Aus dem Institut für Klinische Pharmakologie der Medizinischen Hochschule Hannover
Direktor: Prof. Dr. med. Jens Jordan
Einfluss von Adipositas und Gewichtsreduktion auf Progranulin, PEDF, Betatrophin und Adipolin
Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin in der Medizinischen Hochschule Hannover
vorgelegt von Louisa Braun Exner aus Give/Dänemark
Hannover 2014
Angenommen vom Senat der Medizinischen Hochschule am 23.04.2015 Gedruckt mit Genehmigung der Medizinischen Hochschule Hannover Präsident: Prof. Dr. med. Christopher Baum
Betreuer: PD Dr. med. Dipl. Biol. Stefan Engeli Referent: Prof. Dr. rer. nat. Thomas Illig
Korreferent: Prof. Dr. med. Christoph Gutenbrunner
Tag der mündlichen Prüfung: 23.4.2015
Promotionsausschussmitglieder:
Prof. Dr. med. Roland Seifert
Prof. Dr. rer. nat. Ralf Lichtinghagen Prof. Dr. med. Jens Jordan
Inhaltsverzeichnis
1 Abkürzungsverzeichnis ... 5
2 Abbildungsverzeichnis ... 7
3 Tabellenverzeichnis ... 7
4 Einleitung ... 9
4.1 Adipositas-assoziierte Erkrankungen und Fettverteilung ... 9
4.2 Adipokine als Botenstoffe des Fettgewebes ... 10
4.3 „Neue“ Adipokine ... 15
4.4 Zielsetzung und Hypothesen ... 18
5 Material und Methoden ... 20
5.1 Herkunft der Blut- und Fettgewebeproben: B-SMART Studie ... 20
5.2 Bestimmung von Adipokinkonzentrationen mittels ELISA ... 22
5.2.1 Grundlagen der ELISA-Methode ... 22
5.2.2 Spezifische Durchführung der ELISAs ... 23
5.2.3 Berechnung der Antigen-Konzentrationen ... 26
5.3 Bestimmung der Genexpression mittels real-time RT-PCR ... 27
5.4 Auswertestrategie und statistische Analyse ... 29
6 Ergebnisse ... 31
6.1 Charakterisierung der Studienpopulation im Querschnitt ... 31
6.2 Einfluss von Adipositas und Stoffwechsel auf die „neuen“ Adipokine ... 32
6.2.1 Progranulin ... 32
6.2.2 PEDF ... 34
6.2.3 Betatrophin ... 37
6.2.4 Adipolin ... 38
6.3 Einfluss der Gewichtsreduktion auf die „neuen“ Adipokine ... 39
7 Diskussion ... 45
7.1 Progranulin ... 46
7.2 PEDF ... 48
7.3 Betatrophin ... 49
7.4 Adipolin ... 51
7.5 Methodendiskussion ... 52
8 Zusammenfassung ... 55
9 Literaturverzeichnis ... 57
10 Curriculum Vitae ... 70 11 Eidesstattliche Erklärung ... 72 12 Danksagung ... 73
1 Abkürzungsverzeichnis
ABDM Ambulantes Blutdruck Monitoring über 24h AD I Adipositas Grad I
AD II Adipositas Grad II
Adipolin adipose-derived insulin-sensitizing factor ADMA asymmetrisches Dimethylarginin
AMPK AMP-aktivierte Proteinkinase ANGPTL8 angiopoetin-like 8
ASP acylation stimulating protein
ATGL Adipozyten-spezifische Triglyzerid Lipase BMI body mass index
CTRP12 C1q/TNF-related protein-12
ELISA enzyme-linked immunosorbent assay FABP4 fatty acid binding protein 4
hs-CRP high-sensitive C-reactive protein HDL high density lipoprotein
IHL intrahepatischer Lipidgehalt IL-1ß Interleukin 1ß
IL-6 Interleukin 6 IL-8 Interleukin 8 IL-10 Interleukin 10
ISI Insulin Sensitivitäts-Index KHK koronare Herzkrankheit LDL low density lipoprotein LPL Lipoproteinlipase
MCP-1 monocyte chemoattractant protein 1 M-CSF macrophage colony stimulating factor MIF macrophage migration inhibitory factor MMPs Matrix Metalloproteasen
NAFLD non-alcoholic fatty liver disease NO Stickstoffmonoxid
oGTT oraler Glukosetoleranztest
PAI-1 Plasminogen Aktivator Inhibitor 1
PEDF pigment epithelium derived factor PCOS polyzystisches Ovarialsyndrom
PG Prostaglandin
RBP4 retinol-binding protein 4
RIFLP refeeding-induced fat and liver protein T2D Diabetes mellitus Typ 2
TD26 hepatocellular carcinoma-associated protein TGF-ß transforming growth factor
TIMPs tissue inhibitors of metalloproteases TNF- Tumor Nekrose Faktor
ÜG Übergewicht
VEGF vascular endothelial growth factor
2 Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1: Übersicht der wichtigsten Zelltypen und Sekretionsprodukte des Fettgewebes
Abbildung 2: Plattenbelegung und Messwerte einer Betatrophin-Messung Abbildung 3: Eichkurve des Betatrophin ELISA
Abbildung 4: Progranulin im Plasma nach Gruppeneinteilung anhand von BMI und Leberfett
Abbildung 5: Progranulin mRNA Expression im Fettgewebe nach Gruppeneinteilung anhand von BMI und Leberfett
Abbildung 6: PEDF im Plasma nach Gruppeneinteilung anhand von BMI und Leberfett Abbildung 7: PEDF mRNA Expression im Fettgewebe nach Gruppeneinteilung anhand
von BMI und Leberfett
Abbildung 8: Betatrophin im Plasma nach Gruppeneinteilung anhand von BMI und Leberfett
Abbildung 9: Adipolin im Plasma nach Gruppeneinteilung anhand von BMI und Leberfett
Abbildung 10: Einfluss der Gewichtsreduktion auf Progranulin, PEDF, Betatrophin und Adipolin im Plasma
Abbildung 11: Einfluss der Gewichtsreduktion auf die Genexpression von Progranulin und PEDF im subkutanen Fettgewebe
3 Tabellenverzeichnis
Tabelle 1: Übersicht über die vier „neuen“ Adipokine und ihre Regulation
Tabelle 2: Wasch- und Inkubationsbedingungen der ELISA für die vier Adipokine Tabelle 3: Gruppenvergleich vor Gewichtsreduktion
Tabelle 4: Korrelation nach Pearson von Progranulin mit ausgewählten klinischen Parametern
Tabelle 5: Korrelation nach Pearson der Progranulin mRNA Expression mit ausgewählten klinischen Parametern
Tabelle 6: Korrelation nach Pearson von PEDF mit ausgewählten klinischen Parametern
Tabelle 7: Korrelation nach Pearson der PEDF mRNA Expression mit ausgewählten klinischen Parametern
Tabelle 8: Korrelation nach Pearson von Betatrophin mit ausgewählten klinischen Parametern
Tabelle 9: Korrelation nach Pearson von Adipolin mit ausgewählten klinischen Parametern
Tabelle 10: Einfluss der 6-monatigen Diät auf die untersuchten klinischen Parameter Tabelle 11: Korrelationen von Veränderungen einzelner klinischer Parameter und der
untersuchten Adipokine
Tabelle 12: Übersicht über die vier „neuen“ Adipokine und ihre Regulation in dieser Arbeit
4 Einleitung
4.1 Adipositas-assoziierte Erkrankungen und Fettverteilung
Adipositas wird definiert als BMI (Body Mass Index) ≥ 30 kg/m2 (Klassifikation WHO 2000). Die Zahl der adipösen Menschen steigt weltweit kontinuierlich an und hat sich seit 1980 nahezu verdoppelt (1). Diese Entwicklung ist von großer sozioökonomischer und gesundheitspolitischer Relevanz, da adipöse Menschen ein erhöhtes Risiko für die Entwicklung verschiedener Krankheiten aufweisen.
Zu den häufigsten Adipositas-assoziierten Erkrankungen gehören Hypertonie, Atherosklerose und koronare Herzkrankheit (KHK) (2), ebenso nichtalkoholische Fettleber (NAFDL) (3, 4), Dyslipidämie (5) und Diabetes mellitus Typ zwei (T2D) (6, 7). Auch das Krebsrisiko ist bei Adipösen erhöht (8), dieser Zusammenhang ist für Karzinome des Dickdarms, der Speiseröhre, der Niere, des Endometriums und der postmenopausalen Brustdrüse belegt (9, 10). Das Vorliegen eines erhöhten Körpergewichts steigert insgesamt die Sterblichkeit im Vergleich zu Normalgewicht (11). Viele Studien zeigten dabei eine J-förmige Beziehung zwischen BMI und Morbiditäts-/Mortalitätsrisiko (11-13). Das bedeutet, dass sowohl ein sehr niedriges Körpergewicht mit erhöhter Krankheitshäufigkeit und Sterblichkeit assoziiert ist, als auch, dass ansteigender BMI mit einem progressiven Anstieg der Komorbiditäten (wie Hypertonie, Dyslipidämie, Diabetes mellitus, KHK, Herzinsuffizienz und maligne Erkrankungen) assoziiert ist. Bei niedrigem Körpergewicht besteht diese Assoziation auch dann noch, wenn berücksichtigt wird, dass Gewichtsverlust oft Folge schwerer oder chronischer Erkrankungen ist.
