Aus der Abteilung Klinische Immunologie Direktor Prof. Dr. med. R.E. Schmidt
Zentrum Innere Medizin Medizinische Hochschule Hannover
Auswirkungen von HIV Resistenzmutationen und CCR Polymorphismen
auf die antiretrovirale Therapie
Dissertation
zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin
in der Medizinischen Hochschule Hannover
vorgelegt von Kurt-Wolfram Sühs
aus Erlangen Hannover 2006
Angenommen vom Senat der Medizinischen Hochschule Hannover Am: 19.01.2007
Gedruckt mit Genehmigung der Medizinischen Hochschule Hannover
Präsident: Prof. Dr. Dieter Bitter- Suermann
Betreuer der Arbeit: Prof. Dr. R. E. Schmidt
Referent: Privatdozent Dr. Albert Heim
Korreferent: Privatdozent Dr. Dirk Stichtenoth
Tag der mündlichen Prüfung:19.01.2007
Promotionsausschussmitglieder:
Prof. Dr. Michael Peter Manns Prof. Dr. Arnold Ganser
Frau Prof. ’in Dr. Marion Haubitz
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
1 EINLEITUNG... 3
1.1 DIE ENTWICKLUNG DER HIVEPIDEMIE... 3
1.2 DAS VIRUS... 5
1.3 DER REPRODUKTIONSZYKLUS VON HIV ... 6
1.4 NATÜRLICHER KRANKHEITSVERLAUF... 7
1.5 THERAPIE DER HIVINFEKTION... 10
1.5.1 Surrogatmarker der HIV-Erkrankung ... 10
1.5.2 Nukleosidische Reverse Transkriptase Inhibitoren (NRTI) ... 11
1.5.3 Protease Inhibitoren (PI)... 11
1.5.4 Nicht Nucleosidische Reverse Transkriptase Inhibitoren (NNRTI)... 12
1.5.5 Fusions-Inhibitoren ... 12
1.6 RESISTENZENTWICKLUNG... 13
1.6.1 Antiretrovirale Therapie ... 14
1.6.2 Phänotypische Resistenzbestimmung ... 14
1.6.3 Genotypische Resistenzbestimmung... 15
1.6.4 Resistenzmutationen ... 16
1.7 CHEMOKINREZEPTOREN... 18
2 ZIELSETZUNG DER ARBEIT... 19
3 MATERIAL UND METHODEN... 20
3.1 MATERIAL... 20
3.1.1 GERÄTE... 20
3.1.2 VERBRAUCHSMATERIAL... 20
3.1.3 CHEMIKALIEN,LÖSUNGEN,ENZYME... 21
3.1.4 KIT-SYSTEME... 21
3.2 STUDIENAUFBAU... 22
3.3 PROBEN... 23
3.4 HELFERZELLBESTIMMUNG... 23
3.5 VIRUSLASTMESSUNG... 24
3.6 RNS-ISOLIERUNG... 24
3.7 GENOTYPISCHE RESISTENZANALYSE... 25
3.8 DNS-ISOLATION... 27
3.9 POLYMERASEKETTENREAKTION ZUR BESTIMMUNG DER CCRPOLYMORPHISMEN. 28 3.10 RESTRIKTIONSVERDAU... 29
3.11 STATISTISCHE METHODEN... 30
4 ERGEBNISSE ... 31
4.1 PATIENTENKOLLEKTIV I ... 31
4.2.1 Frequenz der Mutationen in Protease und Reverser Transkriptase... 32
4.2.2 Resistenzmutationen ... 35
4.2.3 Auswirkung der Resistenzmutationen auf die Medikamentenwirksamkeit36 4.2.4 Immunologisches Therapieansprechen ... 37
4.2.5 Einfluss der Mutationen auf die Therapie ... 38
4.2.6 Einfluss der Resistenzmutationen auf die Therapie... 42
4.2.7 Auswirkung direkter Medikamentenresistenz auf die Therapie... 43
4.2.8 Einfluss der CC-Rezeptoren im Kollektiv I ... 44
4.2 PATIENTENKOLLEKTIV II ... 47
4.2.1 Verteilung der Corezeptorpolymorphismen ... 47
4.2.2 Immunologisches Therapieansprechen ... 48
Inhaltsverzeichnis
4.2.3 Einfluss der CCR5 32 Deletion auf den Therapieverlauf ... 49
4.2.4 Einfluss des CCR2 I64 Polymorphismus auf den Therapieverlauf... 51
5 DISKUSSION ... 53
5.1 VERTEILUNG UND AUSWIRKUNG DER VERSCHIEDENEN MUTATIONEN... 53
5.2 COREZEPTORPOLYMORPHISMEN... 58
6 ZUSAMMENFASSUNG ... 62
7 LITERATURVERZEICHNIS ... 64
ABKÜRZUNGEN ... 70
LEBENSLAUF ... 71
PUBLIKATIONSLISTE... 72
DANKSAGUNGEN ... 73
ERKLÄRUNG NACH § 2 ABS. 2 NRN. 5 UND 6 ... 74
Einleitung
1 Einleitung
1.1 Die Entwicklung der HIV Epidemie
Am 5. Juni 1981 veröffentlichte eine amerikanischer Forschungszeitschrift, der Morbidity and Mortality Weekly Report, einen Bericht über fünf junge Männer aus Los Angeles, die aus unerklärlichen Gründen aus scheinbar völliger Gesundheit an Pneumocystis carinii erkrankten1. Das die Veröffentlichung begleitende Editorial schlussfolgerte, dass „all die oben genannten Beobachtungen auf die Möglichkeit einer Dysfunktion des zellulären Immunsystems hindeuten, die verbunden mit einer allgemeinen Gefährdung eine Anfälligkeit der Individuen für opportunistische Infektionen bedingt.“
Einen Monat später erschien ein neuer Bericht, der zehn weitere Pneumocystis carinii Fälle in Los Angeles und im Gebiet der San Francisco Bay erwähnte2. In dieser Publikation wurde außerdem über das Auftreten einer ungewöhnlich hohen Zahl von Fällen des Kaposi Sarkoms in New York und Kalifornien berichtet. Über 26 histopathologisch gesicherte Fälle des Kaposi Sarkoms bei jungen Männern mit einem ungewöhnlich aggressivem Verlauf wurden alleine in den vorangegangenen 30 Monaten beschrieben, während sich in den Jahren zuvor fast keine Fälle des Kaposi Sarkoms in dieser Altersgruppe finden ließen. Eine höhere Inzidenz dieser Krankheit bei jüngeren Patienten fand sich davor nur in Äquatorial-Afrika3, bei Nierentransplantierten4-6 sowie bei anderen immunsupprimierten Patienten7,8.
Zeitgleich stieg die Zahl der Pentamidin-Bestellungen bei der Investigation Drug Unit der Centers of Disease Control (CDC), dem damals einzigen Vertreiber von Pentamidin, beunruhigend an. Zum Einsatz kommt dieses Medikament zur Behandlung resistenter Pneumocystis carinii Infektionen.
Daraufhin wurde noch im selben Jahr von der CDC ein Wissenschaftlerteam ins Leben gerufen, das die Risikofaktoren identifizieren und eine Definition des Krankheitsbildes entwickeln sollte.
Im Jahr 1983 wurde dann das Syndrom AIDS als „acquired immunodeficiency syndrome“ in den Cumulated Index Medicus aufgenommen.
Im gleichen Jahr gelang es den Virologen des Pariser Pasteur Instituts, das schädigende Agens zu isolieren. Das Retrovirus, welches in den Lymphknoten eines Patienten mit chronischer Lymphadenopathie gefunden worden war, wurde
Einleitung
„Lymphadenopathy associated virus“ (LAV) genannt9. Etwa zur gleichen Zeit brachte die Forschungsgruppe um Gallo ein Virus mit AIDS in Zusammenhang, das sie als
„Human T-cell leukemia virus III“ (HTLV III) bezeichneten10. Im Jahr 1984 verständigte man sich schließlich darauf, das Virus mit dem Namen „Human Immunodeficiency Virus“ (HIV) zu versehen.
Inzwischen war Schätzungen zufolge die Zahl der Infizierten in den USA von 200 im Jahre 1981 auf 3000 am Ende des Jahres 1983 gestiegen. Bis Ende 1985 rechnete man mit etwa 20.000 Infizierten.
Zu dieser Zeit starben die meisten Patienten mit AIDS innerhalb von zwei Jahren11. Um 1985 stieg aufgrund der Aufklärung und des verbesserten Umgangs mit opportunistischen Infektionen wie der Pneumocystis carinii Pneumonie (PCP) die Lebenserwartung der infizierten Patienten an. Trotzdem starben 85% der an AIDS Erkrankten innerhalb von fünf Jahren11.
Obwohl die Gruppen um Montagnier und Gallo kurz nach der Entdeckung des infektiösen Viruspartikels getrennte Patentanträge für einen Antikörpersuchtest für HIV beantragten, stand der Test erst ab 1985 zur Verfügung12. Im folgenden Jahr entdeckte die Gruppe um Clavel das nahe verwandte HI-Virus Typ 2 (HIV-2)13. 1987 wurde mit der Zulassung von Zidovudine, einem die Virus Reverse- Transkriptase hemmenden Nucleosid Analogon, die erste Möglichkeit einer antiretroviralen Therapie eröffnet14.
Trotz der Einführung weiterer nucleosidischer Reverse Transkriptase Inhibitoren (NRTI) musste man erkennen, dass die Monotherapie nur einen kurzzeitigen und begrenzten Effekt gegen HIV hatte15,16.
Einen positiven Einfluß auf das Krankheitsgeschehen hatte die Entwicklung der Viruslastmessung in den darauf folgenden Jahren, da sie wichtige Informationen für Therapieentscheidungen für den einzelnen Patienten lieferte17.
