Research Collection

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Doctoral Thesis

Extracellular matrix gene expression patterns are associated with longevity across species

Author(s):

Statzer, Cyril Publication Date:

2020-11-20 Permanent Link:

https://doi.org/10.3929/ethz-b-000475552

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ETH Library

Extracellular matrix gene

expression patterns are associated with longevity across species

A thesis submitted for the degree of Doctor of Science ETH Z¨ urich

(Dr. sc. ETH Zurich)

Presented by

Cyril Alexander Statzer

MSc ETH in Biology, Biological Chemistry major born 19.08.1990

citizen of Switzerland

Institute of Translational Medicine

Eidgen¨ ossische Technische Hochschule Z¨ urich

Accepted on the recommendation of Prof. Dr. Yves BARRAL

Prof. Dr. Collin Yv`es EWALD (supervisor) Prof. Dr. Gunnar R ¨ ATSCH

Dr. Mar´ıa RODR´IGUEZ MART´INEZ November 20, 2020

Diss.-No. ETH 27197

Abstract

Aging is accompanied by the progressive accumulation of damage both within cells and in the extracellular matrix (ECM), a meshwork of macro- molecules outside cells. Lifespan-extending interventions through either genetic alterations or environmental stimuli have been shown to activate protective mechanisms that repair intracellular damage. However, the mechanism of how extracellular proteins are protected or repaired remains mostly unknown. By analyzing publicly-available expression profiles com- paring long-lived to normal-lived animals, we identified a putative ECM- remodeling mechanism in C. elegans and M. musculus associated with longevity. Subsequently, we preformed a proteomic and transcriptomic analysis to validate the observed ECM expression pattern. To gain more precise insight into the specific roles of proteins located exclusively in the extracellular space, the so-called matrisome, we first annotated all genes that comprise the C. elegans matrisome, and subsequently com- pared matrisome-associated phenotypes across model organisms. To as- sess whether candidate matrisome genes are functionally required for C.

elegans longevity, we performed image-based lifespan measurements. The longevity assurance mechanism of the transcription factor (TF) HSF-1 was studied inC. elegans and of the TF ATF-4 in C. elegans and mouse.

Furthermore, a new method to quantify maximum muscle strength in C.

elegans, a key aging parameter, was developed using acoustophoretic force fields. Taken together, this work presents a system-level understanding of longevity, discovered a species-specific reprogramming of the ECM home- ostasis associated with prolonged survival and provides a new method to quantify maximum muscle health to translate scientific advances focused on lifespan extension towards increasing the time spent in good health.

Summary

Aging is the progressive decline of physiological function over time. This process is characterized by the accumulation of damage both within cells and in the extracellular matrix (ECM) of an organism. Several pro-longevity interventions including reduced Insulin/IGF1 signaling (rIIS), inhibition of target of rapamycin (TOR), dietary re- striction (DR) have been identified to delay aging and increase stress resistance across species. However, we currently lack an understanding of the shared regulatory pat- tern of these interventions, how complex protein structures like extracellular proteins are rejuvenated, and how increasing lifespan translates to maintaining good health longer.

In Chapter 3, the first section of the thesis, the methods utilized throughout all chapters are introduced. The setup of the automated lifespan measurement plat- form is described and the evolution of its reliability and output quality shown across improvement cycles. Furthermore, an experimental protocol was devised for imaging- based collagen turnover analysis and biochemical collagen quantification. Using the aforementioned protocol the collagen content ofC. elegans was determined as 11% of the total protein content.

Chapter 4 addresses the composition and function of the ECM across species. As a starting point, we defined theC. elegans matrisome by utilizing orthology and protein domain information and manual curation. TheC. elegans matrisome is comprised of 719 proteins which permanently reside in the extracellular space without being teth- ered to the plasma membrane. Combining the newly defined C. elegans matrisome with the matrisomes of H. sapiens, M. musculus, D. rerio, and D. melanogaster, we performed a comprehensive cross-species matrisome phenotype analysis. Unexpect- edly, our phenome analysis uncovered that muscle function was among the most evo- lutionary conserved matrisome functions across species, mostly governed by MSTN and LAMB2 and their orthologs. Even though the matrisome acts as an intercon- nected matrix, specific ECM phenotypes are dominated by specific primary actors.