Neuere Studien zeigten aber, dass der BMI keinen verlässlichen Marker für das erhöhte Morbiditäts- und Mortalitätsrisiko darstellt (14, 15). Dies wird dann verständlich, wenn berücksichtigt wird, dass nicht das verschobene Verhältnis von Körpergewicht und Körpergröße das eigentliche Problem bei Adipositas darstellt, sondern die Vermehrung des Körperfetts. Dieses kann unterschiedlich am Körper verteilt sein und hat je nach Verteilung unterschiedliche Bedeutung für die Pathophysiologie der Adipositas. Körperfett kann als Depotfett entweder subkutan oder viszeral lokalisiert sein, sowie beispielsweise als Leber- oder Muskelfett in Organen akkumulieren. Dabei hat das subkutane Fettgewebe eine geringere Bedeutung für die Entstehung verschiedener Krankheiten als die anderen Fettlokalisationen (16). Besonders das intraperitoneale oder viszerale Bauchfett wird für die erhöhte Gesundheitsgefährdung bei Adipositas verantwortlich gemacht (17, 18). So stellt die
sogenannte „stammbetonte“ Adipositas den wichtigsten Risikofaktor für die Entwicklung des Typ zwei Diabetes mellitus dar (19, 20).
Folgende Befunde stützen diese Feststellung: Einige normalgewichtige Menschen leiden unter den für Adipositas typischen Komplikationen, sogenannte „metabolisch adipöse Schlanke“
(21-23). Ebenso weisen „metabolisch gesunde Adipöse“, also Menschen mit BMI >30 kg/m2, weder Dyslipidämie noch Insulinresistenz oder andere der bei Adipositas üblicherweise zu erwartenden Komplikationen auf (24). Der entscheidende Unterschied zwischen diesen beiden Gruppen ist sehr wahrscheinlich die Menge des viszeralen Fetts (25, 26), denn die meisten der metabolisch gesunden Adipösen haben eher wenig und die meisten der metabolisch adipösen Normalgewichtigen sehr viel viszerales Fett (27). Dies wird belegt durch eine Untersuchung an Sumo Ringern, die während ihrer sportlich aktiven Zeit trotz des sehr hohen Gewichts nur geringe Mengen viszeralen Fetts und eine gute Insulinsensitivität aufweisen, nach Beendigung ihrer sportlichen Karriere aber an viszeralem Fett zunehmen und metabolische Komplikationen entwickeln (28).
Eine mögliche Ursache für die besondere Bedeutung des viszeralen Fettgewebes ist der Einzugsbereich der Pfortader, die mesenteriales und omentales Fettgewebe drainiert, und damit Sekretionsprodukte des viszeralen Fettgewebes, die sogenannten Adipokine, direkt der Leber zuführt. Die Überflutung der Leber mit Adipokinen wird als einer der wichtigsten Pathomechanismen der abdominalen Adipositas diskutiert (29, 30).
Der Phänotyp des metabolisch gesunden Adipösen ist außerdem durch die Abwesenheit einer Fettleber, weniger Infiltration des Fettgewebes durch Immunzellen und ein günstiges Cytokin- und Adipokinmuster gekennzeichnet (31). Hier sind z.B. hohe Adiponectinwerte im Blut als Determinante des niedrigen Risikos belegt (32, 33).
4.2 Adipokine als Botenstoffe des Fettgewebes
Fettgewebe wird heute als multifunktionales Organ angesehen. Zusätzlich zu seiner zentralen Rolle als Lipidspeicher hat es bedeutende endokrine Funktionen und sezerniert Hormone und andere Proteine, die in ihrer Gesamtheit Adipokine genannt werden (34). Der Begriff
„Adipokin“ ist allerdings unscharf definiert. Letztlich stellen auch Stoffwechselprodukte wie unveresterte Fettsäuren, andere Lipidspezies, Glyzerol und Laktat Sekretionsprodukte der Adipozyten dar. Außer Adipozyten, die das größte Volumen des Fettgewebes einnehmen, kommen dort noch andere Zelltypen wie Endothelzellen, Fibroblasten, Leukozyten und Makrophagen vor, dabei korreliert die Zahl der Makrophagen direkt mit der Ausprägung der Adipositas (35). Daher ist auch die Herkunft der Adipokine heterogen, so können Adipozyten
selber, aber auch das Fettgewebe infiltrierende mononukleäre Zellen und Endothelzellen wesentlich zur Gesamtheit der vom Fettgewebe freigesetzten Botenstoffe beitragen.
Insbesondere die infiltrierenden mononukleären Zellen sind vermutlich die Ursache dafür, dass eine Vermehrung des viszeralen Fettgewebes mit subklinischer Inflammation einhergeht (36, 37). Diese ist durch erhöhte Interleukin 6 (IL-6) und hs-CRP (hoch-sensitives c-reactives Protein) Konzentrationen im Blut und verstärkte Expression der entsprechenden Gene im Fettgewebe charakterisiert (38). Abbildung 1 gibt einen Überblick über bekannte Sekretionsprodukte des Fettgewebes und die häufigsten im Fettgewebe vorkommenden Zelltypen.
Abbildung 1: Übersicht der wichtigsten Zelltypen und Sekretionsprodukte des Fettgewebes ASP – acylation stimulating protein, LPL – Lipoproteinlipase, PG – Prostaglandin, PAI-1 – Plasminogen Aktivator Inhibitor 1, IL-1ß – Interleukin 1ß, IL-6 – Interleukin 6, IL-8 – Interleukin 8, IL-10 – Interleukin 10, TGF-ß – transforming growth factor, VEGF – vascular endothelial growth factor, MMPs – Matrix Metalloproteasen, TIMPs – tissue inhibitors of metalloproteases, TNF- - Tumor Nekrose Faktor , MCP-1 – monocyte chemoattractant protein 1, MIF – macrophage migration inhibitory factor, M-CSF – macrophage colony stimulating factor, NO – Stickstoffmonoxid, ADMA – Asymmetrisches Dimethylarginin.
Deutlich über hundert Adipokine sind bislang beschrieben worden, aber nur wenige wurden intensiv charakterisiert. Zu den besser untersuchten Adipokinen gehören z.B. Adiponectin, Leptin, FABP4 und Visfatin. Aber auch andere, schon lange bekannte Cytokine wie IL-6, IL- 1, Tumor Nekrose Faktor (TNF- und Komplementfaktoren werden im Fettgewebe gebildet, oft allerdings nicht von Adipozyten sondern von Immunzellen (s. Abbildung 1).
TNF- z.B. wird beispielsweise bei Adipösen vermehrt im Fettgewebe exprimiert und die Expression reduziert sich bei Gewichtsabnahme. Dies ist nur ein Beispiel dafür, dass
Adipokine in ihrer Expression und Sekretion durch Gewichtsabnahme und Lebensstilintervention beeinflusst werden können (39). Das weiße Fettgewebe kommuniziert mit dem Gehirn und anderen peripheren Geweben über Adipokine (40). Signale aus dem Fettgewebe sind an vielen Prozessen wie der Regulation von Hunger und Sättigung, der Fettverteilung, der Insulinsensitivität, dem Energieumsatz und an Entzündungszuständen beteiligt. Die bei Adipositas veränderte Sekretion von Adipokinen wird als ein wichtiger Grund für die gestörte Funktion anderer Gewebe bei vermehrter Fettmasse diskutiert. Mit der veränderten Sekretion von Adipokinen werden Adipositas-assoziierte Störungen wie Insulinresistenz und Hypertonie in Verbindung gebracht. Im Folgenden werden einige Adipokine exemplarisch beschrieben.
Adiponectin: Adiponectin wird von Adipozyten gebildet und stärker im subkutanen als im viszeralen Fettgewebe exprimiert. Die Bildung von Adiponectin erfolgt unabhängig von der Adipozytengröße. Die Sekretion von Adiponectin ist bei Adipositas, Insulinresistenz und Diabetes Typ II vermindert und steigt bei Gewichtsreduktion an (38, 41). Supprimierte Adiponectin-Konzentrationen sind prädiktiv für die spätere Entwicklung von Diabetes mellitus Typ 2 und KHK (42, 43). Testosteron und pro-inflammatorische Zytokine unterdrücken die Expression von Adiponectin. Im Tiermodell hat Adiponectin anti- inflammatorische und kardioprotektive Wirkung und verbessert Insulinsensitivität und Fettstoffwechsel. Die Rezeptoren für Adiponectin wurden im Skelettmuskel (Adipo-R1) und in der Leber (Adipo-R2) nachgewiesen. Die Adiponectin-Rezeptoren vermitteln die Aktivierung der AMP-aktivierten Proteinkinase (AMPK). Die aktivierte AMP-Kinase steigert im Muskel die Glukoseaufnahme und die Fettsäureoxidation und unterdrückt in der Leber die Glukoneogenese (44).
