Epimerisierungsdomänen aus Peptidsynthetasen –
Untersuchungen zur Substratspezifität und zur
Interaktion mit anderen Domänen
Dissertation zur
Erlangung des Doktorgrades der Naturwissenschaften
(Dr. rer. nat.)
dem Fachbereich Chemie der Philipps-Universität Marburg
vorgelegt von
Uwe Linne
aus Marburg/Lahn
Vom Fachbereich Chemie der Philipps-Universität Marburg Als Dissertation am 07.09. 2001 angenommen.
Erstgutachter: Prof. Dr. M. A. Marahiel Zweitgutachter: Prof. Dr. T. Schrader
Zusammenfassung
Die nichtribosomale Peptidbiosynthese wird durch multifunktionelle Peptidsynthetasen katalysiert, die eine modulare Struktur aufweisen. Diese Module lassen sich weiter unterteilen in Domänen, wobei jeder Domäne jeweils eine katalytische Funktion zukommt. Die Anzahl der Module und ihre jeweilige Domänenzusammensetzung definiert so die Aminosäuresequenz und die Struktur der Produkte. Die Adenylierungsdomänen (A-Domänen) erkennen und adenylieren die Substrataminosäuren. Danach werden die Aminoacylderivate unter AMP-Freisetzung als Thioester an einen Phosphopantetheinkofaktor (Ppant) gebunden, der seinerseits mit der Seitenkette eines invarianten Serins eines Peptidyl-Carrier-Proteins (PCP; T-Domäne) kovalent verknüpft ist. Kondensationsdomänen (C-Domänen) katalysieren die Peptidbindungsbildung. Neben diesen zur Elongation essentiellen Domänen (C-A-PCP) gibt es optionale Modifikationsdomänen, zu denen u.a. Epimerisierungsdomänen (E-Domänen) gehören, die die L-nach-D und D-nach-L Umwandlung der als Thioester gebundenen Substrate katalysieren.
Im Vordergrund dieser Arbeit standen Untersuchungen zur Spezifität von E-Domänen aus Peptidsynthetasen sowie ihrer Wechselwirkung mit anderen Domänen. Es zeigte sich, dass verkürzte Substratanaloga, sogenannte SNACs, nicht von E-Domänen umgesetzt werden. Daraufhin wurden auf genetischer Ebene Fusionsproteine der Typen A/PCP-E und A-PCP/E hergestellt („/“ gibt dabei die Fusionsstelle an), die jeweils die E-Domäne von TycA und A-Domänen anderer Module enthielten. Es zeigte sich, dass die E-Domäne von TycA, deren natürliches Substrat L-Phe-S-Ppant ist, dazu in der Lage war, mit verminderter Effizienz auch die alternativen Substrate Trp-S-Ppant, Val-S-Ppant und Ile-S-Ppant umzusetzen. Interessanterweise waren aber nur die Fusionsproteine epimerisierungsaktiv, welche ein PCP enthielten, das natürlicherweise mit einer E-Domäne interagiert (PCPE). Solche mit PCPs, welche natürlicherweise C-terminal mit einer C-Domäne, anstatt mit einer E-Domäne verknüpft sind (PCPC), waren inaktiv. Durch Sequenzvergleiche konnten konservierte Sequenzvariationen von PCPEs und PCPCs definiert werden. Der Einfluss der Sequenzunterschiede im CoreT (Bereich, in dem sich zentral das invariante Serin zur Kofaktorbindung befindet) auf die Epimerisierungsreaktion konnte darüber hinaus anhand von Mutanten biochemisch belegt werden. Als wichtiges Ergebnis kann festgehalten werden, dass E-Domänen mit den N-terminalen PCPs kommunizieren und für ihre Aktivität ein PCPE benötigen.
In der Literatur werden zwei Typen von E-Domänen diskutiert. Dies sind E-Domänen von Initiationsmodulen, die ein aminoacyl-S-Ppant Substrat epimerisieren und solche von Elongationsmodulen, die peptidyl-S-Ppant Substrate epimerisieren, nachdem die wachsende Peptidkette auf das entsprechende Modul übertragen wurde. Durch die Entwicklung eines in
vitro Systems konnte gezeigt werden, dass diese peptidyl-E-Domänen prinzipiell dazu in der
Lage sind aminoacyl-S-Ppant Substrate zu epimerisieren, wenn auch mit geringerer Effizienz. Das Vorhandensein einer N-terminalen C-Domäne hingegen hatte nicht nur den Verlust der aminoacyl-S-Ppant Epimerisierungsaktivität sondern auch den der Initiationsfähigkeit des Moduls zur Folge. Daraus konnte ein Modell abgeleitet werden, welches fundamental zum Verständnis der gerichteten Peptidsynthese durch Peptidsynthetasen beiträgt und erklärt, warum bei NRPS keine interne Mis-Initiation beobachtet werden kann. Hierbei wird das aminoacyl-S-Ppant Substrat von einer Akzeptorstelle der C-Domäne, die eine ausgeprägte Substratselektivität zu besitzen scheint, gebunden, bis die Peptidbindungsbildung mit dem elektrophilen Donorsubstrat vollzogen wurde. Das gebildete peptidyl-S-Ppant ist dann nicht länger ein Substrat dieser Akzeptorstelle, wird freigesetzt und kann mit einer optionalen E-Domäne oder aber mit der nachfolgenden C-E-Domäne interagieren.
Inhaltsverzeichnis
1 ABKÜRZUNGEN UND SYMBOLE 1
2 EINLEITUNG 5
2.1 Struktur und Bedeutung nichtribosomal synthetisierter Polypeptide 5
2.2 Die nichtribosomale Peptidsynthese in Bakterien und Pilzen 8
2.3 Die Funktionen der einzelnen Domänen 11
2.3.1 Die Adenylierungsdomäne 12
2.3.2 Das Peptidyl-Carrier-Protein (Thiolierungsdomäne) und die posttranslationale
Modifikation 13 2.3.3 Die Kondensationsdomäne 15 2.3.4 Die Heterozyklisierungsdomäne 17 2.3.5 Terminationsdomänen 18 2.3.6 Optionale Modifikationsdomänen 19 2.3.6.1 Die Epimerisierungsdomäne 20 2.3.6.2 Die N-Methylierungsdomäne 21
2.3.6.3 Weitere Modifikationsdomänen- Oxidations- und N-Formylierungsdomänen 21
2.4 Die Biosynthese von D-Aminosäuren 22
2.5 Die Inkorporation von D-Aminosäuren in nichtribosomal synthetisierte Peptide 24
2.6 Aufgabenstellung 25
3 MATERIAL 26
3.1 Chemikalien, Enzyme und Verbrauchsmaterial 26
3.2 Geräte 28
3.3 Vektoren 29
3.3.1 pQE60 und pQE70 29
3.4 Mikroorganismen 30 3.4.1 E. coli XL1-Blue 30 3.4.2 E. coli M15 30 3.4.3 E. coli SG13009 30 3.5 Medien 30 4 METHODEN 32
4.1 Molekularbiologische Methoden – DNA Techniken 32
4.1.1 PCR-Amplifikation von DNA-Fragmenten 32
4.1.2 Gezielte Punktmutagenese 33
4.1.3 DNA-Sequenzanalyse 33
4.2 Genexpression und Protein-Techniken 34
4.2.1 Genexpression 34
4.2.2 Zellaufschluß – Präparation von E. coli Rohzellextrakten 34 4.2.3 Proteinaufreinigung mittels IMAC - Affinitätschromatographie 35
4.2.4 Sequenzvergleiche von PCPEs mit PCPCs 36
4.3 Biochemische Untersuchungen 36
4.3.1 Assay für die Aktivität der A-Domäne -"ATP-PPi-Austausch" 36 4.3.2 Assay für die Aktivität des PCPs – Aminoacylierungsassay 37
4.3.3 Radioassay für den Nachweis der Elongationsreaktion und der Produktabspaltung im
System TycB2-3/TycC1 38 4.3.4 Produktbildungsassay im System TycB2-3/TycC1 39
4.3.5 DKP-Bildungsassay 40
4.3.6 Epimerisierungsassay 41
4.3.7 SNAC-Epimerisierungsassay 42
5 ERGEBNISSE 44
5.1 SNAC-Epimerisierungsassays 44
5.2 Konstruktion eines Sets aus acht Hybridproteinen des Typs A-PCP/E und A/PCP-E 45
5.2.1 Erzeugung und Reinigung der rekombinanten Enzyme 45
5.2.2 Aminosäureaktivierung (PPi-Austausch) 47 5.2.3 Untersuchung der Zeitabhängigkeit der Aminoacylierung 49
5.2.4 Epimerisierungsaktivitäten der Fusionsproteine 51 5.2.5 Vergleich der Epimerisierungsaktivitäten von TycA (V), TycB3 (XIV),
TycA-AT-TycB3-E (XVII) und TycB3-AT/E (IIb) 54
5.2.6 Weitere Fusionsproteine des Typs A/PCP-E 56
5.3 Der Einfluss der PCPs auf die Epimerisierung – PCPEs versus PCPCs 56
5.3.1 Sequenzvergleiche verschiedener PCPs 56
5.3.2 Einfluss von Mutationen im CoreT von PCPs auf die Epimerisierungsaktivität 58 5.3.3 DKP-Bildungsaktivität der GrsA-CoreT-Mutanten verglichen mit dem Wildtyp 60
5.3.4 Mutationen in TycB2-AT/E (Ib) 62
5.4 Entwicklung eines in vitro Systems zur Charakterisierung einer
peptidyl-Epimerisierungsdomäne 63
5.4.1 Konstruktion und Reinigung der rekombinanten Enzyme 64
5.4.2 Aminosäureaktivierung (PPi-Austausch) 65 5.4.3 Untersuchung der Aminoacylierungskinetiken sowie des Phe-Transfers von den
TycB-Derivaten auf TycC 66
5.4.4 Produkt Identifizierung und Quantifizierung mittels HPLC-MS 68 5.4.5 Epimerisierungsaktivitäten der TycB-Derivate XI, XII, XIII und XIV 71 5.4.6 Epimerisierungsaktivität von TycB2-3-AT.CAT/E (XXV) 73
5.5 Elongationsversuche und Protein-Protein-Erkennung im
Tyrocidin-Biosynthesesystem über die Epimerisierungsdomänen 74
6 DISKUSSION 77
6.1 Motivation für diese Arbeit 77
6.2 Substratspezifität von E-Domänen 78
6.2.1 Externe Variation der Substrate 78
6.2.2 Fusionsproteine – Änderung der Spezifität durch Austausch der A-Domänen 79
6.3.1 Selektivität von E-Domänen und ihre Kommunikation mit dem PCPE 81 6.3.2 Die Auswirkung von Mutationen im PCP auf die Epimerisierungs- und
Produktbildungsaktivität 82 6.3.3 Das L/D-Gleichgewicht und der Einfluss der PCPs 85
