Anhang A: DNA-Sequenzen der Gene atp, pts und clp
Sequenz atp (824 bp):
GCGATTCCACTAGTTGTTGCTCGAAGTACAGCGATTGCGGCAACTAACGGCTTATTAATTCGTAATCGCCAAGCA ATTGAAGTGGCAGATCAAATTACGATGGTTTTAATGGATAAAACAGGGACATTGACGCAAGGGGCTTTTAAGGTC AATGCGGTTCAACCAACTGGCGAGATGTCAAAAACTCAATTGATGGCTTATATGGGTGCTTTGGAACGACACTCA AGTCATCCATTGGCAACTGGGATTTTAGCTTATAATGACGCTGAAAAAATTACGATGTCCCAAGCTGAAAATGTA CAAACGATTCAAGGAATCGGGCTGACAGGCGCAATTGAAGGGCAAACTTATCAAATCGTTACGGCCGATTATCTA CAAGAAAAGCAAATCGCATTTGATACGGCAGCCTTTGAAACTTTGGCGGCTAAAGGTAATTCCATTAGTTATCTA ATTCAAGGTCAAACTGTCTTAGGGATTGGTCGCGCAAGGGGGTTCAGTTGAAACCAGAAGCACTGACGTTCATCA AGGCATTGAAAAAGCGTCATATCCAACCGGTGATGTTGACTGGGGATAATCAACAGGTTGCCGAAAAGGTGGCGC AACAATTGGbTGGTATGACAGTTCAAGCCAATTTGAAGCCAGAAGATAAGGAAGCACTTGTACAAGATTACCAAG CAAAGGGTGAAGTGGTCTTGATGGTTGGCGATGGTGTCAACGATGCCCCTAGCTTGACGCGAGCTGATATTGGGA TTGCAATTGGTGCGGGCACGGATGTCGCAATTGATTCCGCAGATGTRATTTTGGTTAAGAGTAATCCGAACGAT
Sequenz pts (720 bp):
GAAGCTTATAAATCAGTTCTAGAAGGTATGGACGGCAAACCAGTTGTTGTGCGGACAATGGATATTGGTGGAGAT AAGAAATTACCTTACTTACCATTACCAGAAGAAATGAATCCGTTCTTAGGCTACCGAGCAATTCGGATTAGTTTA GATCGTGATGATATTTTCAGAACACAATTGCGCGCCTTATTACGTGCTTCTAACTATGGTAAGTTACGGATCATG TTCCCAATGATCGCAACTGTTGCTGAATTCCGTCAAGCTAAAGGGATTCTCGAAGATGAAAAAGCAAAATTAATT GCTGCAGGTCAAACTGTATCTGACGATTTACAAGTTGGGATGATGGTTGAAATTCCAGCCAGCGCCGTATTGGCT AACCAATTTGCTAAAGAAGTCGATTTCTTCAGTATCGGGACGAACGACTTGATTCAATACACAATGGCTGCTGAT CGGATGAACGAACGTGTTTCATACCTTTACCAACCTTATAATCCAGCAATCTTACGTCTTATTAAGAACGTCATT GACGCTTCTCATAAAGAAGGTAAGTGGACTGGTATGTGTGGGGAAGCTGCCGGAGATTCAATCATGGCACCACTC CTTGTCGGGATGGGCTTAGATGAATTCTCAATGAGTGCAACTTCTGTGTTACGAGTTCGTAGTTTGATGAAACGT TTAGATACAACTGAATTAACTGATTTAGTTGAAACAGCTGTTAAC
Sequenz clp (466 bp):
CTGCAGATTTAATCTTGGCTTCTAATTCCTTAGGATCCATCAAGGTAATCGTCAAGTTTTTCTTAGAGCCTGCTT CATCCAAAAGGTCGATAGCCTTATCAGGCAAATAACGATCTTGGATATAACGACTAGAAAGGGCCGCTGCTGCTT TAAGCGCCTCGTCCGTATAGTGAACGTGGTGATAACTTTCGTATTTATCTTGAAGCCCTTTGAGAATTAGAACGG TTTCGTCAACAGATGGTTCGTTGACCGCGACCGGTTGAAGACGACGTGCAAGGGCTGCGTCTTTTTCAATCTGAC GGAATTCATTATTAGTTGTGGCGCCAACGAGTTGTAATTCGCCACGCGCAAGAGCTGGCTTCAACACGTTACCAG CATCCATGCCGCCTTTCAGACATTTGCCGGCGCCAACGATTTCGTGAATTTCATCAATAAAGAGGATAATCTGCT TATTTTGTTTGAGCTC
Anhang B: Medien LSLB-Medium:
10 g Trypton, 5 g Hefeextrakt, 0,5 g NaCl ad 1 l demin. Wasser, pH mit NaOH (1 N) auf 7,0 einstellen. Autoklavieren. Zur Herstellung von Agarplatten zusätzlich 15 g Agar-Agar zugeben.
