Entwicklung eines Nachweisverfahrens für gentechnische Veraenderungen im Genom von Mikroorganismen aus Starter- und Schutzkulturen

Volltext

(1)ENTWICKLUNG EINES NACHWEISVERFAHRENS FÜR GENTECHNISCHE VERÄNDERUNGEN IM GENOM VON MIKROORGANISMEN AUS STARTERUND SCHUTZKULTUREN. Dissertation zur Erlangung des Grades Dr. rer. nat. am Fachbereich Biologie/Chemie der Universität Bremen vorgelegt von Mario Käse aus Alfeld/Leine Bremen 2000.

(2) 1. Gutachter :. Prof. Dr. Armin Hildebrandt. 2. Gutachter :. Prof. Dr. Detmar Beyersmann. Tag des Promotions-Kolloquiums :. 08. März 2000. 2.

(3) An der Verbraucherakzeptanz von biotechnologisch verbesserten Produkten wird letztlich der Erfolg der Wissenschaft gemessen. (...) Untersuchungen in den USA haben gezeigt, daß dort eine große Mehrheit diese Technologie unterstützt. In Europa sind die Einstellungen der Verbraucher von Land zu Land verschieden. Durch die immer umfangreicheren Informationen über Biotechnologie (...) ist zu erwarten, daß Verständnis und Akzeptanz der Verbraucher weiter zunehmen werden. Aus „Biotechnologie – Chance für die Zukunft“, Broschüre der Monsanto Europe S.A., 1998. Großbritannien Gen-Firma garantiert Arbeitern genfreies Essen LONDON, 22. Dezember (ap). Der MonsantoKonzern gehört zu den Vorreitern bei der Entwicklung von gentechnisch veränderten Nahrungsmitteln. Aber selbst die Kantine der Monsanto-Niederlassung bei London garantiert jetzt den Mitarbeitern, daß ihnen keine Gerichte unter Verwendung von Gen-Mais oder -Soja vorgesetzt werden. Kantinen-Lieferant Granada Food Services teilte mit, diese Entscheidung sei auf Grund der Sorge von Verbrauchern getroffen worden. © Frankfurter Rundschau vom 23.12.1999. 3.

(4) Inhaltsverzeichnis Abkürzungen. 7. Zusammenfassung. 9. 1. Einleitung. 10. 1.1 Einsatz der Gentechnologie zur Herstellung von Lebensmitteln. 10. 1.1.1 Gentechnisch veränderte Nahrungsmittel – ein Wachstumsmarkt?. 10. 1.1.2 Gentechnisch veränderte Starter- und Schutzkulturen. 11. 1.1.3 Kennzeichnungsregelungen für gentechnisch veränderte Lebensmittel. 13. 1.2 Nachweisverfahren für gentechnisch veränderte Organismen in Lebensmitteln. 14. 1.2.1 Untersuchung von Lebensmitteln mit Nachweisverfahren auf Basis der PCR. 14. 1.2.2 Sonstige Verfahren zum gezielten Nachweis bestimmter Fremdgene oder ihrer Genprodukte in Lebensmitteln. 15. 1.2.3 Screening-Verfahren zum universellen Nachweis von Fremdgenen in Lebensmitteln 1.3 Bausteine zur Entwicklung einer universellen Nachweismethode für GVMO. 16 17. 1.3.1 Methoden zur Darstellung geringfügiger Unterschiede im Genom nah verwandter Organismen. 17. 1.3.2 Die Representational Difference Analysis (RDA): Eine Kombination aus Subtraktiver Hybridisierung und Suppression-PCR. 18. 1.3.3 Vorversuche zum Nachweis von GVMO durch genomische Subtraktion. 20. 1.3.4 Anpassung der RDA an die Erfordernisse zum Nachweis von GVMO. 20. 1.4 Charakterisierung der Modell-Organismen Lactobacillus sake und Penicillium nalgiovense 1.4.1 Taxonomische und physiologische Einordnung. 21 21. 1.4.1.1 Lactobacillus sake. 21. 1.4.1.2 Penicillium nalgiovense. 22. 1.4.2 Einsatz der Modell-Organismen in der Lebensmittel-Biotechnologie. 23. 1.4.2.1 Lactobacillus sake. 23. 1.4.2.2 Penicillium nalgiovense. 23. 4.

(5) 2. Material und Methoden 2.1 Organismen. 24 24. 2.1.1 Herkunft und Eigenschaften der Lactobacillus sake Stämme. 24. 2.1.2 Herkunft und Eigenschaften der Penicillium nalgiovense Stämme. 25. 2.2 Kultivierung der Mikroorganismen. 25. 2.2.1 Kultivierung von Lactobacillus sake. 25. 2.2.2 Kultivierung von Penicillium nalgiovense. 26. 2.3 DNA-Isolierung. 26. 2.3.1 DNA-Isolierung aus Lactobacillus sake. 26. 2.3.2 DNA-Isolierung aus Penicillium nalgiovense. 27. 2.4 Standard-Methoden der Molekularbiologie. 27. 2.4.1 Agarose-Gelelektrophorese. 27. 2.4.2 Southern Blot. 28. 2.4.3 Herstellung von DNA-Sonden. 28. 2.4.4 Hybridisierung auf festphasengebundene DNA und DIG-Nachweis. 29. 2.4.5 Polymerase Kettenreaktion (PCR). 29. 2.4.6 Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegel. 30. 2.4.7 Isolierung von DNA-Fragmenten aus Polyacrylamid-Gel. 30. 2.4.8 Klonierung von PCR-Fragmenten. 31. 2.4.8.1 Ligation und Transformation mit dem Vektor pZErO. 31. 2.4.8.2 Ligation und Transformation mit dem Vektor pGEM-T. 31. 2.4.9 Mini-Präparation von Plasmid-DNA. 32. 2.4.10 Präparation von Plasmid-DNA. 32. 2.4.11 DNA-Sequenzierung und Sequenzanalyse. 33. 2.5 Representational Difference Analysis (RDA). 33. 2.5.1 DNA Restriktion. 34. 2.5.2 Adapter Ligation. 34. 2.5.3 Subtraktive Hybridisierung. 34. 2.5.4 Suppression-PCR. 35. 2.6 Zweidimensionale Polyacrylamid-Gelelektrophorese (2D-PAGE). 36. 2.6.1 Diskontinuierliche PAGE. 36. 2.6.2 PAGE mit Bisbenzimid-PEG im Horizontalverfahren. 37. 2.6.2.1 Herstellung des Trenngels. 37. 2.6.2.2 Durchführung der 2D-PAGE im Horizontalverfahren. 37. 2.6.2.3 Silberfärbung von 2D-PA-Gelen. 38 5.

(6) 3. Ergebnisse. 39. 3.1 Nachweis von Fremdgenen bei drei gentechnisch veränderten Stämmen der Art Lactobacillus sake. 39. 3.1.1 Anreicherung von DNA-Fragmenten, die nicht im Genom des Wildtyps L. sake 23K enthalten sind. 39. 3.1.2 Klonierung und Sequenzierung der für die gentechnisch veränderten Stämme spezifischen DNA-Fragmente. 41. 3.1.3 Anreicherung von DNA-Fragmenten bei einem gentechnisch veränderten Stamm von L. sake durch Subtraktion mit der DNA verwandter Stämme. 43. 3.2 Nachweis von Fremdgenen bei zwei gentechnisch veränderten Stämmen der Art Penicillium nalgiovense. 44. 3.2.1 Anreicherung von DNA-Fragmenten, die nicht im Genom des Wildtyps P. nalgiovense BFE 66 vorhanden sind. 44. 3.2.2 Isolierung, Klonierung und Sequenzierung der für die gentechnisch veränderten Stämme spezifischen DNA-Fragmente. 45. 3.2.3 Anreicherung von DNA-Fragmenten bei den gentechnisch veränderten Stämmen von P. nalgiovense durch Subtraktion mit der DNA eines verwandten Stamms 4. Diskussion. 49 50. 4.1 Ableitung eines generellen Vorgehens zum Nachweis gentechnisch veränderter Starter- und Schutzkulturen in Lebensmitteln. 50. 4.2 Bewertung der Leistungsfähigkeit und Praktikabilität des vorgestellten Nachweisverfahrens. 52. 4.2.1 Reproduzierbarkeit und Aufwand. 52. 4.2.2 Zuverlässigkeit der Ergebnisse. 53. 4.2.3 Empfindlichkeit und Spezifität. 56. 4.2.4 Vergleich mit alternativen Nachweisverfahren. 58. 4.3 Weiterentwicklung des Verfahrens und Ausblick. 59. 5. Literaturverzeichnis. 62. Anhang. 69. Danksagung. 76. 6.

(7) Abkürzungen A amdS ampr Anti-Dig-AP argB atp bar BgVV BFE BLAST bp C cDNA clp CTAB demin. DIG DMIF-GEN DNA dNTP DSM EDTA EMBL ELISA emr FPLC G GenTG GVMO GVO Hepes IfLTH INRA IPTG lacZ. Adenin Acetamidase-Gen (von Aspergillus nidulans) Ampicillin-Resistenzgen (Vektor pKW 100) Anti-Digoxigenin-Antikörper gekoppelt mit Alkalischer Phosphatase Ornithin-Carbamoyltransferase-Gen (von Aspergillus nidulans) Adenosintriphosphat-Synthtetase-Gen Phosphinotricin-Acetyltransferase-Gen (von Strepromyces hygroscopicus) Bundesinstitut für gesundheitlichen Verbraucherschutz und Veterinärmedizin Bundesforschungsanstalt für Ernährung Basic Local Alignment Search Tool Basenpaare Cytosin copy-DNA ATP-abhängige-Protease-Gen Cetyltrimethylammoniumbromid entmineralisiert Digoxigenin-DNA-Markierungs-System (Boehringer) Development of methods to identify foods produced by means of genetic engineering Desoxyribonucleinsäure Desoxyribonucleosidphosphat Deutsche Sammlung für Mikroorganismen Ethylendiamin-Tetraessigsäure European Molecular Biology Laboratory Enzyme linked Immuno Sorbent Assay Erythromycin-Resistenzgen (von Streptococcus faecalis) First Performance Liquid Chromatography Guanin Gentechnikgesetz Gentechnisch veränderter Mikroorganismmus Gentechnisch veränderter Organismus N-Hydroxyethylpiperazin-N´-2-Ethansulfonsäure Institut für Lebensmitteltechnologie der Universität Hohenheim Institut National de la Recherche Agronomique Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid β-Galactosidase-Gen (von Escherichia coli) 7.