6.4 Entwicklung eines in vitro Systems zur Charakterisierung einer
Peptidyl-Epimerisierungsdomäne 86
6.4.1 Die Auswahl eines geeigneten Systems 86
6.4.2 Die C-Domäne verhindert Mis-Initiation und legt den Zeitpunkt der Epimerisierung
fest 88
6.5 Aminoacyl- versus peptidyl-E-Domäne 93
6.5.1 Gibt es zwei Klassen von E-Domänen ? 93
6.5.2 Mögliche mechanistische Unterschiede – ein Modell für die abweichende Reaktivität 94
6.6 Protein-Protein-Erkennung und kombinatorische Ansätze zur Erzeugung neuer
Produkte 95
6.6.1 Die in trans Protein-Protein-Interaktion zweier NRPSs 95 6.6.2 Kombinatorik mit NRPS-Modulen und Domänen – ein langfristiges Ziel mit vielen
Hindernissen 97
7 ANHANG 100
Anhang A – Proteinübersicht 100
Anhang B – Herkunft und Klonierung aller verwendeten Proteine 102
Beschreibung der Konstrukte K1-K11: 104
Beschreibung der Plasmide, die für die in dieser Arbeit erwähnten Proteine kodieren 105
Anhang C – Core-Sequenzen von NRPS-Domänen 109
Anhang D – Abbildungsverzeichnis 110
1 Abkürzungen und Symbole
Tabelle 0-1 Verwendete Abkürzungen:
aminoacyl-S-Ppant an das invariante Serin des PCP´s gebundener Kofaktor Ppant, der über einen Thioester aminoacyliert ist
A-Domäne Adenylierungsdomäne Amp Ampicillin AMP Adenosin-5'-monophophat APS Ammoniumpersulfat ATP Adenosin-5'-triphosphat bla β-Lactamase-Gen bp Basenpaare cat Chloramphenicol-Acetyltransferase-Gen C-Domäne Kondensationsdomäne Ci Curie CoASH Coenzym A
cpm gezählte Zerfälle pro Minute (counts per minute) Da Dalton
DC Dünnschichtchromatographie
DH2O entionisiertes Wasser
DKP ohne Zusatz in dieser Arbeit immer D-Phe-L-Pro-Diketopiperazin
DNA Desoxyribonucleinsäure (deoxyribonucleic acid)
dpm korrigierte Zerfälle pro Minute (desintegrations per minute) DTE 1,4-Dithioerythritol E-Domäne Epimerisierungsdomäne EDTA Ethylendiamintetraessigsäure ESI Elektrospray-Ionisation EtBr Ethidiumbromid EtOH Ethanol
FPLC schnelle Flüssigchromatographie ( fast performance liquid
HEPES 2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]-ethansulfonsäure HPLC Hochleistungsflüssigkeitschromatographie
(high performance liquid chromatography) KOH Kaliumhydroxid
LSC Flüssigkeits-Szintillations-Zählung (liquid szintillation
counting)
IMAC Affinitätschromatographie an immobilisierten Metallionen (Immobilized metall affinitychromatography)
IPTG Isopropyl-β-D-thiogalaktosid Kan Kanamycin kb Kilobasenpaare
LC Flüssigchromatographie (liquid chromatography) MCS Multipler Klonierungsbereich (multiple cloning site) M-Domäne Methylierungsdomäne
min Minute(n)
MS Massenspektrometrie (mass spectrometry) NRPS Nichtribosomale-Peptidsynthetasen NTA Nitrilotriacetat
ODλ optische Dichte bei der Wellenlänge λ [nm] ORF offenes Leseraster (engl. open reading frame)
ori Replikationsursprung (origin of replication) PAGE Polyacrylamidgelelektrophorese PCP Peptidyl-Carrier-Protein (s. auch T-Domäne)
PCPC PCP, welches am C-Terminus mit einer Kondensationsdomäne verbunden ist
PCPE PCP, welches am C-Terminus mit einer Epimerisierungsdomäne verbunden ist
PCR Polymerase-Kettenreaktion (polymerase chain reaction)
peptidyl-S-Ppant an das invariante Serin des PCP´s gebundener Kofaktor Ppant, der über einen Thioester mit einem Peptid derivatisiert ist
PKS Polyketidsynthasen
PPi anorganisches Pyrophosphat (inorganic pyrophosphate)
RBS ribosomale Bindestelle (ribosomal binding site) RNase Ribonuklease
RT Raumtemperatur
SDS Natriumdodecylsulfat (sodium dodecyl sulfate)
[Aminosäure]-SNAC Aminosäurederivate, die als Thioester an die Thiolgruppe von N-Acetylcysteamin gebunden sind
TCA Trichloressigsäure (engl. tri-chloro-acetic acid)
T-Domäne Thiolierungsdomäne (s. auch PCP) Te-Domäne Thioesterasedomäne
TEMED N,N,N´,N´-Tetramethylethylendiamin Tris Tris(hydroxymethyl)aminomethan Upm Umdrehungen pro Minute
UV ultraviolett
V/v Volumen pro Volumen (engl. volume per volume) W/v Gewicht pro Volumen (engl. weight per volume)
Tabelle 0-2 Aminosäuren: Abkürzungen und Molekulargewichte Aminosäure 3- 1- Buchstabenkode MW [g⋅⋅⋅⋅mol-1] Alanin Ala A 89 Arginin Arg R 174 Asparagin Asn N 132 Asparaginsäure Asp D 133 Cystein Cys C 121 Glutamin Gln Q 146 Glutaminsäure Glu E 147 Gln oder Glu Glx Z - Glycin Gly G 75 Histidin His H 155 Isoleucin Ile I 131 Leucin Leu L 131 Lysin Lys K 146 Methionin Met M 149 Phenylalanin Phe F 165 Prolin Pro P 115 Ornithin Orn O 132 Serin Ser S 105 Threonin Thr T 119 Tryptophan Trp W 204 Tyrosin Tyr Y 181 Valin Val V 117
2 Einleitung
2.1 Struktur und Bedeutung nichtribosomal synthetisierter Polypeptide
In Bakterien und Pilzen findet man eine große Bandbreite verschiedener außergewöhnlicher Sekundärmetabolite, darunter auch Polypeptide, die oftmals eine zyklische Struktur besitzen und eine große Anzahl nicht proteinogener Aminosäuren und Hydroxysäuren enthalten können (siehe einige ausgewählte Beispiele in Abbildung. 2-1) [1, 2]. Umfangreiche weitere Modifikationen wie α-C-Epimerisierung (D-Aminosäuren), N-Methylierung, N-Formylierung, Heterozyklisierungen, sowie β-, χ- und δ-verknüpfte Peptidbindungen sind ebenfalls möglich [3]. Die strukturelle Vielfalt wird noch weiter vergrößert durch nachträgliche Modifikationen der Peptide, wie zum Beispiel Glykosilierungen oder Hydroxylierungen [4]. Generell lässt sich sagen, dass diese Polypeptide aufgrund ihrer strukturellen Vielfalt ein pharmakologisch sehr breites Wirkungsspektrum zeigen. So findet man Peptidantibiotika, Immunsuppresiva und Zytostatika unter ihnen. Einige dieser Stoffe haben eine so große Bedeutung erlangt, dass sie aus der modernen Medizin nicht mehr wegzudenken sind. Bei dieser Stoffklasse handelt es sich um Sekundärmetabolite der produzierenden Organismen, die nichtribosomal an enzymatischen Templaten, den Peptidsynthetasen (NRPS) [5, 6], synthetisiert werden. Insbesondere dem wachsenden Interesse an diesen Sekundärmetaboliten und Genomprojekten ist es zu verdanken, dass in letzter Zeit immer mehr Biosyntheseoperons identifiziert und analysiert werden. Peptidsynthetasegene bzw. deren Produkte kennt man insbesondere aus gram-positiven Bakterien des Genus Bacillus, einer großen Anzahl von Actinomyceten sowie aus einigen gram-negativen Proteobakterien [7-9]. Aber auch einige einzellige Pilze besitzen die Fähigkeit bestimmte Polypeptide nichtribosomal herzustellen [10]. Hier wäre insbesondere Penicillium chrysogenum zu nennen, ein Penicillin-Produzent [11]. Die 1928 von A. Fleming zufällig gemachte Entdeckung des Penicillins hat die moderne Infektionsmedizin im 20. Jahrhundert entscheidend geprägt. Die nichtribosomal synthetisierten Penicilline [12, 13] und Cephalosporine [11, 14] bilden noch heute die Basis bei der Bekämpfung von Infektionskrankheiten. Weitere pharmakologisch äußerst bedeutsame Produkte nichtribosomaler Peptidsynthese sind das zyklische Undecapeptid Cyclosporin (Tolypocladium niveum) [25], welches als Immunsupressivum bei Organtransplantationen die Abstoßung der Spenderorgane unterdrückt, sowie Vancomycin [4], welches häufig bei
Abbildung 2-1: Beispiele für die strukturelle Vielfalt von Produkten der nichtribosomalen Peptidsynthese
Vancomycin, Penicillin, Tyrocidin und Bacitracin sind Peptidantibiotika [4, 12, 15, 16]. Surfactin hat Biotenside Eigenschaften [17, 18], Cyclosporin wird als Immunsupressivum bei verwendet [19]. Yersiniabactin ist ein Siderophor und essentiell für die Pathogenität des Pesterregers Yersinia pestis [20], während HC-Toxin [21, 22] ein Phytotoxin und Microcystin ein Heptatoxin ist [23, 24].
Infektionen mit sogenannten MDR-Stämmen (Multi-Drug-Resistent) das einzig noch wirksame Antibiotikum darstellt. Insbesondere auch gemischte Produkte, die sowohl einen Polypeptidanteil als auch Polyketidstrukturen in sich vereinen [26], rücken aufgrund ihrer immensen pharmakologischen Bedeutung immer mehr in den Mittelpunkt des Interesses. Wichtige Vertreter dieser letztgenannten Stoffklasse sind Epothilon [27] und Bleomycin [28], hochwirksame Antitumor-Wirkstoffe.
Man findet aber nicht nur pharmakologisch nützliche, sondern auch toxische Produkte. Viele nichtribosomal synthetisierte Produkte pilzlichen Ursprungs verursachen durch ihre Toxizität für Nutzpflanzen beträchtlichen Schaden [21, 29]. Die Heptatoxine des Cyanobakteriums
Microcystis aeruginosa [23, 30, 31] sind als toxische Produkte in eutrophierten Gewässern zu
finden.
