus den in vitro Experimenten nicht zur vollen Transformation fähigen Zellen, schaffen es sich erfolgreich in dem Empfängerorganismus einer Maus einzunisten, über einen längeren Zeitraum zu persistieren und im Endeffekt eine monozytische Leukämie zu entwickeln. Eine Erklärung dafür könnte der Mangel an zusätzlichen Signalen in vitro zur Erhaltung einer prä-leukämischen Zelle oder der prolongierte Zeitrahmen für den Erwerb zusätzlicher genetischer Mutationen in vivo sein (Barabe et al., 2007, Wei et al., 2008).
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Andere Arbeitsgruppen, die in NSG-Xenotransplantationsmodellen mithilfe von TALENs den Einfluss der MLL-Translokationen in Leukämien untersuchten, berichten vom Auftreten der Krankheitssymptome nach durchschnittlich 16 Wochen (Buechele et al., 2015) und nach 48 Wochen (Schneidawind et al., 2018). Eine mögliche Erklärung für diese großen Unterschiede ist die Zeitspanne, in der sich die Zellen in der in vitro Kultur befinden, bevor sie transplantiert werden (Schneidawind et al., 2018). Möglicherweise spielen auch die in den Experimenten verwendeten NSGS-Mäuse eine wichtige Rolle, da die Umweltbedingungen sich von Organismus zu Organismus unterscheiden.
Um das maligne Potential unserer in die NSGS-Mäuse transplantierten Zellen zu validieren, führten wir eine sekundäre Transplantation der Zellen, die aus den erkrankten Mäusen gewonnen wurden, durch, indem wir diese in neue NSGS-Mäuse injizierten. Im Sekundärtransplant verkürzte sich die Latenzzeit bis zum Auftreten des leukämischen Krankheitsbildes von 26 Wochen auf 16 Wochen. Ein ähnliches Ergebnis erzielte die Arbeitsgruppe von Schneidawind et al. mit einer Verkürzung der Latenzzeit von 48 auf 28 Wochen (Schneidawind et al., 2018). Eine mögliche Erklärung dafür ist der bereits erwähnte prolongierte Zeitrahmen der transformierten Zellen im Mausorganismus, in dem zusätzliche Mutationen/ Hits entstehen konnten, die den Krankheitsausbruch im zweiten Organismus beschleunigen. Zudem entdeckten wir in der Sekundärmaus mittels Sanger- Bruchpunktanalyse andere Klone als in der Primärmaus, dieses deutet darauf, dass unsere Methode zu ungenau war und zur genaueren Klonanalyse Next-Gen Sequencing angewendet werden sollte (Hayes, Kim, 2015).
Die unterschiedliche Latenzzeit kann aber auch auf die proliferative Kapazität der unterschiedlichen Leukämie-Typen zurückgeführt werden (Pearce et al., 2006). In den aktuellen Studien wird zwischen den sogenannten „Engraftern“ und „Nonengraftern“
unterschieden (Bonnet, 2017), was vom Karyotyp der Zellen und nicht vom Homing, Conditioning oder der Zelldosis abhängig ist (Pearce et al., 2006). Laut der Arbeit von Pearce et al. bestehe ein direkter Zusammenhang zwischen dem Engraftmentpotential und der karyotypisch festgelegten Prognosegruppe: je schlechter die Prognose, desto höher das Engraftment. Somit hätte unser Karyotyp t(11;19) eine intermediäre Prognose und ein intermediäres Engraftment (Pearce et al., 2006). Um diese Hypothese zu validieren, müssten Transplantationsserien verschiedener Translokationen unter gleichen Bedingungen durchgeführt werden, um den Engraftmenterfolg objektiv vergleichen zu können.