(8) LCR LMBG LSLB LUA mRNA MRS NBT NCBI nos-3´ npt II ocs-3´ PA PAGE pBSK PCR PCI-Mix PEG P n1/n2R P-nos P-35S pts RAPD RDA RNA rpm RT SDS SMT SOC SSC STE STET T Tanneal Tm TAE TB TE TEMED Tris trpC TSE TSES U X-Gal X-Phosphat 2D. Ligase Chain Reaction Lebensmittel- und Bedarfsgegenständegesetz low saline Luria-Bertani (Medium) (Staatliches) Lebensmittel-Untersuchungsamt (Braunschweig) messenger RNA Medium zur Kultivierung von Milchsäurebakterien Nitroblau-Tetrazolium National Center for Biotechnology Information Terminator des Nopalin-Synthetase-Gens (von Agrobacterium tumefaciens) Neomycin-Phosphotransferase-Gen (von TN5) Terminator des Octopin-Synthetase-Gens (von Agrobacterium tumefaciens) Polyacrylamid Polyacrylamid-Gelelektrophorese Vektor pBluescript SK Polymerase Chain Reaction Phenol/Chloroform/Isoamyl-Alkohol Polyethylenglycol nested Primer 1 und 2R (Clontech) Promotor des Nopalin-Synthetase-Gens (von Agrobacterium tumefaciens) Promotor 35S des Cauliflower Mosaic Virus Phosphoenolpyruvat:carbohydrat-Phosphotransferase-Gen Random amplified polymorphic DNA Representational Difference Analysis Ribonucleinsäure rounds per minute Raumtemperatur Natrium-Dodecyl-Sulfat Standards, Measurement and Testing Medium zur Kultivierung von transformationsgestreßten E. coli saline Sodium-Citrate saline Tris/EDTA saline Tris/EDTA/Triton X-100 Thymin Annealing-Temperatur Schmelztemperatur Tris/Acetat/EDTA-Puffer Terriffic Broth Tris/EDTA-Puffer N,N,N´,N´-Tetramethylethylendiamin 2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propandiol Tryptophan-Synthetase-Gen (von Aspergillus nidulans), Untereinheit C Tris/Sodiumchloride/EDTA-Puffer Tris/Sodiumchloride/EDTA/Sucrose-Puffer Unit, Enzym-Einheit 5-Chlor-4-Brom-3-Indolyl-β-D-Galactopyranosid 5-Chlor-4-Brom-3-Indolyl-Phosphat zweidimensional 8.

(9) Zusammenfassung Die Entwicklung von gentechnisch veränderten Mikroorganismen (GVMO) als Starter- und Schutzkulturen in der Lebensmittelproduktion ist mittlerweile so weit fortgeschritten, daß mit einer baldigen Markteinführung derartiger Produkte zu rechnen ist. Die Kennzeichnung dieser Produkte ist u.a. durch die EU Novel Food Verordnung vorgeschrieben. Es fehlen aber bisher noch Nachweisverfahren, die eine umfassende Überprüfung der Kennzeichnungspflicht ermöglichen würden. Alle gängigen Verfahren, einschließlich der PCR-Screening-Verfahren beruhen auf dem spezifischen Nachweis bekannter gentechnischer Veränderungen. Der Nachweis von unbekannten gentechnischen Veränderungen mit einem universellen Verfahren war bisher nicht möglich. In dieser Arbeit wird ein Verfahren zum Nachweis von GVMO vorgestellt, das die Basis für einen universellen und produkt-unspezifischen Nachweis von gentechnisch veränderten Starter- und Schutzkulturen in Lebensmitteln darstellt. Dieses Verfahren beruht auf dem Abgleich des Genoms eines zu untersuchenden Stamms mit dem Genom eines sehr nah verwandten, nicht gentechnisch veränderten Referenzstamms mit Hilfe der Representational Difference Analysis, einer Kombination aus Subtraktiver Hybridisierung und Suppression-PCR. Die damit generierten stammspezifischen DNAFragmente werden mit einer zweidimensionalen Polyacrylamid-Gelelektrophorese isoliert, sequenziert und die DNA-Sequenzen mit Datenbank-Beständen verglichen. Das Verfahren wurde an zwei Modellsystemen Lactobacillus sake und Penicillium nalgiovense jeweils anhand mehrerer gentechnisch veränderter Stämme entwickelt und erprobt. Bei allen untersuchten Stämmen konnten artfremde genetische Elemente zuverlässig und reproduzierbar detektiert werden. Das Verfahren eignet sich prinzipiell zur Untersuchung aller Mikroorganismen, die zur Veredelung oder Konservierung von Lebensmitteln Verwendung finden und ermöglicht einen Nachweis von GVMO, sobald diese zwei bis drei artfremde genetische Elemente besitzen. Es ist durch die Notwendigkeit limitiert, einen geeigneten Referenzstamm zu finden und mit dem Verfahren können nur Starter- und Schutzkulturen aus nicht sterilisierten Lebensmitteln untersucht werden. Der wesentliche Vorteil des Verfahrens liegt in der Universalität: Im Gegensatz zu PCR-Screening-Verfahren zum Nachweis von GVMO ist es ohne Kenntnis von DNA-Sequenzen potentiell vorhandener artfremder genetischer Elemente anwendbar. 9.

(10) 1. Einleitung 1.1 Einsatz der Gentechnologie zur Herstellung von Lebensmitteln 1.1.1 Gentechnisch veränderte Nahrungsmittel – ein Wachstumsmarkt? Während in den USA bereits in großem Maßstab gentechnisch veränderte Pflanzen angebaut werden, steckt in Europa die Gentechnik im Nahrungsmittelsektor noch in den Kinderschuhen. Von den knapp 28 Millionen Hektar Ackerland, auf denen 1998 weltweit transgenes Saatgut1 eingesetzt wurde, entfielen allein 20,5 Millionen auf die USA. Andere bedeutende Anbauländer sind China, Kanada und Argentinien, der europäische Weltmarktanteil lag unter 1%. Dem noch geringen Grad der kommerziellen Nutzung der Gentechnik steht aber in der EU mit rund 1000 Freisetzungsversuchen und zahlreichen gentechnischen Produkten, die nur im Labormaßstab produziert wurden, ein hohes Maß an Forschungsaktivitäten gegenüber (Klärner, 1998; DER SPIEGEL 41/1998; http://www.ucsusa.org, 1999; http://www.rki.de, 1999)2. Doch anhand der bisherigen Forschungsziele offenbart sich, warum sich Novel Food bei den Verbrauchern in Europa bisher so schwer durchsetzen ließ: Nur ca. 10% der bisher bei Freisetzungsversuchen getesteten transgenen Pflanzen weisen veränderte Eigenschaften auf, die man als Qualitätsverbesserung im Sinne des Konsumenten bezeichnen kann. Rund 75% der Forschungsaktivität geht in die Übertragung von Resistenzen gegen Schadinsekten, Krankheitserreger oder Herbizide, allesamt Eigenschaften, die nur den Saatgutkonzernen oder bestenfalls dem Landwirt direkt nutzen (Jany und Greiner, 1998). Verständlicherweise lehnen viele Verbraucher eine „grüne“ Gentechnik ab, die für sie und die Umwelt keine Vorteile, sondern schlimmstenfalls unkalkulierbare Risiken bringt. Solange gentechnisch veränderte Produkte nicht besser schmecken, länger haltbar, oder ernährungsphysiologisch wertvoller sind als ihre unveränderten Pendants, werden sie – zumindest in Europa – weiterhin Ladenhüter bleiben (Sievers, 1999a). Diese sog. 1. Generation gentechnisch veränderter Nahrungsmittel Hierin enthalten sind auch transgene Nutzpflanzen wie z.B. Baumwolle. Laufend aktualisierte Informationen über die Marktzulassung transgener Organismen oder deren Freisetzung zu Forschungszwecken finden sich auf den Internet-Seiten des Robert-Koch-Instituts (für die EU) und der Zeitschrift „Gene Exchange“ (für die USA).. 1 2. 10.

(11) brachte den in dieser Sparte führenden Agro-Konzernen Monsanto, Novartis und Agrevo daher bisher nur massive ökonomische Verluste ein (Sievers, 1999b). Derartige Probleme bei der Markteinführung innovativer Produkte sollen in Zukunft dadurch vermieden werden, daß die 2. Generation gentechnisch veränderter Lebensmittel stärker auf die Wünsche der Konsumenten zugeschnitten sein wird. In der Entwicklung sind z.B. Produkte mit einem erhöhten Gehalt an Vitaminen, komplexen Kohlehydraten oder Ballaststoffen und mit einer ernährungsphysiologisch günstigeren Fettsäuren-Zusammensetzung (Brabeck-Letmathe, 1998; Greiner und Jany, 1998; Wandtner, 1998). Als Vorbild dient der Boom der probiotischen Lebensmittel. Mit Probiotika wurden allein in Deutschland 1997, zwei Jahre nach der Markteinführung, Umsätze in Höhe von 300 Mio. DM erzielt (Kutter, 1998), obwohl die postulierte generelle gesundheitsfördernde Wirkung dieser Produkte nach wie nach nicht bewiesen werden konnte. Die Marktgängigkeit von Lebensmitteln hängt eben in hohem Maße von ihrem Image ab. Es ist demnach davon auszugehen, daß für gentechnisch veränderte Lebensmittel gute Absatzchancen bestehen, sobald glaubhaft vermittelt werden kann, daß sie nicht nur gesundheitlich unbedenklich, sondern sogar noch „gesünder“ sind als herkömmliche Nahrungsmittel. Für die weltweite Vermarktung dieser sog. Nutrazeutika prognostizieren Fachleute Potentiale in der Größenordnung von mehreren Hundert Mrd. USDollar (Sprenger, 1998). 1.1.2 Gentechnisch veränderte Starter- und Schutzkulturen In nahezu allen menschlichen Kulturen dienen Mikroorganismen traditionell der Herstellung, Veredelung und Konservierung von Lebensmitteln. Sie werden als Starterkulturen eingesetzt, um chemische und sensorische Eigenschaften von fermentierten Lebensmitteln zu verändern und als Schutzkulturen zur Hemmung des Wachstums pathogener und anderer unerwünschter Keime. In vielen Milchprodukten , z.B. Joghurt, Sauermilch, Quark, Kefir oder Labkäse sind tote und/oder lebende Milchsäurebakterien ein wesentlicher Bestandteil des Lebensmittels, in probiotischen Joghurts auch in qualitativer Hinsicht. Außer in den genannten Milchprodukten finden sich in Rohwurst (z.B. Salami), sauer fermentiertem Gemüse, Schimmelkäse und einigen fernöstlichen Sojaprodukten noch tote und/oder lebende Mikroorganismen in beträchtlicher Anzahl. Gegenwärtig sind in der EU noch keine Lebensmittel, die gentechnisch modifizierte Milchsäurebakterien, Hefen oder Schimmelpilze enthalten auf dem Markt. In Großbritannien ist aber bereits ein mit gentechnisch veränderter Brauhefe produziertes kalorienreduziertes Bier zugelassen worden und im Direktvertrieb erhältlich (Jany und Greiner, 1998). Dieses Produkt enthält aber keine lebenden GVO-Hefen. 11.