Der Aufwand, den die Miroorganismen zur nichtribosomalen Peptidsynthese betreiben, ist immens, bedenkt man die Größe der NRPS. Die Cyclosporin-Synthetase ist mit 1.69 MDa das bisher größte bekannte Enzym. Die Biosyntheseoperons machen oftmals einen beachtlichen Teil der genomischen bakteriellen DNA aus (in Bacillus subtilis ∼4%). Aber so pharmakologisch interessant die strukturell sehr divergente Gruppe nichtribosomal synthetisierter Peptide ist, so wenig weiß man über ihre physiologische Rolle in den produzierenden Organismen [32, 33]. Betrachtet man die antibiotischen Eigenschaften dieser Stoffklasse [1], so lässt sich vermuten, dass sie den produzierenden Mikroorganismen einen Selektionsvorteil verschafft haben, indem Nahrungskonkurrenten am Wachstum gehindert wurden. Eine andere Spekulation legt regulatorische Funktionen nahe, insbesondere solche, die zu Zelldifferenzierungen führen [34]. Eine wieder andere Hypothese besagt, dass diese Stoffe die Funktion exogener Signalmoleküle übernehmen können [35]. Einige nichtribosomal synthetisierte Peptide sind Fe3+-Chelatbildner, sogenannte Siderophore. Diese werden unter Eisenmangelbedingungen produziert und in den extrazellulären Raum sekretiert, wo sie hochwirksam Fe3+-Ionen komplexieren. Dieser Komplex wird dann durch spezielle Transportsysteme in die Zellen zurückgeschleust, wo die Fe3+-Ionen schließlich freigesetzt werden und den Mikroorganismen ein Überleben ermöglichen [36, 37]. Es ist bekannt, dass dieser Mechanismus essentiell für die Pathogenität bestimmter Mikroorganismen, so die des Pesterregers Yersinia pestis [38, 39], des Choleraerregers Vibrio cholerae [40-43] und des Tuberkuloseerregers Mycobacterium tuberculosis [44, 45] ist.
2.2 Die nichtribosomale Peptidsynthese in Bakterien und Pilzen
Nichtribosomale Peptidsynthetasen (NRPS) sind Multienzyme mit einem modularen Aufbau (siehe Abbildung 2-3) [1] ähnlich dem der Polyketidsynthasen [46]. Beispiele für die Organisation einiger Biosyntheseoperons zeigt Abbildung 2-2. Jedes Modul ist mit allen katalytischen Einheiten, den sogenannten Domänen, ausgestattet, die angefangen von der Aktivierung der Substrate über optionale Modifikationen bis hin zu deren Einbau in das jeweilige Produkt notwendig sind. Die Substrate werden erkannt und unter ATP Hydrolyse als Aminoacyladenylat aktiviert (Adenylierungsdomäne; A-Domäne) [47, 48]. Nachfolgend wird das aktivierte Aminoacyladenylat unter AMP Abspaltung als Thioester auf einen 4´-Phosphopanthetein-Kofaktor (Ppant) des zum Modul gehörenden Peptidyl-Carrier-Proteins (Thiolierungsdomäne; PCP oder T-Domäne) übertragen [49, 50]. Die eigentliche Produktsynthese findet also mit auf diesen PCPs gebundenen Substraten statt, so dass für den Einbau eines Bausteins in das Endprodukt genau ein PCP notwendig ist. Dieses „Multiple-Carrier-Thiotemplat“-Modell [10, 51], was direkt nach der Entdeckung der PCPs postuliert wurde, ist heute allgemein anerkannt. Für die katalysierte Peptidbindungsbildung schließlich ist die Kondensationsdomäne (C-Domäne) verantwortlich [52]. Ein solches aus drei Domänen bestehendes Modul (C-A-PCP), welches die Aktivierung, die Bindung an das Enzymtemplat sowie die Kondensation mit einem elektrophilen Donor-(aminoacyl- oder peptidyl-)-S-Ppant Substrat katalysiert, bezeichnet man als minimales Elongationsmodul. Bei einem Initiationsmodul (A-PCP), welches dazu in der Lage ist, eine als Thioester gebundene Aminosäure auf ein Elongationsmodul zu übertragen und damit die Produktsynthese zu starten, fehlt in der Regel die N-terminale C-Domäne. Ein Terminationsmodul (C-A-PCP-Te) besitzt zusätzlich C-terminal von dem PCP eine Terminationsdomäne (z.B. eine Thioesterasedomäne), die die Produktabspaltung vom Enzymtemplat katalysiert. Die Abfolge der Module ist kolinear mit der Aminosäureabfolge in den jeweiligen Endprodukten, so dass in der Regel je eingebauter Aminosäure im Produkt ein Modul (die Größe beträgt ca. 1000 Aminosäuren für ein Minimalmodul) benötigt wird [1]. Die Kondensation schreitet stufenweise vom Initiationsmodul über eine variable Anzahl von Elongationsmodulen voran, wobei sich die um eine Aminosäure verlängerte Peptidylkette nach erfolgter Kondensation jeweils auf dem nächsten „downstream“ PCP befindet. Ist die Peptidkette schließlich auf dem PCP des Terminationsmoduls gebunden, so wird das nunmehr fertige Endprodukt, gegebenenfalls unter Zyklisierung, vom Enzym-Templat abgespalten. Diese Reaktionsabfolge ist für das Beispiel der Tyrocidin-Biosynthese [15] beispielhaft in Abbildung 2-3 dargestellt,
Abbildung 2-2 (vorherige Seite): Schematische Darstellung der für einige Peptidsynthetasen kodierenden Gene
(a) Gene der Bacitracin Synthetasen A-C aus Bacillus licheniformis ATCC 10716 [16], (b) Gene der Surfactin A Synthetasen A-C aus Bacillus subtilis ATCC 21332 [18], (c) Gene der Tyrocidin Synthetasen A-C aus Bacillus
brevis ATCC 8185 [15], (d) Gene der Mycosubtilin Synthetasen A-C aus Bacillus subtilis ATCC 6633 (Myc A
ist ein natürliches Hybrid, welches aus Teilen einer Fettsäuresynthase, einer Aminotransferase sowie NRPS-Bestandteilen besteht) [53], (e) Gen der Glycolipopetidsynthetase aus Mycobacterium smegmatis MC 2155 [54], (f) Gene der Syringomycin Synthetasen aus Pseudomonas syringae [55], (g) Gene der Microcystin Synthetasen A-E und G aus Microcystis aeroginosa (McyD ist eine Polyketidsynthase, McyE und McyG sind NRPS-PKS-Hybride. Interessanterweise sind die sechs Gene mcyA-E und G nicht Teil eines einzigen Operons) [30]. Abkürzungen: alloThr, allo-Threonin; Dab, Diaminobuttersäure; DhThr, Dehydrothreonin; HAsp, 3-Hydroxyaspartat; MdhA, N-Methyldehydroalanin; MeAsp, 3-Methylaspartat; KS, β-Ketoacylsynthase; AT, Acyltransferase; DH, β-HydroxyDehydratase; MT, Methyltransferase; KR, β-Ketoacylreduktase; ACP,
acyl-carrier-protein; AaT, Aminotransferase. Die Strukturen der zugehörigen Peptide von (a), (b), (c) und (g) sind in
Abb. 2-1 dargestellt.
die auch das „Multiple-Carrier-Thiotemplat“-Modell [10, 51] veranschaulicht. Interessanterweise findet man immer nur ein Endprodukt einer definierten Länge und keine verkürzten Produkte, die auf eine falsche interne Initiation der Produktsynthese durch ein Elongationsmodul schließen ließen. Es muss also einen Mechanismus geben, der diese interne Mis-Initiation effizient unterbindet. Wie in dieser Arbeit gezeigt werden konnte, ist das Vorhandensein einer N-terminalen C-Domäne maßgeblich an der Vermeidung dieser internen Mis-Initiation beteiligt [56].
Die gezeigte modulare Architektur von NRPS führt zu beachtlichen Enzymgrößen. Die Module können dabei alle auf einer Polypeptidkette angeordnet sein (z.B. Cyclosporin-Synthetase aus Tolypocladium niveum [25]) oder aber auf mehreren kleineren Polypeptidketten vorliegen (z.B. Tyrocidin-Synthetasen aus Bacillus brevis [15]), die sich dann selektiv erkennen müssen. Erstere Variante findet man häufig bei den fungalen Systemen, letztere bei den bakteriellen. Ob die selektive Erkennung zweier Synthetasen nur über die spezifische Protein-Protein-Erkennung funktioniert [52, 57] oder ob weitere Mechanismen, wie z.B. eine Substratspezifität der C-Domänen, daran beteiligt sind, ist noch nicht endgültig geklärt. Bei den ebenfalls multimodular aufgebauten Polyketidsynthasen wurde diese Funktion sogenannten Linkerbereichen von ca. 60 bis 70 Aminosäuren Länge zugeordnet [58]. Bei NRPS scheinen solche Bereiche, zumindest in dieser Länge, nicht zu existieren. Auffällig ist hierbei, dass am C-terminalen Ende bakterieller Synthetasen häufig Epimerisierungsdomänen zu finden sind. Es sind aber auch die Übergänge PCP → C [16], A
→ PCP [28] und der ungewöhnliche Übergang C → A [23] bekannt (vergleiche Abbildung 2-2).
Abbildung 2-3: Nichtribosomale Peptidsynthese schematisch dargestellt am Beispiel der Tyrocidin Synthetasen
Für jede eingebaute Aminosäure ist ein Modul mit allen benötigten katalytischen Einheiten, den Domänen, vorhanden. Die Produktsynthese erfolgt auf dem Enzymtemplat („Multiple-Carrier-Thiotemplat“-Modell). Die Reaktionsreihenfolge ist dabei durch die Modulanordnung festgelegt, das heißt, ein Elongationsmodul kann nur ein peptidyl-Substrat an das nachfolgende Modul weitergeben, nicht jedoch ein aminoacyl-Substrat, welches direkt nach der Aminoacylierung der PCPs durch die A-Domänen als Intermediat entsteht. Die Mechanismen, die für diese strikte Einhaltung der Reaktionsabfolge verantwortlich sind, konnten im Rahmen dieser Arbeit aufgeklärt werden, was zum fundamentalen Verständnis der nichtribosomalen Peptidsynthese beigetragen hat [56].