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Als nächstes zeigten wir die vom Primärorganismus unabhängige Entwicklung des leukämischen Klons im Sekundärorganismus, was wiederum den wichtigen Einfluss der Umweltbedingungen auf die Mutationen in den Genen verdeutlicht. Der Einsatz der seriellen Transplantation und des NHEJ-Trackings ermöglicht es die klonale Evolution der leukämischen Zellen unter dem Einfluss verschiedener Faktoren, beispielsweise auch Medikamente, in vivo zu erforschen. Wir konnten auch zeigen, dass selbst Zellen aus einem gesunden Primärorganismus im Sekundärorganismus maligne entarten können, in unserem Fall entwickelte sich eine B-ALL. Mögliche Erklärung für diese Entwicklung wäre wiederholt der Umwelteinfluss des neuen Organismus. Zudem behält jede lymphatische Zelle die Fähigkeit bei immunologischer Aktivierung klonal zu expandieren, dadurch steigt statistisch die Wahrscheinlichkeit der leukämischen Transformation bei einem größeren Pool an sich teilungsfähigen Zellen (Rehe et al., 2013). Der Engraftmenterfolg in den Primärmäusen trotz der fehlenden leukämischen Entwicklung konnte durch den Nachweis von MLL-ENL und ENL-MLL Translokationsprodukten bestätigt werden, was beweist, dass die Zellen sich zwar erfolgreich eingepflanzt haben, allerdings weitere Mutationen notwendig sind, um eine Leukämie hervorzurufen. In weiteren Versuchsreihen können zur weiteren Abklärung der additionalen Mutationen größere Kohortenstudien mit umfassenderen Sequenzierungen durchgeführt werden.
Zusammenfassend zeigt unsere Arbeit ein erstmalig durch CRISPR-Cas9 induziertes in vivo Leukämiemodell der MLL-ENL-Translokation. Im Einklang mit aktuellen Studien konnten wir das limitierte Potential der MLL-ENL-Translokation zur vollständigen Transformation in vitro aufzeigen, das durch ein Xenotransplantationsmodell überwunden werden kann. Die genauen Hintergründe hiervon müssten in weiteren Studien untersucht werden. Um die Frage nach zusätzlichen Mutationen beantworten zu können, müssten Genomsequenzierungsstudien durchgeführt werden, um mögliche Zusammenhänge zwischen den Mutationen aufzudecken. Insgesamt haben wir ein solides CRISPR-Cas9 Modell der MLL-ENL-Translokation geschaffen, das der natürlichen Leukämogenese näher kommt und die Möglichkeit zur tiefergehenden Studien ermöglicht.
Unsere Methodik kann ebenfalls zur weiterführenden Generierung anderer Leukämiemodelle, zur detaillierten Analyse homöostatischer Mechanismen und additionalen Mutationen in der leukämischen Transformation eingesetzt werden.
Weiterführend wird auch die Erforschung und Testung der zielgerichteten Krebstherapien ermöglicht.
___________________________________________________________________ Zusammenfassung
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4. Zusammenfassung
Mit einem Anteil von ca. 30% gehören Leukämien zu den häufigsten pädiatrischen malignen Erkrankungen, die trotz der Fortschritte in der Medizin aufgrund des heterogenen Ansprechens auf die Therapeutika weiterhin teilweise mit schlechter Prognose assoziiert sind. Die meisten pädiatrischen Leukämien werden durch chromosomale Translokationen verursacht, die häufig das KMT2A-Gen (MLL) betreffen. Zur Erforschung der Pathomechanismen und Entwicklung patientenindividueller therapeutischer Ansätze bedarf es an möglichst naturgetreuen in vivo Leukämiemodellen. Besonders geeignet sind hierfür Genomeditierungssysteme, wie das CRISPR- Cas9, das schnell, effizient und kostengünstig zielgenaue Veränderungen durchführen kann. Bis dato existieren keine CRISPR-Cas9-induzierten in vivo Modelle zur Erforschung des onkogenen Potentials der MLL-Translokationen in der Pathogenese der akuten Leukämien.
In der vorliegenden Arbeit haben wir ein solches Leukämiemodell mit der CRISPR-Cas9-Methode generiert und dabei den Schwerpunkt auf die MLL-ENL-Translokation gelegt.