Leptin: Leptin wird hauptsächlich von Adipozyten und stärker im subkutanen als im viszeralen Fettgewebe gebildet. Leptin wird mit zunehmender Adipozytengröße vermehrt sezerniert. Frauen weisen höhere Leptin-Konzentrationen als Männer auf, Katecholamine hemmen, Insulin, Glukokortikoide und TNF- dagegen steigern die Sekretion von Leptin.
Leptin nimmt beim Fasten ab und bei Sättigung zu und trägt wahrscheinlich zur Blutdruckerhöhung bei Adipositas bei. Adipöse Menschen zeigen generell erhöhte Leptin- Konzentrationen im Blut. Diese korrelieren mit der Fettmasse, weil hypertrophe Adipozyten vermehrt Leptin sezernieren und weil bei Adipositas eine Leptinresistenz vorliegt. Rezeptoren für Leptin werden in verschiedenen Isoformen in vielen Organen und im Gehirn besonders in Hypothalamus und im Hirnstamm exprimiert. Der Leptin-Rezeptor hat Ähnlichkeit mit klassischen Cytokin-Rezeptoren. Eine der metabolischen Wirkungen des Leptin-Rezeptors
beruht auf der Aktivierung der AMP-Kinasen. In Leber und Muskel führt dies zu erhöhter Fettsäureoxidation (45). Die physiologische Wirkung von Leptin, die ektope Lipidspeicherung zu kontrollieren, geht bei Leptinresistenz verloren (46, 47).
Retinol-bindendes Protein 4 (RBP4): RBP4 ist ein schon lange bekanntes Transportprotein für Vitamin A. RBP4 wird hauptsächlich in der Leber, aber auch zu einem gewissen Teil von Adipozyten im Fettgewebe gebildet. Rezeptoren für RBP4 finden sich auf vielen Zellen in verschiedenen Organen (48). Die RBPR4-Serumkonzentration ist ein guter Marker für die viszerale Fettmasse (49). RBP4 ist im Tiermodell mit Adipositas und Insulinresistenz assoziiert (50, 51) und wurde daher in mehreren Arbeiten als vielversprechender Kandidat betrachtet, der möglicherweise Adipositas, Insulinresistenz, Diabetes mellitus Typ 2 und andere metabolische Komplikationen verbindet (32, 52-58). Eine solche Assoziation oder direkte Kausalität konnte zwar in mehreren klinischen Studien nicht gezeigt werden (59-62), aber die Mehrheit, der bis jetzt erschienenen klinischen Studien an Kindern und Erwachsenen stützt die Hypothese, dass RBP4 eine Rolle bei Adipositas und der Entwicklung der Insulinresistenz spielt (63-68).
Fatty acid binding protein 4 (FABP4): FABP4 wird von Adipozyten und Makrophagen gebildet {{Kralisch S 2013}}. Die Rezeptoren für FABP4 wurden bisher nicht identifiziert.
FABP4 ist bei Insulinresistenz, Diabetes mellitus Typ 2 und KHK erhöht. Bei Adipösen korrelieren die FABP4-Konzentrationen mit Hüftumfang, Blutdruck, Insulinresistenz und dem Risiko ein metabolisches Syndrom zu entwickeln (69). Im Tiermodell verbessert die pharmakologische Inhibition von FABP4 Leberschäden bei der Non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) (70). Niedrigere FABP4 Expression in Adipozyten verringert die Lipolyse (71, 72). FABP4-Konzentrationen sind im viszeralen höher als im subkutanen Fettgewebe (73). Eine besondere Rolle scheint FABP4 als kardiodepressorisches Adipokin zu spielen. Die Inkubation von Kardiomyozyten in vitro mit FABP4 verschlechtert die Kontraktilität der Zellen, und in einer klinischen Studie mit adipösen Probanden wurde eine Assoziation von linksventrikulärem Remodelling mit den FABP4-Konzentrationen im Blut nachgewiesen (74, 75). Damit ist FABP4 ein wichtiger Kandidat für die bei Adipositas gehäuft auftretende linksventrikuläre Hypertrophie und Herzinsuffizienz.
Fetuin: Fetuin wird in der Leber gebildet. Fetuin-A ist ein natürlicher endogener Inhibitor der Insulin-stimulierten Insulinrezeptor-Tyrosinkinaseaktivität und hemmt die Phosphorylierung des Insulinrezeptors in Leber und Muskel (76, 77). Übergewichtige und adipöse Menschen zeigen erhöhte Blutkonzentrationen von Fetuin-A. Eine erhöhte Fetuin-A Konzentration ist
ein unabhängiger Risikofaktor für Insulinresistenz und Diabetes mellitus Typ 2.
Fettakkumulation in der Leber ist mit erhöhten Fetuin-A Blutkonzentrationen assoziiert. Die Reduktion des Leberfetts durch Lebensstilmaßnahmen ist mit verringerten Fetuin-A Konzentrationen im Blut assoziiert (41, 78-80).
Vaspin: Vaspin wird im Fettgewebe, Magen, Leber und Pankreas gebildet (81). Es handelt sich um einen Serinprotease-Inhibitor, der Ligand eines membranständigen Anionenkanals von Endothelzellen, dem „Cell-surface GRP78/Voltage-dependent Anion Channel Complex“, ist (82). Die genauere Pathophysiologie ist bisher nicht bekannt. Schlanke Menschen haben keine messbaren Vaspin-Blutkonzentrationen, die Häufigkeit messbarer Konzentrationen steigt jedoch von leichtem Übergewicht bis zu manifester Adipositas kontinuierlich an und die Serumkonzentration korreliert mit dem Körperfettgehalt. Die Genexpression von Vaspin ist im viszeralen höher als im subkutanen Fettgewebe. Frauen haben höhere Serumvaspin- Konzentrationen als Männer (83). Die Konzentrationen von Vaspin folgen einem mahlzeitenabhängigen Verlauf. Sie sind präprandial höher und sinken nach einer Mahlzeit. Im Tierversuch reduziert Vaspin die Nahrungsaufnahme und verbessert Insulinsensitivität und Hyperglykämie (84). Vaspin stimuliert die Adiponectin- und supprimiert die Leptin- und TNF-Expression (85).
Visfatin: Visfatin wird in viszeralem, subkutanem, perivaskulärem und anderem Fettgewebe von Adipozyten und Makrophagen gebildet, aber auch viele andere Gewebe wie Herz, Muskel und Pankreas exprimieren Visfatin (86). Visfatin ist eigentlich eine Nicotinamid- Phosphoribosyltransferase, die an der NAD-Synthese beteiligt ist. Mehrere Studien fanden eine Korrelation der Visfatin-Konzentration im Plasma mit Adipositas, viszeraler Fettmasse, Diabetes mellitus Typ 2 und der Ausprägung des metabolischen Syndroms (87-90). Andere Studien konnten jedoch keinen Zusammenhang zwischen Visfatin und viszeraler Fettmasse oder Parametern des Insulinstoffwechsels zeigen (91-94). Visfatin stimuliert die Expression von TNF- und IL-6 Expression in mononukleären Zellen (85). Einige Autoren vermuten, dass Visfatin an der Regulation der ß-Zellfunktion und an immunmodulatorischen Prozessen beteiligt ist (85, 86).
4.3 „Neue“ A dipokine
In dieser Arbeit soll die Bedeutung von Adipositas und Gewichtsreduktion für die Regulation einiger neuer Adipokine im Blut und im Fettgewebe untersucht werden. Die ausgewählten Adipokine waren Progranulin, pigment epithelium derived factor (PEDF), Betatrophin und Adipolin.
Progranulin: Progranulin ist ein hauptsächlich von neutrophilen Granulozyten und Makrophagen sezerniertes Glykoprotein, das sich in Plasma und Liquor findet (95-98). Ein spezifischer Rezeptor für Progranulin konnte noch nicht identifiziert werden (99), aber Progranulin bindet an Sortilin sowie Typ 1 und 2 TNF-Rezeptoren und entfaltet, vermutlich durch Blockade der Rezeptoren für das TNF-, anti-inflammatorische Wirkungen (100, 101).
Progranulin wird in vielen Geweben, besonders aber unter Bedingungen von starkem Gewebeumbau, exprimiert. In Geweben mit hohen Teilungsraten, wie z.B. in tiefen Darmkrypten oder epithelialen Keratinozyten, wird mehr Progranulin exprimiert als in Geweben mit wenig Mitoseaktivität. Entsprechend steigt Progranulin in Situationen mit akuter starker Zellproliferation, wie während der Wundheilung, stark an (102-104).
Progranulin hat neurotrophe Eigenschaften auf Neuronen des Kortex und Rückenmarks und ist ein potenter extrazellulärer anti-Apoptose-Faktor (98, 105-107). Ein Mangel an Progranulin verursacht die neurodegenerative Erkrankung der frontotemporalen Demenz (108, 109). Progranulin aktiviert typische Signaltransduktionswege von Wachstumsfaktoren (110, 111) und fördert das Tumorwachstum durch Proliferationsförderung, Hemmung der Apoptose und erhöhte Invasivität von Tochterzellen in die Extrazellulärmatrix (110-116).