2.3 Die Funktionen der einzelnen Domänen
Sequenzvergleiche von Peptidsynthetasen führten zur Identifizierung putativer katalytischer Einheiten [59], die man als Domänen bezeichnete [60] (siehe Abbildung 2-4). Die Gesamtheit der Domänen, die zum Einbau genau einer Aminosäure in das Endprodukt verantwortlich sind, wird als Modul bezeichnet. Neben den essentiellen Domänen, die zur Substraterkennung und Aktivierung (Adenylierungs-(A)-domäne), Substratbindung (Peptidyl-Carrier-Protein (PCP) oder Thiolierungs-(T)-domäne) und Peptidbindungsbildung
(Kondensations-(C)-domäne) verantwortlich sind, gibt es verschiedene optionale Domänen zur Substratmodifikation, die maßgeblich zur strukturellen Vielfalt und zur Wirksamkeit der nichtribosomal synthetisierten Peptide beitragen. Bekannt sind N-Methylierungs-(M)-
Abbildung 2-4: Die wichtigsten Domänen von Peptidsynthetasemodulen
Das Schema zeigt die Größe, Position und Funktion der wichtigsten Domänen von Peptidsynthetasemodulen. In den einzelnen Domänen ist die Position der in ihnen hoch konservierten Core-Sequenzen (siehe Anhang C) dunkel hervorgehoben. Das kleinste Modul, welches alle katalytischen Aktivitäten zur Verlängerung einer Peptidkette um eine Aminosäure enthält, besteht aus je einer C, A- und PCP-Domäne (C-A-PCP) und wird als minimales Elongationsmodul bezeichnet.
domänen, Epimerisierungs-(E)-domänen, sowie Heterozyklisierungs-(Cy)-domänen, die man häufig anstelle von C-Domänen findet wenn Cystein, Threonin oder Serin eingebaut werden. Die gebildeten zyklischen thiazolin- bzw. oxazolin-Strukturen können optional durch Oxidationsdomänen zu den entsprechenden Thiazol- bzw. Oxazolringen oxidiert werden. Module und Domänen lassen sich meist eigenständig in aktiver Form expremieren [15, 49, 52]. Die Funktionen und katalytischen Aktivitäten der einzelnen Domänen sollen im folgenden genauer betrachtet werden.
2.3.1 Die Adenylierungsdomäne
Die ungefähr 550 Aminosäuren großen A-Domänen sind für die selektive Erkennung der Substrataminosäuren und deren reversible Aktivierung als Aminoacyladenylat zuständig. Für jedes eingebaute Substrat existiert in der Regel eine eigene A-Domäne. Die von ihnen
katalysierte Reaktion in der nichtribosomalen Peptidsynthese ist vergleichbar mit der der Aminoacyl-tRNA-Synthetasen in der ribosomalen Proteinbiosynthese. Wie die Aufklärung der Kristallstruktur der Phenylalanin aktivierenden Domäne „PheA“ zeigte, besitzen A-Domänen aber eine andere Faltung [61], die Strukturhomologien zu Acyl-CoA-Synthetasen und Luziferasen [59, 62], nicht aber zu Aminoacyl-tRNA-Synthetasen aufweist. Die Kristallstruktur zeigt dabei eine große N-terminale und eine kleinere C-terminale Untereinheit und erlaubte auch die Identifizierung einer Substratbindungstasche aus zehn Aminosäuren, was schließlich zur Entdeckung des „nichtribosomalen Codes“ führte [63]. Die Anordnung bestimmter Aminosäuren innerhalb dieser Bindungstasche bestimmt maßgeblich die Selektivität der A-Domäne, wobei aber auch Seitenspezifitäten beobachtet werden können, die zu Variationen im Endprodukt führen [15]. Solche Seitenspezifitäten wurden bei Aminoacyl-tRNA-Synthetasen nicht beobachtet.
Abbildung 2-5: Reversible Aktivierung der Substrataminosäuren
Die hier dargestellte und von den A-Domänen katalysierte Reaktion ist reversibel. Die Substrataminosäure wird unter Hydrolyse von Mg2+-ATP in ein energiereiches Aminoacyladenylat überführt.
Die reversible Aktivierung der gebundenen Substrataminosäuren erfolgt durch die Bildung eines Aminoacyladenylates unter ATP-Hydrolyse und Freisetzung von anorganischem Pyrophosphat (siehe Abbildung 2-5) [64, 65]. In einem zweiten Schritt wird die aktivierte Substrataminosäure unter Ausbildung einer Thioesterbindung auf den 4´-Phosphopantetheinrest (Ppant) eines PCP´s übertragen, wobei AMP abgespalten wird. Man bezeichnet dies als Zweistufenmechanismus [8, 48, 66] und kann Parallelen zu der ribosomalen Peptidbiosynthese ziehen, wo die Aminosäuren als Oxyester an tRNAs gebunden werden.
2.3.2 Das Peptidyl-Carrier-Protein (Thiolierungsdomäne) und die posttranslationale Modifikation
Die Peptidyl-Carrier-Proteine (PCPs, auch als Thiolierungs-(T)-Domänen beschrieben) besitzen eine Größe von ca. 80 Aminosäuren und sind normalerweise immer direkt C-terminal
der A-Domänen lokalisiert. Sie dienen als Bindungsstellen für die Aminosäuren bzw. die Peptidylzwischenprodukte (siehe Abbildung 2-6) [49]. Hierbei werden die Substrate aber nicht direkt an einen Aminosäurerest des PCP´s, sondern als Thioester an das 3´-Cysteamin-Ende eines 4´-Phosphopantetheins [51], welches seinerseits wiederum als Ester an das invariante Serin im CoreT (GG(HD)S(LI); vergleiche Anhang C) der PCPs gekoppelt ist, gebunden. Somit weisen PCPs mechanistische Homologien zu den ACPs aus der Fettsäure- [67] und Polyketidsynthese [68] auf. Eine Strukturaufklärung des PCP´s von TycC3 mittels der NMR-Technik zeigte kürzlich auch strukturelle Ähnlichkeiten zwischen ACPs und PCPs [50].
Abbildung 2-6: Das Peptidyl-Carrier-Protein (PCP)
Das PCP bindet ein von einer A-Domäne synthetisiertes Aminoacyladenylat als Thioester an das 3´-Cysteaminende eines Ppant-Kofaktors, der seinerseits als Ester an die Seitenkette eines invarianten Serins im CoreT des PCP´s gebunden ist. Hierbei wird AMP freigesetzt. PCPs wechselwirken auch mit allen anderen Domänen.
Auch Biotinyl- und Lipoylabhängige Enzyme weisen solche kurzen, etwa 80 Aminosäuren große carrier-Domänen auf, die allerdings nicht homolog zu den PCPs sind [69, 70].
Die essentielle Modifikation des invarianten Serins im CoreT mit dem Kofaktor Phosphopantethein (Ppant) wird von einer speziellen Klasse von Enzymen katalysiert, den 4´-Phosphopantetheintransferasen (Ppant-Transferasen) [71-73]. Die Kristallstruktur einer solchen mit dem Surfactin Biosyntheseoperon assoziierten Ppant-Transferase (Sfp) [18], zeigt eine pseudo-dimere Struktur [74]. Die Ppant-Transferasen katalysieren den nukleophilen Angriff des Serin-Hydroxyl-O-Atoms auf die β-3´-Phosphatgruppe von CoASH. Als Substrate dienen demnach apo-PCPs und CoASH. Bei der Reaktion wird 3´,5´-ADP freigesetzt (siehe Abbildung 2-7). Die Gene der Ppant-Transferasen des Sekundärmetabolismus sind oftmals mit NRPS Biosyntheseoperons assoziiert [18]. Interessanterweise werden PCPs nicht von Ppant-Transferasen des primären Metabolismus, wie z.B. von ACPS, welches die posttranslationale Modifikation der apo-ACPs von
Fettsäuresynthasen mit Ppant katalysiert, modifiziert. Sfp hingegen kann sowohl PCPs als auch ACPs modifizieren [75-77].
Abbildung 2-7: Die enzymatische Funktion der 4´-Ppant-Transferasen
Coenzym A bindende 4´-Phosphopantetheintransferasen (Ppant-Transferasen) katalysieren den Transfer von Ppant auf den invarianten Serinrest von PCPs oder ACPs.
2.3.3 Die Kondensationsdomäne
Neben den A-Domänen und den PCPs stellen die Kondensations-(C)-Domänen den dritten für eine Elongationsreaktion essentiellen Domänentyp dar. Die ca. 450 Aminosäuren großen C-Domänen katalysieren den nukleophilen Angriff der freien Aminogruppe des aminoacyl-S-Ppant-Akzeptors auf das elektrophile Carboxy-C-Atom des aminoacyl- oder peptidyl-S-Ppant Donors (siehe Abbildung 2-8) [52]. Die Peptidkette befindet sich nach der Elongationsreaktion als Thioester gebunden auf dem „downstream“ PCP und wird auf diese Weise unter Verlängerung um je einen Baustein von einem PCP zum nächsten weitergereicht (vergleiche Abbildung 2-3), bis das fertige Endprodukt schließlich auf einem Modul mit einer terminalen Terminationsdomäne angelangt ist, wo es abgespalten wird. Obwohl C-Domänen keine größeren Sequenzhomologien zu anderen bekannten Enzymen zeigen, so findet sich das hochkonservierte Sequenzmotiv CoreC3 ([HHxxxDGxS]; vergleiche Anhang C) auch in den Chloramphenicol-Acetyltransferasen [78], den Dihydrolipoyl-Transacetylasen [79], sowie interessanterweise in E-Domänen von NRPS (vergleiche auch Abbildung 2-14) [80]. Die beiden erstgenannten sind Enzymklassen, die wie die C-Domäne den Transfer von Thioester-aktivierten Acylgruppen katalysieren. Obwohl der genaue Katalyse-Mechansimus der C-Domänen noch nicht geklärt ist, so widerlegen neuere Mutationsexperimente aber die
diskutierte Existenz einer katalytischen Triade ähnlich den Serinproteasen (His-Asp-Ser) [80] und lassen einen Mechanismus wahrscheinlich erscheinen, der diesen beiden Enzymklassen
Abbildung 2-8: Die katalytische Funktion der C-Domäne
Die C-Domäne katalysiert die Peptidbindungsbildung (Kondensation) zweier als Thioester auf benachbarten PCPs gebundener Intermediate. Die Peptidkette befindet sich nach der Elongation auf dem downstream PCP (PCPn+1).