Es wurde erfolgreich ein neuartiger „all-in-one“ CRISPR-Cas9 Vektor zur Steigerung der Effizienz und der Senkung der Toxizität entwickelt. Damit konnte die Translokation t([11;19]/MLL-ENL) erfolgreich in hämatopoetischen Stammzellen generiert werden. Die MLL-ENL und die reziproken ENL-MLL-Translokationsprodukte konnten auf der DNA und der RNA-Ebene nachgewiesen werden. Ein transientes Wachstum der Zellen in der Flüssigkultur in vitro deutete erste Phänotypen und Unterschiede zu vorherigen Ansätzen an. Um das Verhalten dieser Zellen in einem lebenden Organismus zu untersuchen, wurden die mit CRISPR-Cas9-modifizierten humanen hämatopoetischen Stammzellen im xenogenen Mausmodell untersucht und es entwickelten sich de novo Leukämien der lymphatischen und myeloischen Reihe. Im Gegensatz zu den in vitro Experimenten persistieren die transformierten hämatopoetischen Stammzellen in den Mäusen über einen langen Zeitraum. Als Erklärung wird der Einfluss der Umwelt sowohl auf den Erkrankungstyp als auch auf die onkogene Transformation angesehen. Um genauere Zusammenhänge und Ursachen für die vollständige Transformation in vivo herauszufinden, werden weitere Versuche mit höheren Kohortenzahlen notwendig sein.
Somit haben wir erstmals ein leukämisches MLL-ENL-Translokationsmodell mit Hilfe des CRISPR- Cas9-Systems etabliert. Die Generierung weiterer Translokationen soll durch das Ergebnis dieser Arbeit erleichtert werden. Mit Hilfe dieser CRISPR-Cas9-Modelle kann auch der Umwelteinfluss weiter untersucht und neue Therapiemöglichkeiten entwickelt und erprobt werden.
_________________________________________________________________________ Referenzen
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5. Referenzen
Ailles, L.E., Gerhard, B., Kawagoe, H. & Hogge, D.E. 1999, "Growth characteristics of acute myelogenous leukemia progenitors that initiate malignant hematopoiesis in nonobese diabetic/severe combined immunodeficient mice", Blood, vol. 94, no. 5, pp. 1761-1772.
Alvarnas, J.C., Brown, P.A., Aoun, P., Ballen, K.K., Barta, S.K., Borate, U., Boyer, M.W., Burke, P.W., Cassaday, R., Castro, J.E., Coccia, P.F., Coutre, S.E., Damon, L.E., DeAngelo, D.J., Douer, D., Frankfurt, O., Greer, J.P., Johnson, R.A., Kantarjian, H.M., Klisovic, R.B., Kupfer, G., Litzow, M., Liu, A., Rao, A.V., Shah, B., Uy, G.L., Wang, E.S., Zelenetz, A.D., Gregory, K. & Smith, C. 2015, "Acute Lymphoblastic Leukemia, Version 2.2015", Journal of the National Comprehensive Cancer Network : JNCCN, vol. 13, no. 10, pp. 1240-1279.
Andersson, A.K., Ma, J., Wang, J., Chen, X., Gedman, A.L., Dang, J., Nakitandwe, J., Holmfeldt, L., Parker, M., Easton, J., Huether, R., Kriwacki, R., Rusch, M., Wu, G., Li, Y., Mulder, H., Raimondi, S., Pounds, S., Kang, G., Shi, L., Becksfort, J., Gupta, P., Payne-Turner, D., Vadodaria, B., Boggs, K., Yergeau, D., Manne, J., Song, G., Edmonson, M., Nagahawatte, P., Wei, L., Cheng, C., Pei, D., Sutton, R., Venn, N.C., Chetcuti, A., Rush, A., Catchpoole, D., Heldrup, J., Fioretos, T., Lu, C., Ding, L., Pui, C.H., Shurtleff, S., Mullighan, C.G., Mardis, E.R., Wilson, R.K., Gruber, T.A., Zhang, J., Downing, J.R. & St. Jude Children's Research Hospital-Washington University Pediatric Cancer Genome Project 2015, "The landscape of somatic mutations in infant MLL-rearranged acute lymphoblastic leukemias", Nature genetics, vol. 47, no. 4, pp. 330-337.
