Die Plasmakonzentrationen der genannten Proteine wurden durch das sogenannte „Sandwich -ELISA“-Verfahren bestimmt. Dieses Verfahren detektiert die Menge eines zwischen zwei Antikörpern gebundenen Antigens. Bei einem Sandwich-Elisa ist die Mikrotiterplatte mit dem ersten Antikörper („coating antibody“) beschichtet. Nach Zugabe der Plasmaprobe bindet dieser Antikörper spezifisch an das zu bestimmende Antigen (= Adipokin). Der anschließende Waschschritt entfernt nicht oder unspezifisch gebundene Antigene und minimiert damit das Auftreten falsch positiver (erhöhter) Messwerte. Im Anschluss wird ein zweiter gegen das gleiche Antigen gerichteter Antikörper zugefügt („detection antibody“), an den mehrere Biotin-Moleküle gebunden sind. Je nach Menge des bereits gebundenen Antigens bindet eine entsprechend proportionale Anzahl des zweiten Antikörpers an diesen Komplex.
Im nächsten Schritt wird das Enzym Horseradish-Peroxidase zugefügt, an das Streptavidin gebunden ist. Zwischen Biotin (am zweiten Antikörper) und Streptavidin (am Enzym) entsteht eine feste Bindung. Das anschließend als Substrat hinzugefügte farblose Tetramethylbenziden wird durch die Peroxidaseaktivität zu einem blauen Farbstoff umgesetzt.
Durch Zugabe des säurehaltigen Stopp-Reagenz wird die Reaktion zum Stillstand gebracht und dann die Konzentration des nun gelben Farbstoffs photometrisch bestimmt. Da die Enzymaktivität proportional zur Menge des gebundenen Antigens ist, kann anhand einer Eichkurve aus verdünnter Antigenlösung und unter Berücksichtigung von Verdünnungs-faktoren die Konzentration des untersuchten Antigens in der Probe bestimmt werden.
Nützlich sind die Sandwichmethoden vor allem bei geringen Konzentrationen des Antigens.
Da jeder Detektions-Antikörper mehrere Bindungsstellen für das Enzym Peroxidase hat, erfolgt so eine mehrfache Verstärkung des Farbsignals pro Antigenmolekül, damit wird eine größere Sensitivität des Tests erreicht. Ebenfalls von Vorteil ist die Sandwichmethode, wenn viele verschiedene Antigene in einer Probe enthalten sind, wie es im Blutplasma stets der Fall ist. Die Möglichkeit für unspezifische Kreuzreaktionen der Antikörper wird durch den Einsatz von mehreren spezifischen Antikörpern verringert, die Spezifität der Antigenerkennung steigt damit.
5.2.2 Spezifische Durchführung der ELISAs
Die zur Messung benötigten ELISA-Kits enthalten alle zur Durchführung der Adipokin-Messungen benötigten Materialien (s. Tabelle 2), so dass eine gesonderte Aufführung von Materialien und Chemikalien nicht erfolgt. Im Einzelnen wurden die folgenden Kits eingesetzt:
PEDF (Human PEDF ELISA, PED613, Human BioProducts MD, Middletown, USA)
Progranulin (Progranulin human ELISA, AG-45A-0018PP-KI01, AdipoGen Inc., South Korea)
Betatrophin (Human Hepatocellular carcinoma-associated Protein TD26 ELISA, E11644h, Wuhan EIAab Science Co. Ltd, Wuhan, China)
Adipolin (human Protein FAM132A ELISA, CSB-EL008058HU, CUSABIO, Wuhan, China)
Da alle ELISAs auf der gleichen Messmethode beruhen, waren auch die zur Durchführung der Messungen notwendigen Arbeitsschritte weitgehend identisch und können daher im Folgenden zusammenfassend für alle vier ELISAs dargestellt werden:
Zunächst wurde Plasma aufgetaut und in jeweils 2 Aliquots à 250 μl und 2 Aliquots à 100 μl aufgeteilt. Die Aliquots wurden bis zur Messung bei -20°C gelagert. Durch die Aliquotierung wurde die Anzahl der Auftau-Einfrier-Zyklen so gering wie möglich gehalten, um präanalytische Veränderungen der zu messenden Proteine zu vermeiden.
Zur Messung jedes Proteins wurde ein Aliquot aufgetaut und entsprechend der Herstellerangaben mit den mitgelieferten Lösungsmitteln der Kits verdünnt. In Tabelle 2 werden die speziellen Inkubations- und Waschbedingungen für jeden ELISA dargestellt.
1. Auftragen der Proben: Je 100 μl Standard, Blank (= Assay-Puffer ohne weitere Komponenten) und verdünnte Probe wurden zur internen Kontrolle jeweils doppelt auf die Mikrotiterplatte aufgetragen (Abbildung 2). Jede Probe wurde doppelt aufgetragen, um später mit Mittelwerten aus der Doppelbestimmung arbeiten zu können. Die Platte wurde für die Dauer der vom Hersteller jeweils angegebenen Inkubationszeit (s.u.) bei 37° C inkubiert (CO2- freier Inkubator B15 Thermo Fisher Scientific, Braunschweig, Deutschland).