ähnelt [81]. Dabei kommt dem zweiten Histidin des CoreC3 eine essentielle Rolle bei der Katalyse zu. Wahrscheinlich erhöht es den nukleophilen Charakter der freien Aminogruppe des Akzeptor-S-Ppant Substrates. Die Funktion der C-Domäne konnte seinerzeit in vitro mit einem Modellsystem eindeutig belegt werden [52], welches aufgrund seiner Bedeutung für diese Arbeit hier kurz vorgestellt werden soll. Die Initiationssynthetase der Gramicidin S Biosynthese GrsA (A-PCP-E) aktiviert, bindet und epimerisiert Phenylalanin. Das erste Modul der Tyrocidin Synthetase TycB (C-A-PCP) aktiviert und bindet Prolin. Durch die oben beschriebene Kondensationsreaktion wird dann D-Phe auf TycB1-CAT übertragen, wodurch D-Phe-L-Pro-S-Ppant entsteht. Die freie Aminogruppe des D-Phe greift die Carbonylgruppe des Thioesters daraufhin intramolekular nukleophil an, wodurch zyklisches D-Phe-L-Pro-Diketopiperazin (DKP) unkatalysiert abgespalten wird und die Enzyme für einen weiteren Katalysezyklus zur Verfügung gestellt werden. Der gesamte Zyklus ist schematisch in Abbildung 2-9 dargestellt.
Lange Zeit war unklar, ob C-Domänen eine Substratspezifität besitzen. Durch Versuche mit biochemisch fehl-aminoacyliertem GrsA konnte in obigem Modellsystem gezeigt werden, dass die C-Domäne von TycB1-CAT eine Enantioselektivität für das elektrophile Donor-aminoacyl-S-Ppant Substrat besitzt, während die Bindestelle für das nukleophile Akzeptor-aminoacyl-S-Ppant Substrat eine hohe Substratselektivität aufweist. Wie in dieser Arbeit gezeigt werden konnte, verhindert die Substratselektivität der Akzeptorbindestelle eine interne
Mis-Initiation und steuert den Zeitpunkt der Epimerisierung im Falle einer peptidyl-E-Domäne [56].
Abbildung 2-9: DKP-Bildung durch die Enzyme GrsA/TycA und TycB1-CAT
GrsA/TycA erkennt, aktiviert und epimerisiert L-Phe, TycB1-CAT erkennt und aktiviert L-Pro. Nach erfolgter
Kondensationsreaktion greift die Aminogruppe des Phenylalanins die Carbonylgruppe des Thioesters nukleophil an, so dass unter Zyklisierung D-Phe-L-Pro-Diketopiperazin (DKP) in einer nicht-katalysierten Reaktion vom Enzymtemplat abgespalten wird und die Enzyme für einen neuen Katalysezyklus regeneriert werden.
2.3.4 Die Heterozyklisierungsdomäne
In einigen Fällen kann die C-Domäne durch eine Heterozyklisierungs-(Cy)-domäne substituiert sein. Cy-Domänen unterscheiden sich in ihrer Primärstruktur deutlich von C-Domänen, so ist das Coremotivs C3 ([HHxxxDGxS]; vergleiche Anhang C), welches das für die katalytische Aktivität von C-Domänen essentielle Histidin enthält, durch C3´ ([(DNR)xxxxDxxS]; vergleiche Anhang C) substituiert. Ist das Akzeptorsubstrat ein Cystein,
Serin oder Threonin, so wird bei Vorhandensein einer Cy-Domäne ein Thiazolin bzw. ein Oxazolin gebildet [16, 27, 42, 82]. Die Reaktion ist schematisch in Abbildung 2-10 dargestellt, wobei der Mechanismus noch ungeklärt ist. Insbesondere ist nicht bekannt, ob eine Peptidbindungsbildung (wie bei den C-Domänen) oder aber eine (Thio-)Esterbildung der Heterozyklisierung vorausgeht [83].
Abbildung 2-10: Die katalytische Funktion der Cy-Domäne
Die Cy-Domäne katalysiert die Bildung von Ringstrukturen des Oxazolin- oder Thiazolintyps mit den Aminosäuren Serin, Threonin oder Cystein. Der Mechanismus ist, ebenso wie bei der C-Domäne, noch ungeklärt. Insbesondere ist noch nicht geklärt, ob analog zur C-Domäne zunächst die Peptidbindung geknüpft wird oder aber ob die Bildung eines (Thio-)Esters der Bildung der Peptidbindung vorausgeht.
Bei ribosomal synthetisierten Peptiden ist eine solche Heterozyklenbildung während der Synthese nicht möglich. Dennoch sind auch einige Peptide ribosomalen Ursprungs bekannt, wie z.B. das Microcin aus E. coli, die heterozyklische Strukturen besitzen. Diese werden posttranslational mittels ATP-abhängiger Enzyme erzeugt [84]. Der Vergleich der Primärstrukturen dieser Enzyme mit denen der Cy-Domänen zeigt aber keine Homologien.
2.3.5 Terminationsdomänen
Es sind verschiedene Terminationsdomänen bekannt. In bakteriellen Operons findet man meist Thioesterasedomänen (Te-Domänen) die mit dem C-Terminus des letzten Moduls von NRPS verbunden sind [85]. Ihre Länge beträgt ca. 250 Aminosäuren und sie katalysieren die Abspaltung des Endproduktes vom NRPS Templat (siehe Abbildung 2-11). Dies kann unter Hydrolyse (lineare Produkte) oder intramolekularer Zyklisierung (Lacton- bzw. Lactambildung) geschehen. Es ist auch eine Multimerisierung auf Te-Domänen bekannt [86, 87]. Inzwischen konnte wiederholt gezeigt werden, dass die künstliche Fusion von Te-Domänen an Module zur Abspaltung verkürzter Produkte führt [88-91]. Ebenso wurde beobachtet, das die Te-Domäne des Tyrocidin-Operons [15] in vitro die Zyklisierung von sogenannten SNAC-Peptidderivaten, die das 3´-Endes eines aminoacylierten Ppant-Kofaktors
imitieren und frei diffundierbar sind, katalysiert und dabei eine breite Substrattoleranz besitzt [92-94]. Kürzlich konnte die Struktur der Surfactin Te-Domäne aufgeklärt werden [95]. Das katalytische Zentrum bildet eine katalytische Triade ähnlich der der Serinproteasen.
Neben den beschriebenen Te-Domänen findet man auch separate Thioesterasedomänen (TeIIs; Größe ca. 220 Aminosäuren), die für die nichtribosomale Peptidsynthese zwar nicht essentiell sind, deren Deletion aber in vivo zu drastisch verringerten Produktausbeuten führte [85]. Eine mögliche Rolle als „Cleaning-Enzyme“ wird diskutiert [96].
Eine weitere Alternative der Produktfreisetzung wird von den Reduktase-(Red)-domänen katalysiert. Unter NADPH Verbrauch werden Peptide mit C-terminaler Aldehyd- oder Alkoholgruppe freigesetzt [97]. So resultiert die reduktive Abspaltung eines Peptides mit Alanin am C-terminalen Ende in einem Produkt, dessen C-Terminus ein Ethanolamin bildet [54]. Red-Domänen finden sich auch in Enzymen der Lysin-Biosynthese in Hefen [98].
Abbildung 2-11: Die katalytische Funktion der Te-Domäne
Die Te-Domäne katalysiert die Abspaltung der enzymgebundenen Peptide. Dabei können lineare (I), zyklische (II) oder verzweigt zyklische (III) Produkte entstehen. Auch eine Multimerisierung auf einer Te-Domäne (IV) wurde nachgewiesen [86]. X = N, O
In fungalen NRPS Operons fehlen diese Typen von Terminationsdomänen [21, 29]. Hingegen findet man am C-Terminus pilzlicher NRPS meist eine zusätzliche C-Domäne, die offenbar die Aminogruppe der Starteraminosäure als Nukleophil verwendet [99].
2.3.6 Optionale Modifikationsdomänen
Durch modifizierende Domänen wird die strukturelle Vielfalt, die den großen Unterschied zu ribosomal synthetisierten Peptiden ausmacht, und damit verbunden auch die Bioaktivität der nichtribosomal synthetisierten Peptide ganz erheblich erweitert. Neben der Epimerisierung, N-Methylierung oder N-Formylierung von Aminosäuren sind die Heterozyklenbildung, die
Oxidation solcher Heterozyklen und die Ausbildung von Amid- und Esterbindungen bekannt. Aufgrund ihrer Bedeutung für diese Arbeit werden insbesondere die Epimerisierungsdomänen eingehend behandelt, wobei mechanistische Aspekte, sowie ihre Klassifizierung, weiter unten erläutert werden.
2.3.6.1 Die Epimerisierungsdomäne
Die für die Cα–Epimerisierung der Substrataminosäuren verantwortlichen Epimerisierungsdomänen besitzen eine ungefähre Größe von 450 Aminosäuren. Sie sind innerhalb eines Moduls stets C-terminal des zugehörigen PCP´s zu finden [1]. Bezüglich ihrer Lokalisation lassen sie sich in C-terminale sowie in interne E-Domänen unterteilen. Erstere bilden den C-Terminus einer Synthetase, was man sehr häufig in bakteriellen Operons beobachten kann, letztere sind sowohl N- als auch C-terminal kovalent mit weiteren Domänen verknüpft. Es gibt Hinweise, dass C-terminale E-Domänen maßgeblich an der spezifischen gegenseitigen Erkennung zweier Synthetasen beteiligt sind [52, 57]. Hinsichtlich ihrer Funktion lassen sich ebenfalls zwei Typen von E-Domänen unterscheiden. Man findet aminoacyl-E-Domänen, welche in Initiationsmodulen zu finden sind und die Epimerisierung eines aminoacyl-S-Ppant Substrates katalysieren [100], sowie peptidyl-E-Domänen, welche in Elongationsmodulen lokalisiert sind. Letztere katalysieren die Cα–Epimerisierung offenbar erst auf peptidyl-S-Ppant Ebene, nachdem die Peptidbindungsbildung mit dem „upstream“ Substrat stattgefunden hat [101, 102]. Zum Beginn dieser Arbeit war unklar, ob es mechanistische Unterschiede zwischen aminoacyl- und peptidyl-E-Domänen gibt und worauf die unterschiedlichen Zeitpunkte der Epimerisierungsreaktion zurückzuführen sind.
Es konnte gezeigt werden, dass die Epimerisierungsreaktion eine Gleichgewichtsreaktion zwischen der D- und der L-Aminosäure ist. Die Reaktion findet sowohl von L–nach-D als auch von D-nach–L statt [57]. Kürzlich wurde durch "Rapid-Quench"-Kinetik-Untersuchungen gefunden, dass dieses Gleichgewicht sehr schnell (im Falle von GrsA in weniger als zwei Sekunden) erreicht wird [103]. In den Endprodukten findet man aber aufgrund der Enantioselektivität der nachfolgenden Kondensationsdomänen nur die D-konfigurierten Substrate.