We found atrophic scars to be heavily enriched for collagens, while transient ischemic attacks are preferentially associated with secreted factors, and abnormal bleeding is reported to be predominantly connected to ECM regulators.

Chapter 5 takes a broad approach to investigate all signaling changes underlying experimentally validated pro-longevity interventions for both nematodes and mam- mals. Here, we re-analyzed and compared publicly available transcriptional profiles ofM. musculus (1198) andC. elegans (408) to determine how longevity is ensured on

the transcriptional level. We identified the mammalian genesScd2, gsta4, hspa9 and Egfr, Ctsz, Spon2 to be consistently up-, respectively down-regulated with longevity.

InC. elegans, we identifiedhsp-12.3, sod-3, lys-2 to be predominantly over-expressed in longevity while vitellogenins (vit-1,4,5), fat-7, and dod-23 are repressed. Key net-upregulated pathways in longevity are cellular detoxification, NAD, and purine metabolism while cell growth is predominantly down-regulated. The ECM and inflam- mation response were found to be strongly down-regulated in mammalian longevity while they were up-regulated in the nematode model. This result could highlight the role of the inflammation in fibrosis in M. musculus which cannot be found in C.

elegans. To quantify changes in co-expression pattern we developed an open-source python package named integrated di↵erential network analyzer (INDIE).

In addition, we experimentally quantified the functional requirement of 40 matri- some and matrisome-associated proteins in rIIS-mediated longevity. We observed that over 50% of assessed matrisome-associated genes were, partially or strictly, required for longevity. Among the structural matrisome members most-required forC. elegans longevity were UNC-52 (HSPG2 ortholog), EPI-1 (LAMA5 ortholog), and SYM-1 (fibromodulin ortholog). Furthermore, the protease MIG-17 and the integrin subunit INA-1 were identified to be partially required. The role of the matrisome in the mammalian context was further studied by ECM-enriched proteomics, western blots as well as hydroxyproline measurements according to our newly developed protocol.

We identified the majority of age-variable ECM components to be up-regulated in old mice. To study the matrisome contribution to human aging, we mined several single nucleotide polymorphism (SNP) resources and identified the collagens COL22A1 and COL25A1, ECM glycoproteins NID1 and LAMA4 as well as the secreted factors IL6, IL10, and TNF to be associated with exceptional human longevity.

In Chapter 6 the interconnection of life- and healthspan is addressed. Harnessing the voluntary movement tracking potential of the lifespan machine (LM) we observed that long-lived C. elegans strains display an extended healthspan compared to wild type. However, the long-lived mutants daf-2(e1368) and daf-2(e1370) each lacked approximately 3 days of healthspan as would be expected by a similarly long-lived theoretical wild type population. To directly quantify the muscle capacity of wild type and long-lived strains we developed the first stimulated maximum muscle strength ex- ercise platform for C. elegans by applying acoustophoretic force fields. We observed that long-lived strains maintained their muscle energy density significantly longer than wild type and that muscle function decreases prior to the cessation of volun- tary movement. In addition to muscle strength we observed that the integrity of the

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exoskeleton decreased with age leading to higher bending angles and more prevalent cuticle wrinkles upon force field activation.

In the subsequent additional projects we investigated two transcription factors and performed lifespan quantification projects in collaboration with other research groups. Preliminary experiments identified heat shock factor 1 (HSF-1) as a dispens- able module in rIIS at 15� while it is strictly required at higher temperatures as discussed in Chapter 7. Interestingly, a strong temperature dependence for survival under oxidative stress conditions was observed which was independent of HSF-1.

With temperature, rIIS, and dauer signaling being intimately intertwined, we per- formed a whole-genome expression analysis of published expression profiles to define a dauer-exclusive subset to serve as a biomarker for dauer involvement in future stud- ies. In Chapter 8 we investigated preferential translation upon mechanistic target of rapamycin complex 1 (mTORC1) inhibition. We observed that longevity under reduced mTORC1 activity requires the Cyclic AMP-dependent transcription factor ATF-4 (ATF4) in C. elegans. Furthermore, mTORC1 inhibition through DR and inhibition of translation resulted in elevated H2S (hydrogen sulfide) levels. The in- creased hydrogen sulfide abundance was found to be required for both stress resis- tance and longevity under reduced mTORC1 conditions in C. elegans. Using the high throughput of the LM (chapter 3), four additional projects could be realized as listed in (supplement A). Briefly, hsp-16.2 expression levels could be experimentally established as a longevity biomarker in C. elegans. The lifespan-shortening e↵ect of disrupted X-chromosome-linked gene regulation could be quantified in C. elegans by targeted condensin I cleavage. Furthermore, F11A10.5 (ST7 ortholog) and the ECM-remodeling protease asp-4 (CTSD ortholog) were identified to be required for C. elegans longevity and allowed inferences ton their mammalian orthologs in murine liver aging. Finally, the signaling mechanism of the DR-mimic compound rilmeni- dine could be elucidated requiring DAF-16 and preliminary results, suggesting also a human nischarin receptor ortholog to extend lifespan inC. elegans.