(12) In den letzten Jahren wurden die Forschungen zur gentechnischen Optimierung von Starter- und Schutzkulturen stärker anwendungsorientiert durchgeführt. Die Ziele dieser Forschungen waren neben der Verbesserung der Produktqualität, z.B. durch Steigerung des ernährungsphysiologischen Werts aber auch die Erhöhung der Prozeß- und Produktsicherheit, die Reduzierung hygienischer Risiken und die Steigerung der Prozeßeffizienz, also weiterhin rein wirtschaftlicher Natur (Heller, 1997; Schauzu et al., 1998). Im Labormaßstab wurden z.B. mit Erfolg gentechnisch modifizierte Brauhefen zur Herstellung alkoholreduzierten Bieres (Stahl, 1997) und Weinhefen zur Produktion besonders fruchtig schmeckenden Weins (Perez-Gonzalez, 1993) oder von harnstoffreiem Reiswein (Sake) eingesetzt3 (Kitamoto, 1991). Viele Arbeiten beschäftigten sich mit der Optimierung von Milchsäurebakterien und Schimmelpilzen. Doch da diese in Endprodukten wie Joghurt und Käse – im Gegensatz zum Bier oder Wein – noch lebensfähig enthalten sind, muß sichergestellt sein, daß die Mikroorganismen keine Gene für Antibiotika-Resistenzen besitzen und sie keine genetischen Elemente enthalten, die sie zur Übertragung der neu erworbenen Eigenschaften auf Bakterien der menschlichen Darmflora befähigen (Geisen und Holzapfel, 1995). Derartige konjugative Plasmide werden aber momentan noch regelmäßig in der Gentechnik eingesetzt. Durch die Konstruktion von lebensmitteltauglichen Vektoren für Milchsäurebakterien, die sich samt ihrer Fracht stabil in das Genom integrieren, scheint jetzt aber der Weg frei zu sein für den Einsatz der Gentechnik in Molkereiprodukten (Kuipers et al., 1997; Leenhouts et al., 1998). Bei der Bundesanstalt für Milchforschung in Kiel haben solche Bakterien bereits ihren Praxistest in der Käseherstellung bestanden (Bockelmann und Heller, 1998). Mit Hilfe der Gentechnik kann nun auf Aroma und Textur von Joghurt und Käse Einfluß genommen werden, ohne Additive verwenden zu müssen, die als Verursacher des „chemischen Beigeschmacks“ von vielen Verbrauchern abgelehnt werden. Außerdem können die Eigenschaften von Milchsäurebakterien, die für ihre Klassifizierung als probiotische Bakterien relevant sind, verstärkt werden. Auch bei der Entwicklung lebensmitteltauglicher Vektoren für Schimmelpilze wurden einige Fortschritte erzielt, wenn auch noch nicht bis zur Marktreife der Organismen. Inzwischen existieren für alle lebensmitteltechnologisch relevanten Schimmelpilze Vektoren, die sich stabil in das Genom integrieren und deren Markergene für den menschlichen Verzehr geeignet scheinen (Geisen, 1993). Diese Vektoren enthalten aber stets noch größere Abschnitte bakterieller DNA, da sie i.d.R. als shuttle-Vektoren konzipiert wurden. In Kombination mit der Technik ortsspezifischer Rekombination bei filamentösen Pilzen lassen sich aber diese bakteriellen. Harnstoff ist eine Vorstufe des Carcinogens Ethylcarbamat, der Harnstoffgehalt sollte daher in Reiswein möglichst gering sein.. 3. 12.

(13) Sequenzen nachträglich wieder entfernen. Als Alternative zu dieser aufwendigen Methode bieten sich Vektoren an, die frei von bakterieller DNA sind. Diese wurden bereits zur Transformation filamentöser Pilze eingesetzt, allerdings noch nicht bei solchen, die in der LebensmittelBiotechnologie Verwendung finden (Nowak et al., 1995). Dem Einsatz gentechnisch veränderter Starter- und Schutzkulturen steht aus technologischer Sicht nichts mehr im Weg. Die Markteinführung von Lebensmitteln, die lebende GVMO enthalten, wird somit zu einer Frage der Akzeptanz seitens der Verbraucher4 und zu einer Frage der politischen Regulierung5. 1.1.3 Kennzeichnungsregelungen für gentechnisch veränderte Lebensmittel In der Bundesrepublik Deutschland6 sind das Inverkehrbringen und die Kennzeichnung von gentechnisch veränderten Lebensmitteln durch das Lebensmittel- und Bedarfsgegenständegesetz (LMBG) und das Gentechnikgesetz (GenTG) geregelt. Darüberhinaus gelten im Rahmen der EU die Freisetzungsrichtlinie 90/220/EWG, die Novel Food Verordnung 258/97/EG und die Etikettierungsrichtlinie 79/112/EWG samt Ergänzungsverordnungen. Für die Vermarktung von Lebensmitteln, die lebende GVMO enthalten, ergibt sich daraus ein aufwendiges, mehrstufiges Genehmigungsverfahren und eine unbedingte Pflicht zur entsprechenden Kennzeichnung des Produkts. Diese Kennzeichnungspflicht greift generell nur, wenn es auch technisch nachweisbar Bereits einige Jahre vor der Markteinführung von Produkten, die in irgendeiner Form mit Gentechnik in Berührung stehen, wurde die Akzeptanz durch die Konsumenten in repräsentativen Umfragen erforscht. Bundesdeutsche Konsumenten erwiesen sich dabei als überaus kritisch gegenüber Novel Food und die ablehnende Haltung hat sich mit der Intensivierung der Debatte um Gentechnik und Lebensmittel in den Medien eher noch verstärkt. Nach einer europaweit durchgeführten Delphi-Studie über die Zukunftserwartungen an die moderne Biotechnologie versprechen sich lediglich 36% der Deutschen von ihr einen positiven Beitrag zur Verbesserung der Lebensbedingungen. Schlußlichter bei diesem europäischen Orakel sind die Österreicher mit 28%, während in Italien knapp 60% der Menschen der Biotechnologie erwartungsvoll gegenüberstehen (Menrad, 1998). Nichtsdestotrotz rechnet jeder zweite Deutsche damit, daß innerhalb der nächsten zehn Jahre das meiste Bier in der Bundesrepublik mit gentechnisch veränderter Hefe gebraut werden wird. Es scheint also ein gewisser Fatalismus gegenüber der Macht der Konsumenten(wünsche) bezüglich der Produktentwicklung in der Marktwirtschaft zu herrschen. Diese Zukunftserwartung erscheint plausibel, wenn man bedenkt, daß die Akzeptanz gentechnisch veränderter Nahrungsmittel in manchen Ländern Europas wesentlich höher ist als in der Bundesrepublik und daß diese Länder eine Vorreiterrolle einnehmen werden, wenn es darum geht, den Konsumenten die Bedenken gegen Novel Food zu nehmen. So bevorzugten in einem Produkt-Vergleichstest (Bredahl und Grunert, 1998) zwischen Joghurt aus Vollmilch, Magermilch-Joghurt, fettfreiem Joghurt mit Additiven zur Geschmacksabrundung und (nur laut Etikett) gentechnisch hergestelltem fettfreiem Joghurt, der aber wie Vollmilch-Joghurt schmeckt, in Deutschland fast 60% der Tester den Vollmilch-Joghurt und nur 5% das gentechnische Produkt, in Großbritannien hingegen nur 26% den Vollmilch-Joghurt und 19% die gentechnisch hergestellte Alternative. 5 Diesbezüglich hat sich innerhalb der EU im Jahre 1999 eine bemerkenswerte Trendwende vollzogen. So wurde zum Jahresanfang ein Antrag der Firma Zeneca auf Vermarktung einer „Anti-Matsch-Tomate“, die ein Resistenzgen gegen das Antibiotikum Kanamycin enthält, vom zuständigen EU-Ausschuß aufgrund von Sicherheitsbedenken abgelehnt (Emmrich, 1999). Mitte des Jahres verständigten sich die EU-Umweltminister als Reaktion auf neuere Erkenntnisse, nach denen gentechnisch veränderter Mais unkalkulierbare ökologische Risiken berge, auf die Erarbeitung einer strengeren Zulassungsrichtlinie, was nach Worten der EU-Umweltkommissarin Bjerregard einem De-Facto-Moratorium bis zum Jahr 2002 gleichkomme (dpa, 1999). 6 Auf die – angesichts weltweit operierender Lebensmittel-Konzerne durchaus relevanten – Regelungen in anderen Staaten kann hier leider nicht näher eingegangen werden. 4. 13.

(14) ist, daß ein Produkt durch gentechnische Veränderungen nicht mehr gleichwertig mit seinem unveränderten Pendant ist. Diesen Nachweis zu führen, ist unter gewissen Voraussetzungen (s. Kap. 1.2.1) im Falle z.B. eines Joghurts, der transgene Milchsäurebakterien enthält, technisch einfach. Weit schwieriger gestaltet sich eine Überprüfung der Kennzeichnungspflicht. Zur Untersuchung, ob ein nicht gekennzeichneter Joghurt auch wirklich frei ist von GVMO, ist man bislang auf die Kooperation des Herstellers angewiesen und selbst dann sind die technischen Möglichkeiten zur Überprüfung der Kennzeichnung noch unzureichend. Eine gesetzliche Regelung zur (stichprobenartigen) Überprüfung der Kennzeichnung von Lebensmitteln existiert bisher weder in der Bundesrepublik, noch auf EU-Ebene (Jany und Greiner, 1998). In der Präambel der Novel Food Verordnung wurde ausdrücklich darauf hingewiesen, daß Lebensmittel auch derart gekennzeichnet werden können, daß sie „Gentechnikfrei“ seien. In der Bundesrepublik wurde daraufhin eine entsprechende nationale Verordnung erlassen. Demnach dürfen nur dann Lebensmittel als „Gentechnikfrei“ gekennzeichnet werden, wenn sie keine GVO oder deren Bestandteile enthalten und sogar im gesamten Herstellungsprozeß (incl. Tierfutter und Arzneimittel) kein gentechnisches Verfahren oder Produkt angewendet wurde. Für die Produktwahrheit sind die Hersteller verantwortlich, sie müssen gegenüber den Lebensmittelüberwachungsbehörden entsprechende Garantie-Erklärungen abgeben (Haas, 1998). Doch weder die Novel Food Verordnung, noch die nationale Kennzeichnungs-Verordnung schreiben bestimmte technische Verfahren zur Überprüfung dieser Garantie-Erklärungen vor. Auch hier gilt: Ohne wirkungsvolle Überprüfungsverfahren ist der Nutzen einer Etikettierung „Gentechnikfrei“ höchst fragwürdig. 1.2 Nachweisverfahren für gentechnisch veränderte Organismen in Lebensmitteln 1.2.1 Untersuchung von Lebensmitteln mit Nachweisverfahren auf Basis der PCR Die meisten in der Routine eingesetzten Verfahren zum Nachweis von gentechnisch veränderten Organismen bzw. Nahrungsmitteln basieren auf einem Nachweis der modifizierten DNA. Methode der Wahl ist die PCR in Verbindung mit einer geeigneten Verifizierungs-Methode (Schulze, 1997). Dieses Vorgehen wurde von Meyer (1995) für die „Flavr-Savr-Tomate“ eingeführt und seitdem für zahlreiche neue gentechnisch veränderte Lebensmittel etabliert (Hemmer, 1997). Die bundesdeutsche Sammlung von Lebensmittel-Untersuchungsmethoden nach § 35 LMBG umfaßt mittlerweile fünf in Ringversuchen validierte Verfahren, die allesamt auf einer Kombination aus PCR und einer Überprüfung des PCR-Produkts mit einer spezifischen DNA-Sonde beruhen (Zagon et al., 1998). Darunter befinden sich auch zwei Methoden zum 14.