Über die Spezifität von E-Domänen war zu Beginn dieser Arbeit noch nichts bekannt. Fehlaminoacylierungsuntersuchungen von GrsA mit aminoacyl-CoA-Derivaten lieferten dann erste Hinweise, dass E-Domänen eine gewisse Substrattoleranz besitzen könnten. So epimerisierte die E-Domäne von GrsA, deren natürliches Substrat Phe-S-Ppant ist, auch
L-Ala-S-Ppant [104]. Weitere Untersuchungen zur Substratspezifität von E-Domänen sind in dieser Arbeit beschrieben und sollen hier nicht vorweggenommen werden.
2.3.6.2 Die N-Methylierungsdomäne
Die N-Methylierung spielt vor allem in fungalen NRPS eine Rolle. Bisher sind nur wenige Beispiele bakterieller M-Domänen bekannt (z.B. Pristinamycin I) [105]. Die Besonderheit bei der Lokalisation der ca. 420 Aminosäuren großen M-Domänen [106, 107] besteht in ihrem Einschub in die A-Domäne zwischen die Coremotive A8 und A9, was dem flexiblen Bereich zwischen der großen und der kleinen Untereinheit entspricht. Es gibt Hinweise, dass die N-Methylierung auf Aminoacylstufe stattfindet [108, 109] und der Kofaktor S-Adenosylmethionin (SAM) als Methyldonor fungiert.
2.3.6.3 Weitere Modifikationsdomänen- Oxidations- und N-Formylierungsdomänen
In letzter Zeit wurden unter anderem in den Biosyntheseclustern von Epothilon [27, 110] und Myxothiazol [111] Oxidations-(Ox)-domänen entdeckt, die in Kombination mit Cy-domänen die Oxidation der gebildeten Thiazolinstrukturen zu den entsprechenden Thiazolen (vergleiche Abbildung 2-12) zu katalysieren scheinen und wahrscheinlich Flavin-abhängig sind. Es sind zwei Typen von
Abbildung 2-12: Bildung von Thiazol- und Thiazolidin-Strukturen
Die Heterozyklisierungsreaktion, die durch die Cy-Domäne katalysiert wird, führt zur Bildung von Heterozyklen des Thiazolintyps. Die Oxidation scheint von einer Flavin-abhängigen Oxidase, die als optionale Domäne innerhalb von A-Domänen zu finden ist, vollzogen zu werden. Die Reduktion zum Thiazolidin dagegen ist Aufgabe einer externen NADPH-abhängigen Reduktase.
Ox-Domänen bekannt. Sie können, wie die N-Methylierungsdomänen auch, in die A-Domäne insertiert sein (zwischen CoreA8 und CoreA9) oder aber sich C-terminal des PCP´s befinden. Die optionale Reduktion von Thiazolinen zu Thiazolidinen erfolgt dagegen durch externe NADPH-abhängige Enzyme [112].
Kürzlich wurde eine N-Formyltransferasedomäne beschrieben, die eine N-Formylierung der Substrataminosäure durchführt [113]. Als Kofaktor wird N5-formyl-Tetrahydrofolat vermutet. Dieser Domänentyp scheint selten zu sein und wird auch im Biosynthesecluster für lineares Gramicidin A vermutet [114], der aber bisher noch nicht charakterisiert wurde.
2.4 Die Biosynthese von D-Aminosäuren
Die Konfigurationsumkehr von Aminosäuren wird generell durch Racemasen oder Epimerasen katalysiert. Alle bekannten Aminosäureracemasen katalysieren die Konfigurationsumkehr dabei durch De- und anschließende Reprotonierung des Cα [115, 116]. Chemisch betrachtet ist es sehr schwierig das Proton am Cα einer Aminosäure zu abstrahieren, da es nicht azide ist (pKas bis zu 21) [117]. Eine Klasse von Racemasen, zu denen auch die Alanin-Racemasen gehören, die D-Alanin zur Zellwandbiosynthese von Bakterien bereitstellen, nutzt deshalb Pyridoxalphosphat (PLP) als Kofaktor [118, 119]. Dabei wird die Aminogruppe der Aminosäure als Schiffsche Base an PLP gebunden (aminoacyl-PLP-Aldimin), wodurch das entstehende Carbanion-Intermediat resonanzstabilisiert wird (vergleiche Abbildung 2-13). Es gibt aber auch PLP-unabhängige Racemasen, so zum Beispiel die Prolin- [120], die Diaminopimelat- [121, 122] die Aspartat- [122] und die Glutamat-Racemasen [123, 124]. Bei letzteren hat man zwei Cysteine identifiziert, die essentiell für die Aktivität sind. Ein Cystein liegt offenbar als Thiolat vor und deprotoniert das Cα der Aminosäure, während das Proton der SH-Gruppe des zweiten Cysteins anschließend zur Reprotonierung dient.
Abbildung 2-13: Mechanismus einer PLP-abhängigen Racemase
Die zu epimerisierende Aminosäure bildet mit Pyridoxalphosphat (PLP) ein Aldimin. Bei der Abstraktion des Cα-Protons der Aminosäure wird das gebildete Carbanion resonanzstabilisiert, so dass die Abstraktion wesentlich erleichtert wird.
Abbildung 2-14: Diskutierte alternative E-Domänen Mechanismen und der mechanistische Vergleich zu C-Domänen
(A) Für E-Domänen werden zwei alternative Mechanismen diskutiert. Beim „Ein-Basen“-Mechanismus wird die
De- und die anschließende Reprotonierung durch dieselbe Base ausgeführt. Eine Konfigurationsumkehr am Cα ist hierbei nur möglich, wenn auf der Stufe des Carbanions eine Rotation um die C-C-Bindungsachse erfolgt. Das stabilisierte Enolatanion-Intermediat hingegen ist planar und kann nicht rotieren. Beim „Zwei-Basen“-Mechanismus deprotoniert Base1 das C
α, während die Reprotonierung im planaren Übergangszustand durch die
konjugierte Säure einer anderen Base (Base2) von der gegenüberliegenden Seite erfolgt. (B) E-Domänen und C-Domänen besitzen beide das sogenannte „His-Motiv“ [HHxxxDGxS] (CoreE2 bzw. C3; vergleiche Anhang C). Es wird vermutet, dass das zweite Histidin dieses Motivs sowohl in die Deprotonierung des Cα (E-Domänen), als auch in die der Aminogruppe (C-Domäne) involviert ist.
Da keine Sequenzhomologien zu anderen Epimerasen/Racemasen bestehen, handelt es sich bei den E-Domänen aus NRPS-Systemen um eine eigenständige Klasse von Aminosäureepimerasen [1]. Es konnte kein Kofaktor wie bei den PLP-abhängigen Aminosäureracemasen nachgewiesen werden [125, 126]. Als Substrate der E-Domänen dienen nicht die freien Aminosäuren, sondern enzymgebundene aminoacyl- oder peptidyl-S-Ppant Substrate. Trotz kürzlich durchgeführter Mutationsanalyse der Epimerisierungsdomäne von GrsA (der Initiationssynthetase der Gramicidin S Biosynthese), wo alle hochkonservierten Reste mit potentieller katalytischer Funktion mutiert wurden, konnte der Mechanismus nicht eindeutig geklärt werden [57]. Nach wie vor werden der Zwei-Basen- und der Ein-Basen-Mechanismus (siehe Abbildung 2-14-A) diskutiert. Sicher scheint aber, dass der zweite Histidinrest im Sequenzmotiv CoreE2 ([HHxxxDGxS]; vergleiche Anhang C) eine essentielle katalytische Funktion bei der Deprotonierung des Cα besitzt (Anhang C) [80]. Es ist denkbar, dass er in E- und C-Domänen, die beide dieses Coremotiv besitzen, eine ähnliche katalytische Funktion ausübt. Bei der Epimerisierung muss das Cα deprotoniert werden, bei der Peptidbindungsbildung die Aminogruppe um ihre Nukleophilie zu erhöhen (vergleiche Abbildung 2-14-B). Die endgültige Klärung des Mechanismus der E-Domänen kann wohl nur mit Hilfe bisher noch nicht verfügbarer Strukturdaten erfolgen.
2.5 Die Inkorporation von D-Aminosäuren in nichtribosomal synthetisierte
Peptide
D-konfigurierte Aminosäuren spielen für die Bioaktivität der nichtribosomal synthetisierten Polypeptidstrukturen eine entscheidende Rolle [1]. Wahrscheinlich verlangsamen sie den proteolytischen Abbau, da die meisten Proteasen nur Peptidbindungen zwischen L-Aminosäuren effizient spalten können. Aber auch spezifische durch die Stereochemie hervorgerufene Effekte sind möglich.
In NRPS Systemen sind zwei Wege für die Inkorporation dieser seltenen Bausteine realisiert. Zum einen können die L-Aminosäuren durch in das entsprechende Modul integrierte E-Domänen epimerisiert werden [127]. Die von den E-E-Domänen katalysierte Epimerisierung ist eine Gleichgewichtsreaktion [57]. Dass trotzdem nur die D-konfigurierte Aminosäure in das Produkt eingebaut wird, wird von einer postulierten enantioselektiven Donorbindungsstelle in der nachfolgenden C-Domäne sichergestellt [104]. Zum anderen können die D-Aminosäuren selektiv durch enantioselektive A-Domänen aktiviert werden [25]. Hierbei werden die D-konfigurierten Aminosäuren dann durch externe Racemasen bereitgestellt [128, 129].
Auffällig ist, dass die Epimerisierung über E-Domänen anscheinend in bakteriellen Systemen bevorzugt wird [16, 130-132], während die zweite Variante bevorzugt in pilzlichen NRPS Systemen realisiert zu sein scheint [25]. Es gibt jedoch auch Ausnahmen. So finden sich zum Beispiel in dem bakteriellen System zur Syringomycin Synthese (Pseudomonas syringae) [55] A-Domänen, die selektiv D-Aminosäuren aktivieren, während in dem pilzlichen Biosyntheseoperon für Penicillin (ACV-Synthetase; Penicillium chrysogenum) [133] eine Epimerisierungsdomäne kodiert ist. Im fungalen Biosyntheseoperon für HC-Toxin (Chochliobolus carbonum) sind sogar beide Varianten verwirklicht [21, 129].
