Untersuchung unterschiedlicher Formen von Interleukin 33
in Hautentzündungsmodellen
Der Naturwissenschaftlichen Fakultät
der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg zur
Erlangung des Doktorgrades Dr. rer. nat.
Vorgelegt von
Olga Kurow
aus Simferopol
Als Dissertation genehmigt von der Naturwissenschaftlichen Fakultät
der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
Tag der mündlichen Prüfung: 09.05.2018
Vorsitzender des Promotionsorgans: Prof. Dr. Georg Kreimer Gutachter: Prof. Dr. Falk Nimmerjahn
Prof. Dr. Georg Schett
„Die zwei mächtigsten Krieger sind Geduld und Zeit“.
Leo Tolstoi (1828-1910)
Inhaltsverzeichnis
1. Zusammenfassung ... 1
2. Summary ... 3
3. Einleitung ... 4
3.1. Allgemeine Eigenschaften von Zytokinen ... 4
3.1.1. Die IL-1-Zytokin-Superfamilie ... 5
3.1.2. Expression und Freisetzung der Zytokine der IL-1-Superfamilie ... 6
3.1.3. Biologische Aktivität ... 7
3.2. Das Zytokin IL-33 ... 9
3.2.1. Struktur von IL-33 ... 9
3.2.2. IL-33 Expression, Prozessierung und Freisetzung ... 10
3.2.3. Aufbau und Funktion des IL-33-Rezeptorkomplexes ... 11
3.2.4. Die Rolle von IL-33 bei Autoimmunerkrankungen ... 12
3.2.4.1. Das Zytokin IL-33 in der Allergie ... 13
3.2.4.2. IL-33 in der rheumatoiden Arthritis ... 13
3.2.4.3. IL-33 in Hauterkrankungen: atopische Dermatitis und Psoriasis ... 14
3.3. Ionisierende Strahlung ... 16
3.3.1. Biologische Wirkung ionisierender Strahlung ... 16
3.3.1.1. Schädigung der DNA ... 17
3.3.1.2. Zellzyklusveränderungen und strahleninduzierte Mechanismen des Zelltodes18 3.3.2. Zytokine und ionisierende Strahlung ... 20
4. Fragestellung ...22
5. Ergebnisse ...23
5.1. Phänotypische Hautveränderungen in der K14-mmIL-33-Maus ... 23
5.1.1. Etablierung und Genotypisierung einer IL-33 transgenen Mauslinie ... 23
5.2. Generierung und Charakterisierung einer transgenen Maus, die IL-33 in voller Länge hautspezifisch überexprimiert ... 31
5.2.1. Herstellung eines K14-mflIL-33-Konstrukts ... 31
5.2.2. Vorbereitung des K14-mflIL-33-Konstruktes für die Mikroinjektion ... 32
5.2.3. Genotypisierung der K14-mflIL-33-Tiere ... 34
5.2.4. Morphologische Analysen... 36
5.2.5. Histologische Analysen der Haut von K14-mflIL-33 Mäusen ... 36
5.2.6. Stimulation zur IL-33-Expression ... 37
5.3. Wirkung ionisierender Strahlung auf die Produktion und Sezernierung von mflIL- 33 41 5.3.1. IL-33-Expression in der Keratinozytenzelllinie nach Einwirkung ionisierender Strahlung. ... 41
5.3.2. IL-33-Expression in der K14-mflIL-33-Mauslinie im Vergleich zur Wildtyp-Kontrolle nach Einwirkung ionisierender Strahlung ... 43
6. Diskussion ...45
6.1. Phänotypische Veränderungen der K14-mmIL-33-Maus ... 45
6.2. Phänotypische Veränderungen in der K14-mflIL-33-Maus ... 46
6.3. Expressionsanalyse und Sezernierung von IL-33 in transgenen Mausmodellen ... 49
6.4. Zytokinanalyse nach Induktion von IL-33 in K14-mmIL-33-Mäusen ... 50
6.5. Wirkung ionisierender Strahlen auf die Produktion und Sezernierung von flIL-33... 51