(15) Nachweis gentechnisch veränderter Mikroorganismen, nämlich von Lactobacillus curvatus als Starterkultur in Rohwurst (Nr. L 08.00.44) und von Streptococcus thermophilus als Starterkultur in Joghurt (Nr. L 02.02.4). Mit der PCR lassen sich auch in hochgradig verarbeiteten Lebensmitteln noch geringe Spuren der modifizierten DNA nachweisen. Das macht diese Methode zwar unschlagbar in puncto Sensitivität, hat aber den Nachteil der möglichen Verwechselung unbeabsichtigter Kontaminationen mit „echter“ Gen-Manipiulation. Dieses Problem kann allerdings durch die Festlegung eines Grenzwertes und die Einführung einer quantitativen PCR gelöst werden (Greiner und Jany, 1998). Die Methode versagt lediglich bei gentechnisch erzeugten Lebensmitteln, bei denen es durch Filterung der transgenen Mikroorganismen (z.B. bei Bier) oder durch sehr starkes Erhitzen und Ansäuern (z.B. in Soja-Öl oder Tomaten-Ketchup) zur vollständigen Degradierung oder Entfernung der DNA kommt (Greiner et al., 1997). Die PCR ist eine Methode hoher Spezifität, vorausgesetzt, es werden Primer einer Länge von ca. 20 Basen, hoch stringente Bedingungen für das Annealing der Primer und PrimerBindungsstellen, die in ihrer Kombination ausschließlich in einem gentechnisch veränderten Organismus vorkommen, gewählt. Daraus ergibt sich zwangsläufig, daß sich mit der PCR nur solche gentechnisch veränderten Nucleinsäuren nachweisen lassen, deren Sequenzen publiziert wurden und nach denen gezielt gesucht werden kann. Ein universeller Nachweis „Enthält gentechnisch veränderte DNA“ oder gar „Gentechnikfrei“ ist mit einem einzelnen PCRVerfahren nicht möglich. 1.2.2 Sonstige Verfahren zum gezielten Nachweis bestimmter Fremdgene oder ihrer Genprodukte in Lebensmitteln Andere Verfahren als die PCR kommen zum Nachweis gentechnisch veränderter Lebensmittel i.d.R. nur als Methoden zu deren Verifizierung zum Einsatz, oder wenn das Produkt erwartungsgemäß keine amplifizierbare manipulierte DNA enthält. Zur Verifizierung besteht neben der Hybridisierung mit einer DNA-Sonde auch die Möglichkeit einer RestriktionsFragmentlängen-Analyse oder einer Sequenzierung des PCR-Produkts. Alternativ zur PCR kommt gelegentlich eine Ligase-Kettenreaktion (LCR) als Methode der Wahl in Frage (Hemmer, 1997). Gentechnische Veränderungen lassen sich in einigen Fällen auch gezielt auf der Protein-Ebene nachweisen. Als Verfahren kommen die Flüssigchromatographie (FPLC) oder immunologische Methoden wie der Enzyme linked Immuno Sorbent Assay (ELISA) in Frage. Die Methoden sind aber wesentlich aufwendiger und weniger sensitiv als die Verfahren auf Nucleinsäure-Ebene und 15.

(16) ermöglichen ebenfalls nur die gezielte Suche nach publizierten gentechnischen Manipulationen (Jany und Greiner, 1998). 1.2.3 Screening-Verfahren zum universellen Nachweis von Fremdgenen in Lebensmitteln Alle bisher publizierten Ansätze zur Etablierung eines universellen Nachweises von Fremdgenen basieren auf der PCR. Durch die Verwendung von Primer-Paaren, mit Hilfe derer sich genetische Elemente nachweisen lassen, die sehr häufig bei der gentechnischen Veränderung von Lebensmitteln Verwendung finden, können diese PCR-Verfahren zum Screening benutzt werden. In diesem Sinne bezeichnen Greiner et al. (1998) die Primer-Paare 35S-1/35S-2 und NOS1/NOS-2 als geeignet zum Screening nach transgenen Pflanzen. Eine auf ähnlichen Primern beruhende Methode ist 1998 unter dem Titel „Screeningverfahren zum Nachweis gentechnisch veränderter DNA-Sequenzen in Lebensmitteln“ in die Amtliche Sammlung nach § 35 LMBG aufgenommen worden (Nr. L 00.00.31), sie erfaßt aber ebenfalls „nur“ alle bisher vermarkteten transgenen Pflanzen. Neben den bereits erwähnten Zielsequenzen P-35S-Promoter und nos-3´Terminator eigenen sich noch der P-nos-Promoter, der ocs-Terminator und die Markergene npt II und bar gut für einen universellen Nachweis von Fremdgenen, da sie vielfach bei der Transformation von pflanzlichen Lebensmitteln eingesetzt wurden. Durch eine Kombination der entsprechenden Primer-Paare ließe sich nach Hemmer (1997) der Großteil der bis dato vermarkteten transgenen Pflanzen erfassen. Der Autor merkt allerdings selbst an, daß diese Gene auch sehr häufig in der belebten Natur vorkommen und damit eine beträchtliche Anzahl falsch positiver Testergebnisse zu erwarten sei. Zur Identifikation gentechnisch modifizierter Mikroorganismen schlagen MacCormick et al. (1998) ein ähnliches Vorgehen vor. Ausgehend von den Sequenzen sechs häufig benutzter Markergene bakterieller Herkunft (davon vier Antibiotika-Resistenzgene) und der übereinstimmenden Abschnitte der gebräuchlichsten Polylinker haben sie Primer abgeleitet und einen Cocktail von DNA-Sonden entwickelt, mit deren Hilfe sich gentechnisch veränderte Milchsäurebakterien mit einer hohen Wahrscheinlichkeit identifizieren lassen sollten. Für GVOHefen wurden insgesamt sieben Markergene aufgeführt, die sich als Zielgene zum Nachweis einer gentechnischen Manipulation eignen sollten, da sie in Hefen von Natur aus nicht vorkommen. Leider wurde bisher keine entsprechende Liste für gentechnisch veränderte Schimmelpilze erarbeitet. Den empirischen Beweis, daß diese Strategie in der Laborpraxis auch umsetzbar ist, liefern MacCormick et al. nicht, die entsprechenden Experimente stehen noch aus. Zweifellos ist hiermit ein Ansatz für den Nachweis nicht deklarierter gentechnisch veränderter Mikroorganismen bzw. Lebensmittel gegeben. Die Autoren betonen aber auch, daß jedes 16.

(17) Screening mit solch einem System zwangsläufig den Neu-Entwicklungen der gentechnologischen Lebensmittelproduktion hinterhinken muß und stets auf die Preisgabe der Methoden und DNASequenzen durch Forschungsinstitute und Unternehmen angewiesen sein wird. 1.3 Bausteine zur Entwicklung einer universellen Nachweismethode für GVMO Um in einem Organismus Fremdgene nachzuweisen, muß man mit den bisher zur Verfügung stehenden Methoden entweder gezielt oder im PCR-Screening nach ganz bestimmten, bekannten Zielsequenzen suchen. Als Alternative zu diesem Vorgehen wurde in dieser Arbeit ein Verfahren auf Grundlage der Subtraktiven Hybridisierung entwickelt, das einen Abgleich des Genoms des potentiell gentechnisch veränderten Untersuchungs-Organismus mit einem gentechnisch nicht veränderten Referenz-Organismus ermöglichen sollte. Anhand der Differenzen sollte rückverfolgt werden können, ob der Untersuchungs-Organismus genmanipuliert worden ist oder nicht. 1.3.1 Methoden zur Darstellung geringfügiger Unterschiede im Genom nah verwandter Organismen Das Grundprinzip der Subtraktiven Hybridisierung besteht in der Entfernung aller NukleinsäureSequenzen eines Zelltyps oder Stamms, die homolog zu einem Referenz-Zelltyp oder ReferenzStamm sind. Dadurch ergibt sich eine Anreicherung und die Möglichkeit zur genaueren Analyse derjenigen Sequenzen, die in der Referenz nicht vorkommen. Das Verfahren kann mit cDNA (seitens der Referenz auch cDNA oder RNA) und Gesamt-DNA durchgeführt werden. Die Subtraktive Hybridisierung wurde ursprünglich zur Analyse zelltypspezifischer Genexpression entwickelt (Davis et al., 1984; Hedrick et al., 1984) und seitdem eingesetzt zur Identifikation einzigartiger Sequenzen im Genom pathogener Bakterienstämme oder zur Isolierung merkmalsgebundener polymorpher Marker. Die methodische Weiterentwicklung betraf im wesentlichen die Technik zur Entfernung der homologen Hybride nach der Hybridisierung der Genome. Die DNA/RNA-Hybride, die bei der Untersuchung von Genexpressionsmustern anfallen, lassen sich durch eine Hydroxyl-Apatit-Chromatographie entfernen. Bei Subtraktiven Hybridisierungen auf DNA-Ebene werden die Hybride abgetrennt, indem die DNA der Referenz biotinyliert wird und die somit biotinylierten Hybride durch eine Reaktion mit Streptavidin und eine Phenol/Chloroform-Extraktion entfernt werden können (Sive und St. John, 1988). Eine Vereinfachung dieser Methode ergibt sich durch den Einsatz streptavidinbeschichteter magnetischer Partikel. Die Anreicherung der nach einer Subtraktiven Hybridisierung isolierten 17.

(18) cDNA oder DNA-Fragmente erfolgt, falls sie nicht markiert und als Sonde eingesetzt werden sollen, entweder durch Klonierung oder durch PCR nach der Ligation von Adaptern (Straus und Ausubel, 1990). In jedem Fall müssen für eine Anreicherung einzelner einzigartiger Sequenzen die Arbeitsschritte Hybridisierung und anschließende Entfernung der Hybride mehrfach hintereinander durchgeführt und dabei eine große Menge an Referenz-Nucleinsäure eingesetzt werden. Das macht die Methode zu einem zeitaufwendigen und in manchen Fällen (z.B. bei wenig Probenmaterial) auch nicht praktikablen Verfahren. 1.3.2 Die Representational Difference Analysis (RDA): Eine Kombination aus Subtraktiver Hybridisierung und Suppression-PCR Eine wesentliche Vereinfachung und qualitative Verbesserung zur Untersuchung der Unterschiede nah verwandter Genome oder cDNA-Banken stellt die RDA dar. Während durch eine fünfstufige Subtraktive Hybridisierung eine Anreicherung einzigartiger Sequenzen gegenüber dem Ausgangszustand etwa um den Faktor 1000 erreicht werden kann, was zur Isolierung von single-copy Genen aus komplexen eukaryotischen Genomen nicht ausreicht, liefert die RDA in einem zweistufigen Verfahren bereits eine Anreicherung um den Faktor 105 (Lisitsyn et al., 1993). Erreicht wird dies durch eine adaptergestützte exponentielle Amplifikation aller Nicht-Hybride nach jeder einzelnen Subtraktion, während Hybrid-DNA nur linear oder gar nicht amplifiziert wird. Damit eröffneten sich zunehmend Möglichkeiten zur Arbeit mit hoch komplexen Genomen wie dem menschlichen, z.B. zur Analyse molekulargenetischer Unterschiede zwischen Krebszellen und gesunden Zellen (Lisitsyn, 1995). Eine weitere methodische Vereinfachung der RDA führten Gurskaya et al. (1996) und Diatchenko et al. (1996) ein, indem sie das Prinzip der Suppression PCR (US Patent # 5.565.340) integrierten. Dadurch, daß beide Adapter A und B eine selbst-komplementäre Sequenz haben, bilden DNA-Fragmente, die an ihren Enden den gleichen Adapter tragen Sekundärstrukturen aus, die zu einer Verminderung ihrer Amplifikation in einer PCR führen, obwohl Primer eingesetzt werden, die auf die Sequenzen der Adapter abgestimmt sind. Zur exponentiellen Amplifikation gelangen lediglich DNA-Fragmente, die an einem Ende den Adapter A und am anderen Ende den Adapter B tragen. Sie werden somit selektiv angereichert. Darauf aufbauend hat die Firma Clontech ihr PCR-SelectTM cDNA Subtraction Kit mit den Adaptern 1 und 2R und einem Primer P1 für eine erste und einem Primer-Paar Pn1 und Pn2R für eine nested PCR entwickelt. Das Prinzip der Methode ist in Abb. 1.1 dargestellt (s. auch Kap. 2.5). Die zweistufige Amplifikation gewährleistet eine maximale Anreicherung der gesuchten einzigartigen Sequenzen gegenüber dem Rest des Genoms (Clontech Laboratories Inc., 1995). 18.