Bei viszeraler Adipositas wurden erhöhte Progranulin-Konzentrationen im Serum beschrieben. Diese waren mit erhöhten Blutzuckerspiegeln und Dyslipidämie assoziiert und korrelierten mit BMI, Infiltration der Makrophagen im omentalen Fettgewebe, Gesamtcholesterin und CRP. Körperliches Training senkte die erhöhten Konzentrationen von Progranulin bei adipösen Typ 2 Diabetikern (97) . Weitere Korrelationen bestehen zur Expression von PPARγ(Peroxisom Proliferator aktivierter Rezeptor γ) (117) und, unabhängig von anderen Variablen, zum Grundumsatz (118).
Pigment epithelium derived factor (PEDF): PEDF wird in Leber und Fettgewebe, hier hauptsächlich von Adipozyten, gebildet (119-121). Die PEDF Genexpression ist im subkutanen höher als im omentalen Fettgewebe und bei morbider Adipositas im Fettgewebe insgesamt verringert. In der Leber dagegen steigt die PEDF Genexpression mit Adipositas und Insulinresistenz an und ist mit Nüchternglucose und glykosiliertem Hämoglobin (HbA1c)
assoziiert (122). Spezifische Rezeptoren für PEDF wurden bisher im retinalen Epithel, in Hepatozyten und anderen Geweben identifiziert (123), im Fettgewebe werden besonders viele PEDF Rezeptoren ausgebildet. PEDF hemmt die Angiogenese (124, 125), ist ein neuroprotektiver (126) und tumorhemmender Faktor (127-130) und reguliert oxidativen Stress, Inflammation und Insulinsensitivität. Im Gegensatz zu Daten aus Tiermodellen und Zellkultur beeinflusst die Hemmung des sympathoadrenergen Systems beim Menschen (pharmakologisch durch transdermal appliziertes Clonidin über 6 Tage) die PEDF-Bildung nicht (131). Akute ß-Adrenozeptorstimulation (pharmakologisch durch i.v. Isoproterenol über 30 min.) hemmt jedoch die PEDF-Bildung für die Dauer der Belastung (132).
PEDF im Serum ist positiv mit BMI, Waist-to-hip Ratio, Körperfett, Insulinresistenz und HbA1c assoziiert und die PEDF-Konzentration nimmt bei Gewichtsreduktion in Korrelation mit dem Blutdruck ab (133). Bei morbid adipösen Patienten korreliert die PEDF- Konzentration im Serum besser mit der Insulinresistenz als mit Merkmalen der Adipositas (134). PEDF senkt die Expression der Adipozyten-spezifischen Triglyceride Lipase (ATGL), verstärkt die Lipolyse in Adipozyten und reduziert ATGL-abhängig die Fettsäureoxidation im Muskel (135). Zunahme der Masse des Fettgewebes führt zu erhöhten PEDF Konzentrationen in Fettgewebe und Plasma. Erhöhte Plasmakonzentrationen von PEDF bei Adipösen steigern die Freisetzung freier Fettsäuren, was die ektope Triglyzeridakkumulation in peripheren Organen begünstigt (119) und zur Ausbildung der Insulinresistenz beiträgt (136). Eine vierwöchige fettreiche Diät bei schlanken Menschen und Kalorienrestriktion bei adipösen Menschen zeigten einen zeitlichen Zusammenhang von Energieaufnahme und PEDF-Bildung auf Genexpressions- als auch auf Proteinebene auf, der unabhängig von der Ausprägung der Adipositas sein könnte (137).
Betatrophin: Betatrophin ist ein hauptsächlich in der Leber und weniger stark auch in Fettgewebe und Gehirn gebildetes Protein (138, 139). Aufgrund unterschiedlicher experimenteller Strategien ist dieses Protein mehrfach entdeckt worden und trägt damit auch mehrere Namen: Lipasin, refeeding-induced fat and liver protein (RIFLP), angiopoetin-like 8 (ANGPTL8) und hepatocellular carcinoma-associated protein (TD26). Der Name
„Betatrophin“ leitet sich von dem Befund ab, dass im Mausmodell das Wachstum von pankreatischen ß-Zellen stimuliert und die Glucosetoleranz verbessert wurde (140-143). Beim Menschen bzw. an menschlichen ß-Zellen wurde diese Wirkung bislang nicht bestätigt (144).
Rezeptoren für Betatrophin sind noch nicht identifiziert worden. Die Regulation von Betatrophin wird durch TNF und Nahrungsaufnahme beeinflusst (137, 138). Betatrophin wirkt im Mausmodell prolipogen, eine Überexpression in der Leber verursacht
Hypertriglyzeridämie und bei Abwesenheit von Betatrophin sanken die Triglyzerid- Konzentrationen über die Aktivierung von ANGPTL3 ab (139, 145). Im Mausmodell stimuliert Insulinresistenz die Bildung von Betatrophin in der Leber (140). Bei Menschen mit Typ 1 Diabetes ist die Betatrophin-Konzentration im Blut zwar erhöht, korreliert aber nicht mit HbA1C oder C-Peptid (146). Im Mausmodell führte eine fettreiche Diät zum Anstieg und Fasten zum Abfall der Betatrophin-Konzentrationen (147). Refeeding nach Fasten geht im Tiermodell mit einem deutlichen Anstieg des zirkulierenden Betatrophins einher. Und auch bei allerdings wenig gut charakterisierten Probanden wurde ein Anstieg von Betatrophin 3-6h nach Nahrungsaufnahme nachgewiesen, wobei nicht beschrieben wurde, ob die Probanden vorher nüchtern waren (139).
Adipolin: Auch Adipolin (Adipose-derived insulin-sensitizing factor) hat mehrere Namen:
C1qdc2, FAM132A und C1q/TNF-related Protein-12 (CTRP12). Adipolin wird im Fettgewebe von Adipozyten gebildet und findet sich im Plasma. Rezeptoren für Adipolin sind nicht bekannt. Die Expression von Adipolin ist im subkutanen höher als im viszeralen Fettgewebe. Die Bildung von Adipolin im Fettgewebe ist in Nagermodellen der Adipositas reduziert. Unter den Bedingungen der Adipositas verbessert die Gabe von Adipolin die Insulinsensitivität und unterdrückt Entzündungsreaktionen im Fettgewebe (148). Die Herabregulation von Adipolin bei Adipositas kann durch die Gabe des Insulinsensitizers Rosiglitazon normalisiert werden (149).
Bei Frauen mit polyzystischem Ovarialsyndrom fanden sich in Serum und subkutanem Fettgewebe signifikant niedrigere Adipolin Protein-Konzentrationen und mRNA Expression als bei gesunden Frauen. Die Adipolin-Serumkonzentrationen waren signifikant negativ zu BMI, waist-to-hip-ratio und Glukose korreliert (150). Bei Glukosebelastung sinkt die Adipolinkonzentration akut ab. Diese Reaktion war bei gesunden Frauen deutlich stärker ausgeprägt als bei den Patientinnen mit polyzystischem Ovarialsyndrom (PCOS). Die Behandlung mit Metformin führte bei diesen Patientinnen zu einem Anstieg von Adipolin im Serum, parallel verbesserte sich die Insulinresistenz (151). Insulininfusionen induzierten bei gesunden schlanken Probanden signifikant erhöhte Adipolin-Konzentrationen für die gesamte Dauer der Hyperinsulinämie (152). Daher könnte der beschriebene Effekt der Glukosebelastung auch durch den gleichzeitigen Insulinanstieg vermittelt worden sein und die niedrigen Adipolin-Werte bei Adipositas durch die reduzierte Wirkung von Insulin erklärt werden.
4.4 Zielsetzung und Hypothesen
Nach der aktuellen Datenlage ist noch wenig über die Regulation der neuen Adipokine beim Menschen bekannt, insbesondere die Einflüsse von Adipositas und Gewichtsreduktion auf Betatrophin und Adipolin wurden bisher kaum untersucht. Ziel dieser Arbeit war es daher, den Einfluss von Adipositas und Gewichtsreduktion auf die noch wenig beschriebenen Adipokine Progranulin, PEDF, Betatrophin und Adipolin in einer gut charakterisierten Kohorte adipöser Probanden systematisch zu beschreiben. Tabelle 1 zeigt eine zusammenfassende Übersicht des bisherigen Wissenstands über Veränderungen der vier neuen Adipokine in Abhängigkeit von verschiedenen Phänotypen (Referenzen s. 4.3). Um dieses Ziel zu erreichen, wurden in Plasmaproben aus einer abgeschlossenen Studie des Betreuers die vier Adipokine Progranulin, PEDF, Betatrophin und Adipolin mittels ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) bestimmt. Zusätzlich konnte in vorhandenen subkutanen Fettgewebeproben die Genexpression von Progranulin und PEDF quantitativ bestimmt werden.
Tabelle 1: Übersicht über die vier „neuen“ Adipokine und ihre Regulation
zeigt einen positiven Zusammenhang, einen negativen Zusammenhang auf.