7. Schlussfolgerung ...55
8. Material ...56
8.1. Verbrauchsmaterial ... 56
8.2. Puffer und Medien ... 56
8.3. Zelllinien und Mausstämme... 59
8.4. Kommerziell erhältliche Kits und Reagenzien... 59
8.5. Antikörper... 61
8.6. Oligonukleotide ... 61
8.7. Stimulantien ... 63
8.8. Reagenzien und Verbrauchsmaterialien ... 63
8.9. Geräte und Programme ... 65
9. Methoden ...68
9.1. Zellbiologische Methoden ... 68
9.1.1. Allgemeine Zellkulturtechniken ... 68
9.1.1.1. Bestimmung der Zellzahl ... 68
9.1.1. Transiente Transfektion ... 68
9.1.2. Bestrahlung ... 69
9.2. Biochemische Methoden ... 69
9.2.1. Herstellung von Proteinlysaten ... 69
9.2.2. Detergent Compatible Protein Assay ... 69
9.2.3. SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) ... 70
9.2.1. Western-Blot Analyse ... 70
9.3. Molekularbiologische Methoden ... 71
9.3.1. RNA Isolation ... 71
9.3.2. cDNA Synthese ... 71
9.3.1. Quantitative Echtzeit-PCR (qRT-PCR) ... 72
9.3.1. Mutagenese-Polymerasekettenreaktion (PCR) ... 73
9.3.1. Transformation von E.coli ... 74
9.3.2. Kolonie-PCR ... 74
9.3.1. Präparation von Plasmid-DNA aus E. coli ... 75
9.3.2. Sequenzieren von Plasmid-DNA ... 75
9.3.3. Restriktionsverdau ... 76
9.3.4. Phosphataseverdau ... 76
9.3.5. Agarosegelelektrophorese ... 76
9.3.6. Gelextraktion ... 76
9.4. Histologie ... 77
9.4.1. Herstellung von Paraffinschnitten ... 77
9.4.2. Hämatoxilin-Eosin-Färbung ... 77
9.4.3. Toluidinblau-Färbung ... 78
9.4.4. Bestimmung der Epidermis und Dermisdicke... 78
9.5. Immunologische Methoden ... 78
9.5.1. Enzyme Elinked Immunosorbent Assay (ELISA) ... 78
9.5.2. Immunohistochemische Färbungen ... 79
9.6. Tiermodelle ... 79
9.6.1. Mauszucht ... 79
9.6.1.1. K14-mmIL-33-Maus ... 79
9.6.1.1. K14-flmIL-33-Maus ... 80
9.6.1. In vivo Maus Versuche ... 81
9.6.1.1. Bestimmung der klinischen Parameter ... 81
9.6.1.2. Töten von Mäusen ... 82
9.6.1.3. Organentnahme und Verarbeitung für RNA Isolierungen ... 82
9.6.1.4. Präparation der Haut und Ohren für histologische Analysen ... 82
9.6.1.5. Induzierte Entzündung am Rücken mittels Hautstripping ... 82
9.6.1.6. Behandlung mit Imiquimod ... 82
9.6.1.7. Induzierte Entzündung am Ohr mittels IL-23-Injektion ... 83
9.6.1.8. Bestrahlung von Mäusen ... 83
10. Statistik ...84
11. Anhang ...85
11.1. Plasmidkarte flIL-33 ... 85
11.2. Abkürzungsverzeichnis ... 91
11.3. Abbildungsverzeichnis ... 95
11.4. Tabellenverzeichnis ... 97
12. Literaturverzeichnis ...98
13. Publikationsliste ... 112
14. Danksagung ... 113
1
1. Zusammenfassung
Der Schwerpunkt dieser Arbeit liegt auf der Analyse des Zytokins IL-33 in der Hautentzündung und den funktionalen Auswirkungen der Überexpression der beiden IL- 33-Formen: mflIL-33 (murines full length IL-33) und mmIL-33 (murin mature (verkürzt, reif) IL-33) in basalen Keratinozyten der Maus. Für diese Untersuchungen wurden zwei transgene Mauslinien generiert, die jeweils eine der beiden IL-33-Varianten unter dem K- 14-Promoter hautspezifisch überexprimieren.