(19) Representational Difference Analysis mit dem Clontech-Kit Fragmentierte Tester-DNA mit Adapter 1. Fragmentierte Driver-DNA (im Überschuß). 1A. Fragmentierte Tester-DNA mit Adapter 2R. 1B a. a. b. b. c. c. d. d 2. a,b,c,d +. e 3 a b c d e 4 b = Suppression-PCR, geringe Amplifikation. e = exponentielle Amplifikation. a,d = keine Amplifikation c = lineare Amplifikation. Abbildung 1.1: Schematische Darstellung der Representational Difference Analysis mit dem Clontech PCR-Select cDNA Subtraction Kit (Clontech Laboratories Inc., 1995). Schritte 1A und 1B: Erste Subtraktive Hybridisierung in getrennten Ansätzen, Schritt 2: Zweite Subtraktive Hybridisierung unter Vereinigung der Ansätze sowie Zugabe frisch denaturierter Driver-DNA, Schritt 3: Auffüllen der überstehenden Adapter, Schritt 4: Erste PCR und anschließende nested PCR.. 19.

(20) 1.3.3 Vorversuche zum Nachweis von GVMO durch genomische Subtraktion Im Rahmen einer Diplomarbeit in der AG von Prof. Hildebrandt wurde anhand eines Modellsystems bestehend aus λ-Phagen-DNA, der als Fremdgen ein bakterieller Transformationsvektor zugefügt wurde, überprüft, inwieweit durch genomic blocking hybridization ein Nachweis dieses „GVO“ möglich wäre. Der Nachweis beruhte darauf, daß enzymatisch geschnittene, einzelsträngige GVO-DNA an eine Membran gebunden und mit DIG-markierter, identischer DNA hybridisiert wurde. Der Hybridisierungslösung wurde als Driver-DNA in hohem Überschuß nicht markierte, fragmentierte DNA des nicht gentechnisch veränderten Referenz-Organismus, in diesem Falle λ-DNA zugefügt. Dadurch sollte die DNASonde für das Fremdgen relativ zur restlichen Sonden-DNA angereichert werden und damit nach der Hybridisierung auf einen Southern Blot ein deutliches Signal auf der Bahn mit dem „GVO“ liefern. Diese Methode erwies sich nur innerhalb des beschriebenen, sehr einfachen Modellsystems als praktikabel und auch nur dann, wenn der „GVO“ Fremdgene in einem Ausmaß enthielt, das in der Realität nicht zu erwarten wäre (Foth, 1997). Die Anwendung der Methode scheiterte bereits im prokaryontischen Modellsystem L. sake (s. Kap. 2.1.1). Auch die bereits in Kap. 1.3.1 beschriebene Methode von Straus und Ausubel (1990) lieferte mit dem prokaryontischen Modellsystem L. sake keinen Nachweis der GVMO. Als Tester-DNA diente enzymatisch geschnittene DNA des Stamms L. sake ATP, als Driver DNA gleichartig geschnittene und biotinylierte DNA des Wildtyp-Stamms L. sake 23K. Es wurden fünf Zyklen der Subtraktiven Hybridisierung jeweils mit einem hohen Überschuß an Driver-DNA durchgeführt, wobei die biotinylierten Hybride mit streptavidin-beschichteten Magnetpartikeln (Merck BioBeads) aus der Hybridisierungslösung entfernt wurden. Die verbliebenen, nicht-biotinylierten Hybride wurden mit Adaptern versehen und in einer PCR amplifiziert. Die Amplifikate entsprachen aber nicht den nachzuweisenden Fremdgenen. 1.3.4 Anpassung der RDA an die Erfordernisse zum Nachweis von GVMO Die RDA verspricht verglichen mit anderen Methoden der genomischen Subtraktion eine außerordentlich starke Anreicherung speziesspezifischer oder gewebespezifischer Gene. Ob diese Leistungsfähigkeit auch ausreichen würde, in einem realitätsnahen Modellsystem Fremdgene und damit die GVMO nachzuweisen, sollte in dieser Arbeit geklärt werden. Dafür wurde jeweils ein prokaryontischer und ein eukaryontischer Modell-Organismus ausgewählt, der sowohl in der Art und dem Umfang der gentechnischen Veränderung den Anforderungen entsprach, als auch hinsichtlich seiner Relevanz für die Lebensmittel-Biotechnologie. Außerdem wurde auf das 20.

(21) kommerziell erhältliche PCR-SelectTM cDNA Subtraction Kit der Firma Clontech zurückgegriffen, da damit auch ein späterer Einsatz des Nachweisverfahrens im Routinebetrieb einfach zu bewerkstelligen wäre. Die Arbeitsvorschriften aus dem Kit sollten für die Arbeit mit Gesamt-DNA modifiziert werden. Im wesentlichen galt es, die Bedingungen für eine Anreicherung weniger single-copy Fremdgene einschließlich ihrer Steuerungselemente aus einem hoch komplexen Genom heraus zu ermitteln. In Bezug auf das eukaryontische Modellsystem wurde hier Neuland betreten, da genomische Subtraktion bisher stets von bakterieller DNA ausging und auf eukaryontischer Ebene von der cDNA des zu untersuchenden Organismus bzw. Gewebes. Darüber hinaus sollte eine Methodik etabliert werden, die angereicherten GenFragmente zu isolieren und ihre Herkunft zu bestimmen, um damit den Nachweis von GVMO zu führen. 1.4 Charakterisierung der Modell-Organismen Lactobacillus sake und Penicillium. nalgiovense 1.4.1 Taxonomische und physiologische Einordnung 1.4.1.1 Lactobacillus sake Die Milchsäurebakterien werden in der Familie der Lactobacteriaceae zusammengefaßt, wobei die Gattung Lactobacillus mehr als 50 Arten umfaßt (Miteva et al., 1992). Obwohl die Gruppe morphologisch uneinheitlich erscheint und Lang- und Kurzstäbchen sowie Kokken einschließt, ist sie physiologisch relativ gut zu charakterisieren. Alle Angehörigen sind gram-positiv, bilden keine Sporen und sind mit Ausnahmen unbeweglich. Zur Energiegewinnung sind sie durchweg auf Kohlehydrate angewiesen und scheiden Milchsäure (Lactat) aus. Im Gegensatz zu den ebenfalls Lactat produzierenden Enterobacteriaceae sind sie obligate Gärer. Sie enthalten keine Hämine (Cytochrome, Katalase). Trotz dieses Mangels sind die Lactobacteriaceae in der Lage, in Gegenwart von Luftsauerstoff zu wachsen, sie sind anaerob aber aerotolerant (Schlegel, 1985). Lactobacteriaceae haben die Fähigkeit zur Synthese vieler Metabolite verloren. Sie haben einen hohen Bedarf an Aminosäuren, Peptiden, Nucleotiden, Vitaminen, Salzen und fermentierbaren Kohlehydraten. Nach ihrer Eigenart, Glucose entweder nur zu Lactat oder daneben auch zu anderen Gärprodukten und CO2 zu vergären, teilt man die Milchsäurebakterien in homofermentative und heterofermentative ein. Homofermentative Lactobacillen bilden reines Lactat. Bei den heterofermentativen Milchsäurebakterien entsteht neben Lactat auch Ethanol (Schlegel, 1985). 21.

(22) Mit den hohen Nährstoffansprüchen und der Art der Energiegewinnung hängt die Verbreitung der Lactobacteriaceae in der Natur zusammen. Sie sind Teil der Normalflora vieler Tiere, einschließlich des Menschen. Obwohl vereinzelt über eine Beteiligung der Lactobacteriaceae bei schweren Infektionen berichtet wird, gelten die Lactobacteriaceae als nicht pathogen. Aufgetretene Infektionen mit Lactobacillus stellten sich in der Vergangenheit als Kontaminationen, als Sekundärbesiedlung oder aber als falsch identifizierte Streptokokken-Infektion heraus (Aguirre und Collins, 1993). Roussel et al. (1993) bestimmten für Milchsäurebakterien eine Genomgröße von ca. 2 x 106 bp, damit zählen sie zu den Prokaryoten mit einem eher kleinen Genom. Der GC-Gehalt der DNA beträgt 32-53% (L. sake: 42-44%). Innerhalb der Art L. sake beträgt die DNA-Homologie lediglich 76-100%. Anhand dieser Ergebnisse wurde inzwischen vorgeschlagen, die Art in die Subspezies L. sake subsp. sake und L. sake supsp. carnosus zu unterteilen. (Torriani et al., 1996). 1.4.1.2 Penicillium nalgiovense Die Gattung Penicillium gehört zu den Deuteromycetes oder Fungi imperfecti, sie umfaßt mehr als hundert Arten. Der Name leitet sich von der charakteristischen Form der Konidiophoren ab, die in einem Büschel von verzweigten Ästen (lat. Penicillus) enden. Penicillium Arten sind vorwiegend in den gemäßigten klimatischen Regionen anzutreffen, dort aber in Boden, Wasser, Luft und Innenräumen sehr häufig vertreten. Penicillien sind Saprobionten, gewinnen also ihre Energie aus dem Abbau toter organischer Substanz. Sie pflanzen sich überwiegend vegetativ fort und sind in der Lage, Sporen zu bilden. Wie die meisten Schimmelpilze sind auch die Arten der Gattung Penicillium i.d.R. sehr anspruchslos und wachsen daher auf den unterschiedlichsten Substraten und in einem weiten Temperaturbereich. Daher spielen sie auch eine bedeutende Rolle als Lebensmittelverderber und Materialzersetzer. Die Art P. nalgiovense ist beispielsweise häufig am Verschimmeln von Weichkäse beteiligt. Einige Penicillien besiedeln die menschliche Haut, gedeihen dort als Opportunisten und können auch an Haut-Mykosen beteiligt sein. Im engeren Sinne pathogen ist aber keine Penicillium Art. Zur Gattung Penicillium gehört auch eine Reihe von Mycotoxinbildnern, darunter auch die lebensmitteltechnologisch relevante Spezies P. roqueforti. P. nalgiovense ist demgegenüber nicht fähig zur Synthese bekannter Mycotoxine (Reiß, 1997). Penicillien haben ein Genom einer Größe von ca. 5 x 107 bp und sind im Gegensatz zu Hefen im molekulargenetischen Sinne echte Eukaryonten (Alberts et al., 1995).. 22.