Weiterhin konnten durch verbesserte Arzneimittelforschung 1995 die ersten Inhibitoren der HIV Protease (PI) hergestellt werden. Bald ließ sich zeigen, dass sich durch die Kombination von einem PI mit zwei NRTIs die virale Replikation senken und eine deutliche Abnahme der Sterblichkeit erzielen ließ18.
Ein Jahr später wurde schließlich Nevirapine als erster nicht nucleosidischer Reverse-Transkriptase Inhibitor (NNRTI) zugelassen. Obwohl zunächst versucht wurde, durch Kombination der antiretroviralen Wirkstoffe das Virus aus dem Körper zu eliminieren, musste bald durch neue Forschungsergebnisse davon ausgegangen
Einleitung
werden, dass dies mit den zur Verfügung stehenden Medikamenten nicht zu erreichen wäre19.
Nach Angaben der WHO infizierten sich weltweit im Jahr 2004 ca. 4,9 Millionen Menschen, damit mehr als je in den Jahren zuvor, mit dem HI-Virus. Zur Zeit leben etwa 39,4 Millionen mit HIV. Seit Beginn der Epidemie sind über 23 Millionen Personen an den Folgen der Infektion verstorben.
1.2 Das Virus
Zur Zeit unterscheidet man zwischen zwei Typen des HIV: HIV-1 und HIV-2. HIV-2 war ursprünglich in Westafrika endemisch und breitet sich inzwischen auch in Indien aus. Die überwiegende Zahl der AIDS Fälle wird weltweit jedoch von dem virulenteren HIV-1 verursacht. Aufgrund von Sequenzbeziehungen geht man davon aus, dass HIV-1 von Schimpansen und HIV-2 von Mangaben auf den Menschen übertragen wurde.
Abb. 1 Schematische Darstellung der HIV-1 Struktur 20.
Genomorganisation (in 3 Leserastern)
Strukturproteine
Hülle Kapsid RNA
LTR gag
p55 p18 p24 p15
pol p66/51 p31
vif vpr
rev
tat LTR
env nef
gp160 gp 120 gp41
Einleitung
HIV ist ein Einzelstrang RNS Retrovirus positiver Polarität und zählt zur Gattung der Lentiviren. Es hat eine ikosaerdrische Form mit einem Durchmesser von etwa 100 nm.
Seine Hülle besteht aus einer Doppellipidmembran, welche sich beim Ausschleusen des Virus von der Wirtszellmembran abgeschnürt und weitgehend mit der Plasmamembran der produzierenden Zelle übereinstimmt21. Aus dieser Hülle ragen in Form von Trimeren „Andockproteine“, die aus den Virusproteinen gp120 und gp41 gebildet werden, heraus. Unter der Hülle liegt das Nukleokapsid, bestehend aus den Proteinen p24, p17, p9 und p7. Im Inneren des Kerns befinden sich zwei Kopien des RNS Genoms sowie die Enzyme Reverse Transkriptase und Protease20.
Das von „long terminal repeats“ eingefasste 9,7 Kilobasen große Genom besteht aus neun Genen, die 15 Proteine codieren22. Die drei Hauptgene sind gag, pol und env.
Das gag-Gen codiert die Strukturproteine des Virus, das pol-Gen Enzyme der Virusreplikation und Integration, das env-Gen trägt Informationen der Hüllglykoproteine. Des Weiteren existieren die Gene tat, rev, vif, vpr, vpu und nef, welche durch Erforschung ihrer Funktion und Genprodukte an Bedeutung gewinnen23.
1.3 Der Reproduktionszyklus von HIV
Der Reproduktionszyklus von HIV beginnt mit der Bindung des HI-Virus an die Wirtszelle. Hauptzielzellen von HIV sind CD4+ T-Lymphozyten sowie Makrophagen und dendritische Zellen. HIV kann aber auch CD4- Zellen wie B-Lymphozyten, CD8- Zellen und Zellen des zentralen Nervensystems wie Astrozyten und Endothelzellen infizieren, wahrscheinlich unter Zuhilfenahme des CD4 Moleküls einer Nachbarzelle.
Zu Beginn bindet das virale Protein gp120 hochaffin an den Zelloberflächenrezeptor CD4. Für die Verschmelzung mit der Zielzelle benötigt gp120 zusätzlich die Bindung mit einem der verschiedenen Chemokinrezeptoren der Zelloberfläche. Die für die Adsorption wichtigsten Chemokinrezeptoren sind CXCR4 und CCR5. An welchem der Corezeptoren die weiterhin erforderliche Bindung entsteht, hängt von der vorliegenden HIV-Variante ab, die durch die vorliegende V3-Loop Sequenz des Virus definiert wird. Man spricht in diesem Fall von Tropismus. Die Form, die CCR5 für den Eintritt in die Zellen benutzt, wird als makrophagentropisch (M-tropisch) oder als R5
Einleitung
Variante bezeichnet, da sie in vitro nur Makrophagen infiziert. Im Gegensatz dazu infiziert sie in vivo allerdings auch T-Lymphozyten und dendritische Zellen. Die andere Variante wird aufgrund ihrer Fähigkeit, in vivo nur CD4+ T-Lymphozyten zu infizieren, als lymphozytentropisch (T-tropisch) oder X4 beschrieben. Unmittelbar nach der Primärinfektion setzt sich die „makrophagentropische“ Form durch. Als Ursachen angenommen werden unter anderem die unterschiedliche Expression der CC-Rezeptoren in verschiedenen Geweben und ein geringerer Selektionsdruck durch zytotoxische T-Lymphozyten24,25.
Nach der Adsorption und der Freisetzung der Virus-RNS ins Innere der Zelle schreibt das Virusenzym Reverse Transkriptase den RNS-Strang in eine komplementäre cDNA um. Diese wird durch die Integrase in das Genom der Wirtszelle eingebracht.
Das so entstandene Provirus kann entweder im inaktiven Zustand in der Zelle integriert bleiben oder über Aktivierung der Transkription die Virusreplikation einleiten. Besondere Bedeutung während der Replikationsphase haben die Regulatorgene tat, ref, nef, da sie potente Aktivatoren für die anschließende Expression der viralen Gene sind. Die Provirus-Transkripte werden aus dem Zellkern ausgeschleust, wobei das virale Rev-Protein eine protektive Funktion übernimmt. Bei der anschließenden Translation entstehen Virusproteine, die mit Hilfe der Protease zu neuen infektiösen Partikeln zusammengesetzt werden. Beim Austritt aus der Zelle wird schließlich das virale Kapsid mit einer zellulären Lipidmembran umhüllt.
1.4 Natürlicher Krankheitsverlauf
Die Infektion verläuft normalerweise in vier verschiedenen Phasen. Nach der Infektion breitet sich das Virus im Lymph- und Blutsystem aus und beginnt mit einer massiven Replikation. Gleichzeitig mit dem Anstieg der Virusmenge im Plasma sinkt die Zahl der CD4+ T-Lymphozyten stark ab. Die beginnende massive zelluläre und humorale Immunantwort führt im Verlauf der nächsten drei bis sechs Wochen zu einem Anstieg der CD4+ Zellen sowie einem deutlichen Rückgang der Viruslast. Das Virus wird jedoch nicht vollständig eliminiert; so etabliert sich eine chronische Infektion, mit einem je nach Patient unterschiedlich hohem Replikationsniveau (Setpoint). Die Auseinandersetzung des Körpers mit dem Virus führt in diesem Zeitraum zur Bildung von Antikörpern, die dann mit den gängigen Tests nachweisbar sind (Serokonversion). Zu diesem Zeitpunkt durchleben ungefähr die Hälfte aller
Einleitung
Pharyngitis, Fieber und ein urtikariell-makulöses, leicht juckendes Exanthem. In Einzelfällen wurden schwerere Krankheitsverläufe mit Bewusstseinstrübung bis hin zum Koma beschrieben.
An die akute Infektion schließt sich die Phase der klinischen Latenz an. In dieser verläuft die Erkrankung asymptomatisch, was keineswegs Zeichen einer Latenzphase mit viraler Inaktivität ist. Vielmehr hat sich ein vorübergehendes Gleichgewicht zwischen andauender viraler Replikation und den vom Körper eliminierten Viren eingestellt. Auf der einen Seite werden täglich etwa zehn Milliarden Viren mit einer Halbwertszeit von sechs Stunden bis zu zwei Tagen gebildet, auf der anderen Seite entstehen etwa eine Milliarde CD4+ T-Lymphozyten mit einer Halbwertszeit von 1,6 Tagen.
Von zentraler Bedeutung bei der Viruselimination sind, neben Antikörpern gegen verschiedene virale Strukturen sowohl cytotoxische CD8-T-Zellen wie auch Th1- Zellen.
Abb.2 Verlauf der HIV Infektion ohne therapeutische Intervention 20.
Diese Phase der klinischen Latenz ist interindividuell von sehr unterschiedlicher Dauer, sie reicht von einem bis zu zwölf und mehr Jahren23. Noch ist nicht vollständig geklärt, warum dieser Zeitraum so verschieden ist. Man weiß, dass verschiedende Faktoren, wie z.B. Veränderungen der Corezeptoren des Wirts, ein unterschiedlich
CD4+ T-Lymphozyten (Zellen /µl) Plasma Viruslast (Verdünnungsreihe)
Wochen Jahre
1200 1100 1000 900 800 700 600 500 400 300 200 100
0 0 3 6 9 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
1:512 1:265 1:126 1:64 1:32 1:16 1:8 1:4 1:2 0
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stark ausgeprägtes Immunsystem und eine mehr oder minder virulente primäre Virusvariante eine Rolle spielen26,27.