Es konnte gezeigt werden, dass die Überexpression von mmIL-33 in Gegensatz zu mflIL-33 zu einer spontanen Hautentzündung führt. K14-mmIL-33-Maus entwickelte makroskopisch sichtbare massive entzündliche Hautveränderungen, wie gerötete Hautpartien mit starker Krustenbildung und blutigen Läsionen. In histologischen Untersuchungen konnte die Mastzell-Infiltration der Epidermis und Dermis, Zunahme der Dicke der beiden Hautschichten, Hyperkeratosen und abschnittsweise eine schwere Hyperplasie und Fibrose detektiert werden. Auf mRNA Ebene konnte gezeigt werden, dass die Induktion von mmIL-33 in der Haut die Produktion verschiedener proinflammatorischen Zytokine und Chemokine hoch regulierte, was zu Entzündungsprozessen in der Haut beitragen kann.
Die Untersuchungen des zweiten Mausmodells (K14-mflIL-33-Maus) ergaben vorerst keine sichtbaren Auswirkungen der flIL-33-Überexpression in der Haut. Mittels verschiedenen Entzündungs-Modellen der Haut wie IL-23-Injektion, Imiquimod induzierte Dermatitis und mechanische Zerstörung der Hautbarrierefunktion wurde untersucht, ob der Hautphänotyp in transgenen Mäusen von der Stärke der IL-33 Expression abhängig ist. Keines der erwähnten tierexperimentellen Entzündungs-Modellen hat zur Veränderung des Hautphänotyps der K14-mflIL-33-Maus geführt.
Es ist bekannt, dass ionisierende Strahlung die Induktion der Expression und Sezernierung von Zytokinen und Wachstumsfaktoren in der Haut fördert. Außerdem löst die Bestrahlung Apoptose und Nekrose in den betroffenen Hautpartien aus. In einem weiteren Abschnitt dieser Arbeit sollte untersucht werden, wie ionisierende Strahlung auf die Produktion und Freisetzung von IL-33 in murinen Keratinozyten wirkt.
Mit Hilfe der murinen Keratinozytenzelllinie PDV, die mit dem K14-mflIL-33-Plasmid transfiziert und anschließend bestrahlt wurde, konnten die strahleninduzierten Veränderungen hinsichtlich der mflIL-33-Produktion und Freisetzung detektiert werden.
Nach Bestrahlung wurde die Verringerung von IL-33 im Zellpellet und Erhöhung im
2 Zellkulturüberstand der mit K14-mflIL-33-Plasmid transferierten PDVs im Vergleich zu nicht bestrahlten Zellen beobachtet.
Für die weitere Untersuchungen in vivo wurden Wildtyp- und K14-mflIL-33-Mäuse verwendet. Es konnte gezeigt werden, dass in Folge einer Bestrahlung K14-mflIL-33- Mäuse eine verstärkte Bildung von Erythem, Ödem und Entzündung der Epidermis aufwiesen, was mit einer vermehrten Freisetzung des Zytokins IL-33 einherging.
Zusammenfassend zeigen die durchgeführten Untersuchungen, dass das Zytokin IL-33 in seiner verkürzten Form (mmIL-33) eine sehr starke pro-inflammatorische Wirkung in der Haut hat, während die Wirkungsweise der kompletten IL-33-Form (mflIL-33) durch intrazelluläre Funktionen begrenzt ist. Weiterhin demonstriert die vorliegende Arbeit eine wichtige Rolle des Zytokins als „Alarmin“. Es konnte gezeigt werden, dass mflIL-33 bestrahlungsinduzierte Hautveränderungen in dem K14-mflIL-33-Mausmodel verschlimmert indem es bei der massiver Gewebezerstörung die Zelle verlässt und das Immunsystem in Allarmbereitschaft versetzt.
3
2. Summary
The focus of this thesis was to analyse the role of IL-33 in skin inflammation. Therefore two different lines of transgenic mice were generated which selectively overexpress a murine full length IL33 (flmIL-33) and murine mature truncated IL-33 (mmIL-33) in skin due to the specific K14 promoter.
It could be shown that in contrast to mflIL-33 the overexpression of mmIL-33 leads to a spontaneous skin inflammation. The K14-mmIL-33 mouse developed massive inflammatory skin changes that were visible in macroscopic scale and comprised reddened skin areas with strong scab formation and bloody lesions. Histological analyses revealed epidermal and dermal mast cell infiltrations, an increase in skin thickness of both layers, hyperkeratosis and partially severe hyperplasia as well as fibrosis. Furthermore, it could be demonstrated that the induction of mmIL-33 in the skin leads to an upregulation of gene expressions coding for pro-inflammatory cytokines and chemokines. This increase may contribute to dermal inflammatory processes.