(23) 1.4.2 Einsatz der Modell-Organismen in der Lebensmittel-Biotechnologie 1.4.2.1 Lactobacillus sake Der auf der Ansäuerung ihrer Umgebung durch die Ausscheidung von Lactat beruhenden sterilisierenden und konservierenden Wirkung verdanken die Milchsäurebakterien ihre breite Verwendung in der Landwirtschaft, in der milchverarbeitenden Industrie und in der Lebensmittelherstellung (Ruiz-Barba et al., 1991). Man verwendet sie als Starterkulturen in MilchGetreide-, Fleisch- und Fischprodukten, zur Fermentation von Bier, (Reis-)Wein, Obst und Fruchtsäften, eingelegtem Gemüse, Sauerkraut, Silagen, Sauerteig und Maische. Die Art L. sake befindet sich als Starterkultur vorwiegend in japanischem Reiswein (Sake), in Sauerkraut und in Rohwurst wie z.B. Salami (Schlegel, 1985; Rodtong und Tannock, 1993; Mäkelä et al., 1992; Geisen und Holzapfel, 1995). 1.4.2.2 Penicillium nalgiovense Die Fähigkeit zur Bildung einer Vielzahl von Primär- und Sekundärmetaboliten macht Schimmelpilze zu biotechnologisch höchst interessanten Organismen. Dies nutzt man biotechnologisch bei der Produktion von Enzymen, Pharmazeutika und Aromastoffen sowie zur Veredelung von Lebensmitteln. Drei Arten der Gattung Penicillium sind bei der Lebensmittelherstellung von Relevanz: P. camemberti und P. roqueforti zur Produktion von Weichbzw. Schimmelkäse sowie P. nalgiovense zur Herstellung von Rohwürsten und anderen Fleischwaren. Im letzteren Fall erfolgt das Wachstum des Pilzes ausschließlich auf der Oberfläche der Rohware. Das dichte Mycel gibt Stoffwechselprodukte in das Innere der Wurst oder des Schinkens ab und hat dabei gleichzeitig die Funktion einer Schutz- und einer Starterkultur. Beispielhafte Endprodukte aus der Fermentation mit P. nalgiovense sind Salami, Bündner Fleisch, Tiroler Bauernspeck oder Amerikanischer Knochenschinken (Reiß, 1997).. 23.

(24) 2. Material und Methoden 2.1 Organismen 2.1.1 Herkunft und Eigenschaften der Lactobacillus sake Stämme Die in dieser Arbeit benutzten, gentechnisch veränderten Lactobacillus sake Stämme wurden von Dr. M. Zagourec, vom Institut National de la Recherche Agronomique (INRA), Jouy-en-Josas (Frankreich) zur Verfügung gestellt, ebenso der Wildtyp, von dem die GVO-Stämme abgeleitet wurden. Bei den GVO handelte es sich um drei Lactobacillus sake Stämme, die durch homologe Rekombination mit einem um ein Erythromycin-Resistenzgen (emr) von Streptococcus faecalis erweiterten, auf pBluescript SK basierenden Vektor pRV 300 (Kok et al. , 1984; Simon and Chopin, 1988; Leloup et al., 1997) transformiert wurden. Mit diesem Vektor wurde beim Stamm L. sake ATP das Gen atp, beim Stamm L. sake CLP das Gen clp und beim Stamm L. sake PTS das Gen pts übertragen. Die anderen Wildtyp-Stämme wurden von der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen (DSM) und vom Institut für Lebensmitteltechnologie (IfLTH) der Universität Hohenheim bezogen. Tabelle 2.1: Charakterisierung der in dieser Arbeit verwendeten Lactobacillus sake Stämme. BEZEICHNUNG L. sake ATP L. sake CLP L. sake PTS L. sake 23K L. sake DSM 20017 L. sake LTH 938 L. sake LTH 947 L. sake LTH 948. STATUS GVO GVO GVO Wildtyp (original) Wildtyp (alternativ) Wildtyp (alternativ) Wildtyp (alternativ) Wildtyp (alternativ). GENTECHNISCHE VERÄNDERUNGEN ATP-Synthase-Gen atp, emr, pBSK Protease-Gen clp, emr, pBSK Phosphotransferase-Gen pts, emr, pBSK Keine Keine Keine Keine Keine. HERKUNFT INRA INRA INRA INRA DSM IfLTH IfLTH IfLTH. Die Sequenzen der Gene atp, clp, pts (s. Anhang) wurden uns vom INRA zur Verfügung gestellt, allerdings nicht die komplette Sequenz des Vektors pRV 300, die bisher auch nicht in den Datenbanken Genbank oder EMBL veröffentlicht worden ist. Die Funktionen der Gene atp, clp 24.

(25) und pts sind in der Tab. 2.1 beschrieben, bezüglich ihrer Herkunft wurde vom INRA lediglich mitgeteilt, daß sie aus einem Milchsäurebakterium stammen. Bei allen GVO-Stämmen sind die Zusatz-Gene stabil genomisch integriert, über den Integrationsort und die Kopienzahl liegen keine Angaben vor (Zagourec, pers. Mitteilung 1997). Bei den Wildtyp-Stämmen, die alternativ zum Stamm L. sake 23K als Referenz eingesetzt wurden, handelte es sich um ein Umwelt-Isolat von der DSM und vier Laborstämme, die in lebensmitteltechnologischen Forschungsarbeiten am IflTH verwendet werden. 2.1.2 Herkunft und Eigenschaften der Penicillium nalgiovense Stämme Die in dieser Arbeit benutzten Stämme von P. nalgiovense wurden von Dr. R. Geisen von der Bundesforschungsanstalt für Ernährung (BFE) in Karlsruhe zur Verfügung gestellt. Es handelte sich dabei um die zwei gentechnisch veränderten Stämme BFE 19 und BFE 20, den WildtypStamm BFE 66, der als Wirtstamm für die Transformationen diente, sowie den „alternativen“ Wildtyp BFE 328. Beide GVO-Stämme wurden mit den Plasmiden p3SR2 und pKW 100 transformiert, die an unterschiedlichen Orten im Genom stabil integriert wurden (Geisen und Leistner, 1989; Geisen, pers. Mitteilung 1998). Die Plasmide sind 13 kb und 8,7 kb groß. Auf den Plasmiden sind folgende Gene lokalisiert: Ein Acetamidase-Gen amdS von Aspergillus nidulans, das β-Galactosidase-Gen lacZ von Escherichia coli, ein Ampicillin-Restistenzgen ampr unbekannter Herkunft, ein Ornithin-Carbamoyltransferase-Gen argB von Aspergillus nidulans sowie der Oligomycin-C-Resistenzgen-Promotor und der trpC-Terminator von Aspergillus nidulans. 2.2 Kultivierung der Mikroorganismen 2.2.1 Kultivierung von Lactobacillus sake Zur Kultivierung der L. sake Stämme wurde das Vollmedium MRS (DeMan et al.,1960) verwendet. Ausnahme: Die Stämme L. sake ATP und L. sake PTS wurden in MRS+-Medium kultiviert. Die Bakterien wurden mittels 3-Ösen-Ausstrich auf MRS-Agarplatten bzw. MRS+Agarplatten ausgebracht und über Nacht bei 30 °C inkubiert. Einzelne Klone wurden mit einem sterilen Zahnstocher in 5 ml Medium überführt und ebenfalls über Nacht bei 30 °C unter Schütteln inkubiert. Anschließend wurde die Vorkultur in 120 ml vorgewärmtes Medium überführt und nochmals für 24 h bei 30 °C unter Schütteln inkubiert. Den Medien wurde bei der Kultivierung der GVO-Stämme kein Erythromycin zugegeben, da das Gen emr auch ohne Selektionsdruck stabil im Genom verbleibt. 25.

(26) 2.2.2 Kultivierung von Penicillium nalgiovense Die Schimmelpilze wurden in Malzextrakt-Medium bzw. auf Malzextrakt.Agar bei 25 °C in der Dunkelheit kultiviert. Ein Bakterienwachstum wurde mit Kanamycin (50 µg/ml) unterdrückt. Für präparative Zwecke wurden Flüssigkulturen von 250 ml 5 Tage lang unter kräftigem Schütteln inkubiert. 2.3 DNA-Isolierung 2.3.1 DNA-Isolierung aus Lactobacillus sake Es wurde eine Methode zur Isolierung der Gesamt-DNA gram-positiver Bakterien angewandt (Stahl et al., 1990), die in einigen Punkten nach dem Protokoll zur Aufreinigung von DNA über einen CsCl-Gradienten (Sambrock et al., 1989) modifiziert wurde. 125 ml Bakterienkultur aus exponentiellem Wachstum wurden in Zentrifugenbecher überführt und 10 min lang bei 4000 x g und 4 °C zentrifugiert. Das Pellet wurde in 10 ml eiskaltem TSE-Puffer suspendiert und nochmals bei 4000 x g und 4 °C zentrifugiert. Das Pellet wurde in 3 ml TSES-Puffer suspendiert, dann 2 ml TSES mit 120 mg Lysozym und 140 U Mutanolysin hinzugefügt, 2 h bei 42 °C inkubiert und gelegentlich aufgeschüttelt. Zu jeder Probe wurden 3 mg Proteinase K hinzugegeben und bei 37 °C für 30 min inkubiert. Dem Lysat wurde 1 ml NaCl-Lösung (5%), 2 ml SDS-Lösung (20%) und 10,4 ml TSE-Puffer zugegeben, die Suspension sanft mit einem Glasstab zu einer homogenen Lösung verrührt und für 15 min bei 65 °C inkubiert. Die Suspension wurde auf RT abgekühlt und dann 1 mal mit einem Volumen Phenol/Chloroform extrahiert. Anschließend wurde 10 min bei 16000 x g zentrifugiert. Die wäßrige Oberphase wurde in ein neues Gefäß überführt und mit 1 Volumen Chloroform/Isoamylalkohol extrahiert. Erneut wurde bei 16000 x g für 10 min zentrifugiert. Die DNA wurde durch Zugabe von 0,2 Volumen Ammoniumacetat-Lösung (10 M) und 2,5 Volumen eiskaltem Ethanol präzipitiert. Durch die anschließende Zentrifugation für 15 min bei 16000 x g wurde die DNA pelletiert. Das Pellet wurde in 14 ml TE gelöst und 1,12 ml Ethidiumbromid (10 mg/ml) hinzugegeben. Anschließend wurden zu der DNA-Lösung 14 g CsCl hinzugegeben und die Proben auf 37 °C erhitzt, bis sich das CsCl vollständig gelöst hatte. Die DNA-Lösung wurde mit einer Pasteurpipette luftblasenfrei in die Ultrazentrifugationsröhrchen gefüllt, die Röhrchen mit flüssigem Paraffin aufgefüllt, auf 0,01 g genau austariert und verschlossen. Die Proben wurden für 16 h bei 45000 rpm und 20 °C im VT 8651-Rotor zentrifugiert. Die DNA-Bande wurde unter 26.