Dieses Stadium entspricht der klinischen Kategorie A der „Centers of Disease Control“ (CDC) Klassifikation:
• Asymptomatische HIV-Infektion
• Persistierende generalisierte Lymphadenopathie
Schließlich kommt es zu einem quantitativen und qualititativen Abfall der CD4+
Zellen. Einerseits wird durch gesteigerte Apoptose, durch direkte zytopathologische Effekte von HIV und durch die zytotoxische Antwort der T-Lymphozyten die Gesamtpopulation der CD4+ Zellen dezimiert, andererseits durch Ausdünnen von CD4+ Subpopulationen die qualitative Immunantwort gegen das Virus vermindert.
Durch die ersten opportunistischen Infektionen, die nicht zu den AIDS definierenden Erkrankungen gerechnet werden, jedoch der HIV-Infektion zuzuordnen sind, erfolgt der Übergang in die symptomatische Phase, die der CDC Kategorie B entspricht:
Typisch sind Symptome und Erkrankungen, wie persistierendes Fieber (>1 Monat), Mehrsegmentbefall durch einen Herpes Zoster, oropharyngeale Candida Infektionen, etc.
Unter einer Konzentration von <200 CD4-Zellen/µl kommt es meist durch das Auftreten AIDS-definierter Erkrankungen zum Übergang ins letzte Krankheitsstadium (CDC C).
Zu den AIDS definierenden Erkrankungen gehören unter anderem: Candidose von Ösophagus, Bronchien, Trachea oder Lungen, CMV-Retinitis, HIV-bedingte Enzephalopathien, Kaposi-Sarkome, extrapulmonale Kokzidioidomykosen, Burkitt- Lymphome, disseminierte Mycobacterium avium complex or M. kansasii Infektionen, Pneumocystis carinii Pneumonien und rezidivierende Tuberkulosen.
Das letzte Stadium endet nach ein bis zwei Jahren mit dem Tod des Patienten.
Einleitung
Die CDC Klassifikation teilt die HIV-Erkrankung in drei klinische sowie drei Laborkategorien. Die klinischen Kategorien A-C entsprechen den oben genannten Stadien. Die Einteilung in eine bestimmte Laborkategorie erfolgt anhand der CD4+
Zellen. Die Rückstufung von einer fortgeschritteneren klinischen Kategorie in eine vorangegangene ist prinzipiell nicht vorgesehen.
Klinische Kategorie
Labor-Kategorien A B C
(CD4-Zellen/µl) (asytomatisch) (Symtome, (AIDS)
kein AIDS)
Kategorie 1: ≥ 500 A1 B1 C1
Kategorie 2: 200 - 499 A2 B2 C2
Kategorie 3: <200 A3 B3 C3
1.5 Therapie der HIV Infektion
1.5.1 Surrogatmarker der HIV-Erkrankung
Zur Überwachung der Entwicklung der HIV-Infektion und des Fortschreitens der Krankheit werden im Rahmen der Routinediagnostik die Lymphozyten- subpopulationen (CD4/CD8) und die Viruslast bestimmt.
Mit Bestimmung der CD4+ Zellzahl lässt sich ein Eindruck der immunologischen Status des Patienten einschätzen. Dieser Parameter korreliert mit dem Fortschreiten der Krankheit und wird daher bei der CDC-Klassifikation berücksichtigt. Des Weiteren wird er verwendet, um den Beginn von HAART und prophylaktischer Maßnahmen gegen verschiedene opportunistische Infektionen festzulegen, da mit diesen ab Unterschreiten der Helferzellzahl von 200/µl zu rechnen ist.
Die Viruslast, gemessen als HIV-RNS Kopien pro ml Plasma, ist ein Maß der replikativen Aktivität des Virus. Durch sie kann eine Kontrolle der antiretroviralen Therapie erfolgen. Eine hohe Viruslast ist in der Regel mit schnellerer Krankheitsprogression vergesellschaftet28.
Einleitung
1.5.2 Nukleosidische Reverse Transkriptase Inhibitoren (NRTI)
In den ersten Jahren der Epidemie beschränkten sich die therapeutischen Optionen auf die Kontrolle der zahlreichen und ungewöhnlichen opportunistischen Infektionen.
Die erste kausale Therapie der HIV-Infektion wurde erst 1987 mit der Zulassung von Zidovudine, einem NRTI, möglich14. Wirkstoffe dieser Medikamentengruppe konkurrieren kompetitiv mit den natürlich vorkommenden Aminosäuren um eine Bindungsstelle an der Reversen Transkriptase. Die Reverse Transkriptase ist ein Heterodimer, bestehend aus den Untereinheiten p51 und p66. Die p51 Untereinheit setzt sich aus den ersten 440 Aminosäuren des pol Gens zusammen und verfügt über keine enzymatische Aktivität. Die p66 Untereinheit besteht aus allen 560 Aminosäuren des pol Gens und enthält das aktive Zentrum. Bei der Umwandlung der viralen RNS in die DNS durch dieses Enzym werden die NRTIs als „falsche“
Nukleoside verwendet und führen so zum Kettenabbruch der proviralen DNS29. Zur Zeit sind acht verschiedene NRTIs verfügbar:
Lamivudin (3TC) = Epivir; Abacavir (ABC) = Ziagen;
Zidovudin (AZT) = Retrovir; Stavudin (d4T) = Zerit;
Zalcitabin (ddC) = Hivid; Dianosin (ddl) = Videx;
Emtricitabin (FTC) = Emtriva;
Tenofovir disopril fumarat (TDF) = Viread (einziges Nucleotid Analogon)
Außerdem sind verschiedene Kombinationen der einzelnen Wirkstoffe erhältlich, wie Combivir (3TC+AZT) und Trizivir (ABC+3TC+AZT), TRUVADA (TDF+FTC) und KIVEXA (3TC+ABC).
1.5.3 Protease Inhibitoren (PI)
Das erste Medikament einer zweiten Wirkstoffklasse, der Protease Inhibitoren, wurde 1995 zugelassen. Die retroviralen Transkriptionsprodukte liegen zunächst als große Polypeptide vor. Um zu funktionsfähigen Proteinen zu werden, müssen diese durch die virale Protease gespalten werden. Dieses Enzym ist eine Aspartylprotease. Sie besteht aus zwei nicht-kovalent gebundenen, 99 Aminosäuren großen Monomeren, deren hydrophobe Substratbindungsstelle Sequenzen verschiedener Peptide erkennt
Einleitung
und prozessiert. Sie sind beispielsweise nötig, um das Nucleocapsid oder verschiedene virale Enzyme zu produzieren.
Protease Inhibitoren blockieren das aktive Zentrum der Protease und verhindern so, dass infektiöse Viren entstehen29. Zur Zeit gibt es sieben zugelassene Protease Inhibitoren:
Amprenavir (APV) = Agenerase; Atazanavir (ATV) = Reyataz;
Indinavir (IDV) = Crixivan; Nelfinavir (NFV) = Viracept;
Ritonavir (RTV) = Norvir; Saquinavir (SQV) = Fortovase;
Lopinavir+Ritonavir (LPV) = Kaletra
1.5.4 Nicht Nucleosidische Reverse Transkriptase Inhibitoren (NNRTI)
Kurz nach Entwicklung der Protease Inhibitoren kam mit der Entwicklung der NNRTIs die dritte Wirkstoffklasse auf den Markt. NNRTIs binden an eine hydrophobe Region der Reversen Transkriptase in der Nähe des aktiven Zentrums. Diese Bindung führt zu einer Strukturveränderung des aktiven Zentrum dieses Enzyms und damit zu seiner Funktionsunfähigkeit. Drei unterschiedliche Medikamente stehen derzeit zur Verfügung:
Delavirdin (DLV) = Rescriptor; Efavirenz (EFV) = Sustiva;
Nevirapin (NVP) = Viramune
1.5.5 Fusions-Inhibitoren
Zu dieser noch relativ neuen Substanzklasse wird der erst vor kurzem zugelassene Fusionsinhibitor Enfuvirtide (T20) = Fuzeon gezählt. Enfuvirtide ist ein 36 Aminosäuren langes, synthetisches Peptid, abgeleitet von der extrazellulären Domäne des viralen Proteins gp41.
Bei Kontakt des viralen Proteins gp120 mit den Wirtszelloberflächenrezeptor CD4 findet normalerweise eine Strukturveränderung des gp41 statt, die eine Verschmelzung zwischen viraler und zellulärer Membran ermöglicht. Durch Bindung von Enfuvirtide wird diese Änderung blockiert und so eine Fusion von Virus und Zelle verhindert. Enfuvirtide muss bislang täglich subkutan verabreicht werden, ist relativ teuer und schwer herstellbar30.
Einleitung
1.6 Resistenzentwicklung
Ein großes Problem stellt die Entstehung resistenter Viren dar, die den Erfolg der HAART gefährden. Da die Reverse Transkriptase beim Umschreiben viraler RNS in DNS nicht Korrektur liest, entstehen bei der Transkription ständig neue Punktmutationen31. Bedenkt man die hohe Replikationsrate von HIV, muss man statistisch gesehen davon ausgehen, dass jede beliebige Stelle des Virusgenoms im Laufe eines Tages mehrfach verändert wird. So entstehen mit der Zeit unzählige verschiedene Varianten (Quasispezies) von HIV32.
Vor Beginn der Therapie treten diese Varianten aufgrund eines mangelnden Selektionsvorteils gegenüber dem Wildtyp nicht in Erscheinung. Allerdings kann es bei Einleitung der HAART dazu kommen, dass sich eine gegenüber einem oder mehreren Medikamenten resistente Virusvariante durchsetzt. Begünstigt wird diese Selektion resistenter Quasispezies, wenn es, beispielsweise durch mangelnde Compliance, nicht gelingt, die Virusreplikation unterhalb der Nachweisgrenze zu halten. Über längere Zeit sammeln sich durch den nun vorherrschenden Selektionsdruck resistente Varianten an, deren Replikation nicht mehr oder nur ungenügend durch die vorhandenen Pharmaka zu beeinflussen ist.