2.6 Aufgabenstellung
Im Vordergrund der Aufgabenstellung standen Untersuchungen zur Spezifität von Domänen aus NRPS-Systemen. Zum einen sollte der Frage nach der Substratspezifität von Domänen nachgegangen werden. Das heißt, es sollte untersucht werden, wie effizient E-Domänen nicht-kognate Substrate epimerisieren können. Hierzu sollten unter anderem Fusionsproteine hergestellt werden, in denen E-Domänen auf genetischer Ebene an andere Module bzw. A-Domänen unterschiedlicher Spezifität fusioniert sind. Damit sollten neben der Frage der E-Domänen-Selektivität zunächst die Fragen nach der Verwendbarkeit dieser Methode für E-Domänenfusionen sowie nach der geeignetsten Fusionsstelle beantwortet werden.
Zum anderen sollte untersucht werden, ob aminoacyl- und peptidyl-E-Domänen unterschiedliche Substratspezifitäten aufweisen oder ob der beobachtete funktionale Unterschied alleine durch ihre Einbettung in eine andere Proteinumgebung (aminoacyl-E-Domänen sind stets in Initiations-, peptidyl-E-(aminoacyl-E-Domänen in Elongationsmodulen lokalisiert) beeinflusst wird. In diesem Zusammenhang sollte auch geklärt werden, wodurch sich ein Initiationsmodul von einem Elongationsmodul unterscheidet und welche Mechanismen eine interne Mis-Initiation verhindern. Hierzu musste zunächst ein geeignetes in vitro Modellsystem entwickelt werden.
3 Material
3.1 Chemikalien, Enzyme und Verbrauchsmaterial
Tabelle 3-1 Liste der benutzten Chemikalien, Enzyme und Kits: Bei nicht gesondert aufgeführten
Chemikalien wurden stets Standardprodukte namhafter Hersteller (insbesondere Merck sowie Sigma/Aldrich) in p.a.-Qualität verwendet
Hersteller (Vertriebsort) Produkt
Applied Biosystems(Weiterstadt) ABI Prism dRhodamine Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit V 2.0
Amersham/Buchler (Braunschweig) λ-DNA, Restriktionsendonucleasen,
DNA-modifizierende Enzyme, Ampicillin, IPTG, Kanamycin, Hefeextrakt, Coomassie Brilliant Blue G und R250, Agar Nr.1
Biomol (Ilvesheim) DTT und DTE
Biotrend (Köln) [14C]-D-Phenylalanin, Peptidstandards L-Phe-L-Asn (FN), L-Phe-D-Phe-L-Asn (FfN) und L-Phe-L-Phe-L-Asn (FFN) für HPLC
Boehringer Mannheim (Mannheim) Expand Long Template PCR System Difco (Detroit, USA) Hefeextrakt
DuPont/NEN (Bad Homburg) 32P-Pyrophosphat (16 Ci/mmol)
Eurogentech (Seraing, Belgien) Agarose, Elektrotransformations-Küvetten
Fluka (Neu Ulm) TEMED, SDS
Gibco BRL (Eggenstein) 10 kDa Proteinmolmarker
Hartmann-Analytik (Braunschweig) [14C]- und [3H]-markierte Aminosäuren Kodak (Rochester, USA) Röntgenfilme Biomaxx MR
Merck (Darmstadt) HPTLC-Fertigplatten CHIR (chiral, 10x10 cm) und Silica gel 60 DC-Alufolien (20x20 cm), versch. Feinchemikalien
MWG Biotech (Ebersberg) synthetische Oligonukleotide Oxoid (Wesel) Agar Nr.1, Trypton
Ni-NTA-Agarose, QIAexpress Vektor Kit ATG
Roth (Karlsruhe) Ethidiumbromid, β-Mercaptoethanol, Acrylamid-Lösung für SDS-PAGE, Szintillationsflüssigkeit Rotiszint Eco Plus
Schleicher & Schüll (Dassel) Sterilfilter (Porengröße 0,45µm und 0,2µm), Whatman 3MM Papier
Serva (Heidelberg) Bromphenolblau, Xylencyanol, Visking- Dialyseschläuche
Sigma (Deisenhofen) Desoxinukleotide (dATP, dTTP, dGTP, dCTP) versch Standardchemikalien
3.2 Geräte
Tabelle 3-2 Geräte, Hersteller und Typenbezeichnung: Bei nichtaufgeführten Geräten handelt es sich stets um
Standardmodelle üblicher Laborgerätehersteller
Gerät Hersteller mit Typenbezeichnung
DNA-Sequenzer PE Applied Biosystems ABI Prism 310 Genetic Analyzer
Elektroporations-Pulser Bio-Rad Gene Pulser und Pulse-Controler
FPLC-System Amersham/Pharmacia Äkta „Prime“
French Press Sim Aminco French-Presssure Cell-Version 5.1
20k Rapid-fill cell (40 mL) Heizschüttler Eppendorf
HPLC-MS-System Agilent/Hewlett Packard Series 1100 MSD HPLC-System
mit DAD-Detektor, Vakuumentgaser, quaternärer Pumpe, Autosampler und HP-Chemstation Software
HPLC-Trennsäulen Macherey & Nagel „Nucleosil C18“ Merck „Chiradex Gamma“
Luftschüttler New Brunswick Scientific Series 25 Incubator Shaker
Mikrotiterplattenlesegerät Dynatech MR 7000
Photometer Pharmacia Biotech Ultraspec 3000
Radioaktivitätsscanner Raytest RITA
Reinstwasseranlage Seral Seralpur Pro90CN
Speed-Vac Savant Speed Vac Concentrator Uniequip Univapo 150 H
Szintillationszähler Packard 1900CA Tri-CARB Liquid Szintillation Analyzer
Thermo-Cycler PE Applied Biosystems Gene Amp PCR System 2400 Perkin Elmer Gene Amp PCR System 9600
Zentrifugen Heraeus Mikrofuge pico, Minifuge RF Sorvall RC26 plus
3.3 Vektoren
3.3.1 pQE60 und pQE70
Die beiden zum Expressionssystem „QIAexpressionist“ (Qiagen) gehörenden Vektoren pQE60 und pQE70 (jeweils 3431 bp) unterscheiden sich lediglich in ihrer MCS. Sie gehören zu der Familie der pDS-Plasmide [134] und basieren auf dem Plasmid pDS56/RBSII. Sie wurden als Standardvektoren für das Klonieren und Expremieren aller verwendeter Peptidsynthetasemodule und ihrer Fragmente verwendet.
Sie besitzen den T5-Promotor PN25 [135], zwei Erkennungssequenzen für den lac-Repressor, sowie eine synthetische ribosomale Bindungsstelle, die auf hohe Expressionsraten in E. coli optimiert ist. Eine in frame Ligation in die MCS führt zu einer C-terminalen Fusion der rekombinanten Proteine mit sechs Histidinen (His6-tag). Die MCS des pQE60 enthält NcoI,
BamHI und BglII, die des pQE70 SphI, BamHI und BglII. Die in den Erkennungssequenzen
von NcoI und SphI enthaltenen ATGs dienen jeweils als Startcodon. Durch die Expression des β-Lactamasegens bla verleiht das Plasmid den Bakterien eine Resistenz gegenüber Ampicillin. Die Replikation in E. coli erfolgt über den ColE1 Replikationsursprung aus pBR322 [136]. Da die Expression der gewünschten Gene mit Hilfe der lac-Operatoren reprimierbar ist, wurde diese stets in Gegenwart des Plasmides pREP4 durchgeführt, welches den lac-Repressor kodiert. Die Expression wurde dann mit IPTG induziert, welches eine Konformationsänderung des Repressors bewirkt, was zu einer Dissoziation des lac-Repressors vom lac-Operator führt.
3.3.2 pREP4
Das Plasmid pREP4 (3740 bp) ist mit seinem Replikationsursprung P15A [137] kompatibel zu ColE1 Plasmiden und kann so in Kombination mit den pQE-Vektoren stabil repliziert werden. Es dient zur Expression des durch das lacI-Gen [138] kodierten lac-Repressors. Durch das neo-Gen vermittelt es eine Resistenz gegenüber Kanamycin. Aufgrund einer Mutation in der zugehörigen RBS sollten jedoch nur Kanamycin-Konzentrationen von 25 µg/mL zur Selektion eingesetzt werden. Dieses Plasmid wurde stets bei der Expression von in pQE-Vektoren klonierten Genen verwendet um eine gezielte Induktion der Expression sicherzustellen.
3.4 Mikroorganismen
3.4.1 E. coli XL1-Blue
E. coli XL1-Blue ist ein Standard-Laborstamm der zur Klonierung von Genen routinemäßig
eingesetzt wird. Der Genotyp sei hier kurz beschrieben [139]: recA1, endA1, gyrA96, thi-1,
hsdR17, supE44, relA1, lac, {F'proAB+, lacIq, lacZ∆M15, Tn10(Tetr)} 3.4.2 E. coli M15
Dieser Stamm ist einer der für das Expressionssystem „QIAexpressionist“ (Qiagen) empfohlenen Expressionsstämme. Sein Genotyp sieht wie folgt aus: nals, strs, rifs, lac, ara,
gal, mtl, F- [140].
3.4.3 E. coli SG13009
Dieser Stamm wird ebenfalls für das Expressionssystem „QIAexpressionist“ (Qiagen) empfohlen und wurde alternativ zu E. coli M15 verwendet.
3.5 Medien
Zur Anzucht der E. coli Stämme diente LB-Medium.
LB-Medium 16 g/L Bactotrypton
10 g/L Hefeextrakt
5 g/L NaCl
Zur Expression wurde ausschließlich 2xYT-Vollmedium [141] verwendet, welches zur Steigerung der Löslichkeit der NRPS-Proteine bei Expressionsansätzen 10 mM Mg2+-Ionen enthielt. Zur Vorbeugung von Phageninfektionen wurde nach dem Autoklavieren Natriumcitrat (Endkonzentration 20mM) zugegeben.
2xYT-„Expressionsmedium“ 16 g/L Bactotrypton
10 g/L Hefeextrakt
5 g/L NaCl
10 mM MgCl2
20 mM Natriumcitrat
Zum Herstellen von Kulturplatten wurde dem Medium vor dem Autoklavieren 1,5% (w/v) Agar Nr.1 zugesetzt. Zur Sterilisation wurden alle Lösungen und Medien vor dem Gebrauch
20 min bei 121°C und 1,5 bar autoklaviert. Die hitzeempfindlichen Antibiotika wurden den Medien bei Bedarf als sterilfiltrierte Lösungen bei einer Temperatur von <60°C in folgenden Endkonzentrationen zugesetzt:
100 µg/mL Ampicillin
4 Methoden
In dem Methodenteil sind nur die Techniken beschrieben, die sich grundlegend von den in Standardwerken [142] beschriebenen Methoden der molekularen Genetik und Biochemie unterscheiden. Die Präparation von Plasmid-DNA aus E. coli wurde nach dem Verfahren der alkalischen Lyse nach Birnboim & Doly [143] durchgeführt. Die Reinigung von DNA erfolgte mittels Qiagen-Kits, denen das von Vogelstein entwickelte Prinzip der Anionenaustauscherchromatographie zugrunde liegt [144]. Bei der Verwendung von Kits wurden, sofern nicht gesondert angegeben, die Protokolle des Herstellers befolgt.