BMI Gewichts- reduktion
subku- tanes Fett
viszerales Fett
Insulin-
resistenz Dyslipidämie
Progranulin
PEDF
Betatrophin
Adipolin
Aus den in Tabelle 1 und Kapitel 4.3 beschriebenen Vorbefunden anderer Arbeitsgruppen lassen sich einige Erwartungen und Hypothesen formulieren:
Da Progranulin in bisherigen Arbeiten mit dem BMI, mit viszeraler Adipositas, mit erhöhten Blutzuckerspiegeln und Dyslipidämie assoziiert war, war ein Ziel der Arbeit zu untersuchen, ob Gewichtsabnahme zu Verringerungen der Progranulin-Konzentration im Blut führt.
Ebenso sollte im Rahmen der vorliegenden Studie die vorbeschriebene Korrelation von Progranulin mit Gesamtcholesterin und CRP überprüft werden.
Ziel der Untersuchungen von PEDF war die Überprüfung der Korrelation mit BMI, Taillenumfang, Körperfett und Insulinresistenz, sowie der Hypothese, dass die PEDF- Konzentration durch Gewichtsreduktion abnimmt.
Bei Betatrophin ist die Datenlage noch sehr spärlich. Ziel der hier durchgeführten Untersuchung war die Untersuchung des im Tiermodell beschriebenen positiven Zusammenhangs der Betatrophin-Konzentration mit Triglyzerid-Konzentrationen (145) beim Menschen. Zur Insulinresistenz ist aus dem Mausmodell bekannt, dass sie die Betatrophin- Bildung in der Leber stimuliert, so dass überprüft werden sollte, ob auch beim Menschen ein Zusammenhang zwischen dem Betatrophin und Insulinsensitivität zu beobachten ist.
Da Adipolin bei den mit Adipositas einhergehenden Bedingungen verringert zu sein scheint, kann die Hypothese abgeleitet werden, dass die zirkulierenden Konzentrationen von Adipolin nach Gewichtsreduktion und den damit einhergehenden Verbesserungen des Glukose- und Lipidstoffwechsels ansteigen.
5 Material und Methoden
5.1 Herkunft der Blut- und Fettgewebeproben: B-SMART Studie
Die B-SMART-Studie, aus der mir die zur Bestimmung der Adipokine eingesetzten Blut- und Fettgewebeproben zur Verfügung gestellt wurden, hatte zum Ziel, den erzielten Gewichtsverlust durch eine fettreduzierte und eine kohlenhydratreduzierte hypokalorische Diät zu vergleichen. Hierzu wurden vor Beginn und nach 6 Monaten anthropometrische, metabolische und kardiovaskuläre Parameter erhoben, um deren Änderungen unter den beiden Diäten zu vergleichen.
Die prospektive randomisierte einfachblinde B-SMART-Studie wurde an einem universitären Forschungszentrum in der Zeit von März 2007 bis Juni 2010 in Übereinstimmung mit der Deklaration von Helsinki (Fassung von 1996) und in Anlehnung an die aktuellen Richtlinien für gute klinische Praxis (GCP) durchgeführt. Die Studie wurde von der Ethik-Kommission der Charité zustimmend bewertet. Alle Teilnehmer gaben vor Einschluss ihr schriftliches Einverständnis. Die B-SMART-Studie wurde unter dem ClinicalTrials.gov Identifier:
NCT00956566 registriert. Ergebnisse zur Gewichtsreduktion, zu Messmethoden und zu kardiovaskulären Parametern aus der B-SMART-Studie sind mehrfach publiziert worden (314). Ziel der prospektiven randomisierten Studie war der Vergleich von Gewichtsverlust und damit in Verbindung stehenden metabolischen und kardiovaskulären Änderungen zwischen hypokalorischen Ernährungsformen mit reduziertem Kohlenhydrat- oder reduziertem Fettgehalt.
Individuelle Empfehlungen zur Energie-Aufnahme lauteten folgendermaßen:
Reduktion der Gesamtenergieaufnahme des Baseline- Ernährungsprotokolls um 30%
kohlenhydratreduzierte Gruppe: Kohlenhydrataufnahme ≤ 90g/d; Fettaufnahme mindestens 30% der täglichen Kalorienaufnahme; 0,8 g Protein pro kg Körpergewicht
fettreduzierte Gruppe: Fettgehalt von ≤ 20% der Gesamtenergieaufnahme, 0,8 g Protein pro kg Körpergewicht, restlicher Energiebedarf aus Kohlenhydraten
Nach der randomisierten Zuordnung zur jeweiligen Diät führten die Probanden als Ausgangsbasis sieben Tage lang ein Ernährungsprotokoll, das hinsichtlich der Makro- und Mikronährstoffaufnahme einschließlich der Fettsäure-Zusammensetzung der Nahrung analysiert wurde. Die Analyse-Software Optidiet (V3.1.0.004, GOE, Linden, Deutschland) basiert auf dem Nährstoffgehalt der Nahrung laut Bundeslebensmittelschlüssel. Alle
Teilnehmer besuchten während des 6-monatigen Gewichtsreduktionsprogramms wöchentliche Kurse, in denen von Diätassistenten für beide Gruppen Grundlagenwissen über gesunde Nahrungsmittelauswahl vermittelt wurde. Entsprechend der randomisierten Zuordnung wurden Kurse zur kohlenhydratreduzierten und zur fettreduzierten Ernährungsweise durchgeführt. Darüber hinaus fand während der 6-monatigen Intervention alle 2 Monate eine individuelle Ernährungsberatung einschließlich der Analyse eines 7-Tage- Ernährungsprotokolls durch eine Diätassistentin statt, bei der individuelle Strategien zur Einhaltung der Diät besprochen wurden.
Die randomisierte Zuordnung zur Diät war nur den Diätassistentinnen bekannt, nicht aber den Krankenschwestern und Ärzten der Studie. Für die Zuordnung der Personen wurde eine computererzeugte Liste von Zufallszahlen verwendet. Die Sequenz der Randomisierung wurde mithilfe der SPSS 18 (Chicago, IL, USA) Statistik-Software festgelegt.
Patienten: In der Studie wurden 170 übergewichtige und adipöse, ansonsten gesunde Personen (135 Frauen, 35 Männer) zu einer der beiden Diäten im Verhältnis 1:1 randomisiert.
Personen, die laut Bewegungsprotokoll an sieben aufeinander folgenden Tagen jeweils mehr als zwei Stunden geplante körperliche Betätigungen verrichteten, wurden nicht eingeschlossen. Die Probanden wurden außerdem angehalten, ihr augenblickliches körperliches Betätigungsniveau während der Studie nicht zu ändern. Personen mit einem Alkoholkonsum von > 20g/d, mit Diabetes mellitus Typ 1 oder 2, mit akuten oder chronischen Infektionen oder Krankheiten, die eine dauerhafte medikamentöse Behandlung erforderten sowie schwangere und stillende Frauen wurden nicht in die Studie aufgenommen.
Die angewandten Untersuchungsmethoden wurden mehrfach publiziert (314) und werden in dieser Arbeit nicht im Detail erläutert, da die Daten bereits vorlagen. Taillenumfang und Gewicht wurden morgens am nüchternen unbekleideten Probanden gemessen. Der Taillenumfang wurde in der Mitte zwischen Beckenkamm und unterem Rippenbogen bestimmt und auf volle cm gerundet. Der Body Mass Index BMI errechnet sich aus dem Körpergewicht geteilt durch Körpergröße zum Quadrat (kg/m²).
Die Fettverteilung im Abdomen wurde mit einem 1,5-Tesla Magnetresonanztomographen (Siemens) in T1-Wichtung, FLAIR Sequenz, 10 mm Schichtdicke und 10mm Abstand zwischen den Schichten über das gesamte Abdomen vom Diaphragma bis zur Symphyse aufgenommen. Die Bilder wurden mit einer Segmentationssoftware (Vitom, Deutschland) analysiert, um das Volumen der viszeralen und subkutanen abdominalen Fettgewebedepots zu bestimmen. Das Leberfett (IHL) wurde mittels 1H-Magnetresonanz-Single-Voxel- Spectroskopie im 7. Lebersegment gemessen.
Die ambulante Blutdruckmessung (ABDM) erfolgte über 24h mit Messungen alle 20 min in der Zeit von 6 bis 22h und alle 30 min zwischen 22 und 6h (Spacelabs Healthcare).
Der orale Glukosetoleranztest (oGTT) wurde im nüchternen Zustand durchgeführt. Die Blutabnahme erfolgte zum Zeitpunkt 0, 15, 30, 45, 60, 90 und 120 min nach Einnahme von 75g Glukose in 500ml Wasser. Anschließend erfolgte die Bestimmung von Glukose und Insulin aus diesen Proben. Der Insulin Sensitivitäts-Index (ISI) wurde nach folgender Formel berechnet: 10000/√[(Nüchternplasmaglukose × Nüchternplasmainsulin) × (Glukose × Insulin)] (156). Dabei stehen „Glukose“ und „Insulin“ jeweils für die Mittelwerte aller sieben Messungen während des oGTT.