In the second mouse model, the K14-mflIL-33 mouse, no visible effects of the flIL-33 overexpression were detected in the skin. With different skin inflammation models including IL-23 ear injection, Imiquimod induced dermatitis and the mechanical destruction of the barrier function of the skin we tried to figure out whether the skin phenotype of the transgenic mice is dependent on the intensity of the IL-33 expression or not. None of the mentioned inflammation models induced alteration of the skin phenotype of the K14-mflIL-33 mouse.
It is known that radiation triggers induction of the expression followed by secretion of cytokines and growth factors in the skin. More over the radiation induced apoptotic and necrotic cell death in the affected skin areas. Therefore the effect of ionizing radiation on the production and the release of IL-33 in murine keratinocytes was investigated here.
To investigate irradiation-mediated differences in the production and secretion of IL-33 in keratinocytes in vitro, we used the murine keratinocyte cell line PDV transfected with the K14-mflIL-33 plasmid. Upon irradiation, we detected an intracellular decrease of IL-33 and an increase of IL-33 in the supernatant compared to non-irradiated cells. In vivo radiation studies using wild-type mice and K14-mflIL-33 transgenic mice resulted in an intensified formation of erythema, edema and epidermal inflammation together with an increased release of the cytokine IL-33.
In summary, these data demonstrated that the cytokine IL-33 in his mature form (mmIL-33) has strong proinflammatory effects in the skin, whereas effect of full length IL-33 (mflIL-33) is limited due to its intracellular retention. Further, this work demonstrated a major role of IL-33 as alarmin ase we could show that overexpression of mflIL-33 lead to exacerbated radiation- induced skin reaction in the K14-flmIL-33 strain. In conclusion, during tissue damage IL-33 acts as alarmin, is released in extracellular space and thereby activating the immune system.
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3. Einleitung
3.1. Allgemeine Eigenschaften von Zytokinen
Im Laufe der Evolution hat unser Körper ein höchst komplexes Kommunikationssystem entwickelt. Durch eine Vielzahl von endogenen und exogenen Stimuli werden klassische Hormonen und Entzündungsmediatoren wie Histamine, Leukotriene, Prostaglandine, aber auch Zytokine aktiviert.
Zytokine sind kleinmolekulare Zellbotenstoffe (Molmasse meist unter 40kDa), die im Gegensatz zu Hormonen fast von allen kernhaltigen Zellen produziert werden und eine große Rolle in der angeborenen und erworbenen Immunabwehr spielen. Zytokine steuern die Immunantwort indem sie vielfältige biologische Funktionen ausüben. Dabei sind sie im Stande sowohl eine Immunreaktion anzuregen als auch zu hemmen.
Zytokine werden meistens bei akutem Bedarf produziert, daher haben diese Proteine eine kurze Halbwertzeit und eine damit verbundene geringe Reichweite. Die biologische Wirkung der Zytokine kann schon in sehr geringen Mengen, in Konzentrationen zwischen Nano und Pikogramm-Bereich erzielt werden. Als Schutzmechanismus ist die Wirkung von Zytokinen oft redundant, unterschiedliche Zytokine könne die gleiche Wirkung erzielen und somit kann der Ausfall von einzelnen Zytokinen kompensiert werden. Die meisten Zytokine liegen als Monomere oder Dimere vor und sind für gewöhnlich glykosyliert (Brocker et al., 2010; Commins et al., 2010).
Es gibt unterschiedliche Arten von Zytokinen die aufgrund ihrer Struktur und Wirkungsweise in Familien wie Interleukine, Tumornekrosefaktoren, Interferone, Wachstumsfaktoren und chemotaktische Peptide unterteilt werden.
Der Begriff „Interleukin“ wurde zuerst im Jahre 1979 eingeführt und bezeichnet Proteine die hauptsächlich von immunologischen Zellen produziert werden und der Kommunikation zwischen Leukozytenpopulationen dienen (Dinarello, 2009, 2010c).
Interleukine sind auch verantwortlich für das Wachstum, Teilung und Reifung von Immunzellen unter anderen wie T-Helferzellen, B-Lymphozyten und NK-Zellen. Zurzeit sind ungefähr 40 unterschiedliche Interleukin Arten bekannt und hinsichtlich der Reihenfolge ihrer Entdeckung nummeriert. Eines der ersten Zytokine die beschrieben und charakterisiert wurden war Interleukin-1 (IL-1), nachdem auch die IL-1-Familie benannt wurde, deren Mitglieder sowohl proinflammatorisch als auch entzündungshemmend agieren(Dinarello et al., 2010; Dinarello, 2009, 2010a; Gabay et al., 2010).