Antoniani, C., Meneghini, V., Lattanzi, A., Felix, T., Romano, O., Magrin, E., Weber, L., Pavani, G., El Hoss, S., Kurita, R., Nakamura, Y., Cradick, T.J., Lundberg, A.S., Porteus, M., Amendola, M., El Nemer, W., Cavazzana, M., Mavilio, F. & Miccio, A. 2018, "Induction of fetal hemoglobin synthesis by CRISPR/Cas9-mediated editing of the human beta-globin locus", Blood, vol. 131, no. 17, pp.
1960-1973.
Aquino, V.M. 2002, "Acute myelogenous leukemia", Current problems in pediatric and adolescent health care, vol. 32, no. 2, pp. 50-58.
Barabe, F., Kennedy, J.A., Hope, K.J. & Dick, J.E. 2007, "Modeling the initiation and progression of human acute leukemia in mice", Science (New York, N.Y.), vol. 316, no. 5824, pp. 600-604.
Barrangou, R., Fremaux, C., Deveau, H., Richards, M., Boyaval, P., Moineau, S., Romero, D.A. &
Horvath, P. 2007, "CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes", Science (New York, N.Y.), vol. 315, no. 5819, pp. 1709-1712.
Bassan, R. & Hoelzer, D. 2011, "Modern therapy of acute lymphoblastic leukemia", Journal of clinical oncology : official journal of the American Society of Clinical Oncology, vol. 29, no. 5, pp. 532-543.
Bhaya, D., Davison, M. & Barrangou, R. 2011, "CRISPR-cas systems in bacteria and archaea: Versatile small RNAs for adaptive defense and regulation", Annual review of Genetics, vol. 45, pp. 273-297.
Bibikova, M., Beumer, K., Trautman, J.K. & Carroll, D. 2003, "Enhancing gene targeting with designed zinc finger nucleases", Science (New York, N.Y.), vol. 300, no. 5620, pp. 764.
Bitoun, E., Oliver, P.L. & Davies, K.E. 2007, "The mixed-lineage leukemia fusion partner AF4 stimulates RNA polymerase II transcriptional elongation and mediates coordinated chromatin remodeling", Human molecular genetics, vol. 16, no. 1, pp. 92-106.
_________________________________________________________________________ Referenzen
36
Blasco, R., Karaca, E., Ambrogio, C., Cheong, T., Karayol, E., Minero, V., Voena, C. & Chiarle, R. 2014,
"Simple and Rapid In Vivo Generation of Chromosomal Rearrangements using CRISPR/Cas9 Technology", Cell Reports, vol. 9, no. 4, pp. 1219-1227.
Bonnet, D. 2017, "Acute myeloid leukemia including favorable-risk group samples engraft in NSG mice:
just be patient", Haematologica, vol. 102, no. 5, pp. 805-806.
Brandts, C., Kim, A. & Serve, H. 2010, "Die Akute Myeloische Leukämie (AML) des Erwachsenen", Informationszentrum - Kompetenznetz „Akute und chronische Leukämien“ Klinikum der Johann Wolfgang Goethe-Universität, vol. 1.
Breese, E.H., Buechele, C., Dawson, C., Cleary, M.L. & Porteus, M.H. 2015, "Use of Genome Engineering to Create Patient Specific MLL Translocations in Primary Human Hematopoietic Stem and
Progenitor Cells", PloS one, vol. 10, no. 9, pp. e0136644.