Diese Quasispezies können dann weiter übertragen werden. Bereits jetzt werden in Europa und den USA bei 10-20% der Neuinfektionen Virusstämme übertragen, die gegen mindestens ein Medikament resistent sind33-35.
Genotypische und phänotypische Resistenzbestimmung sind die zur Zeit etablierten Methoden zur Bestimmung von Resistenzen des Hi-Virus gegenüber antiretroviralen Medikamenten36.
Sie beruhen auf unterschiedlichen Verfahrensweisen, die in den Kapiteln 1.6.2 und 1.6.3 näher erläutert werden.
Verschiedene kommerzielle Anbieter stehen hierbei zur Verfügung:
Genotypische Resistenztests: z. B. HIV-1 TrueGene, Bayer Healthcare Diagnostics;
Virco®Type HIV-1, Virco; ViroSeq, Celera Diagnostics/Abbott Laboratories;
GenoSure (Plus), LabCorp; GeneSeq, Virologic;
Phänotypische Resistenztests: z.B. Antivirogram, Virco; PhenoSense, ViroLogic;
Phenoscrip, VIRalliance.
Einleitung
1.6.1 Antiretrovirale Therapie
Die ersten als Monotherapie eingesetzten therapeutischen Medikamente erbrachten nur kurzzeitige und begrenzte Erfolge15. Allerdings ließ sich schon die Übertragung von HIV von Mutter auf Kind (vertikale Transmission) durch den Einsatz von Zidovudine von 25,5 auf 8,3 Prozent senken. Langfristige Erfolge bescherte die Einführung der „hoch aktiven antiretroviralen Therapie“ (HAART), die sich auf die Kombination von mindestens drei verschiedenen Wirkstoffen stützt. Gemäß der Studienlage werden bestimmte Empfehlungen ausgesprochen37. Bewährt haben sich die hierbei folgende Kombinationen:
• ein oder zwei PIs+ zwei NRTIs
• ein NNRTI + zwei NRTIs
• drei NRTIs
Mit Hilfe der HAART lassen sich Morbidität18 und Mortalität deutlich senken, die Viruslast über lange Zeit unter der Nachweisgrenze halten und vertikale Transmission in fast 99% der Fälle verhindern38.
Kurze Zeit später musste man jedoch erkennen, dass eine Reihe von Nebenwirkungen und metabolischer Komplikationen wie Laktatazidose, Pankreatitis, Polyneuropathie, Diabetes mellitus und Fettstoffwechselstörungen mit der HAART vergesellschaftet waren39.
1.6.2 Phänotypische Resistenzbestimmung
Bei der phänotypischen Resistenzbestimmung wird die Replikationsfähigkeit des zu untersuchenden Virusstammes in einer Zellkultur unter steigenden Wirkstoffkonzentrationen eines antiretroviralen Medikaments untersucht. Die Replikationsfähigkeit wird hierbei mit der des Wildtypvirus verglichen.
Die Konzentration einer antiretroviralen Substanz die benötigt wird um die Replikation auf 50% zu reduzieren wird als IC50 (inhibtory concentration) bezeichnet.
Ob eine Viruspopulation gegenüber einem bestimmten Medikament als sensibel bezeichent werden kann, wird mittels verschiedener Cut off Werte entschieden.
Einleitung
Man unterscheidet einen technischen, einen biologischen und einen klinischen Cut off Wert. Der technische Cut off bezeichnet die messtechnische Variationsbreite und liegt bei etwa dem 2,5 fachen der IC50. Der biologische Cut off wird unter Rücksichtnahme auf die interindividuelle Schwankungsbreite der Virus-Isolate von ART-naiven HIV-Patienten bestimmt und liegt oberhalb des technischen Cut off Wertes.
Der relevanteste Parameter für den behandelden Arzt ist der klinische Cut off. Dieser gibt an um welchen Faktor die IC50 erhöht sein kann, bevor nicht mehr von einem virologischen Ansprechen der Viruspopulation auf ein Medikament auszugehen ist.
Da sich der klinische Cut-off jeweils auf einzelne Medikamente bezieht, ist bei Angabe des klinischen Cut offs für Protease Inhibitoren wichtig, ob dieser sich auf den ungeboosterten, das heisst den Einzelwirkstoff bezieht, oder auf den beispielsweise mit Ritonavir kombinierten (geboosterten).
Nachteile dieses Verfahrens gegenüber der genotypischen Resistenzbestimmung, sind der grössere Zeitaufwand und die höheren Kosten. Vorteil ist die leichtere klinische Interpretation der Daten, da ähnlich wie bei Antibiotikaresistenz mit Wirkstoffhemmkonzentrationen gearbeitet wird.
1.6.3 Genotypische Resistenzbestimmung
Bei der genotypischen Resistenzanalyse werden die Mutationen durch Sequenzierung des Virusgenoms oder spezifische Hybridisierungsverfahren nachgewiesen. Die Bedeutung einzelner Mutationen für die antiretrovirale Resistenz der Viruspopulation wird abgeleitet aus der Korrelation zwischen Geno- und Phänotyp. Entsprechende Daten hierfür stammen aus In-vitro-Selektionsstudien, klinischen Beobachtungen oder aus zahlreichen Doppelmessungen, bei denen Mutationen auf ihre phänotypische Resistenz untersucht wurden.
Mit Hilfe umfassender Datenbanken lassen sich einzelne genotypische Mutationen, oder eine Kombination von Mutationen in einen virtuellen Phänotyp umrechnen.
Einige der wichtigsten Datenbanken zu Resistenzprofilen bzw. Interpretationssyteme sind unter folgenden Internetadressen frei verfügbar:
Stanford-Database: http://hiv.net/link.php?.id=24
Einleitung
geno2pheno: http://hiv.net/link.php?id=26
HIV Genotypic Drug Resistance Interpretation ANRS AC11:
http://hiv.net/link.php?.id=138
Die verschiedenen Interpretationsrichtlinien sind von den kommerziellen Anbietern in ihre Systeme integriert worden. Nachteil dieser Methode gegenüber der phänotypischen Resistenzbestimmung, ist die komplexere Interpretation des Resistenzbefundes. Vorteile sind der geringere Zeitaufwand und niedrigere Kosten.
Die Ablauf der genotypischen Resistenzbestimmung iim einzelnen ist für den TrueGene HIV-Assay (Visibile Genetics, jetzt Fa. Bayer) in Kapitel 3.7 beschrieben.
1.6.4 Resistenzmutationen
Zur Beschreibung von Mutationen in der Protease oder Reversen-Transkriptase Region wird ein spezielles System verwendet. Es basiert auf dem Vergleich der sich aus der Nucleotidabfolge ergebenden Aminosäuresequenz der untersuchten Genabschitte mit der Wildtyp-Referenzsequenz. Diese stammt aus dem „Los Alamos National Laboratory“.
Findet man in der untersuchten Probe eine Veränderung gegenüber der erwarteten Wildtyp-Nukleotidsequenz, wird der Ort der Veränderung (z.B. Kodon 184) sowie die Art der Veränderung (z.B. Methionin → Valin) notiert. Wenn zum Beispiel an Kodon 184 der Genotyp von ATG zu GTG mutiert, würde später in die Aminosäurekette statt Methionin Valin eingebaut und die Mutation als M184V beschrieben werden.
Häufig werden Mutationen, die direkt eine pharmakologische Resistenz bewirken, als primär oder „major“ Mutation bezeichnet und andere, die ihre Wirkung nur durch das Zusammenspiel mit anderen Mutationen oder durch Einflußnahme auf die virale Fitness entfalten, als sekundär oder „minor“ beschrieben.
Es existieren zwei biochemische Mechanismen für die Entwicklung von NRTI Resistenzen. Der erste Resistenzmechanismus wird ermöglicht durch Mutationen, die der RT erlauben, NRTIs von „natürlichen“ Nucleotiden abzugrenzen, so dass die NRTIs nicht mehr in den wachsenden DNS Strang integriert werden40. Viren, die von diesem Mechanismus Gebrauch machen, weisen in vitro eine verminderte enzymatische Replikation auf.
Einleitung
Andere Mutationen führen dazu, dass die Reverse-Transkriptase (RT) bereits eingebaute „falsche“ Nucleotide wieder aus dem neu synthetisierten DNS Strang entfernt und anschließend die Transkription normal weiter führt41. Für diesen Schritt benötigt die RT Adenosintriphosphat (ATP) als Phosphatträger.
Mutationen in der hydrophoben Bindungsregion, an die die NNRTIs normalerweise binden, bewirken, dass diese Pharmaka die Struktur der RT nicht mehr verändern können und führen so zu einer Resistenz gegenüber diesen Wirkstoffen42. Ein besonderes Problem hierbei ist, dass einzelne Mutationen in der Bindungsregion häufig zu einer Resistenzentwicklung gegenüber allen drei NNRTIs führen.
Resistenzen gegenüber PIs entwickeln sich durch Mutationen im Substratbindungsspalt der viralen Protease. Hierdurch wird die Bindungsaffinität gegenüber PIs herabgesetzt. Allerdings müssen noch weitere Mutationen an anderen Stellen dieses Enzyms auftreten, um eine direkte Resistenz gegen PIs zu ermöglichen. Die Notwendigkeit des Auftretens verschiedener Mutationen, um eine Resistenz hervorzurufen, wird als „genetische Barriere“ bezeichnet43.