2. Waschen: Nach Ablauf der Inkubationszeit wurde jede Mikrotiterplatte nach den Angaben des jeweiligen Herstellermanuals gewaschen, um Probenreste zu entfernen. Es wurde vorsichtig gearbeitet, damit die Antigene gebunden blieben. Der Überstand wurde entfernt und Waschpuffer zugegeben. Der Waschpuffer wurde wieder entfernt und die Platte auf Papiertücher ausgeklopft. Dieser Schritt wurde gemäß den Angaben im Manual des jeweiligen Kits wiederholt. Bei Betatrophin und Adipolin blieb der Waschpuffer jeweils für 1-2 min. in den Plattenvertiefungen, bei den anderen Adipokinen wurde der Waschpuffer nach der Zugabe sofort wieder entfernt.
3. Auftrag des zweiten Antikörpers: Der zweite Antikörper wurde nach dem Waschen auf die Platte aufgetragen und wieder bei 37° C inkubiert.
4. Waschen: Nach Ablauf der jeweiligen Inkubationszeit wurde der überschüssige zweite Antikörper vorsichtig abgewaschen, um später nur die Enzymaktivität der direkt an die Antigene gebundenen Antikörper messen zu können.
5. Zugabe von Streptavidin-Horseradish Peroxidase
6. Zugabe von Tetramethylbenziden als Substrat für die Horseradish-Peroxidase
7. Zugabe des Stopp-Reagenz: Nach Ablauf der jeweiligen Inkubationszeit wurde die enzymatische Reaktion mittels Zugabe des säurehaltigen Stopp-Reagenz gestoppt.
8. Messung der Absorption: Direkt nach dem Reaktionsstopp wurde die Absorption des entstandenen Farbstoffes gemessen. Es wurde ein 450 nm Filter im Plattenleser Infinite 200 (TECAN Austria GMBH, Salzburg, Österreich) verwendet.
PEDF liegt mit Proteinen komplexiert im Blut vor. Deshalb wurden die Plasma-Proben zunächst zu gleichen Teilen mit 8M Harnstoff gemischt und für 15-30 min. bei 4°C (auf Eis) unter wiederholtem Mischen mit einem Vortex-Schüttler inkubiert. Die Proben wurden dann 1:50 in dem im Kit mitgelieferten Puffer verdünnt und anschließend nochmals 1:200 mit PBS verdünnt. Die so vorbereiteten Proben wurden dann auf die Microtiter-Platte aufgetragen.
Tabelle 2: Wasch- und Inkubationsbedingungen der ELISA für die vier Adipokine.
PEDF Progranulin Betatrophin Adipolin 1. Inkubation
nicht bestimmt CV%<6,4% nicht bestimmt CV%<10%
5.2.3 Berechnung der Antigen-Konzentrationen
Für jede ELISA-Platte wurde eine Eichkurve generiert, indem auf jeder Microtiterplatte eine Verdünnungsreihe des mitgelieferten Antigens („Standard“) gemessen wurde. Diese Verdünnungsreihe wurde durch geometrische Verdünnung hergestellt. Zur Verdeutlichung wird in Abbildung 2 eine Originaldarstellung einer gemessenen Platte gezeigt. Die Reihen 1 und 2 enthalten die Doppelbestimmungen der Verdünnungsreihe. Die beiden Positionen H1 und H2 enthalten den sogenannten Blank („Leerwert“), der nur Assay-Puffer enthält und zur Bestimmung der Hintergrundextinktion dient. Der Mittelwert der Blank Bestimmungen wird vor allen weiteren Auswerteschritten von allen Messwerten abgezogen. Die Reihen 3 bis 12 enthalten dann Messwerte von Plasmaproben.
Abbildung 2: Plattenbelegung und Messwerte einer Betatrophin-Messung
Aus den Extinktionswerten dieser bekannten Konzentrationen ergab sich eine Eichkurve (Abbildung 3), auf der die zur jeweiligen Extinktion gehörende Konzentration des Antigens durch die Software des Plattenlesers (Magellan 7.1, TECAN Austria GMBH, Salzburg, Österreich) abgelesen wurde. Zur Berechnung der tatsächlichen Antigenkonzentration im Plasma musste dieser Wert noch mit dem Verdünnungsfaktor der gemessenen Probe multipliziert werden.
Abbildung 3: Eichkurve des Betatrophin ELISA
Auf der x-Achse werden die bekannten Konzentrationen des verdünnten Betatrophin-Standards aus dem Kit und auf der y-Achse die dazugehörigen gemessenen Extinktionswerte aufgetragen. Anhand dieser Eichkurve kann nun die Betatrophin-Konzentration der gemessenen Plasmaproben durch Auftragen der gemessenen Extinktionen auf die Kurve abgelesen werden. Bedingung ist dabei, dass die Extinktionswerte der Proben zwischen 0,1 und 1,0 liegen.