Buechele, C., Breese, E.H., Schneidawind, D., Lin, C.H., Jeong, J., Duque-Afonso, J., Wong, S.H., Smith, K.S., Negrin, R.S., Porteus, M. & Cleary, M.L. 2015, "MLL leukemia induction by genome editing of human CD34+ hematopoietic cells", Blood, vol. 126, no. 14, pp. 1683-1694.
Bursen, A., Schwabe, K., Ruster, B., Henschler, R., Ruthardt, M., Dingermann, T. & Marschalek, R. 2010,
"The AF4.MLL fusion protein is capable of inducing ALL in mice without requirement of MLL.AF4", Blood, vol. 115, no. 17, pp. 3570-3579.
Cancer Genome Atlas Research Network, Ley, T.J., Miller, C., Ding, L., Raphael, B.J., Mungall, A.J., Robertson, A., Hoadley, K., Triche, T.J.,Jr, Laird, P.W., Baty, J.D., Fulton, L.L., Fulton, R., Heath, S.E., Kalicki-Veizer, J., Kandoth, C., Klco, J.M., Koboldt, D.C., Kanchi, K.L., Kulkarni, S., Lamprecht, T.L., Larson, D.E., Lin, L., Lu, C., McLellan, M.D., McMichael, J.F., Payton, J., Schmidt, H., Spencer, D.H., Tomasson, M.H., Wallis, J.W., Wartman, L.D., Watson, M.A., Welch, J., Wendl, M.C., Ally, A., Balasundaram, M., Birol, I., Butterfield, Y., Chiu, R., Chu, A., Chuah, E., Chun, H.J., Corbett, R., Dhalla, N., Guin, R., He, A., Hirst, C., Hirst, M., Holt, R.A., Jones, S., Karsan, A., Lee, D., Li, H.I., Marra, M.A., Mayo, M., Moore, R.A., Mungall, K., Parker, J., Pleasance, E., Plettner, P., Schein, J., Stoll, D., Swanson, L., Tam, A., Thiessen, N., Varhol, R., Wye, N., Zhao, Y., Gabriel, S., Getz, G., Sougnez, C., Zou, L., Leiserson, M.D., Vandin, F., Wu, H.T., Applebaum, F., Baylin, S.B., Akbani, R., Broom, B.M., Chen, K., Motter, T.C., Nguyen, K., Weinstein, J.N., Zhang, N., Ferguson, M.L., Adams, C., Black, A., Bowen, J., Gastier-Foster, J., Grossman, T., Lichtenberg, T., Wise, L., Davidsen, T., Demchok, J.A., Shaw, K.R., Sheth, M., Sofia, H.J., Yang, L., Downing, J.R. & Eley, G.
2013, "Genomic and epigenomic landscapes of adult de novo acute myeloid leukemia", The New England journal of medicine, vol. 368, no. 22, pp. 2059-2074.
Carroll, D. 2011, "Genome engineering with zinc-finger nucleases", Genetics, vol. 188, no. 4, pp. 773- 782.
Chao, M.P., Seita, J. & Weissman, I.L. 2008, "Establishment of a normal hematopoietic and leukemia stem cell hierarchy", Cold Spring Harbor symposia on quantitative biology, vol. 73, pp. 439-449.
Chen, B., Gilbert, L.A., Cimini, B.A., Schnitzbauer, J., Zhang, W., Li, G.W., Park, J., Blackburn, E.H., Weissman, J.S., Qi, L.S. & Huang, B. 2013, "Dynamic imaging of genomic loci in living human cells by an optimized CRISPR/Cas system", Cell, vol. 155, no. 7, pp. 1479-1491.
Chen, W., Kumar, A.R., Hudson, W.A., Li, Q., Wu, B., Staggs, R.A., Lund, E.A., Sam, T.N. & Kersey, J.H.
2008, "Malignant transformation initiated by Mll-AF9: gene dosage and critical target cells", Cancer cell, vol. 13, no. 5, pp. 432-440.
_________________________________________________________________________ Referenzen
37
Choi, P.S. & Meyerson, M. 2014, "Targeted genomic rearrangements using CRISPR/Cas technology", Nature communications, vol. 5, pp. 3728.