MRS-Medium:
10 g Trypton, 10 g Fleischextrakt, 5 g Hefeextrakt, 20 g Glucose, 5 g Natriumacetat, 2 g Ammoniumacetat, 2 g tri-Ammoniumcitrat, 2 g di-Kaliumhydrogenphosphat, 1 ml Tween 80, 200 mg Magnesiumsulfat, 50 mg Mangansulfat ad 1 l demin. Wasser, pH auf 6,5 einstellen. Zur Herstellung von Agarplatten zusätzlich 15 g Agar-Agar zugeben. Autoklavieren.
MRS+-Medium:
s. MRS-Medium, nur statt Glucose sind 20 g Glukonat zu verwenden. Autoklavieren.
Malzextrakt-Medium:
30 g Malzextrakt, 3 g Pepton, 5 g Glucose ad 1 l demin. Wasser. Zur Herstellung von Agarplatten zusätzlich 15 g Agar-Agar zugeben. Autoklavieren.
SOC-Medium:
20 g Trypton, 5 g Hefeextrakt, 0,5 g NaCl lösen und Zugabe von 10 ml KCl-Lösung (250 mM) ad 1 l demin. Wasser, pH mit NaOH (1 N) auf 7,0 einstellen. Autoklavieren. Vor Gebrauch Zugabe von 5 ml steriler MgCl2-Lösung (2 M) und 20 ml steriler Glucose-Lösung (1 M).
TB-Medium:
12 g Trypton, 24 g Hefeextrakt, 4 ml Glycerin ad 900 ml demin. Wasser. Autoklavieren. Vor Gebrauch Zugabe von 100 ml steriler Salzlösung (KH2PO4 0,17 M + K2HPO4 0,72 M).
Anhang C: Lösungen Crush-and-Soak-Puffer:
0,5 M Ammoniumacetat, 10 mM Magnesiumacetat, 1 mM EDTA, 0,1% SDS, mit Essigsäure (konz.) pH 8,0 einstellen.
CTAB-Puffer:
2% CTAB, 0,1 M Tris, 20 mM EDTA, 1,4 M NaCl, mit HCl (1 N) pH 8,0 einstellen.
Hybridisierungspuffer für die Subtraktive Hybridisierung, 4fach konzentriert:
200 mM Hepes, 2 M NaCl, 0,8 mM EDTA, mit NaOH (1 N) pH 8,0 einstellen.
PA-Gelpuffer Formiat/Tris, Stammlösung:
In 250 mM Ameisensäure so viel kristallines Tris-Base lösen, bis pH 8,0 erreicht ist.
PAGE-Elektrodenpuffer Hepes/NaOH:
200 mM Hepes, mit NaOH (5 N) ad pH 8,0.
2D-PAGE-Laufpuffer EDTA/NaOH:
25 mM EDTA, mit NaOH (1 N) ad pH 5,9.
PCI-Mix:
Salzgesättigtes Phenol + Chloroform + Isoamyl-Alkohol (25 + 24 + 1 Volumenanteile).
1x SSC:
0,15 M NaCl, 15 mM Natriumcitrat, pH 7,0.
STE-Puffer:
100 mM NaCl, 10 mM Tris, 1 mM EDTA, mit HCl (1 N) pH 8,0 einstellen.
STET-Puffer:
100 mM NaCl, 10 mM Tris, 1 mM EDTA, 5% Triton X-100, mit HCl (1 N) pH 8,0 einstellen.
TAE-Gelelektrophorese-Puffer (Stammlösung 50fach):
2 M Tris, 1 M Natriumacetat, 0,1 M EDTA, mit Essigsäure (konz.) pH 8,0 einstellen.
TE-Puffer:
10 mM Tris, 1 mM EDTA, mit HCl (0,1 N) pH 7,6 bis 8,0 einstellen.
TSE-Puffer:
100 mM Tris, 50 mM NaCl, 70 mM EDTA, mit HCl (1 N) pH 8,0 einstellen.
TSES-Puffer:
2fach TSE-Puffer + 50% Glucose-Lösung (1 + 1 Volumenanteil).
Verdünnungspuffer für die Subtraktive Hybridisierung:
20 mM Hepes, 50 mM NaCl, 0,2 mM EDTA, mit NaOH (0,1 N) pH 8,0 einstellen.