Die Bestimmung von Triglyzeriden (Glyzerin-phosphat-Oxidase/Peroxidase Aminophenazon, GPO/PAP Methode) und Gesamt-Cholesterin (Cholesterin-Oxidase/ Peroxidase Aminophenazon, CHOD/PAP Methode) erfolgte vollenzymatisch. High density lipoprotein (HDL) Cholesterin wurde durch Immuninhibition bestimmt und das low density lipoprotein (LDL) Cholesterin wurde anhand der Friedewald-Formel berechnet, da die Triglyzeridwerte bei allen Studienteilnehmern < 4,5 mmol/l lagen und alle Blutentnahmen im nüchternen Zustand durchgeführt wurden (LDL = Cholesterin – Triglyzeride/2,2 – HDL, alle Einheiten mmol/l). Die Bestimmungen und Berechnungen erfolgten in einem zertifizierten Labor (Labor 28 GmbH, Berlin). Hs-CRP (high-sensitive C-reactive protein), Leptin, Adiponectin, FAPB4, RBP4 und Fetuin A wurden bereits für frühere Auswertungen mittels ELISA im Institut für Klinische Pharmakologie bestimmt.
5.2 Bestimmung von Adipokinkonzentrationen mittels ELISA 5.2.1 Grundlagen der ELISA-Methode
Die Plasmakonzentrationen der genannten Proteine wurden durch das sogenannte „Sandwich- ELISA“-Verfahren bestimmt. Dieses Verfahren detektiert die Menge eines zwischen zwei Antikörpern gebundenen Antigens. Bei einem Sandwich-Elisa ist die Mikrotiterplatte mit dem ersten Antikörper („coating antibody“) beschichtet. Nach Zugabe der Plasmaprobe bindet dieser Antikörper spezifisch an das zu bestimmende Antigen (= Adipokin). Der anschließende Waschschritt entfernt nicht oder unspezifisch gebundene Antigene und minimiert damit das Auftreten falsch positiver (erhöhter) Messwerte. Im Anschluss wird ein zweiter gegen das gleiche Antigen gerichteter Antikörper zugefügt („detection antibody“), an den mehrere Biotin-Moleküle gebunden sind. Je nach Menge des bereits gebundenen Antigens bindet eine entsprechend proportionale Anzahl des zweiten Antikörpers an diesen Komplex.
Im nächsten Schritt wird das Enzym Horseradish-Peroxidase zugefügt, an das Streptavidin gebunden ist. Zwischen Biotin (am zweiten Antikörper) und Streptavidin (am Enzym) entsteht eine feste Bindung. Das anschließend als Substrat hinzugefügte farblose Tetramethylbenziden wird durch die Peroxidaseaktivität zu einem blauen Farbstoff umgesetzt.
Durch Zugabe des säurehaltigen Stopp-Reagenz wird die Reaktion zum Stillstand gebracht und dann die Konzentration des nun gelben Farbstoffs photometrisch bestimmt. Da die Enzymaktivität proportional zur Menge des gebundenen Antigens ist, kann anhand einer Eichkurve aus verdünnter Antigenlösung und unter Berücksichtigung von Verdünnungs- faktoren die Konzentration des untersuchten Antigens in der Probe bestimmt werden.
Nützlich sind die Sandwichmethoden vor allem bei geringen Konzentrationen des Antigens.
Da jeder Detektions-Antikörper mehrere Bindungsstellen für das Enzym Peroxidase hat, erfolgt so eine mehrfache Verstärkung des Farbsignals pro Antigenmolekül, damit wird eine größere Sensitivität des Tests erreicht. Ebenfalls von Vorteil ist die Sandwichmethode, wenn viele verschiedene Antigene in einer Probe enthalten sind, wie es im Blutplasma stets der Fall ist. Die Möglichkeit für unspezifische Kreuzreaktionen der Antikörper wird durch den Einsatz von mehreren spezifischen Antikörpern verringert, die Spezifität der Antigenerkennung steigt damit.
5.2.2 Spezifische Durchführung der ELISAs
Die zur Messung benötigten ELISA-Kits enthalten alle zur Durchführung der Adipokin- Messungen benötigten Materialien (s. Tabelle 2), so dass eine gesonderte Aufführung von Materialien und Chemikalien nicht erfolgt. Im Einzelnen wurden die folgenden Kits eingesetzt:
PEDF (Human PEDF ELISA, PED613, Human BioProducts MD, Middletown, USA)
Progranulin (Progranulin human ELISA, AG-45A-0018PP-KI01, AdipoGen Inc., South Korea)
Betatrophin (Human Hepatocellular carcinoma-associated Protein TD26 ELISA, E11644h, Wuhan EIAab Science Co. Ltd, Wuhan, China)
Adipolin (human Protein FAM132A ELISA, CSB-EL008058HU, CUSABIO, Wuhan, China)
Da alle ELISAs auf der gleichen Messmethode beruhen, waren auch die zur Durchführung der Messungen notwendigen Arbeitsschritte weitgehend identisch und können daher im Folgenden zusammenfassend für alle vier ELISAs dargestellt werden:
Zunächst wurde Plasma aufgetaut und in jeweils 2 Aliquots à 250 μl und 2 Aliquots à 100 μl aufgeteilt. Die Aliquots wurden bis zur Messung bei -20°C gelagert. Durch die Aliquotierung wurde die Anzahl der Auftau-Einfrier-Zyklen so gering wie möglich gehalten, um präanalytische Veränderungen der zu messenden Proteine zu vermeiden.
Zur Messung jedes Proteins wurde ein Aliquot aufgetaut und entsprechend der Herstellerangaben mit den mitgelieferten Lösungsmitteln der Kits verdünnt. In Tabelle 2 werden die speziellen Inkubations- und Waschbedingungen für jeden ELISA dargestellt.
1. Auftragen der Proben: Je 100 μl Standard, Blank (= Assay-Puffer ohne weitere Komponenten) und verdünnte Probe wurden zur internen Kontrolle jeweils doppelt auf die Mikrotiterplatte aufgetragen (Abbildung 2). Jede Probe wurde doppelt aufgetragen, um später mit Mittelwerten aus der Doppelbestimmung arbeiten zu können. Die Platte wurde für die Dauer der vom Hersteller jeweils angegebenen Inkubationszeit (s.u.) bei 37° C inkubiert (CO2- freier Inkubator B15 Thermo Fisher Scientific, Braunschweig, Deutschland).
2. Waschen: Nach Ablauf der Inkubationszeit wurde jede Mikrotiterplatte nach den Angaben des jeweiligen Herstellermanuals gewaschen, um Probenreste zu entfernen. Es wurde vorsichtig gearbeitet, damit die Antigene gebunden blieben. Der Überstand wurde entfernt und Waschpuffer zugegeben. Der Waschpuffer wurde wieder entfernt und die Platte auf Papiertücher ausgeklopft. Dieser Schritt wurde gemäß den Angaben im Manual des jeweiligen Kits wiederholt. Bei Betatrophin und Adipolin blieb der Waschpuffer jeweils für 1-2 min. in den Plattenvertiefungen, bei den anderen Adipokinen wurde der Waschpuffer nach der Zugabe sofort wieder entfernt.
3. Auftrag des zweiten Antikörpers: Der zweite Antikörper wurde nach dem Waschen auf die Platte aufgetragen und wieder bei 37° C inkubiert.
4. Waschen: Nach Ablauf der jeweiligen Inkubationszeit wurde der überschüssige zweite Antikörper vorsichtig abgewaschen, um später nur die Enzymaktivität der direkt an die Antigene gebundenen Antikörper messen zu können.
5. Zugabe von Streptavidin-Horseradish Peroxidase
6. Zugabe von Tetramethylbenziden als Substrat für die Horseradish-Peroxidase
7. Zugabe des Stopp-Reagenz: Nach Ablauf der jeweiligen Inkubationszeit wurde die enzymatische Reaktion mittels Zugabe des säurehaltigen Stopp-Reagenz gestoppt.
8. Messung der Absorption: Direkt nach dem Reaktionsstopp wurde die Absorption des entstandenen Farbstoffes gemessen. Es wurde ein 450 nm Filter im Plattenleser Infinite 200 (TECAN Austria GMBH, Salzburg, Österreich) verwendet.
PEDF liegt mit Proteinen komplexiert im Blut vor. Deshalb wurden die Plasma-Proben zunächst zu gleichen Teilen mit 8M Harnstoff gemischt und für 15-30 min. bei 4°C (auf Eis) unter wiederholtem Mischen mit einem Vortex-Schüttler inkubiert. Die Proben wurden dann 1:50 in dem im Kit mitgelieferten Puffer verdünnt und anschließend nochmals 1:200 mit PBS verdünnt. Die so vorbereiteten Proben wurden dann auf die Microtiter-Platte aufgetragen.
Tabelle 2: Wasch- und Inkubationsbedingungen der ELISA für die vier Adipokine.