Taken together, the research laid out in this thesis contributed to a better char- acterization of the ECM, a systematic understanding of longevity from nematodes to mammals and insight into the mechanisms how di↵erent interventions mediate longevity. The discoveries made in this work contribute to the larger goal of extend- ing human healthspan and preventing the onset of age-dependent chronic illnesses.

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Zusammenfassung

Altern ist die fortschreitende Abnahme der physiologischen Funktionen im Laufe der Zeit. Dieser Prozess ist gekennzeichnet durch die Akkumulation von Sch¨aden, sowohl innerhalb der Zellen als auch in der extrazellul¨aren Matrix (ECM) eines Organis- muses. Es wurden mehrere lebensverl¨angernde Interventionen identifiziert, darunter die Runterregulierung des Insulin/IGF1-Signalwegs (rIIS), Hemmung der TOR Ki- nase durch Rapamycin (TOR) und Verringerung der Nahrungsaufnahme (DR). Diese Interventionen verz¨ogern den Alterungsprozess und erh¨ohen die Stressresistenz bei allen getesteten Spezies. Jedoch mangelt es uns zur Zeit an einem Verst¨andnis des gemeinsamen Regulationsmusters dieser Prozesse. Wie werden komplexe protein- haltige Strukturen wie extrazellul¨are Proteine wieder verj¨ungt, kann eine zunehmende Lebensdauer dazu f¨uhren, dass die Gesundheit l¨anger erhalten bleibt und wenn ja, wie?

In Kapitel 3, dem ersten Abschnitt der Arbeit, werden die Methoden vorgestellt, die in den folgenden Kapiteln angewandt werden. Der Aufbau der automatisierten Lebensdauermessplattform wird beschrieben sowie ihre Optimierung ¨uber mehrere Verbesserungszyklen hinweg. Dar¨uber hinaus wurde ein experimentelles Protokoll f¨ur die bildgesch¨utzte Kollagenumsatzanalyse und biochemische Kollagenquantifizierung erstellt. Unter Verwendung des oben erw¨ahnten Protokolls konnte der Kollagengehalt von C. elegans auf 11% bestimmt werden.

Kapitel 4 befasst sich mit der spezies¨ubergreifenden Zusammensetzung und Funk- tion der ECM. Zu Beginn definierten wir das Matrisom von C. elegans unter Ver- wendung von Orthologie- und Proteindom¨aneninformationen und manueller Kura- tion. Das C. elegans-Matrisom besteht aus 719 Proteinen, die sich dauerhaft im extrazellul¨aren Raum befinden, ohne an die Plasmamembran gebunden zu sein. Wir kombinierten das neu definierte C. elegans-Matrisom mit den Matrisomen von H.

sapiens, M. musculus, D. rerio und D. melanogaster und f¨uhrten eine umfassende arten¨ubergreifende Matrisom-Ph¨anotyp-Analyse durch. Unerwarteterweise deckte unsere Ph¨anom-Analyse auf, dass die Muskelfunktion zu den evolution¨ar am besten erhaltenen Matrisomfunktionen z¨ahlt, die haupts¨achlich durch MSTN und LAMB2 und ihre Orthologe bestimmt wurden. Obwohl das Matrisom als eine zusammenh¨angende Matrix fungiert, scheint es je nach Ph¨anotyp spezifische prim¨are Akteure zu geben.

Wir fanden heraus, dass atrophische Narben stark von Kollagenen gepr¨agt werden, w¨ahrend vor¨ubergehende isch¨amische Attacken haupts¨achlich mit sekretierten Fak- toren assoziiert sind und abnorme Blutungen vorwiegend mit ECM-Regulatoren in

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Verbindung gebracht werden.