Anhang D, Abbildung 1.1: Schematische Darstellung der Representational Difference Analysis mit dem Clontech PCR-Select cDNA Subtraction Kit (Clontech Laboratories Inc., 1995).
Legende: DNA-Restriktionsfragment (Doppelstrang) Adapter 1
Adapter 2R Primer P1
Nested Primer Pn1 und Pn2R
Einander komplementäre DNA-Stränge bzw. die komplementären Sequenzen der Adapter 1 und 2R sind durch unterschiedliche Graustufen, aber gleichartige Symbole dargestellt. Die Adapter 1 und 2R sind ca. 40 Nucleotide lang und unterscheiden sich in einer ca. 20 Nucleotide langen Basenfolge am 3´-Ende. Die Sequenz des Primers P1 ist identisch mit dem ca. 20 bp langen äußeren (5´-)Abschnitt beider Adapter 1 und 2R, die Sequenz des Primers Pn1 ist identisch mit dem ca. 20 Nucleotide langen inneren (3´-)Abschnitt des Adapters 1, die Sequenz des Primers Pn2R ist identisch mit dem ca. 20 Nucleotide langen inneren (3´-)Abschnitt des Adapters 2R.
Vorbereitung: DNA-Restriktion und Adapter-Ligation
Die Gesamt-DNA des zu untersuchenden, gentechnisch veränderten Stamms (sog. Tester) und die Gesamt-DNA des nicht gentechnisch veränderten Referenz-Stamms (sog. Driver) wird mit einem Restriktionsenzym vollständig geschnitten, das DNA-Fragmente einer durchschnittlichen Länge von ca. 300 bp mit stumpfen Enden erzeugt (z.B. Rsa 1 oder Hae 3). Die fragmentierte Tester-DNA wird auf zwei Ansätze aufgeteilt. An die 5´-Enden der Fragmente werden die Adapter 1 und 2R ligiert. Die Adapter bestehen aus einem ca. 40 b langen Oligonucleotid (s.
Legende) und einem 15 b langen Oligonucleotid (ohne Abbildung) mit einer Sequenz, die komplementär zum 3´-Ende des längeren Oligonucleotids ist. Das kürzere Oligonucleotid ist an seinem 5´-Ende dephosphoryliert, so daß keine Ligation an den 3´-Enden der doppelsträngigen DNA-Fragmente erfolgen kann, es wird durch eine Erwärmung nach erfolgter Ligationsreaktion vom Ligationsprodukt abgespalten. Dieses Oligonucleotid dient der Formierung einer Struktur – doppelsträngige DNA mit einem Einzelstrangbruch – die von der Ligase als Substrat erkannt werden kann und damit der Festlegung der Ausrichtung des eigentlichen
Adapter-Oligonucleotids. Durch die sehr hohe Konzentration von Adapter-Molekülen und Ligase ist trotz der ungünstigen Bedingungen (blunt-end-Ligation) eine gute Ausbeute an Fragmenten
gewährleistet, die an beiden Enden in Verlängerung des 5´-endenden Strangs einen Adapter tragen. Die Tester-DNA ist damit durch eine PCR mit passenden Primern amplifizierbar, Driver-DNA, die keine Adapter trägt, nicht.
1. Arbeitsschritt: Subtraktive Hybridisierung (1A und 1B)
Die fragmentierte Tester-DNA mit dem Adapter 1 wird mit einem hohen Überschuß an Driver-DNA vermischt, ebenso der Ansatz der Tester-Driver-DNA 2R. Durch eine Hitze-Denaturierung werden die Doppelstränge in Einzelstränge getrennt. Unter hoch stringenten
Hybridisierungsbedingungen können sich anschließend in den Ansätzen 1A und 1B in
Abhängigkeit von Konzentration und Zeit wieder DNA-Doppelstränge ausbilden. Durch den hohen Überschuß an Driver-DNA werden DNA-Einzelstränge aus der Tester-DNA vorwiegend mit komplementären Strängen der Driver-DNA hybridisieren (Molekül c). Tester-spezifische Einzelstränge hingegen verbleiben einzelsträngig (Molekül a) oder hybridisieren mit einem komplementären Strang aus der Tester-DNA (Molekül b). Hybride oder DNA-Einzelstränge der Driver-DNA sind als Moleküle d bezeichnet, sie tragen keine Adapter und können daher in der weiteren Betrachtung vernachlässigt werden.