(27) UV-Licht (366 nm) in dem CsCl-Gradienten sichtbar gemacht und mit einer Spritze aus dem Gradienten herausgesogen. Das Ethidiumbromid wurde durch die Zugabe von 1 Volumen TEgesättigtem n-Butanol extrahiert. Diese Extraktion wurde bis zur vollständigen Entfernung des Ethidiumbromids wiederholt (ca. 3-6 mal). Anschließend wurde die DNA-Lösung in Dialyseschläuche gefüllt und gegen das 100-fache Volumen TE bei 4 °C über Nacht dialysiert. Nun wurde die Lösung in ein 13 ml Sarstedt-Röhrchen überführt, 0,2 Volumen Ammoniumacetat-Lösung (10 M) hinzugegeben und die DNA mit 2,5 Volumen eiskaltem Ethanol präzipitiert. Die DNA wurde durch Zentrifugation für 30 min bei 12000 x g und 4 °C pelletiert, das Pellet mit 70% Ethanol gewaschen und die DNA in TE gelöst. 2.3.2 DNA-Isolierung aus Penicillium nalgiovense Die Isolierung von Gesamt-DNA aus filamentösen Pilzen erfolgte nach der Methode von Zhang et al. (1996). Das Pilzmycel einer Flüssigkultur wurde durch ein steriles Filterpapier vom Medium abfiltriert und mit demin. Wasser gewaschen. 5 bis 10 g Mycel wurden in flüssigem Stickstoff mit einem Mörser sehr fein pulverisiert und in 20 ml CTAB-Puffer suspendiert. Die Suspension wurde 1 h lang bei 65 °C inkubiert, auf RT heruntergekühlt und mit einem Volumen Chloroform/Isoamylalkohol extrahiert. Aus der wäßrigen Phase wurden die Nucleinsäuren mit 0,6 Volumen Iso-Propanol ausgefällt und durch Zentrifugation bei 8000 x g pelletiert. Das Pellet wurde mit 70% Ethanol gewaschen und in 5 ml demin. Wasser gelöst. Zum RNA-Abbau wurde 3 g RNase zugegeben und 1 h lang bei 37 °C inkubiert. Die Lösung wurde mit einem Volumen PCI-Mix und anschließend mit einem Volumen Chloroform/Isoamylalkohol extrahiert. Die DNA wurde durch Zugabe von 0,1 Volumen Natriumacetat-Lösung (3 M) und 2,5 Volumen Ethanol präzipitiert und bei 12000 x g abzentrifugiert. Das Pellet wurde mit 70% Ethanol gewaschen und die DNA in TE gelöst. 2.4 Standard-Methoden der Molekularbiologie Falls nicht anders angegeben, wurden alle Methoden nach Sambrook et al. (1989) mit geringfügigen laborinternen Modifikationen durchgeführt. 2.4.1 Agarose-Gelelektrophorese Die Agarose (0,8% - 2% in 1 x TAE-Puffer) wurde durch Aufkochen in der Mikrowelle vollständig gelöst. Die Lösung wurde auf ca. 60 °C abgekühlt, der Flüssigkeitsverlust mit demin. 27.

(28) Wasser ausgeglichen und in die vorbereitete Gelkammer gegossen. Nach dem Auspolymerisieren wurden die DNA-Proben mit 0,1 Volumen Probenauftragspuffer versetzt und das Gel mit den Proben beladen. Nach der Auftrennung der DNA bei einer Feldstärke von ca. 10 V/cm wurde das Gel für mindestens 20 min mit Ethidiumbromid (0,5 mg/l in TAE-Puffer) angefärbt, die DNA im UV-Licht bei 366 nm visualisiert und fotografiert. 2.4.2 Southern Blot Nach der gelelektrophoretischen Auftrennung der DNA wurde diese im alkalischen Blotverfahren auf eine Nylonmembran transferiert. Hierzu wurden die Membran und 2 Whatman-Filterpapiere kurz in 2x SSC äquillibriert und in die Blotting-Apparatur gelegt. Darauf wurde eine Folienmaske und schließlich das Agarosegel luftblasenfrei auf die Membran gelegt. An der Vakuumpumpe wurde ein Unterdruck von ca. 50 hPa eingestellt. Das Gel wurde während des 75 - 90 minütigen Blotvorgangs mehrfach mit alkalischer Transferlösung (0,4 M NaOH) überschichtet. Nach der Entfernung des Gels wurde die Membran kurz in 2 x SSC äquillibriert und konnte nun direkt zur Hybridisierung verwendet oder bei 4 °C in 2x SSC gelagert werden. 2.4.3 Herstellung von DNA-Sonden Um DNA-Fragmente als Sonden verwenden zu können, wurden sie nach dem DigoxigeninDNA-Labeling-System (Boehringer) markiert. Nach 10 minütiger Hitzedenaturierung der DNA (ca. 1 µg/15µl) im kochenden Wasserbad und Zwischenlagerung im Eiswasserbad wurden zu der DNA je 2 µl Hexanucleotidmix und DNA-Labeling-Mix gegeben. Nach der Addition von 1 µl Klenow-Polymerase (5U/µl) wurde der Reaktionsansatz für 1 - 24 h bei 37 °C inkubiert. Die Reaktion wird durch Zugabe von 2 µl EDTA-Lösung (0,5 M) gestoppt. Zur Kontrolle der Markierungseffizienz wurde eine Verdünnungsreihe der markierten DNA neben einer solchen Reihe mit DIG-markierter Kontroll-DNA (Boehringer) auf eine Nylonmembran aufgetragen. Nach Antrocknen der Proben wurde die Membran kurz in DIGPuffer 1 gewaschen, darauffolgend für 30 min bei RT in DIG-Puffer 2 inkubiert. Der Puffer 2 wurde verworfen und die Membran für 30 min in Anti-DIG-Antikörper-Alkalische-PhosphataseKonjugat (Anti-DIG-AP, 1:10000 mit DIG-Puffer 2 verdünnt) inkubiert. Dann folgte 2 x Waschen für je 15 min in DIG-Puffer 1 sowie 2 min Inkubation der Membran in DIG-Puffer 3. Die Membran wurde mit 1 ml Detektionslösung (NBT + X-Phosphat) in Folie eingeschweißt und 1 - 16 h lang im Dunkeln gelagert. Die Intensität der sich entwickelnden Grau- bis 28.

(29) Dunkelblaufärbung der einzelnen Dots konnte schließlich miteinander verglichen und daraus die Markierungseffizienz berechnet werden. 2.4.4 Hybridisierung auf festphasengebundene DNA und DIG-Nachweis Die durchgeführten Hybridisierungen wurden nach dem Boehringer-Protokoll zur Hybridisierung mit DIG-markierten Sonden durchgeführt und erfolgten in verschließbaren Glasröhren, in der Regel unter hoch stringenten Bedingungen. Die auf Kunststoffgaze gelagerte Membran wurde für mindestens 1 h im Hybridisierungsofen in 10 ml Prähybridisierungslösung prähybridisiert. 100 ng DIG-markierte Sonde für wurden 10 min lang bei 95 °C denaturiert und in 5 ml Hybridsierungslösung aufgenommen. Die Prähybridisierungslösung wurde verworfen und durch die Hybridisierungslösung ersetzt. Die Hybridisierung erfolgte über Nacht. Nach dem Abgießen der Hybridisierungslösung folgte 2 mal 5 minütiges Waschen der Membran in 2 x SSC + 0,1% SDS bei RT, dann 2 mal 15 minütige Stringenzwäsche in 0,1 x SSC + 0,1% SDS bei 68 °C. Zur Visualisierung der Sonde wurde die Membran für 1 min in DIG-Puffer 1 äquillibriert, dann 30 min in DIG-Puffer 2 und 30 min mit 1:10000 in Puffer 2 verdünnten Anti-DIG-AP-Konjugat inkubiert. Es folgte 2 x Waschen für je 15 min in DIG-Puffer 1, sowie Äqullibrieren für 2 min in DIG-Puffer 3. Die Membran wurde in einen Folienschlauch gelegt, mit 1 - 2 ml Detektionslösung (NBT + X-Phosphat) benetzt und eingeschweißt. Die Farbreaktion erfolgte für 1 bis 16 h im Dunkeln bei RT. Anschließend wurde die Membran kurz in TE inkubiert und fotografiert. 2.4.5 Polymerase Kettenreaktion (PCR) Die Polymerase-Chain-Reaction (PCR) stellt ein in-vitro-Verfahren zur selektiven Anreicherung von DNA-Fragmenten aus einem Gemisch von Nukleinsäuremolekülen dar und wurde nach dem PCR Applications Manual von Boehringer (1995) durchgeführt. Für eine Standard-PCR wurden pipettiert: 10 ng. DNA (template). 5 µl. 10 x PCR-Puffer. 1,5 µl. MgCl2 (50 mM). 50 pmol. Primer A. 50 pmol. Primer B 29.

(30) 0,5 µl. dNTP-Mix (jeweils 20 mM). 1U. Taq-Polymerase. ad 50 µl 50 µl. H2O bidest. Mineralöl (überschichten). Die Standard-PCR wurde im Thermocycler mit folgendem Programm durchgeführt: Zuerst erfolgte eine 5 minütige Denaturierung der DNA bei 95 °C. In dieser Phase erfolgte der „hot start“ durch die Zugabe der Taq-Polymerase. Das Programm durchlief 25 - 35 folgender Zyklen: Das Annealing der Primer erfolgte für 1 min, die Elongation für 1 min bei 72 °C und die Denaturierung der DNA für 45 sec bei 95 °C. Die PCR wurde durch eine finale Elongation bei 72 °C für 5 min abgeschlossen. Die Annealing-Temperatur wurde je nach Sequenz der eingesetzten Primer nach folgender Formel ermittelt: Tm = 4 °C x (Fraktion G+C) + 2 °C x (Fraktion A+T) Tanneal = Tm + 5 °C. 2.4.6 Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegel Die Elution von DNA aus einem Agarosegel wurde mit dem QuiaQuick Gel Extraktions-Kit (Quiagen) durchgeführt. Die gewünschte DNA-Bande wurde aus dem Gel ausgeschnitten und der Block gewogen. Pro 100 mg Gewicht wurden 300 µl Puffer QG zugegeben und der Agaroseblock bei 50 °C bis zu seiner Auflösung inkubiert. Nach Zugabe von einem Volumen Iso-Propanol wurde die Lösung per Zentrifugation über eine DNA-bindende Membran filtriert. Im Zentrifugationsverfahren wurde die Membran mit dem Puffer PE gewaschen und die DNA mit 50 µl Puffer EB eluiert. Je nach Bedarf wurde die DNA anschließend mit NatriumacetatLösung und Ethanol präzipitiert, gewaschen und in einem geringen Volumen TE oder demin. Wasser gelöst. 2.4.7 Isolierung von DNA-Fragmenten aus Polyacrylamid-Gel Die DNA-spots aus einem silbergefärbten 2D-PA-Gel wurden auf einem Leuchttisch mit einem Skalpell ausgeschnitten und in 100 µl Crush-and-Soak-Puffer (Sambrook et al., 1989) 1 h lang bei 37 °C inkubiert. Die Gelstücke wurden anschließend mit einer Pipettenspitze zerkleinert und die Suspension über Nacht bei 37 °C inkubiert. Die Suspension wurde bei 12000 x g zentrifugiert und vom Überstand 1 µl zur Reamplifikation der DNA in eine PCR gegeben. 30.