5 3.1.1. Die IL-1-Zytokin-Superfamilie
Die Mitglieder der IL-1-Superfamilie sind unverzichtbar für das menschliche Immunsystem und besitzen vielfältige immunmodulierende Eigenschaften (Dinarello, 1996). IL-1 ist das am besten untersuchte Zytokin der IL-1-Familie und wurde zunächst als fieberinduzierender Faktor eingestuft. Es konnte gezeigt werden, dass, durch IL-1 die Zahl an Knochenmarkszellen ansteigt und IL-1 bei Entzündungsprozessen die zum Knorpelabbau führen beteiligt ist. (Dinarello, 2010-1; et al., 2012;(Contassot et al., 2012;
Dinarello, 2010b, c). Später wurde erkannt das IL-1 aus zwei unterschiedlichen Proteinen besteht die jedoch eine ähnliche biologische Aktivität besitzen: IL-1α und IL- 1β. Im Gegensatz dazu wirkt das dritte Mitglied der IL-1-Familie, Interleukin-1Ra (Rezeptor Antagonist) als Antagonist, da IL-1Ra mit IL-1α und IL-1β um denselben Rezeptor konkurriert, bei Bindung aber keine Reaktion auslöst (Roux-Lombard, 1998).Trotz der Sequenzhomologien dieser drei Gene wirken IL-1α und -β proinflammatorisch, während IL-1Ra antiinflammatorische Wirkung besitzt (Nicklin et al., 2002). Beide IL-1α und -β werden mit einer Pro-Domäne synthetisiert, wobei nur IL-1β einen Reifeprozess durch die Proteolyse durchläuft um die biologische Aktivität zu erlangen (Cerretti et al., 1992).
Die biologische Wirkung der Zytokine wird durch die Bindung an membranständige Rezeptoren, und die damit induzierte Signalübertragung erzielt. Die Rezeptoren der IL-1- Familie sind nah verwandt mit den Toll-like-Rezeptoren und weisen neben einer extrazellulären Immunglobulin Domäne noch eine hoch konservierte zytoplasmatische Toll/IL-1 (TIR) Domäne auf. Nach Ligandenbindung an den IL-1 Rezeptor (IL-1RI) und nachfolgender Dimerisierung des Rezeptors mit dem membranständigen akzessorischen Protein (IL-1RacP) kommt es zur Aktivierung von IL-1 assoziierten-Kinasen und weiteren Signalkaskaden die typischerweise über die Aktivierung von NF-κB (nuclear factor-κB) und MAP-Kinasen (mitogen-activated protein kinases) vermittelt werden (Sims et al., 2001). Dies führt letztendlich zur Aktivierung von spezifischen Genen und einer Immunantwort (Sims and Smith, 2010). Die Zytokinrezeptoren werden analog zu den Zytokinen anhand ihrer strukturellen Merkmale in Familien unterteilt (siehe Tabelle 1).
Neben klassischen Mitgliedern der IL-1 Familie wie IL-1α, IL-1β, IL-1RA wurden später aufgrund der hoch konservierten Genstruktur und Aminosäuresequenzen weitere Mitglieder der IL-1 Familie zugeordnet: IL-18, IL-33 und IL-1F5 – IL-1F10 (Sims et al., 2001) (siehe Tabelle 1). Alle Gene der Mitglieder der IL-1-Familie außer IL-18 und IL-33 befinden sich auf dem langen Arm des Chromosoms 2 was auf die Abstammung von einem gemeinsamen Ur-Gen hindeutet (Nicklin et al., 2002; Steinkasserer et al., 1992;
Taylor et al., 2002).
6 3.1.2. Expression und Freisetzung der Zytokine der IL-1-Superfamilie IL-1α und IL-1β werden in aktivierten Makrophagen, neutrophilen Granulozyten, dendritischen Zellen, Endothelzellen, Keratinozyten und synovialen Fibroblasten exprimiert (Berda-Haddad et al., 2011; Chen et al., 2007; Dinarello, 2011; Rider et al., 2011). Beide Interleukine werden als 31 kDa große Protein-Vorläufer produziert mit dem Unterschied, das IL-1α nicht unbedingt eine Aktivierung durch Spaltung mittels Caspase-
Tabelle 1: Eigenschaften der IL-1-Familie.