Bereits jetzt zwingen Resistenzmutationen die behandelnden Ärzte oft zur Umstellung der antiretroviralen Therapie. Weitere Schwierigkeiten bereitet das Auftreten multipler Resistenzen innerhalb einer Viruspopulation, da hierdurch die Zahl der real zur Verfügung stehenden antiretroviral wirksamen Medikamente weiter reduziert wird.
Es ist damit zu rechnen, dass sich diese Problematik verstärkt, da durch Zunahme der mit HAART längerfristig behandelten Patienten die Zahl der Neuinfektionen mit sich unter HAART entwickelten Resistenzmutationen steigen wird.
Zwar treten diese mutierten Virussubpopulationen aufgrund ihrer dem Wildtyp gegenüber oft verminderten Replikationsfähigkeit unter Wegfall des Selektionsdrucks der HAART in den Hintergrund, setzen sich jedoch bei Aufnahme der Therapie schnell wieder gegen den Wildtyp durch.
Einleitung
1.7 Chemokinrezeptoren
HIV benötigt neben dem CD4 Rezeptor weitere Corezeptoren, um eine Fusion mit der Wirtszelle einzugehen. Diese Chemokinrezeptoren gehören zur Familie der G- Proteingekoppelten Moleküle mit sieben transmembranen Domänen. Sie werden anhand der Affinität für ihre spezifischen Liganden bzw.Chemokine in vier unterschiedliche Gruppen eingeteilt, C-, CC-, CXC- und CX3C-Rezeptoren.
Die bei der HIV-Infektion wichtigsten Corezeptoren sind CCR5 und CXCR4. Die natürlichen Liganden von CCR5 sind die CC-Chemokine RANTES, MIP-1α und MIP- 1β.
Als genetische Variante des CCR5, welcher auf Monozyten und Makrophagen vorkommt, wurde mit einer Häufigkeit von 10-20% in der kaukasischen Population eine Deletion von 32 Basenpaaren innerhalb des Rezeptorgens identifiziert. Diese genetische Variante führt dazu, dass der veränderte Rezeptor nicht an der Zelloberfläche exprimiert wird.
Die Frequenz von homozygoten Genträgern dieser Deletion in einer kaukasischen Population beträgt ca. 1 %. Heterozygote Merkmalsträger zeigen in vitro eine um 70 - 75% verminderte Expression von CCR5 auf der Zelloberfläche und finden sich in vivo gehäuft in Kollektiven von HIV-infizierten Langzeitüberlebenden.
In verschiedenden klinischen Studien wird die Auswirkung der heterozygoten CCR5 32 Basendeletion unterschiedlich beschrieben. Einige Studien legen für Merkmalsträger nicht nur eine verminderte Transmissionsrate, sondern auch eine verlangsamte Progression zum Vollbild AIDS, ein verbessertes Ansprechen auf HAART sowie eine verminderte Lymphominzidenz nahe. Andere Studien erkennen weniger oder keine positiven Einflüsse. Inzwischen geht man nach vorherrschender Meinung davon aus, dass eine verminderte Rezeptordichte von CCR5 an der Zelloberfläche nicht nur in vitro, sondern auch in vivo einen positiven Einfluß auf die Krankheitsentwicklung der HIV-Infektion hat.
CCR2b ist ebenfalls ein HIV-1 Corezeptor. Neben CCR5 wird auch der CCR2 I64 Polymorphismus mit positiven Einflüssen auf den Krankenheitsverlauf assoziiert. Er tritt mit einer Frequenz von etwa 17% in der europäischen Bevölkerung auf und findet sich bei Patienten mit afrikanischer Abstammung mit einer Häufigkeit von ca. 28%44. Sein natürlicher Ligand ist das MCP-1.
Zielsetzung der Arbeit
2 Zielsetzung der Arbeit
In verschiedenen Studien wird versucht, Prognosefaktoren für den Verlauf einer HIV- Infektion zu finden. Obwohl bereits eindeutige Zusammenhänge zwischen bestimmten Parametern, wie beispielsweise der Helferzellzahl und dem Verlauf der Infektion festgestellt werden konnten, ist oft noch unklar, warum trotz gleicher Standardparameter das Therapieansprechen und Krankheitsverlauf bei verschiedenen Patienten völlig unterschiedlich ist. Es liegt nahe zu vermuten, dass neben beispielsweise Helferzellzahl, Viruslast und Koinfektionen sowohl Veränderungen des Virus selbst als auch Unterschiede im Genom des Infizierten, eine grosse Rolle spielen. In dieser Arbeit soll der Zusammenhang zwischen Genomveränderung des Virus einerseits, Polymorphismen der zur Virus-Zellfusion benutzten CC-Rezeptoren 5 und 2 andererseits, sowie dem Therapieverlauf analysiert werden.
Hierzu wurden Patienten mit diagnostizierter HIV-Infektion ausgewählt, die zur Kontrolle der Infektion eine antiretrovirale Therapie (ART) erhalten. Von diesen Patienten sollten Plasmaproben analysiert werden, die unmittelbar vor Beginn der ART entnommen wurden. Dies ist notwendig, um von einer möglichst nicht vorselektionierten Viruspopulation ausgehen zu können.
Besondere Bedeutung soll hierbei den ersten sechs Monaten der hochaktiven antiretroviralen Therapie zugemessen werden, da Unterschiede im Therapieansprechen in diesem Zeitraum am genauesten zu erfassen sind.
Von diesen Experimenten sind Erkenntnisse für eine bessere Prognose der Infektion zu erhoffen.
Material und Methoden
3 Material und Methoden
3.1 Material 3.1.1 Geräte
Autoklav Fa. Jürgens; Willich
Cobas-Amplicor Fa. Hoffmann-La Roche, Mannheim
Elektrophoresekammern Fa. BioRad; USA
Durchflußzytometer (FACSCalibur) Fa. Becton Dickinson, San Jose, USA Long Read Gel Toaster Fa. Visible Genetics, Toronto, Kanada Gel-Dokumentationsanlage Fa. Konrad Bender, Wiesloch
Pipetten Fa. Eppendorf, Hamburg
Sequenzierer Fa. Visible Genetics, Toronto, Kanada
Thermocycler Fa. Biometra, Göttingen
Thermoblock Fa. Neolab, Heidelberg
Tischzentrifuge Fa. Eppendorf, Hamburg
Vortexer Fa. IKA Works INC, Wilmington, USA
Zentrifuge Fa. Heraeus Sepatech, Osterode
3.1.2 Verbrauchsmaterial
Röhrchen (5 ml, 15 ml, 50 ml) Fa. Greiner, Frickenhausen Zellkulturflaschen (10 ml, 50 ml) Fa. Greiner, Frickenhausen 96-well Spitzbodenplatten Fa. NUNC, Wiesbaden Pipettenspitzen (Filter) Fa. SARSTEDT, Nümbrecht Pipettenspitzen (10 µl, 100 µl) Fa. Greiner, Frickenhausen
Serummonovetten Fa. SARSTEDT, Nümbrecht
EDTA-Monovetten Fa. SARSTEDT, Nümbrecht
Material und Methoden
3.1.3 Chemikalien, Lösungen, Enzyme
Agarose Fa. Invitrogen, Paisley, UK
Ethidiumbromid Fa. Sigma, St. Luis, USA
Ethanol Zentralapotheke, MHH
Bromphenolblau Fa. Qiagen; Hilden
10 * TBE-Puffer
• Tris Fa. Sigma, St. Luis, USA
• Borsäure Fa. Merck, Darmstadt
• EDTA Fa. Sigma, St. Luis, USA
DNTP Fa. Qiagen; Hilden
Oligonukleotide Fa. Qiagen; Hilden
Q-solution Fa. Qiagen; Hilden
PCR Puffer Fa. Qiagen; Hilden
TaqDNA Polymerase Fa. Qiagen; Hilden
BSA BI Fa. Qiagen; Hilden
ECO RI Fa. Qiagen; Hilden
HINCII Fa. Qiagen; Hilden
3.1.4 Kit-Systeme
QIAamp® DNA Blood Mini Kit Catalog no. 51106 Qiagen
• „QIAamp spin Columns“
• Sammelröhrchen (collection tubes) (2ml)
• Puffer AL
• Puffer ATL
• Puffer AW1
• Puffer AW2
• Puffer AE
• QIAGEN® Protease
QIAamp® RNA Blood Mini Kit Catalog no. 52304 Qiagen
• QIAamp Spin Columns
• QIAshredder Spin Columns
Material und Methoden
• Collection tubes (1,5 ml)
• Collection tubes (2.0 ml)
• Puffer EL
• Puffer RLT
• Puffer RW1
• Puffer RPE
• RNase-freies Wasser
Truegene HIV-1 Genotyping Kit Bayer
• dNTP
• DDT
• RNase-Inhibitor
• PCR-Puffer
• Clip-Puffer
• RT-Enzym
• DNA-Polymerase
• Ampli Taq FS
• Stop-loading dye
3.2 Studienaufbau
Alle Daten dieser retrospektiven Studie wurden von 2001 bis 2003 gesammelt und stammen von Patienten, die in der Immunologischen Ambulanz II der Medizinischen Hochschule Hannover betreut werden. In die Studie eingeschlossen wurden nur HIV- positive Patienten mit erstmaliger antiretroviraler Therapie. Während des Kontrollzeitraumes wurde alle vier Wochen aus zum gleichen Zeitpunkt entnommenen Blutproben die Viruslast gemessen und die Verteilung der Lymphozytensubpopulationen bestimmt.