PEDF Progranulin Betatrophin Adipolin 1. Inkubation
100µl Probe
1h bei 37°C 5x Waschen mit je 300µl WP
1h bei 37°C 3x Waschen mit je 300µl WP
2h bei 37°C kein Waschen
2h bei 37°C kein Waschen
2. Inkubation Detektions- Antikörper
1h bei 37°C 5x Waschen mit je 300µl WP
1h bei 37°C 3x Waschen mit je 300µl WP
1h bei 37°C 4x Waschen mit je 300µl WP und jeweils 1-2min setzen lassen
1h bei 37°C 3x Waschen mit je 200µl WP und jeweils 2min setzen lassen 3. Inkubation
Streptavidin- Peroxidase
30 min bei 37°C 5x Waschen mit je 300µl WP
1h bei 37°C 5x Waschen mit je 300µl WP
1h bei 37°C 7x Waschen mit je 300µl WP und jeweils 1-2min setzen lassen
1h bei 37°C 5x Waschen mit je 200µl WP und jeweils 2min setzen lassen 4. Inkubation
Farbsubstrat
100µl
30 min bei 18- 25°C
100µl
10 min bei 18- 25°C
90µl
15-30min bei
37°C in
Dunkelheit
90µl
15-30min bei
37°C in
Dunkelheit Volumen des
Stopp-Reagenz
100µl 100µl 50µl 50µl
Verdünnung der Probe
1:200 keine 1:200 keine
Intra-Assay Präzision
CV%<5,8% CV%<5,1% nicht bestimmt CV%<8%
Inter-Assay Präzision
nicht bestimmt CV%<6,4% nicht bestimmt CV%<10%
5.2.3 Berechnung der Antigen-Konzentrationen
Für jede ELISA-Platte wurde eine Eichkurve generiert, indem auf jeder Microtiterplatte eine Verdünnungsreihe des mitgelieferten Antigens („Standard“) gemessen wurde. Diese Verdünnungsreihe wurde durch geometrische Verdünnung hergestellt. Zur Verdeutlichung wird in Abbildung 2 eine Originaldarstellung einer gemessenen Platte gezeigt. Die Reihen 1 und 2 enthalten die Doppelbestimmungen der Verdünnungsreihe. Die beiden Positionen H1 und H2 enthalten den sogenannten Blank („Leerwert“), der nur Assay-Puffer enthält und zur Bestimmung der Hintergrundextinktion dient. Der Mittelwert der Blank Bestimmungen wird vor allen weiteren Auswerteschritten von allen Messwerten abgezogen. Die Reihen 3 bis 12 enthalten dann Messwerte von Plasmaproben.
Abbildung 2: Plattenbelegung und Messwerte einer Betatrophin-Messung
Aus den Extinktionswerten dieser bekannten Konzentrationen ergab sich eine Eichkurve (Abbildung 3), auf der die zur jeweiligen Extinktion gehörende Konzentration des Antigens durch die Software des Plattenlesers (Magellan 7.1, TECAN Austria GMBH, Salzburg, Österreich) abgelesen wurde. Zur Berechnung der tatsächlichen Antigenkonzentration im Plasma musste dieser Wert noch mit dem Verdünnungsfaktor der gemessenen Probe multipliziert werden.
Abbildung 3: Eichkurve des Betatrophin ELISA
Auf der x-Achse werden die bekannten Konzentrationen des verdünnten Betatrophin-Standards aus dem Kit und auf der y-Achse die dazugehörigen gemessenen Extinktionswerte aufgetragen. Anhand dieser Eichkurve kann nun die Betatrophin-Konzentration der gemessenen Plasmaproben durch Auftragen der gemessenen Extinktionen auf die Kurve abgelesen werden. Bedingung ist dabei, dass die Extinktionswerte der Proben zwischen 0,1 und 1,0 liegen.
5.3 Bestimmung der Genexpression mittels real-time RT-PCR
Die Bestimmung der Genexpression von Progranulin und PEDF im subkutanen Fettgewebe erfolgte im Labor eines Kooperationspartners (Prof. Birkenfeld, Charité, Berlin). Die verwendeten cDNA-Proben wurden für eine frühere Analyse im Rahmen der B-SMART Studie vom Betreuer synthetisiert (74). Die Beschreibung der Methodik erfolgt hier daher nur überblicksartig wie bei den klinischen Untersuchungsmethoden.
Die Technik der subkutanen Nadelbiopsie am Abdomen ist ein etabliertes Verfahren im Institut für Klinische Pharmakologie und erlaubt die Entnahme von 0,5 bis 1,0 g. Wegen der geringen Traumatisierung und weitgehend schmerzfreien Durchführung ist diese Methode zur mehrfachen Anwendung im Rahmen von Interventionsstudien gut geeignet.
Die RNA-Extraktion aus Fettgewebe erfolgte mit dem RNeasy Mini Kit (Qiagen, #74106, Hilden, Deutschland), der Lyse- und Extraktionspuffer sowie Zentrifugationssäulen enthält.
Zunächst wurden im Eisbad 5-7 Keramikkugeln zur Fettgewebeprobe gegeben und dann bei Raumtemperatur 600µl RLT-Lysispuffer dazu pipettiert. Für 2 x 20s bei 6800rpm wurde das Gewebe vollständig durch Schütteln und die mechanische Wirkung der Keramikkugeln
homogenisiert (Precellysis 24, PeqLab, Erlangen, Deutschland). Das Homogenisat wurde vollständig in ein frisches Gefäß überführt und 5min bei maximaler Geschwindigkeit der Tischzentrifuge (5417C, Eppendorf, Hamburg, Deutschland) zentrifugiert. So konnten die Lipide der Adipozyten von der wässrigen Phase getrennt werden, die die RNA enthält. Die weitere Isolierung der RNA erfolgte nach Herstellerangaben unter Anwendung von Zentrifugationssäulen.
Die Messung der RNA-Konzentration, die Messung des Verhältnisses der Absorption bei 260nm und 280nm und der Proteinkontamination bei 320 nm wurde im Nanodrop durchgeführt (PeqLab, Erlangen, Deutschland). Die cDNA-Synthese erfolgte mit dem High Capacity cDNA RT Kit von Ambion (#4368813) unter Einsatz von 2µg isolierter RNA entsprechend der Herstellerangaben.
Die quantitative real-time RT-PCR wurde im 7500 Fast Real-Time PCR System von ABI durchgeführt, auch alle Chemikalien wurden von ABI bezogen. Hierbei kamen spezifische Primer für jedes Ziel-Gen (Progranulin und PEDF) und das Kontroll-Gen (PO1) zum Einsatz.
Das Prinzip der real-time RT-PCR ist, dass die spezifischen Primer zur selektiven Amplifikation der Zielsequenz führen. Dabei steigt die Menge der amplifizierten DNA mit jedem PCR-Zyklus exponentiell an und wird kontinuierlich durch vorherige Zugabe des interkalierenden Fluoreszenzfarbstoffes SYBR Green in die Reaktionslösung sichtbar gemacht. Dieser Farbstoff lagert sich in doppelsträngige DNA ein emittiert nur dann bei UV- Anregung ein Fluoreszenzsignal. Mit jedem PCR-Zyklus steigt die Fluoreszenzintensität bei logarithmischer Auftragung proportional an, bis nach etwa 40 Zyklen die Kurve abflacht und schließlich in ein Plateau übergeht. Bei logarithmischer Auftragung gibt es aber einen längeren linearen Bereich des Fluoreszenzintensitätsanstiegs. Zusätzlich zum Ziel-Gen erfolgt auch die Amplifikation eines sogenannten internen Kontroll-Gens, von dem bekannt ist, dass es sich durch den untersuchten Einfluss (hier: Adipositas und Gewichtsreduktion) in der Expression nicht verändert wird.
Für die Auswertung der quantitativen Genexpression wird zunächst ein Grenzwert für die Fluoreszenzintensität festgelegt, der für alle Proben gilt, in denen ein Gen gemessen werden soll. Anschließend wird für jede Probe ermittelt, bei welchem PCR-Zyklus dieser Grenzwert erreicht wurde (sog. ct-Wert: threshhold cycle). Indem der ct-Wert des Ziel-Gens nun durch den ct-Wert des Kontroll-Gens geteilt wird, werden Unterschiede zwischen verschiedenen Proben hinsichtlich Ausgangsmengen und PCR-Effizienz ausgeglichen („normalisiert“). Erst dieser Schritt erlaubt den Vergleich verschiedener Proben.
Diese normalisierten ct-Werte gehen in die Auswertung der Genexpression von PEDF und Progranulin im Querschnitt ein. Der Vergleich der Genexpression vor und nach Gewichtsreduktion erfolgt durch direkten Gruppenvergleich der normalisierten ct-Werte.
Konventionsgemäß wird den so quantifizierten Genexpressionswerten eine „künstliche“
Einheit zugeordnet (arbitrary unit, AU), obwohl die Zahlen einheitenlos sind.