In Kapitel 5 wurden in einem breit angelegten Ansatz alle Signalver¨anderungen untersucht, die den experimentell validierten Langlebigkeitsinterventionen sowohl bei Nematoden als auch bei S¨augetieren zugrunde liegen. Hier haben wir ¨o↵entlich zug¨angliche Transkriptionsprofile von M. musculus (1198 Profile) und C. elegans (408 Profile) reanalysiert und verglichen, um festzustellen, wie die Langlebigkeit auf der Transkriptionsebene gew¨ahrleistet wird. Wir haben die Gene Scd2, gsta4, hspa9 und Egfr, Ctsz, Spon2 identifiziert, welche in langlebigen M¨ausen konsequent hoch- bzw. herabreguliert werden. In C. elegans haben wir festgestellt, dass hsp-12.3, sod-3, lys-2 uberwiegend ¨¨ uberexprimiert werden, w¨ahrend Vitellogenine (vit-1,4,5), fat-7 und dod-23 herabreguliert werden. Zu den wichtigsten netto hochregulierten Langlebigkeitsprozessen z¨ahlen die zellul¨are Schutzmechanismen, NAD- und Purin- metabolismus. Im Gegensatz dazu wird das Zellwachstum ¨uberwiegend herunterreg- uliert. Die ECM und die Immunaktivierung werden in langlebigen S¨augetieren stark herunterreguliert, w¨ahrend sie im Nematodenmodell hochreguliert werden. Dieses Ergebnis legt eine gr¨ossere Rolle von chronischen Entz¨undungen und fibrotischem Gewebe in S¨augetieren nahe, welche inC. elegans nicht anzutre↵en sind. Zur Quan- tifizierung von Ver¨anderungen im Koexpressionsmuster entwickelten wir ein Open- Source Python-Paket namens INDIE.

Experimentell quantifizierten wir den funktionellen Bedarf von 40 Matrisom- und Matrisom-assoziierten Proteinen in Langlebigkeit. Wir beobachteten, dass ¨uber 50%

der untersuchten Matrisom-assoziierten Gene eine teilweise bis vollst¨andig notwendige Bedingung f¨ur Langlebigkeit darstellen (unter rIIS Bedingungen). Zu den struk- turellen Proteinen, die f¨ur die Langlebigkeit inC. elegans am meisten ben¨otigt wer- den, geh¨orten UNC-52 (HSPG2-Ortholog), EPI-1 (LAMA5-Ortholog) und SYM-1 (Fibromodulin-Ortholog). Dar¨uber hinaus wurden die Protease MIG-17 und die Integrin-Untereinheit INA-1 als teilweise erforderlich identifiziert. Die Rolle des Ma- trisoms im S¨augetierkontext wurde durch ECM-angereicherte Proteomik, Western Blots sowie durch Hydroxyprolinmessungen gem¨ass unserem selbstentwickelten Pro- tokoll weiter untersucht. Wir stellten fest, dass die Mehrzahl der ECM-Komponenten, die sich ¨uber den Alterungsprozess hinweg ¨andern, in alten M¨ausen stark hochreg- uliert werden. Um den Beitrag der ECM im menschlichen Alterungsprozess zu unter- suchen, haben wir mehrere SNP-Datenbanken (Einzel-Nukleotid-Polymorphismen) prozessiert und die Kollagene COL22A1 und COL25A1, die ECM-Glykoproteine NID1 und LAMA4 sowie die sekretierten Faktoren IL6, IL10 und TNF identifiziert.

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Diese Proteine sind im Menschen mit einer außergew¨ohnlich langen Lebenszeit as- soziiert.

In Kapitel 6 wird der Zusammenhang von Lebens- und Gesundheitsspanne behan- delt. Dank automatischer Bilderkennung konnten wir beobachten, dass langlebigeC.

elegans-Genotypen im Vergleich zum Wildtyp eine l¨angere Zeit gesund bleiben. Bei den langlebigen Mutanten daf-2(e1368) und daf-2(e1370) fehlte jedoch jeweils eine Gesundheitsspanne von etwa 3 Tagen, wie es von einer ¨ahnlich langlebigen theoretis- chen Wildtyp-Population zu erwarten w¨are. Um die Muskelkapazit¨at von Wildtyp- und langlebigen C. elegans-Genotypen direkt zu quantifizieren, entwickelten wir die erste stimulierte Maximale-Muskelkraft- Trainingsplattform f¨urC. elegans durch An- wendung akustophoretischer Kraftfelder. Wir beobachteten, dass langlebige Geno- typen ihre Muskelenergiedichte signifikant l¨anger beibehalten. Zudem stellten wir fest, dass zuerst die maximale Muskelkraft vor der spontanen Bewegung abnahm.