Die Studie umfasst gemäß ihrer Zielsetzung zwei Patientenkollektive. Im ersten Kollektiv, bestehend aus 77 Patienten, wurden Resistenzmutationen analysiert und ihre Auswirkung auf die antiretrovirale Therapie betrachtet. Die Therapieantwort in den ersten sechs Monaten konnte bei allen Patienten ausgewertet werden. Eine längerfristiges Therapieansprechen, im Mittel 26 Monate, konnte bei 74 Patienten
Material und Methoden
analysiert werden. Bei den drei fehlenden Patienten erfolgte, aufgrund von Therapieunterbrechungen, keine Analyse des längerfristigen Verlaufs. Die Zeit bis zum Erreichen der viralen Suppression wurde definiert als der Abstand zwischen der Viruslastbestimmung zu Beginn der Therapie und der ersten von zwei aufeinanderfolgenden Messungen mit einem Mindestabstand von 14 Tagen, die eine Viruslast von weniger als 50 Kopien pro ml ergab.
Im zweiten Kollektiv lag der Fokus auf der Analyse von Corezeptorpolymorphismen und ihren Auswirkungen auf die ersten sechs Monate der Therapie. Hierfür wurden Daten von 103 Patienten analysiert.
3.3 Proben
Mit Einwilligung der HIV-infizierten Patienten wurden ihnen für die Untersuchungen eine 7,5 ml EDTA Monovette für die Viruslastbestimmung sowie eine 2,7 ml EDTA Monovette für die Bestimmung der Helferzellzahl und der DNS Isolation abgenommen.
Die Isolation des Blutplasmas erfolgte durch Zentrifugation der Vollblutprobe und Abpipettieren des Überstands. Die Plasmaprobe wurde in 2-3 Aliquots von 500 µl bis 1 ml bei –80° C eingefroren.
Die DNS, die zur Bestimmung des CC-Rezeptor Genotyps diente, wurde direkt aus der Vollblutprobe isoliert und anschließend bei –20° C gelagert. Zur Analyse wurde das Patientenmaterial in dieser retrospektiven Studie der Serumdatenbank, Genehmigungsnummer 3206 der Ethikkommission, entnommen.
3.4 Helferzellbestimmung
Die Bestimmung der Lymphozytensubpopulationen erfolgte mit Hilfe der Durchflusszytometrie (engl. fluorescence-activated cell sorter) (FACS). Bei dieser Methode verwendet man fluoreszenzmarkierte monoklonale Antikörper, die an Zellstrukturen wie beispielsweise den Oberflächenrezeptor CD4 binden. Für die Analysen wurden die Fluoreszenzfarbstoffe Phycoerytrin (PE), Fluorescein- Isothiocyanat (FITC) und Allophycocyanin (APC) benutzt. Durch Detektion von
Material und Methoden
Zellgröße (Forwardscatter/FSC) und Granularität (Sidewardscatter/SSC) können zunächst verschiedene Zellpopulationen wie Granulozyten, Lymphozyten, Monozyten voneinander abgegrenzt werden. Die via Antikörper gebundenen Fluoreszenzfarbstoffe ermöglichen es nun, bestimmte Zellstrukturen sichtbar zu machen und auf einer logarithmischen Skala zu quantifizieren, um beispielsweise verschiedene Zellsubpopulationen voneinander unterscheidbar zu machen.
3.5 Viruslastmessung
Die quantitative Bestimmung der Viruslast im Plasma erfolgte im Labor mittels des COBAS AMPLICOR. Bei diesem Test werden per Polymerasekettenreaktion (PCR) virale RNA Fragmente vervielfältigt. Die Konzentration der HIV-RNA Kopien in der Probe wird dann optisch über den Vergleich ihrer Extinktion und eines Quantifizierungsstandards bestimmt. Schließlich wird mittels des Extinktionswerts die Belastung des Patientenblutes mit HIV errechnet und der Wert als (RNS) Kopien pro ml angegeben. Die obere Sensitivitätsgrenze dieses Test liegt bei 750000 Kopien pro ml, die untere bei 50 Kopien pro ml (c/ml).
3.6 RNS-Isolierung
Die Isolation von RNS erfolgt laut Herstellerprotokoll aus Vollblut mittels des QIAamp RNA Blood Mini Kit (Qiagen).
Zunächst wird das Vollblut zur Lyse im Verhältnis 1:5 mit einem Lyse-Puffer (EL) auf Eis für 10-15 min inkubiert. Während der Inkubation wird die Probe zur besseren Lyse zweifach aufgemischt.
Nach der Inkubation wird die Probe für 10 min bei bei 4° C mit 400 g zentrifugiert und der Überstand dekantiert. Anschließend wird erneut der Lyse-Puffer, diesmal im Verhältnis zwei zu eins, hinzugefügt und es erfolgt ein weiterer Zentrifugationsschritt.
Nach Abnahme des Überstands wird das Pellet in 350 µl Lyse-Puffer (RLT) resuspendiert, in ein Zentrifugationsröhrchen überführt und zwei Minuten mit 20.000 g abzentrifugiert. Die Zentrifugationsröhrchen enthalten eine Säulenmatrix, durch die die Probe filtriert wird und in der je nach Arbeitschritt verschiedene Bestandteile der Probe, z.B. Zellüberreste oder RNS, zurückgehalten werden. Nach den Lyseschritten
Material und Methoden
wird die Säulenmatrix verworfen, das Lysat mit 350 µl Ethanol versetzt und in ein weiteres Zentrifugationsröhrchen transferriert. Durch die Zugabe von Ethanol erfolgt die Bindung der RNS an die Säulenmatrix. Nach einer Zentrifugation von 15 s bei 8000 g erfolgen zwei weitere Zentrifugationsschritte mit jeweils 700 µl und 500 µl der Waschpuffer RW1 und RPE. Hierbei wird nach jedem Schritt die Säulenmatrix in ein neues Zentrifugationsröhrchen eingebracht und das Filtrat verworfen.
Anschließend erfolgt ein letzter Waschschritt mit 500 µl RPE Puffer für drei Minuten bei 20000 g.
Zur Elution wird die Säulenmatrix in ein neues Zentrifugenröhrchen transferiert und 50 µl RNase freies Wasser direkt auf die Matrix pipettiert und eine Minute bei 8000 g zentrifugiert.
3.7 Genotypische Resistenzanalyse
Die genotypische Resistenzanalyse wird mittels des TrueGene HIV-Assays laut Herstellerprotokoll (Visibile Genetics, jetzt Fa. Bayer) durchgeführt.
Für die Analyse werden für jede Probe eines Patienten vier 0,2 ml PCR Reagenzgefäße (tubes)und zusätzlich je ein 0,2 ml Reagenzgefäß für Negativ-und Positiv-Kontrolle benötigt. Zu Beginn werden in jeweils einem auf Eis ruhenden sterilen 0,5 ml Reagenzgefäß der RT-Master Mix I und II für die RT-PCR gemischt.
Master Mix I (MMx I): Beispiel für 6 Proben
RT-PCR Primer 40,60 µl
dNTP Lösung 10,14 µl
DTT Lösung 6,76 µl
RNase Inhibitor 3,38 µl
Nach Erstellen des MMx I werden 9 µl des Gemischs in jedes der 0,2 ml PCR Tubes pipettiert und diese auf Eis gelagert.
Master Mix II (MMx II): Beispiel für 6 Proben
RT-PCR Buffer I 67,60 µl
RNase Inhibitor 3,38 µl
RT-Enzym 6,76 µl
DNA-Polymerase 16,88 µl
Material und Methoden
In jedes Probengefäß werden 9 µl des MMx I vorgelegt und jeweils 17 µl der isolierten viralen RNA hinzugefügt. Hierbei ist darauf zu achten, dass nacheinander immer nur eine PCR-Tube geöffnet ist und nach jedem Mischvorgang die Pipettenspitze gewechselt wird.
Nachdem die Proben in den auf 90° C vorgewärmten Thermocycler gestellt wurden, wird dieser mit folgendem Programm gestartet:
1 Durchlauf mit 20 Durchläufe 17 Durchläufe 1 Durchlauf 90°C für 2min 94°C für 30 sec 94°C für 30 sec 68°C für 7 min
50°C für 60min 57°C für 30 sec 60°C für 30 sec 4°C (Endtemperatur) 94°C für 2min 68°C für 2 min 68°C für 2,5 min
Nach 5 min wird jeder Probe 14 µl des MMx II hinzugegeben. Die PCR Produkte können abgedunkelt für maximal 24 Stunden bei 4° C gelagert werden.
In eine 96 well Platte, die nach dem unten gezeigten Schema arrangiert ist, werden auf den Boden der wells 7µl Clip terminatior mix gebracht.
Protease 2 A C G T
RT-Beginning A C G T
RT Middle A C G T
Je 4 µl des RT-PCR Produkts werden mit 71 µl des Clip Master Mix gemischt und jeweils 5 µl des Gemischs in die jeweiligen Vertiefungen der 96 well Platte pipettiert und die Reaktion gestartet.
Clip Master Mix (6 Proben) Clip Puffer 90,0 µl Steriles Wasser 354,0 µl Ampli Taq FS 16,8 µl
Ein Durchlauf 30 Durchläufe ein Durchlauf 94°C für 20 sec 70°C für 5 min
94°C für 5 min 56°C für 20 sec 4°C (Endtemperatur) 70°C für 1,5 min
Material und Methoden
Nach Ablauf des Thermocyclerprogramms wird die Reaktion durch Zugabe des stop loading Dye beendet. Anschließend wird die Probe bei 90°C für 2 min denaturiert.
In die Gelkammer des „Long-Read Tower Sequencer“ wird jetzt das im Long Read Gel Toaster vorbereitete Elektophoresegel eingespannt und die Kammer mit TBE- Puffer aufgefüllt.
Das Sequenzierprogramm wird gestartet und 1,8 µl der Probe aus jeder Plattenvertiefung (engl. well)in die entsprechende Geltasche gefüllt.