2. Arbeitsschritt: Vereinigung der Subtraktions-Ansätze A und B
Im zweiten Hybridisierungs-Schritt werden die Ansätze 1A und 1B (unter Zugabe frisch denaturierter Driver-DNA) vereint, ohne sie vorher zu denaturieren. Dadurch können aus verbliebenen DNA-Einzelsträngen Doppelstränge gebildet werden. Dies betrifft auch die tester-spezifischen Moleküle a. Hybridisieren in diesem Schritt komplementäre Einzelstränge 1Aa und 1Ba miteinander, so entstehen die Moleküle e, doppelsträngige DNA-Fragmente, die an einem Ende den Adapter 1 und am anderen Ende den Adapter 2R tragen. Darüber hinaus verbleiben durch die Vereinigung der Ansätze 1A und 1B die Moleküle b bis d und bei unvollständiger Hybridisierung auch einige Moleküle a unverändert.
3. Arbeitsschritt: Ergänzung adapter-komplementärer DNA-Sequenzen
Nach dem vollständigen Ablauf des zweiten Hybridisierungs-Schritts wird zu dem Ansatz eine DNA-Polymerase gegeben, die am 3´-Ende der doppelsträngigen Fragmente Nucleotide anfügt, die komplementär zur Sequenz der 5´-überstehenden Adapter sind. Dadurch entstehen
Bindungsstellen für die Primer 1 sowie Pn1 und Pn2R. Dies betrifft ausschließlich die Moleküle b, c und e.
4. Arbeitsschritt: Amplifikation durch nested PCR
In der ersten PCR wird der Primer 1 verwendet. Die Moleküle a und d verfügen nicht über Primer-Bindungsstellen, sie sind nicht amplifizierbar. Die Moleküle c haben nur an einem Ende eine Primer-Bindungsstelle, es erfolgt daher nur eine lineare Amplifikation. Die Anzahl der Amplifikate ist damit gegenüber der Anzahl exponentiell amplifizierter DNA-Fragmente vernachlässigbar. Die Moleküle b haben an beiden Enden eine Primer-Bindungsstelle für den Primer 1, ihre Amplifikation wird aber durch das Prinzip der Suppression-PCR verhindert. Die ca. 40 Nucleotide langen Enden der einzelsträngigen Moleküle b sind einander komplementär. Es kommt dadurch bei der PCR nicht zum Annealing der Primer, statt dessen bildet sich bevorzugt eine Sekundärstruktur (loop bzw. pan-like structure, s. Abbildung) aus. Bei den Molekülen e reicht die kurze, ca. 20 Nucleotide ausmachende Komplementarität der Enden der Einzelstränge nicht aus, um die PCR zu unterdrücken. Diese Moleküle weisen entsprechende
Primer-Bindungsstellen auf und können exponentiell amplifiziert werden. Bei der zweiten PCR mit den nested Primern wird die bevorzugte Amplifikation der Moleküle e gegenüber b zusätzlich dadurch verstärkt, daß die nested Primer an zwei Abschnitten binden, die in der erforderlichen Kombination nur bei den Molekülen e vorhanden sind. Die Moleküle b weisen jeweils nur eine Primer-Bindungsstelle auf und können daher bestenfalls linear amplifiziert werden.
Gesamtbetrachtung: Anreicherung tester-spezifischer DNA-Fragmente
DNA-Fragmente, die ausschließlich im Genom des Tester-Stamms vorkommen, also auch zusätzlich vorhandene, artfremde genetische Elemente, werden durch die RDA stark angereichert. Sie unterliegen nicht der Subtraktion durch komplementäre Driver-DNA-Einzelstränge im ersten Hybridisierungs-Schritt, sondern durchlaufen in idealer Weise den Prozeß als Moleküle a → e → e → exponentielle Amplifikation. Die DNA-Sequenzen, die gleichermaßen im Genom des Tester-Stamms und des Driver-Stamms vorkommen, werden im Regelfall nur linear amplifiziert (c → c → c). Bei den in der zweistufigen Hybridisierung entstehenden Molekülen b läßt sich nicht bestimmen, ob sie tester-spezifisch sind, oder nicht.
Durch die Schritte b → b → Suppression-PCR ist aber sichergestellt, daß diese Fragmente nur schwach angereichert werden können. Sowohl durch die Amplifikate der Fragmente c, als auch durch die der Fragmente b entsteht damit bei der RDA stets ein unvermeidbarer „Hintergrund“.
Die Subtraktions- und die PCR-Bedingungen müssen in jedem Einzelfall entsprechend optimiert werden, um eine möglichst starke Amplifikation der tester-spezifischen Sequenzen bei möglichst geringer unspezifischer „Hintergrund-Amplifikation“ zu gewährleisten.