(31) 2.4.8 Klonierung von PCR-Fragmenten 2.4.8.1 Ligation und Transformation mit dem Vektor pZErO Der Vektor pZErO 2.1 wurde mit dem Restriktionsenzym Eco RV geschnitten (blunt ends), die Reaktion durch Extraktion mit PCI-Mix gestoppt und der Vektor aus der wäßrigen Phase ausgefällt. Die Vektor-DNA wurde gewaschen und in einem geringen Volumen demin. Wasser gelöst. Als Insert-DNA wurden die Endprodukte der Suppression-PCR eingesetzt. Diese wurden aus einem Agarosegel herauseluiert und in einer PCR mit den nested Primern reamplifiziert. Die PCR-Fragmente wurden erneut aus einem Agarosegel herauspräpariert und mit dem Restriktionsenzym Rsa 1 geschnitten, um die Adapter abzutrennen und blunt ends zu erzeugen. Nach einer weiteren Aufreinigung über ein Agarosegel wurden die DNA-Fragmente in einem geringen Volumen demin. Wasser gelöst und nach folgendem Pipettierschema mit dem Vektor ligiert: 7 µl. Insert DNA (ca. 500 ng). 1 µl. Vektor pZErO (ca. 100 ng). 1 µl. 10fach Ligationspuffer. 0,1 µl. T4 DNA-Ligase (1U). Die Inkubation des Ligationsansatzes erfolgte für 2 h bei RT. Mit 2 µl jedes Ligationsansatzes wurden je 200 µl kompetenter Zellen E. coli TOP 10 transformiert. Dazu wurden die Transformationsansätze 30 min lang auf Eis gehalten, für 90 sec bei 42 °C hitzegeschockt und noch einmal für 10 min auf Eis inkubiert. Nach Zugabe von 0,8 ml SOC-Medium wurden die Transformanden 1 h lang bei 37 °C inkubiert. Je 200 µl dieser Kultur wurden auf LSLBAgarplatten ausgestrichen und die Platten über Nacht bei 37 °C inkubiert. Die Selektion der positiven Klone erfolgte dabei mit 50 µg/ml Kanamycin und 1 mM IPTG. Zur Überprüfung der Inserts wurde eine Plasmid Mini-Präparation angeschlossen. 2.4.8.2 Ligation und Transformation mit dem Vektor pGEM-T Der T-overhang-Vektor pGEM-T wurde von der Firma Promega bezogen. Er kann ohne weitere Vorbereitungen zur Ligation von A-tailing PCR-Produkten verwendet werden. Als Insert-DNA wurden die Endprodukte der Suppression-PCR eingesetzt. Diese wurden aus einem 2D-PA-Gel herauseluiert und in einer PCR mit den nested Primern reamplifiziert. Die 31.

(32) PCR-Fragmente wurden erneut aus einem Agarosegel herauspräpariert, in einem geringen Volumen demin. Wasser gelöst und nach folgendem Pipettierschema mit dem Vektor ligiert: 6 µl. Insert DNA (ca. 500 ng). 1 µl. Vektor pGEM-T (ca. 50 ng). 1 µl. 10fach Ligationspuffer. 1 µl. T4 DNA-Ligase (3U). Die Inkubation des Ligationsansatzes erfolgte über Nacht bei 10 °C. Mit 2 µl jedes Ligationsansatzes wurden je 100 µl kompetenter Zellen E. coli TOP 10 transformiert. Dazu wurden die Transformationsansätze 30 min lang auf Eis gehalten, für 90 sec bei 42 °C hitzegeschockt und noch einmal für 10 min auf Eis inkubiert. Nach Zugabe von 0,9 ml SOCMedium wurden die Transformanden 1 h lang bei 37 °C inkubiert. Je 100 µl dieser Kultur wurden auf LSLB-Agarplatten ausgestrichen und die Platten über Nacht bei 37 °C inkubiert. Die Selektion der positiven Klone erfolgte dabei mit 100 µg/ml Ampicillin, 80 µg/ml X-Gal und 1 mM IPTG anhand eines Blau/Weiß-Screenings. Zur Überprüfung der Inserts wurden wenige Zellen einer weißen Kolonie in 20 µl demin. Wasser suspendiert und 10 min lang bei 98 °C inkubiert. Die Suspension wurde bei 12000 x g zentrifugiert und 1 µl des Überstands als template in eine PCR mit den nested Primern eingesetzt. Die Größe der Inserts wurde anschließend in einer Agarose-Gelelektrophorese ermittelt. 2.4.9 Mini-Präparation von Plasmid-DNA Die „Boiling Mini-Prep“ wurde nach Holmes und Quigley (1981) durchgeführt. Mehrere Flüssigkulturen (1 ml TB/Kanamycin) wurden mit je einem Klon (s. Kap. 2.4.8.1) beimpft und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Die Zellen wurden pelletiert, mit je 1 ml STE-Puffer gewaschen, erneut pelletiert und in 350 µl STET-Puffer suspendiert. Zur Suspension wurden 25 µl LysozymLösung (10 mg/ml) gegeben, kurz bei RT und 40 sec lang bei 100 °C inkubiert. Nach Abkühlung im Eisbad wurde die Suspension bei 12000 x g zentrifugiert und das Pellet mit einem Zahnstocher entfernt. Die Plasmid-DNA wurde mit 0,1 Volumen Natriumacetat-Lösung (3 M) und 1 Volumen Iso-Propanol präzipitiert und bei 12000 x g abzentrifugiert. Das Pellet wurde mit 70% Ethanol gewaschen und für weitere Analysen in einem geringen Volumen TE gelöst. 2.4.10 Präparation von Plasmid-DNA. 32.

(33) Die Präparation größerer und hoch reiner Mengen an Plasmid-DNA zur Sequenzierung der Inserts erfolgte mit dem Nucleobond AX Kit der Firma Macherey-Nagel. Es wurden von den betreffenden Transformanden jeweils 5 ml Flüssigkulturen angelegt (LSLB-Medium mit 50 µg/ml Kanamycin oder 100 µg/ml Ampicillin) und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Die Zellen wurden durch Zentrifugation bei 5000 x g pelletiert und 1 x mit STE-Puffer gewaschen. Das Pellet wurde in 0,4 ml Puffer S1 suspendiert. Durch Zugabe von 0,4 ml stark alkalischem Puffer S2 und eine 5 minütige Inkubation bei RT wurden die Zellen lysiert. Es wurden 0,4 ml Puffer S3 zugegeben und 5 min lang auf Eis inkubiert. Die Suspension wurde bei 12000 x g 20 min lang zentrifugiert. Der Überstand wurde durch ein Milchfilter auf eine mit Puffer N2 äquilibrierte Säule Nucleobond AX 20 gegeben und das Säulenbett 3 x mit je 1 ml Puffer N3 gewaschen. Anschließend wurde die Plasmid-DNA mit 0,8 ml Puffer N5 eluiert und aus dem Eluat durch Zugabe von 0,6 ml Iso-Propanol ausgefällt und abzentrifugiert (12000 x g, 20 min). Das Pellet wurde mit 70% Ethanol gewaschen und die DNA in 100 µl demin.Wasser gelöst. 2.4.11 DNA-Sequenzierung und Sequenzanalyse Die Sequenzierung der Inserts der aus den Klonierungen hervorgegangenen Plasmide wurde als Auftragsarbeit an die Firma Genom Analytik GmbH (Bremen) vergeben. Die Sequenzierung erfolgte im Cycle-Sequencing-Verfahren mit den Primern M13 for/re in der Regel nur in der Hin-Reaktion, bei längeren Inserts in Hin- und Rück-Reaktion. Die Analyse der Herkunft der ermittelten Sequenzen erfolgte durch eine Abfrage in der Datenbank „Genbank“ des NCBI (http://www2.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez/). Die Übereinstimmung einer zu überprüfenden Sequenz mit einer in der Datenbank abgelegten Sequenz und die Ermittlung der genauen Position im Herkunfts-Gen erfolgte durch Alignments mit dem Programm BLAST (http://www2.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). Bei Sequenzen von Herkunfts-Genen, die nur Prof. Hildebrandt zugänglich gemacht wurden und in keiner Datenbank abgelegt worden sind, erfolgte die Analyse ausschließlich durch ein Alignment. 2.5 Representational Difference Analysis (RDA) Die RDA wurde mit dem PCR-SelectTM cDNA Subtraction Kit der Firma Clontech durchgeführt, allerdings wurde statt cDNA mit Gesamt-DNA gearbeitet. Damit entfielen die Arbeitsschritte zur cDNA-Synthese. Außerdem mußte der Arbeitsschritt der Subtraktiven Hybridisierung gegenüber dem Clontech-Protokoll durch zusätzliche Zugaben von Driver-DNA. 33.

(34) modifiziert werden, um der größeren Komplexität des Genoms gegenüber der cDNA Rechnung zu tragen (Thiermann, 1999). 2.5.1 DNA Restriktion Für einen RDA-Ansatz wurden jeweils 5 µg DNA jedes Stamms in einem Restriktionsansatz von 50 µl mit 15 U Rsa 1 über Nacht bei 37 °C geschnitten. Die Reaktion wurde durch Zugabe von EDTA gestoppt, der Ansatz auf 200 µl mit TE aufgefüllt und mit einem Volumen PCI-Mix 2 mal extrahiert. Aus dem wäßrigen Überstand wurde die DNA durch Zugabe von 0,1 Volumen Natriumacetat-Lösung (3M) und 2,5 Volumen Ethanol ausgefällt und bei 12000 x g abzentrifugiert. Das Pellet wurde mit 70% Ethanol gewaschen und in 15 µl demin. Wasser gelöst. 2.5.2 Adapter Ligation Es wurden zur Ligation die Adapter der Firma Clontech verwendet, bzw. anhand der Sequenzen aus dem Manual durch Hybridisierung der Oligonucleotide selbst hergestellte, gleichartige Adapter. Die geschnittene Tester-DNA wurde mit demin. Wasser 1 + 5 verdünnt. Die Ligation der Adapter 1 und 2R erfolgte in getrennten Ansätzen. Für einen Ligationsansatz wurden 2 µl der verdünnten Tester-DNA, 2 µl Adapter-Lösung (10 µM), 1 µl 10fach Ligationspuffer, 400 U T4 DNA-Ligase und demin. Wasser ad 10 µl pipettiert. Je 2 µl eines Ansatzes mit dem Adapter 1 und dem Adapter 2R wurden als nicht subtrahierte Kontrolle vermischt. Alle drei Ligationsansätze (Tester-1, Tester-2R, Kontrolle) wurden über Nacht bei 16 °C inkubiert. Die Ligation wurde durch Zugabe von EDTA und eine 5 minütige Inkubation bei 72 °C gestoppt und der Kontrollansatz für die Suppression-PCR (s. Kap. 2.5.4) mit demin. Wasser 1:1000 verdünnt. 2.5.3 Subtraktive Hybridisierung Im ersten Schritt erfolgte die Subtraktion der Tester-DNA mit Driver-DNA getrennt für die Ligationsansätze mit den Adaptern 1 und 2R. Es wurden jeweils 1,5 µl Tester-1 oder Tester-2R Ligationsansatz vermischt mit 1,5 µl Driver-DNA (aus unverdünntem Restriktionsansatz) und 1 µl 4fach Hybridisierungspuffer. Die Ansätze wurden mit Mineralöl überschichtet, für 1,5 min auf 98 °C erhitzt und anschließend insgesamt 8 h lang bei 63 °C inkubiert. Während dieser Inkubation wurde nach 1 h und nach weiteren 2 h in jeden Ansatz jeweils 1 µl frisch denaturierte. 34.