Modifiziert nach (Carta et al., 2013).
Familienname Bezeichnung Rezeptor Eigenschaft Funktion
L-1F1 IL-1α IL-1RI /IL-1RAcP proinflammatorisch Agonist
IL-1F2 IL-1β IL-1RI/IL-1RAcP proinflammatorisch Agonist
IL-1F3 IL-1Ra IL-1RI anti-inflammatorisch Antagonist
IL-1F4 IL-18 IL-18Rα/IL-18Rβ proinflammatorisch Agonist
IL-1F5 IL-36Ra IL-1Rrp2 anti-inflammatorisch Antagonist
IL-1F6 IL-36α IL-1Rrp2/IL-1RAcP proinflammatorisch Agonist
IL-1F7 IL-37 IL-18Ra, IL-18BP anti-inflammatorisch Unklar
IL-1F8 IL-36β IL-1Rrp2/IL-1RAcP proinflammatorisch Agonist
IL-1F9 IL-36γ IL-1Rrp2/IL-1RAcP proinflammatorisch Agonist
IL-1F10 IL-38 IL-1Rrp2 anti-inflammatorisch Antagonist?
IL-1F11 IL-33 ST2/IL-1RAcP proinflammatorisch Agonist
7 1 in die kürzere (17 kDa) reife Form braucht, da es in beiden Formen intrazellulär autokrin wirksam ist. Im Gegensatz dazu muss IL-1β, als kurze Form vorliegen um sezerniert zu werden und somit biologisch wirksam sein kann (Mosley et al., 1987a;
Mosley et al., 1987b).
Die größte biologische und strukturelle Ähnlichkeit zu IL-1β weist IL-18 ein weiterer Vertreter der IL-1-Familie auf. Genauso wie IL-1β wird IL-18 als Pro-Form produziert und muss für die Reifung und Sezernierung durch die Caspase-1 aktiviert werden. Als proinflammatorisches Zytokin wird IL-18 vorrangig von aktivierten Makrophagen (Okamura et al., 1995) dendritischen Zellen (Stoll et al., 1998) Osteoblasten (Udagawa et al., 1997) Keratinozyten (Stoll et al., 1997) sowie Epithelzellen (Cameron et al., 1999;
Takeuchi et al., 1997) produziert.
Im Jahre 2000, wurde von mehreren unabhängigen Gruppen ein neues Mitglied der IL-1- Familie, IL-37, identifiziert. Bei IL-37 handelt es sich um ein Zytokin, das bei der Regulierung des Entzündungsprozesses beteiligt ist. Es wird als langes Propeptid synthetisiert und nur bei Entzündungsprozessen gespalten und freigesetzt (Kumar et al., 2002; Sharma et al., 2008). Fünf Isoformen von IL-37 werden sowohl in gesunden als auch in Tumorgeweben exprimiert (Bufler et al., 2004; Kumar et al., 2000). IL-37 zeigt eine weit verbreitete Expression von Gehirn, Nieren und Leber zu Knochenmark, NK (natural killer)-Zellen, Monozyten und stimulierten B-Zellen (Boraschi et al., 2011).
Die jüngsten Mitglieder der IL-1-Familie, IL-36Ra/IL-1F5, IL-36α/IL-1F6, IL-36β/IL-1F8, IL‑36Ɣ/IL‑1F9, IL-38/IL-1F10, IL-33/IL-1F11 ist eine Gruppe von Zytokinen, die weder ein Signalpeptid noch eine Caspase-1 Schnittstelle aufweisen (Lin et al., 2001; Talabot-Ayer et al., 2009; Towne et al., 2011). Die Zytokine IL-1F5, -6, -8, -9 bilden gemeinsam die Subgruppe der IL-36 Zytokine, die sowohl pro- als auch anti-inflammatorische Eigenschaften zeigen. Diese Zytokine sind meistens in Keratinozyten, Epithelzellen und Immunzellen wie Monozyten, T-Zellen und dendritischen Zellen (DC) exprimiert (Towne et al., 2004); (Nicklin et al., 2002; Vigne et al., 2012).