Christian, M., Cermak, T., Doyle, E.L., Schmidt, C., Zhang, F., Hummel, A., Bogdanove, A.J. & Voytas, D.F. 2010, "Targeting DNA double-strand breaks with TAL effector nucleases", Genetics, vol. 186, no. 2, pp. 757-761.
Collins, E.C. & Rabbitts, T.H. 2002, "The promiscuous MLL gene links chromosomal translocations to cellular differentiation and tumour tropism", Trends in molecular medicine, vol. 8, no. 9, pp. 436- 442.
Cong, L., Ran, F.A., Cox, D., Lin, S., Barretto, R., Habib, N., Hsu, P.D., Wu, X., Jiang, W., Marraffini, L.A. &
Zhang, F. 2013, "Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems", Science (New York, N.Y.), vol. 339, no. 6121, pp. 819-823.
Cornu, T.I., Mussolino, C. & Cathomen, T. 2017, "Refining strategies to translate genome editing to the clinic", Nature medicine, vol. 23, no. 4, pp. 415-423.
Corral, J., Lavenir, I., Impey, H., Warren, A.J., Forster, A., Larson, T.A., Bell, S., McKenzie, A.N., King, G.
& Rabbitts, T.H. 1996, "An Mll-AF9 fusion gene made by homologous recombination causes acute leukemia in chimeric mice: a method to create fusion oncogenes", Cell, vol. 85, no. 6, pp. 853- 861.
Cozzio, A., Passegue, E., Ayton, P.M., Karsunky, H., Cleary, M.L. & Weissman, I.L. 2003, "Similar MLL- associated leukemias arising from self-renewing stem cells and short-lived myeloid progenitors", Genes & development, vol. 17, no. 24, pp. 3029-3035.
Creutzig, U., van den Heuvel-Eibrink, M.M., Gibson, B., Dworzak, M.N., Adachi, S., de Bont, E., Harbott, J., Hasle, H., Johnston, D., Kinoshita, A., Lehrnbecher, T., Leverger, G., Mejstrikova, E., Meshinchi, S., Pession, A., Raimondi, S.C., Sung, L., Stary, J., Zwaan, C.M., Kaspers, G.J., Reinhardt, D. & AML Committee of the International BFM Study Group 2012, "Diagnosis and management of acute myeloid leukemia in children and adolescents: recommendations from an international expert panel", Blood, vol. 120, no. 16, pp. 3187-3205.
Daser, A. & Rabbitts, T.H. 2004, "Extending the repertoire of the mixed-lineage leukemia gene MLL in leukemogenesis", Genes & development, vol. 18, no. 9, pp. 965-974.
Dash, A. & Gilliland, D.G. 2001, "Molecular genetics of acute myeloid leukaemia", Best practice &
research.Clinical haematology, vol. 14, no. 1, pp. 49-64.
De Braekeleer, E., Douet-Guilbert, N., Basinko, A., Le Bris, M.J., Morel, F. & De Braekeleer, M. 2014,
"Hox gene dysregulation in acute myeloid leukemia", Future oncology (London, England), vol. 10, no. 3, pp. 475-495.
De Braekeleer, M., Morel, F., Le Bris, M.J., Herry, A. & Douet-Guilbert, N. 2005, "The MLL gene and translocations involving chromosomal band 11q23 in acute leukemia", Anticancer Research, vol.
25, no. 3B, pp. 1931-1944.
Deininger, M., Buchdunger, E. & Druker, B.J. 2005, "The development of imatinib as a therapeutic agent for chronic myeloid leukemia", Blood, vol. 105, no. 7, pp. 2640-2653.
Deltcheva, E., Chylinski, K., Sharma, C.M., Gonzales, K., Chao, Y., Pirzada, Z.A., Eckert, M.R., Vogel, J. &
Charpentier, E. 2011, "CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III", Nature, vol. 471, no. 7340, pp. 602-607.