Die im Clip-Terminator-Mix enthaltenen fluoreszenzmarkierten didesoxy- Nukleotidtriphosphate (ddNTP)s führen in der PCR bei ihrem Einbau zum Abbruch der wachsenden DNS Kette. Diese Terminatoren werden nun anstelle des richtigen Nucleotids eingebaut (A→A‘). Da dieser Einbau zufällig erfolgt, entstehen unterschiedlich lange DNS Sequenzen.
Bsp: Adenosin Position 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1) G C T C A G T C A‘
2) G C T C A‘
3) G C T C A G T C A G G A‘
Gesamt: A A A
Die ddNTPs sind mit verschiedenen Farbstoffen markiert, welche bei unterschiedlichen Wellenlängen fluoreszieren. Die Didesoxynukleotide am 3`Ende der Fragmente dienen als Markierungen, die vom Laserstrahl angeregt werden, und so detektiert werden können. Der Sequenzer unterscheidet die vier verschiedenen ddNTPs aufgrund der detektierten Wellenlänge und errechnet anhand der unterschiedlich langen Fragmente die komplette Basenabfolge. Sequenziert werden Teile des Protease- und des Reverse- Transkriptase-Gens. Die Basensequenz der Probe wird anschließend mit der Viruswildtypsequenz verglichen. Bei Veränderungen der Kodons werden diese in der genannten Form aufgeschrieben. (Bsp: M184V)
3.8 DNS-Isolation
Die Isolation von DNS erfolgte laut Herstellerprotokoll aus Vollblut mittels des QIAamp DNA Blood Mini Kit (Qiagen).
Material und Methoden
Zunächst werden in einem 1,5 ml Reaktiongefäß, zur Erythrozytenlyse 200 µl Vollblut mit 20 µl Proteinase K und 200 µl Lyse-Puffer (AL) bei 56° C für 10 min inkubiert.
Nach der Inkubation wird die Probe in ein Zentrifugenröhrchen überführt.
Anschließend erfolgen drei Zentrifugationsschritte. Während die Lösung abfiltiert wird, bindet die doppelstrang (ds) DNS an die Säulenmatrix des Zentrifugationsröhchrens. Der erste Zentifugationsvorgang erfolgt zur Fällung der Nukleinsäuren unter Zugabe von 200 µl Ethanol (96%). Anschließend erfolgen zwei Waschschritte mit 500 µl Waschpuffer (AW1, AW2). Die Zentrifugenbeschleunigung der beiden ersten Schritte liegt bei 6000 g für eine Minute, die des letzten bei 20000 g für drei Minuten. Zur Elution der DNS werden 200 µl Elutionspuffer (AE) auf die Säulenmatrix pipettiert. Nach dreiminütiger Inkubation wird die DNS mit 6000 g für eine Minute abzentrifugiert.
Letztendlich enthält das Isolat durchschnittlich 6 µg DNS in 200 µl Lösung.
3.9 Polymerasekettenreaktion zur Bestimmung der CCR Polymorphismen
Die PCR ist eine Methode zur in vitro Amplifikation von DNS, die auf der Eigenschaft der DNS-Polymerasen beruht, DNS zu duplizieren. Es werden jeweils zwei spezifische Oligonukleotide benutzt, die komplementär zu der Sequenz der zu vervielfältigenden DNS-Region und in ihrer Orientierung zueinander ausgerichtet sind.
Zu Beginn der PCR wird der Matrizenstrang bei 95°C denaturiert. In der anschließenden Hybridisierungs-Phase binden die Oligonukleotide an die nun einzelsträngigen DNA-Abschnitte. Die Polymerasen synthetisieren ausgehend von den Oligonukleotiden komplementäre Stränge. Durch Wiederholung dieses Zyklus kommt es zu einer expontentiellen Amplifikation der entsprechenden DNA Abschnitte.
Der für die Corezeptorpolymorphismen benötigte Master-Mix enthält eine hitzestabile Taq-Polymerase, Desoxynucleotide, Oligonucleotide und Puffer. Die für die Bestimmung des CCR5 und CCR2 Polymorphismus verwendeten Master-Mix unterscheiden sich in den verwendeten Oligonukleotiden.
Material und Methoden
Master Mix (Beispiel für 16 Proben):
H2O 531 µl 10*PCR Puffer 90 µl 5* Q-Solution 180 µl dNTP Mix 36 µl Oligo Mix 18 µl Taq-Polymerase 9 µl
3.10 Restriktionsverdau
Mit Hilfe von Restriktionsendonukleasen kann doppelsträngige DNS an spezifischen definierten Sequenzabschnitten gespalten werden. Die PCR-Produkte für die Analyse der Corezeptorpolymorphismen werden mit Hilfe solcher Endonukleasen geschnitten. Diese erkennen die bei den Polymorphismen vorliegende veränderte Basenabfolge der für die Corezeptoren codierenden Genabschnitte und spalten den DNA-Strang an diesen Stellen.
Verdau: ( Beispiel für 16 Proben)
H2O 30,6 µl
10*Puffer 3,6 µl
BSA BI (für CCR5) 1,8 µl HINC II (fürCCR2) 1,8 µl
Zu jeweils 2 µl des Gemischs werden 25 µl PCR-Produkt hinzugefügt. Die Inkubation erfolgt bei 37° C für 60 min.
Anschließend werden die Proben, unter Zusatz von Bromphenolblau als optischer Marker der Laufstrecke, in die Geltaschen eines 2 % Agarosegels eingebracht.
Die Elektrophorese wird bei Raumtemperatur für ca. 60 Minuten bei einer Spannung von 90 Volt durchgeführt.
Die DNS wandert mit einer der Fragmentgröße entsprechenden Geschwindigkeit in Richtung der Anode. Durch die unterschiedliche Wandergeschwindigkeit werden die Fragmente voneinander getrennt. Nach Ende der Elektrophorese wird das Gel in einer ethidiumbromidhaltigen Lösung gefärbt. Das Ethidiumbromid interkaliert in die Doppelhelix der DNS Moleküle und lässt sie so unter UV-Licht sichtbar werden.
Material und Methoden
Während die amplifizierte DNS des Wildtyprezeptors nicht durch die spezifischen Endonukleasen geschnitten wird und sich so als einzelne Bande im Elektophoresegel darstellt, werden die Polymorphismen enthaltenden DNS Abschitte gespalten und es treten statt einer DNS Bande gemäß dem Wildtyp zwei Banden für den CCR2 I64 Polymorphismus und drei Banden für die CCR5 32 Deletion in Erscheinung.
3.11 Statistische Methoden
Der Vergleich von Messwerten bei zwei verschiedenen Gruppen erfolgte jeweils mit Hilfe des t-Test für unverbundene Stichproben.
Für die Analyse der Therapieantwort der verschiedenen Gruppen wurde Pearsons Chi Quadrat Test und der Kruskal-Wallis Test benutzt, beim Vergleich einzelner Gruppen wurde der Mann-Whitney Test verwendet. Der Vergleich zweier verschiedener Einflussfaktoren erfolgte durch univariante lineare Regressions- analyse.
Die Signifikanzgrenze wurde auf p < 0,05 festgesetzt.
Die Analysen erfolgten durch die Computerprogramme GraphPad Prism 4.00, Microsoft EXEL und StatXact-5.0.3.
Die Auswahl der statistischen Tests und Berechnung erfolgte unter Mithilfe von Herrn Vaske (Institut für Biometrie der Medizinischen Hochschule Hannover).
Ergebnisse
4 Ergebnisse
Die Arbeit analysiert zwei Patientenkollektive mit unterschiedlichen Zielsetzungen.
Der Schwerpunkt im ersten Patientenkollektiv lag in der Erfassung und Analyse von Mutationen des HI-Virus in den für die Medikamentenwirksamkeit entscheidenden Genen der Protease und der Reversen Transkriptase sowie der Einflußnahme dieser Mutationen auf die Therapie.
Im zweiten Patientenkollektiv lag der Schwerpunkt in der Analyse des Einflusses der natürlichen Polymorphismen des CCR5 und des CCR2, die von HIV als Corezeptoren für die Fusion mit der Zielzelle benutzt werden.
4.1 Patientenkollektiv I
Das erste Kollektiv setzte sich aus 66 Männern und elf Frauen zusammen. Der Altersdurchschnitt betrug 43 Jahre. Der jüngste Patient war zum Zeitpunkt der Datenerhebung 23, der älteste 74 Jahre alt. Die antiretrovirale Therapie wurde bei allen Patienten im Zeitraum von 1998 bis Ende 2002 initiiert. Unmittelbar vor Beginn der Therapie lag die Anzahl der Helferzellen im Durchschnitt bei 238 Zellen pro µl Vollblut.
Als durchschnittliche HIV-RNA Plasmakonzentration wurde ein Wert von 5,02 log10 c/ml ermittelt.
Die Analyse dieses Kollektivs gliedert sich in drei Hauptabschnitte mit jeweils zwei Teilabschnitten.
Im ersten Hauptabschnitt werden alle Mutationen gegenüber dem Wildtyp an resistenzrelevanten Positionen des HI-Virus gemeinsam betrachtet. Hierzu zählen die „major“ Resistenzmutationen, akkzessorische Mutationen und Polymorphismen der Protease sowie typische und atypische Mutationen an resistenzrelevanten Positionen der Reversen Transkriptase. (Kapitel 4.1.1 und 4.1.5)
Im zweiten Hauptabschnitt erfolgt ausschließlich eine Analyse der primären (major) Resistenzmutationen. (Kapitel 4.1.2 und 4.1.6)
Im dritten Hauptabschnitt werden jene Resistenzmutationen getrennt analysiert, deren Auftreten zu einer direkten Einschränkung der Wirksamkeit antiretroviraler Pharmaka führt. (Kapitel 4.1.3 und 4.1.7)
Ergebnisse
In den Teilabschitten werden zuerst jeweils die gefundenen Mutationen beschrieben, im zweiten Teilabschnitt wird dann ihre Auswirkung auf das Ansprechen auf die antiretrovirale Therapie analysiert.