Techniken der Protein-Biochemie wurden durchgeführt wie beschrieben für die SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese in [145], für die anschließende Coomassie-Färbung in [146] und für die Bestimmung der Proteinkonzentration in [147].
4.1 Molekularbiologische Methoden – DNA Techniken
4.1.1 PCR-Amplifikation von DNA-Fragmenten
Die Polymerase Kettenreaktion (PCR) [148, 149] wurde zur Amplifikation aller benötigten DNA-Fragmente benutzt. Dazu wurde der ExpandTM Long Template PCR Kit (Böhringer
Mannheim), der eine Taq- und eine Pwo-DNA-Polymerase enthält, nach dem Protokoll des
Herstellers angewandt. Die Länge der Zyklen wurde an die Größe der jeweiligen Fragmente angepaßt, die Hybridisierungstemperaturen nach Art der verwendeten Primer variiert. In der Regel wurden die Primer so ausgewählt, dass die Annealing-Temperaturen im Bereich von 50°C-60°C lagen. An den Enden der zur Klonierung bestimmten Fragmente wurden durch die Wahl geeigneter Oligonukleotidsequenzen für die PCR die Erkennungsschnittsequenzen der gewünschten Restriktionsendonukleasen eingeführt. Ein typischer Reaktionsansatz sah wie folgt aus:
PCR-Ansatz DNA-Templat 0,05-0,5 ng
Oligonukleotide jeweils 50 pmol
dNTP´s (Stammlösung je 2mM) 2,5 µL
10x PCR-Puffer III 2,5 µL
Polymerase-Mix 0,25 µL
4.1.2 Gezielte Punktmutagenese
Die in dieser Arbeit beschriebenen gezielten Punktmutationen wurden alle mit dem QuickChange Site Directed Mutagenesis Kit (Stratagene) durch PCR in die entsprechenden auf Plasmiden kodierten Gene eingeführt. Das Primerdesign erfolgte nach den Angaben des Herstellers. Die PCR, die Aufarbeitung sowie die anschließende Transformation wurden ebenfalls durchgeführt wie vom Hersteller beschrieben.
4.1.3 DNA-Sequenzanalyse
Die verwendete Methode zur DNA Sequenzierung funktionierte nach dem Kettenabbruchverfahren von Sanger. Dabei wurde eine PCR-Reaktion mit nur einem Primer durchgeführt. Dem Reaktionsmix waren dabei bestimmte Mengen von mit basenspezifischen Fluoreszenzfarbstoffen modifizierten ddNTPs beigemischt, die zu Kettenabbrüchen führten. Man erhielt auf diese Weise Ketten unterschiedlicher Länge. Diese DNA Fragmente wurden mit einem ABI Prism 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems) durch Kapillarelektrophorese der Größe nach aufgetrennt und anhand der Fluoreszenzfarbstoffe identifiziert. Die Fluoreszenzfarbstoffe emmitierten nach der Anregung mit einem Laser Licht einer spezifischen Wellenlänge, welche detektiert wurde.
Für die PCR-Reaktion wurde der ABI Prism dRhodamine Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit v2.0 (Applied Biosystems) nach Herstellerangaben verwendet. Hierzu wurden pro 1000bp DNA-Templat 100 ng Plasmid-DNA als Templat eingesetzt und insgesamt 5 pmol Primer und 3 µL Reaktionsmix zugegeben. Der Reaktionsmix enthielt bereits eine Mischung aus dNTPs, ddNTPs, Puffer sowie eine AmpliTaq-DNA-Polymerase FS. In einem PCR-Reaktionsgefäß wurden die Komponenten gemischt und mit ddH2O auf 10 µL Endvolumen aufgefüllt. Die PCR-Bedingungen waren wie folgt:
1 Zyklus 96°C 5 min
25 Zyklen 96°C 10 s
50-55°C 5 s
60°C 4 min
Nach Beendigung der Reaktion wurden 10 µL Wasser zu den Reaktionen zugegeben und diese dann in zuvor vorbereitete 1,5 mL Reaktionsgefäße (2,5 µL 3M NaOAc (pH 5,2) und 50 µL 98% Ethanol) überführt. Nach dem Mischen wurde 30 min zentrifugiert (13000 U/min bei 4°C), der Überstand vorsichtig abgenommen und das Pellet mit 250 µL 70%igem EtOH
gewaschen. Nach dem Trocknen des Pellets bei 37°C wurde in 40 µL HPLC-Wasser resuspendiert, 2 min bei 95°C denaturiert und die fertige Lösung dann blasenfrei in ein Probengefäß überführt.
4.2 Genexpression und Protein-Techniken
4.2.1 Genexpression
Für die heterologe Expression der klonierten Peptidsynthetasegene in E. coli wurde das Expressionssystem „QIAexpressionist“ (Qiagen) eingesetzt. Dazu wurden die E. coli-Stämme M15 oder SG13009 mit pQE-Vektoren, in die das gewünschte Peptidsynthetasegen insertiert worden war, transformiert. Diese Stämme enthielten bereits das Plasmid pREP4.
Für die Expression wurden zwei Methoden angewandt. In beiden Fällen wurden 400 mL vorgewärmtes 2xYT-Medium (Amp100, Kan25) mit einer Übernachtkultur der gewünschten Produzentenstämme 1:100 angeimpft. Bei der ersten Variante wurden die Kulturen bei 30°C und 250 upm im Luftschüttler angezogen. Nach Erreichen einer OD600 von 0,6 bis 0,8 wurde die Expression durch Zugabe von 0,2 mL IPTG-Lösung (400 mM) induziert (Endkonzentration 0,2 mM). Bei der zweiten Variante wurden die Expressionskulturen ohne Induktion für 16-18 Stunden bei RT (22-24°C) und 250 upm inkubiert. Danach wurden 0,2 mL IPTG-Lösung (400 mM) zugegeben. In beiden Fällen wurde dann nach der Induktion für weitere zwei bis drei Stunden bei der entsprechenden Temperatur inkubiert. Die entstandenen dichten Zellsuspensionen wurden pelletiert (6000 upm/4°C) und die erhaltenen Pellets in 10 mL FPLC-PufferA (50 mM HEPES, 300 mM NaCl, pH 7,8-8,0) resuspendiert. Diese Suspensionen konnten direkt zum Zellaufschluß weiterverwendet oder bei -20°C zur späteren Aufarbeitung aufbewahrt werden. Der Erfolg der Expression konnte durch SDS-PAGE, wobei Proben vor Induktion mit Proben nach der Induktion verglichen wurden, verfolgt werden. Variante 2 wurde bevorzugt bei Proteinen angewandt, die bei der ersten Variante entweder eine schlechte Löslichkeit zeigten oder aber deren Aktivität sehr niedrig war.
4.2.2 Zellaufschluß – Präparation von E. coli Rohzellextrakten
Die resuspendierten E. coli Zellen wurden mit Hilfe einer French-Press aufgeschlossen. Durch die schlagartige Expansion der unter einem Druck von 10000 PSI stehenden Zellsuspension wird die Zellwand und die Zellmembran aufgerissen. Der Vorgang von Kompression und Dekompression der Zellsuspension wurde drei mal wiederholt. Um die Proteine zu schonen wurde die gesamte Behandlung bei 4°C durchgeführt. Nach dem Aufschluß wurden die
erhaltenen Suspensionen durch Zentrifugation (17000 upm/ 4°C/ 30 min) von unlöslichen Bestandteilen befreit und der leicht gelbliche Überstand direkt durch IMAC aufgereinigt.
4.2.3 Proteinaufreinigung mittels IMAC - Affinitätschromatographie
Die Affinitätschromatographie an immobilisierten Metallionen (IMAC) erlaubt eine besonders schnelle Aufreinigung der mit einem His6-Tag versehenen rekombinanten Proteine [150-152]. Eine Chelatisierung der immobilisierten Ni2+-Ionen der Säulenmatrix durch die Histidinreste des His6-Tag´s bewirkt die Trennung von den übrigen Proteinen im Zellrohextrakt. Durch Imidazol können die gebundenen Proteine wieder freigesetzt werden. Zur Aufreinigung der Proteine aus 800 mL Zellkultur wurden ca. 1,5 mL Säulenvolumen der Matrix für die FPLC-Säule benötigt. Es wurde eine FPLC-Anlage der Firma Pharmacia verwendet. Zur Aufreinigung wurde eine konstante Fußrate von 0,8 mL/min eingestellt. Nach dem Equilibrieren der Säule mit der Anfangskonzentration an FPLC-Puffer B wurde sie mit dem Zellrohextrakt aus dem Zellaufschluß beladen. Die Auftragung erfolgte in der Regel mit 5% FPLC-Puffer B und es wurde so lange unter gleichen Bedingungen gewaschen bis sich die Absorption bei 280 nm des Eluates der Grundlinie näherte. Durch lineare Erhöhung des Anteils an FPLC-Puffer B in der mobilen Phase (innerhalb 30 Minuten von 5% auf 70%) wurden die gebundenen Proteine anschließend von der Säule eluiert. Die erhaltenen Fraktionen wurden zunächst durch den Bradford-Test [147] auf die Proteinkonzentrationen und danach durch SDS-PAGE auf Reinheit untersucht. Die geeigneten Fraktionen wurden vereinigt und dialysiert. Die Dialyse (2-3 mal gegen das 200-fache Volumen Dialysepuffer) diente zur Entfernung des Imidazols und anderer niedermolekularer Bestandteile sowie zur Einstellung definierter Pufferbedingungen. Nach der Dialyse wurden die Konzentration der einzelnen Proteinlösungen nach der Methode von Bradford bestimmt. Die Proteine konnten entweder direkt biochemischen Untersuchungen unterzogen oder aber aliquotiert und mit flüssigem Stickstoff eingefroren werden. Bei –80°C konnten die meisten Proteine über mehrere Monate ohne signifikanten Aktivitätsverlust gelagert werden.
FPLC-PufferA: 50 mM HEPES (pH 7,8-8,0)
300 mM NaCl
FPLC-PufferB: 50 mM HEPES (pH 7,8-8,0)
300 mM NaCl