Zus¨atzlich zur Muskelkraft beobachteten wir, dass die Integrit¨at des Exoskeletts mit zunehmendem Alter abnahm, was zu h¨oheren Biegewinkeln f¨uhrte und h¨aufiger vorkam als beim Wildtyp.

In den folgenden zus¨atzlichen Projekten untersuchten wir zwei Transkriptionsfak- toren und f¨uhrten in Zusammenarbeit mit anderen Forschungsgruppen verschiedene Lebensdauermessungen durch. Erste Resultate identifizierten den Hitzeschockfak- tor 1 (HSF-1) als nicht notwendig bei 15°C und als ben¨otigter Akteur unter rIIS und erh¨ohten Temperaturen. Interessanterweise wurde eine starke Temperaturabh¨angigkeit f¨ur das ¨Uberleben unter oxidativen Stressbedingungen beobachtet, unabh¨angig von HSF-1. Da Temperatur, rIIS und Dauer-Signalisierung eng miteinander verflochten sind, f¨uhrten wir eine genomweite Expressionsanalyse der publizierten Transkription- sprofile durch, um ein dauer-exklusives Subset zu definieren, das als Biomarker f¨ur die Dauer-Beteiligung an zuk¨unftigen Studien dienen soll.

In Kapitel 8 untersuchten wir den E↵ekt der bevorzugten Translation durch die Inhibition des mechanistischen Ziels des Rapamycin-Komplex-1 (mTORC1). Wir beobachteten, dass die Langlebigkeit unter reduzierter mTORC1-Aktivit¨at den zyk- lischen AMP-abh¨angigen Transkriptionsfaktor ATF-4 (ATF4) inC. elegans erfordert.

Dar¨uber hinaus f¨uhrte die mTORC1-Hemmung durch DR und die Hemmung der Transkription zu erh¨ohten H2S Werten (Schwefelwassersto↵). In C. elegans zeigte sich, dass die erh¨ohte Konzentration von Schwefelwassersto↵ sowohl f¨ur die Stress- resistenz als auch f¨ur die Langlebigkeit unter reduzierten mTORC1-Bedingungen er- forderlich ist.

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In vier weiteren Projekten wurden gezielt Lebenszeitmessungen in C. elegans in Kollaboration mit anderen Forschungsgruppen durchgef¨uhrt.

Als erstes konnten wir das Expressionsniveau von hsp-16.2 als Langlebigkeits- Biomarker in C. elegans experimentell etablieren. Des Weiteren haben wir den Ef- fekt einer gest¨orten X-Chromosom-gebundenen Genregulation in C. elegans durch gezielte Kondensin-I-Spaltung quantifiziert. Dar¨uber hinaus wurdenF11A10.5 (ST7- Ortholog) und die ECM-remodellierende Protease asp-4 (CTSD-Ortholog) identi- fiziert, die f¨ur die Langlebigkeit von C. elegans erforderlich sind und R¨uckschl¨usse auf ihre Orthologe in S¨augetieren und deren Leberalterung zulassen. Schließlich kon- nte der Signalweg des DR-imitierenden Medikaments Rilmenidin in C. elegans teil- weise aufgekl¨art werden. Der FOXO Transkriptionsfaktor DAF16 konnte als einer der Akteure identifiziert werden sowie die Involvierung des menschlichen Nischarin- Rezeptor-Orthologs.

Zusammengenommen tr¨agt diese Forschungsarbeit zu einer besseren Charakter- isierung der ECM und dem systematischen Verst¨andnis der Langlebigkeit von Fadenw¨urmern bis hin zu S¨augetieren bei. Zudem gibt sie einem Einblick in die Mechanismen, sowie verschiedene Interventionen die Langlebigkeit vermitteln. Die Entdeckungen, die in dieser Arbeit gemacht wurden, tragen zu dem ¨ubergeordneten Ziel bei, die Gesund- heitsspanne des Menschen zu erweitern und den Ausbruch altersbedingter chronischer Krankheiten zu verz¨ogern.

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