3.1.3. Biologische Aktivität
Die IL-1-Familie beinhaltet Zytokine, die sehr vielfältige biologische Funktionen aufweisen und eine wichtige Rolle bei der Zell-Zell Kommunikation, bei Wachstum, Entzündungsreaktionen, Apoptose und Immunantwort spielen (Arai et al., 1990).
IL-1, auch lymphocyte activating factor (LAF) genannt fördert die Proliferation von T- und B-Lymphozyten, induziert unter anderem die Expression von Interleukin-2 (T- Lymphozyten-Proliferationsfaktor), TNF-α, MMPs und Stickstoffmonoxid-Synthase (Dinarello, 2002). IL-1α wirkt auf ein breites Spektrum von Zellen wie Fibroblasten, Epithelzellen durch die Produktion von Prostaglandin E und Kollagenase (Dinarello,
8 1987). Außerdem spielen die Zytokine der IL-1-Familie eine wichtige Rolle bei der Autoimmunerkrankung Psoriasis: es wurde eine erhöhte Expression von IL-1β in Hautbiopsien von Psoriasis-Patienten detektiert (Mee et al., 2006), Defizit an IL-1Ra führt zum spontanen Psoriasis- ähnlichen Hautphänotyp in Maus und Mensch (Aksentijevich et al., 2009; Reddy et al., 2009; Shepherd et al., 2004) Zu der IL-18 Gruppe gehören die Zytokine IL-18 und IL-37, die eng miteinander verwandt sind (Boraschi et al., 2011).
Beide Zytokine binden an den IL-18 Rezeptor unterscheiden sich jedoch in ihrer biologischen Wirkung. IL-18 induziert nach Rezeptoraktivierung die Expression von Interferon-γ (IFN-γ) in NK-Zellen und inflammatorischen TH1-Zellen (Akira, 2000;
Boraschi et al., 2011). Des Weiteren reguliert IL-18 die B-Zell Aktivierung, induziert den Tumornekrosefaktor-α (TNF-α), IL-8, IL-6 und IL-1β in verschiedenen Zelltypen (z.B.
dendritische Zellen (DC) sowie neutrophile Granulozyten und ist involviert in der TH17- Zellantwort (Carroll et al., 2008; Harrington et al., 2006). Obwohl IL-18, strukturell betrachtet sehr eng mit IL-37 verwandt ist, unterscheiden sich beide Zytokine in ihrer biologischen Wirkung. Während IL-18 als proinflammatorischer Faktor agiert, unterdrückt IL-37 die Entzündung, indem es nicht nur die proinflammatorische Wirkung von IL-18 reguliert, sondern sowohl als intrazellulärer Transkriptionsfaktor, als auch als extrazellulärer Botenstoff, die angeborene und adaptive Immunität inhibiert (Boraschi et al., 2011; Dinarello, 2009, 2015).
Zur IL-36 Unterfamilie gehören Zytokine, die insbesondere eine kritische Rolle in der Pathogenese der Psoriasis pustolosa generalisata spielen (Johnston et al., 2011). In vivo konnte eindeutig gezeigt werden, das die Überexpression von IL-36α in Mäusen zu einem Psoriasis- ähnlichen Hautphänotyp führt, charakterisiert durch die Schuppung der Haut, Akanthose, Hyperkeratose, Influx inflammatorischer Zellen in die Dermis und erhöhter Zytokin- und Chemokin Expression wie IL-23, IL-17 und TNF-α (Blumberg et al., 2007). IL-36α, IL-36β und IL-36γ induzieren die Expression von Matrix- Metalloproteinasen (MMPs), Wachstumsfaktoren und antimikrobiellen Peptiden (Johnston et al., 2011).
Ein erst kürzlich identifizierter Antagonist der Interleukin-1-Familie ist IL-38. Ein Polymorphismus im IL-38-Gen gilt als proinflammatorischer Risikofaktor und wurde mit Autoimmunkrankheiten wie die Psoriasisarthritis und ankylosierende Spondylitis im Zusammenhang gebracht (Maksymowych et al., 2006; Rahman et al., 2006).
Das letzte Mitglied der IL-1-Famile ist IL-33 (IL-1F11). Es ist ein stark pro- inflammatorisches Zytokin, das an entzündlichen Prozessen unterschiedlicher Organsysteme, unter anderem der Haut beteiligt ist (Balato et al., 2012; Hueber et al., 2011; Schmitz et al., 2005).