4.1.1 Frequenz der Mutationen in Protease und Reverser Transkriptase
Im ersten Teil werden zunächst die Veränderungen gegenüber dem Wildtypvirusgenom beschrieben. Hierbei werden auch akzessorische Mutationen und Polymorphismen in der Protease Region und unerwartete Mutationen an resistenzrelevanten Positionen in der RT Region berücksichtigt.
In lediglich fünf (6%) der 77 analysierten Patientenproben lag das Virusgenom in den sequenzierten Bereichen komplett unverändert vor. In 18 (23%) Patienten fand sich jeweils eine einzelne Veränderung. 47 (61%) Virusstämme wiesen zwei oder drei verschiedene Mutationen oder Polymorphismen in den sequenzierten Regionen auf.
Vier Wildtypaberrationen wurden bei vier (5%) Virussequenzen festgestellt. Bei den verbliebenen drei Patienten war das Virus gegenüber dem Wildtyp an mehr als fünf Stellen verändert. Siehe Abbildung 1.
Abb 1: Ergebnisse des genotypischen Resistenztests. Die Abbildung zeigt die Einteilung der Patienten in verschiedene Gruppen je nach Anzahl der in Protease und Reverser Transkriptase gefundenen Mutationen. Die dargestellten Mutationen umfassen primäre und sekundäre PI Mutationen und Polymorphismen und typische sowie atypische Mutationen an resistenzrelevanten Positionen der Reversen Transkriptase.
0 Mutationen 1 Mutation 2 Mutationen 3 Mutationen 4+ Mutationen
7 5
18
24 23
Ergebnisse
Im Allgemeinen waren Mutationen im Bereich des Proteasegens häufiger als Veränderungen in der Reversen Transkriptase. Dies ist besonders auf die verschiedenen Polymorphismen der Protease zurückzuführen (z.B.: M36I, L63P).
Während in 53 (69%) Proben keine einzige Veränderung der Reversen Transkriptase gefunden wurde, war dies in nur sieben Protease-Sequenzen der Fall. Vier (5%) Rt- Sequenzen gegenüber 48 (62%) aller Protease-Sequenzen wiesen zwei oder mehr Mutationen beziehungsweise Polymorphismen auf. Siehe Abbildung 2a/b.
Abb 2a: Ergebnisse des genotypischen Resistenztests. Die Abbildung zeigt die Einteilung der Patienten in verschiedenene Gruppen je nach Anzahl der in der Protease gefundenen Mutationen. Die dargestellten Mutationen umfassen primäre und sekundäre PI Mutationen und Polymorphismen.
0 Mutationen 1 Mutation 2 Mutationen 3 Mutationen 4 Mutationen 5 Mutationen 15
2 1
7
22
30
Ergebnisse
Abb 2b: Ergebnisse des genotypischen Resistenztests. Die Abbildung zeigt die Einteilung der Patienten in verschiedenene Gruppen je nach Anzahl der in der Reversen Transkriptase gefundenen Mutationen. Die gezeigten Mutationen umfassen typische sowie atypische Mutationen an resistenzrelevanten Positionen der reversen Transkriptase.
0 Mutationen 1 Mutation 2 Mutationen 3 Mutationen 4 Mutationen 5 Mutationen
20 3 1
53
Ergebnisse
Das Kodon L63 war die am häufigsten veränderte Position der Protease-Region. 35 (45%) Isolate wiesen den Polymorphismus L63P auf. Ihr folgten Änderungen der Aminosäuren I93 und M36. Vor allem traten hier die Polymorphismen I93L und M36I in 17 (33%) und 30 (39%) der Proben in den Vordergrund. In zehn (13%) Proben fand sich eine Veränderung der Position L10.
Alle übrigen Positionen der Protease-Region wiesen in weniger als 10%
Veränderungen auf.
In der RT-Sequenz war die Position V179 am häufigsten verändert. Dies ist vor allem durch den Polymorphismus V179I bedingt, der in vier (5%) Patienten gefunden wurde.
Eine genaue Zusammenstellung der aufgetretenen Veränderungen gegenüber dem Wildtyp findet sich in Tabelle1
Tabelle 1
Mutationen im Protease Gen
Mutationen im RTI Gen
Position Verändert (n) Position Verändert (n) Position Verändert (n)
L 10 10 A 98 1 M 41 2
K 20 7 L 100 1 E 44 5
L 33 4 K 101 1 T 69 1
M 36 31 K 103 2 V 118 3
M 46 2 V 106 1 M 184 1
I 47 1 V 179 7 T 215 4
L 63 59
A 71 6
V 82 4
I 93 19
4.2.2 Resistenzmutationen
Die Interpretation und Klassifikation der Mutationen erfolgte gemäß der Stanford HIV Drug Resistance Database45. In den sequenzierten Proben fanden sich bei drei Patienten in der Protease-Region „major“ Resistenzmutationen. Die Mutationen M46I, M46L und I47M traten jeweils einzeln bei einem Patienten auf.
In der Reversen Transkriptase-Region fanden sich bei vier (5%) verschiedenen Patienten die NNRTI Resistenzmutation K103N und dreimal die Resistenzmutation V179D.
Ergebnisse
Vier Patienten wiesen die Mutation T215I/S/D auf, die einen Übergang zwischen der Mutation T215Y/F und dem Wildtyp darstellt.. Sie bedingt eine AZT und D4T Resistenz.
Zusammenfassend fand sich bei 15 (19%) aller Patienten vor Einleitung der ersten antiretroviralen Therapie eine Resistenzmutation. (Siehe Tabelle 2)
Tabelle 2
Verteilung der „major“ Resistenzmutationen
n % Resistenzmutationen Alle Patienten 15 19
PI Mutationen 3 4 M46I, M46L, I47M,
NRTI Mutationen 9 12 E44D, T69N, V118I, M184V, NNRTI Mutationen 4 5 K103N, V179D
Umkehrmutationen 4 5 T215S, T215I
Multi-class 0 0
4.2.3 Auswirkung der Resistenzmutationen auf die Medikamentenwirksamkeit
Eine hohe (high-level) Medikamentenresistenz konnte in zwei Fällen beobachtet werden: Bei einem Patienten wurde die Mutation K103N gefunden, die eine hohe Resistenz gegen alle drei NNRTIs bedingt. In der RT-Sequenz eines anderen Patienten trat die Mutation M184V in Erscheinung. Durch diese Mutation wird eine hohe Resistenz gegen 3TC und eine eingeschränkte Wirksamkeit der Substanzen DDI, DDC und ABC bedingt (low-level resistance). Da bei diesem Patienten des weiteren die Mutation T215I vorlag, ergab sich eine weitere Wirkungseinschränkung der Pharmaka AZT und D4T.
Mittelgradige (intermediate) Pharmakaresistenz fand sich bei zwei Patienten.
Bei einem Patienten bedingte die Mutation M46I eine mittelgradige Resistenz gegen die Protease Inhibitoren APV und NFV und eine eingeschränkte Wirksamkeit aller anderen PIs.
Bei einem weiteren Patienten verursachte die Mutation T69N eine mittelgradige Resistenz gegen DDC, eine Wirksamkeitseinschränkung der Substanz DDI und eine mögliche Wirkungsverminderung von D4T.
Ergebnisse
Bei vier weiteren Patienten fand sich ebenfalls eine eingeschränkte Medikamentenwirksamkeit.
Beim ersten Patienten ergab sich durch die Mutation M46L eine Wirkungseinschränkung der Protease Inhibitoren APV und NFV. In drei weiteren Fällen verursachten die RT-Mutationen T215D/S eine Wirkungsverminderung von AZT. Zusammenfassend lag bei acht (10%) Patienten bereits vor Initiierung ihrer ersten hochaktiven antiretroviralen Therapie eine erniedrigte Wirksamkeit ein oder mehrerer antiretroviraler Pharmaka vor. Bei zwei Patienten aus diesem Kollektiv wurde zu diesem Zeitpunkt sogar eine hohe Medikamentenresistenz festgestellt.
In Tabelle 3 ist die Anzahl der Resistenzen gegen die verschiedenen antiretroviralen Wirkstoffe gezeigt.
Tabelle 3
Resistenz gegen antivirale Wirkstoffe (n= 77)
Protease Inhibitoren NNRTIs RTI
Resistenzlevel
niedrig mittel hoch niedrig mittel hoch niedrig mittel hoch
APV 1 1 0 DLV 1 0 1 3TC 0 0 1
ATV 1 0 0 EFV 1 0 1 ABC 1 0 0
IDV 1 0 0 NVP 1 0 1 AZT 5 0 0
LPV 1 0 0 D4T 1 0 0
NFV 1 1 0 DDC 1 1 0
RTV 1 0 0 DDI 2 0 0
SQV 1 0 0 TDF 0 0 0
Während es sich bei den NNRTIs außer in einem Fall ausschließlich um Kreuzresistenzen handelt und somit die Wirkstoffe dieser Gruppe etwa gleichhäufig und gleichschwer von Resistenzen betroffen sind, ergibt sich für die NRTIs und PI eine uneinheitliche Verteilung.
4.2.4 Immunologisches Therapieansprechen
Sechs Monate nach Therapiebeginn waren die Helferzellen im Mittel um 140 auf 378 Zellen pro µl angestiegen. Die Viruslast war im gleichen Zeitraum um 3,01 log auf 1,91 log c/ml abgefallen. Innerhalb dieser ersten sechs Behandlungsmonate fiel die Plasmaviruslast bei 58 Patienten (75%) unter die Nachweisgrenze von 50 c/ml