5.4 Auswertestrategie und statistische Analyse
Um die erhobenen Adipokinwerte in einen Zusammenhang mit den klinischen Daten zu bringen, wurden aus der Vielzahl der in der B-SMART Studie erhobenen Daten einige wichtige Parameter ausgewählt. Die gut untersuchten Adipokine Leptin, Adiponectin, Fetuin- A, RBP4 und FABP4 werden gezeigt weil bekannt ist, dass sie durch Adipositas und Gewichtsreduktion beeinflusst werden. Zur Beschreibung der Körperzusammensetzung wurde der BMI als die klassische Beschreibungseinheit des Gewichts ausgewählt und durch Taillenumfang sowie die im MRT ermittelten abdominalen subkutanen und viszeralen Fettgewebemassen ergänzt, da diese eine genauere Charakterisierung des Übergewichts ermöglichen. Der metabolische Zustand der Probanden wird durch Insulinsensitivitäts-Index, Gesamtcholesterin, HDL- und LDL-Fraktion und die Triglyzeride charakterisiert. Zuletzt wurden die 24-Stunden Blutdruckwerte als weitere Komponenten des metabolischen Syndroms und das hoch-sensitive CRP ausgewählt („hs-CRP“).
Die genannten Variablen zusammen mit Alter und Geschlechterverteilung werden zunächst im Querschnitt vor Gewichtsreduktion betrachtet und zwar aufgeteilt nach den randomisierten Diäten. Der Gruppenvergleich erfolgte mittels ungepaartem t-Test bei stets normalverteilten Parametern. Hierbei ergaben sich keine wesentlichen Gruppenunterschiede, so dass vor Gewichtsreduktion alle Daten in einen gemeinsamen Datensatz zusammengefasst wurden. Für die Analyse des Einflusses von Adipositas und Adipositas-assoziierten Variablen auf die neuen Adipokine wurden dann 10 besonders wichtige von den genannten 19 Variablen auf der Basis der Literatur ausgewählt: für Alter, Taillenumfang, subkutane und viszerale Fettmasse, Insulinsensitivität, Triglyzeride, Adiponectin und Leptin wurden jeweils Korrelationsanalysen mit Progranulin, PEDF, Betatrophin und Adipolin nach Pearsons berechnet.
Anhand des BMI wurden drei Klassen gebildet: Übergewicht (ÜG), Adipositas Grad I (AD I) und Adipositas Grad II (AD II) analog zur Einteilung von Übergewicht und Adipositas durch die Weltgesundheitsorganisation (WHO).
BMI-Klassen:
ÜG BMI < 30 kg/m² (n = 21) AD I BMI 30-35 kg/m² (n = 31) AD II BMI > 35 kg/m² (n = 17)
Entsprechend dieser Einteilung erfolgte der Mittelwertvergleich für Progranulin, PEDF, Betatrophin und Adipolin mittels ANOVA und Bonferronis multiplem t-Test.
Anhand des intrahepatischen Lipidgehalts (IHL) wurden zwei Gruppen gebildet. Hierbei diente die in der Inneren Medizin gängige Definition der Fettleber mit einem cut-off von 5,5%
Fettgehalt als Grenze zwischen normal und pathologisch (RW.ERROR - Unable to find reference:314). Von den ursprünglich 69 Probanden der Untergruppe fehlten von 6 Probanden die MRT Daten, so dass nur 63 Probanden nach Leberfettklassen aufgeteilt werden konnten.
Leberfett-Klassen:
IHL I IHL < 5,5% (n = 46) IHL II IHL > 5,5% (n = 17)
Entsprechend dieser Einteilung erfolgte der Mittelwertvergleich für Progranulin, PEDF, Betatrophin und Adipolin mittels ungepaarten t-Tests.
Bei der Betrachtung der Daten im Querschnitt ergibt sich also für jedes der neuen Adipokine eine zehnfache Auswertung. Bei der Ergebnisdarstellung wird dieses multiple Testen zunächst nicht berücksichtigt und jeder durch die statische Berechnung generierte p-Wert für sich allein dargestellt. Dabei gelten p-Werte < 0,05 als Hinweis auf einen statistisch signifikanten Gruppenunterschied oder Zusammenhang zwischen zwei Variablen. In der Diskussion wird die Frage nach Korrekturen für multiples Testen aufgegriffen werden.
Die Darstellung der Gewichtsreduktionsdaten erfolgt zum einen anhand der Differenzen der klinischen Variablen (Wert nach Gewichtsreduktion – Wert vor Gewichtsreduktion;
ungepaarter t-Test für den Vergleich der beiden Diätgruppen) oder durch direkten gepaarten t- Test innerhalb jeder Diätgruppe bei den Adipokinen. Außerdem wurden Korrelationsanalysen zwischen den Änderungen der neuen Adipokine mit Änderungen der klinischen Variablen berechnet. Für die Betrachtung der generierten p-Werte s. den vorhergehenden Absatz.
6 Ergebnisse
6.1 Charakterisierung der Studienpopulation im Querschnitt
Von ursprünglich 170 randomisierten Probanden beendeten 102 die Gewichtsreduktionsphase. Für die Querschnittsbetrachtung standen aber nur 69 vollständige Datensätze zur Verfügung. Die Charakteristika der betreffenden 69 Probanden sind in Tabelle 3 abgebildet.
Tabelle 3: Gruppenvergleich vor Gewichtsreduktion.
Alle Daten werden als Mittelwert Standardabweichung gezeigt. Mittelwertvergleich durch t-Test für ungepaarte Stichproben. * p < 0,05.
Low Carb (n = 29) Low Fat (n = 40)
Frauen/Männer 27 / 3 29 / 11
Alter [Jahre] 44 9 46 10
BMI [kg/m²] 33,0 5,5 33,1 4,5
Taillenumfang [cm] 100 13 102 13
subkutanes Fett [kg] 10,3 3,1 9,3 3,2
viszerales Fett [kg] 1,7 0,9 2,1 1,5
intrahepatisches Fett [%] 6,5 7,2 9,8 10,2
Insulinsensitivitäts-Index [AU] 5,2 2,0 5,0 2,8
Triglyzeride [mmol/l] 1,2 0,6 1,2 0,7
Gesamt-Cholesterin [mmol/l] 4,8 0,9 5,0 0,9
LDL [mmol/l] 2,9 0,7 3,2 0,9
HDL [mmol/l] 1,3 0,3 1,3 0,3
ABDM [mmHg] 115 7/70 7 120 10*/73 8
hs-CRP [µg/ml] 1,2 0,9 1,6 1,5
Leptin [ng/ml] 33 12 32 13
Adiponectin [µg/ml] 6,4 2,2 6,0 1,9
Fetuin A [ng/ml] 249 66 250 70
RBP4 [µg/ml] 75 28 71 31
FABP4 [µg/ml] 37 13 34 13
ABDM – ambulante Blutdruckmessung über 24h; BMI – Body Mass Index ; FABP4 – Fatty Acid Binding Protein 4 ; HDL – High Density Lipoprotein; hs-CRP- high sensitivity C-reactive Protein; ISI- Insulin Sensitivitäts-Index; LDL – Low Density Lipoprotein; RBP4 – Retinol Binding Protein 4. ABDM – Ambulantes Blutdruck Monitoring über 24h; BMI – Body Mass Index ; FABP4 – Fatty Acid Binding Protein 4 ; HDL – High Density Lipoprotein; hs-CRP- high sensitivity C-reactive Protein; ISI- Insulin Sensitivitäts-Index; LDL – Low Density Lipoprotein; RBP4 – Retinol Binding Protein 4
Beim Vergleich der Baseline-Daten in beiden Diätgruppen zeigte sich in der Ausprägung der ausgewählten Parameter bis auf den systolischen Blutdruck kein Unterschied. Weiterhin unterschieden sich die Plasmakonzentrationen der in dieser Arbeit untersuchten Adipokine Progranulin, PEDF, Betatrophin und Adipolin nicht. Daher wurden alle 69 Probanden bei der Betrachtung der Daten vor der Gewichtsreduktion zusammengefasst.
6.2 Einfluss von Adipositas und Stoffwechsel auf die „neuen“ Adipokine 6.2.1 Progranulin
Die Plasmakonzentrationen von Progranulin wurden mit den genannten 8 ausgewählten klinischen Parametern in univariaten Korrelationsanalysen untersucht (Alter, Taillenumfang, subkutane und viszerale Fettmasse, Insulinsensitivität, Triglyzeride, Adiponectin und Leptin).
Wie in Tabelle 4 dargestellt bestehen signifikante positive Korrelation von Progranulin mit dem Taillenumfang und der viszeralen Fettmasse und eine signifikante negative Korrelation mit Adiponectin. Die übrigen Korrelationen zeigten sich nicht statistisch signifikant, allerdings besteht mit der subkutanen Fettmasse eine positive Korrelation knapp unterhalb des Signifikanzniveaus von p < 0,05 in der gleichen Weise wie mit der viszeralen Fettmasse.
Tabelle 4: Korrelation nach Pearson von Progranulin mit ausgewählten klinischen Parametern.
Dargestellt sind Regressionskoeffizienten (r), signifikante Korrelationen sind fett hervorgehoben (n = 69).
r p
Alter [Jahre] - 0,03 0,81
Taillenumfang [cm] 0,30 0,01
subkutanes Fett [kg] 0,24 0,07
viszerales Fett [kg] 0,33 0,01
Insulinsensitivitäts-Index [AU] - 0,15 0,23
Triglyzeride [mmol/l] 0,20 0,13
Leptin [ng/ml] -0,06 0,67
Adiponectin [µg/ml] - 0,34 0,01