9 3.2. Das Zytokin IL-33
3.2.1. Struktur von IL-33
Humanes als auch murines IL-33 wird als 30 kDa Protein synthetisiert, besitzt kein Signal-Peptid, ähnlich wie IL-1α und besteht aus 270 bei den Menschen und 266 Aminosäuren bei der Maus (Schmitz et al., 2005). Die Exone 1 - 3 kodieren für das Kernlokalisierungssignal das im N-Terminus liegt und verantwortlich für die Lokalisation des Zytokins im Zellkern ist. Im C-Terminus liegt, die von den Exonen 4 - 7 kodierte IL-1- ähnliche-Zytokin-Domäne. Außerdem besteht die Sequenz von Interleukin-33 aus der zentralen Domäne, die das mit der IL-1-Domäne verbindet (Cayrol and Girard, 2014;
Garlanda et al., 2013; Lefrancais and Cayrol, 2012). Die Kernlokalisierungssequenz weist ein Chromatin-Bindemotiv (Aminosäuren 40-58) auf, welches die Interaktion von IL-33 mit den Histonen H2A/H2B vermittelt und damit die Verdichtung des Chromatin einleitet (siehe Abbildung 1) (Roussel et al., 2008).
Die dreidimensionale Struktur des Proteins ähnelt auch anderen Mitgliedern der IL-1- Superfamilie und besteht aus 12β-Faltblättern, die zu 4 Kleeblatt Strukturen gefaltet sind (siehe Abbildung 2) (Lingel et al., 2009; Murzin et al., 1992)
Abbildung 1: Aufbau von IL-33.
Nach N-terminaler Nuklear-Domäne, die fünfundsechzig Aminosäuren lang ist und ein Chromatin- Bindemotiv beinhaltet liegt Zentral-Domäne und eine IL-1-like-Zytokindomäne am C-Terminus. Die Zahlen geben die Anzahl der Aminosäuren an. Modifiziert nach (Schmitz et al., 2005).
10 3.2.2. IL-33 Expression, Prozessierung und Freisetzung
Das Protein IL-33 wurde zuerst in kleinen venösen Blutgefäßen (hochendotheliale Venole (HEV)), welche in lymphatischen Organen zu finden sind identifiziert (Baekkevold et al., 2003; Onda et al., 1999); später wurde es in Epithelzellen von Geweben mit Barrierefunktion, als auch in Endothelzellen und Fibroblasten beschrieben (Pichery et al., 2012). In verschiedenen aktivierten Zelltypen und Geweben konnte eine erhöhte Expression von IL-33 mRNA nachgewiesen werden, dazu gehören ein entzündetes Synovium von Patienten mit rheumatoider Arthritis (RA) (Hong et al., 2011) und der Intestinaltrakt von Morbus Crohn Patienten (Carriere et al., 2007). In Psoriasis Patienten ist die Expression von IL-33 sowie seinem Rezeptor ST2 in den entzündeten Läsionen als auch in nicht entzündeten Hautarealen erhöht verglichen zu gesunden Kontrollen (Theoharides et al., 2010). In Abwesenheit proinflammatorischer Stimuli verbleibt IL-33 im Zellkern, deshalb stellt sich die Frage wie IL-33 prozessiert und freigesetzt wird. Die Sequenz von IL-33 weist ein Kernlokalisierungssignal (nuclear localization signal, NLS) und ein kurzes Chromatin-Bindemotiv am N-Terminus auf welche die Ortung des Proteins im Zellkern sichern (Lefrancais and Cayrol, 2012; Lefrancais et al., 2014). Die Fehllokalisierung der unprozessierten Form von IL-33 im Zellkern hat drastische Folgen, wie man an einem in vivo Maus-Modell beobachten konnte: eine Maus mit fehlender NLS in der IL-33-Sequenz entwickelte eine tödliche Splenomegalie und Infiltration von Immunzellen in andere lebensnotwendige Organe (Bessa et al., 2014). Die native Form
Abbildung 2: Proteinstruktur von IL-33.
Dargestellt ist dreidimensionale Struktur von humanem IL-33 in Lösung mit N- und C-Terminus. Blauen Strukturen zeigen Helices, grüne:β-Faltblätter. Adaptiert nach (Lingel et al., 2009).
11 des Proteins ist aktiv und kann bei Nekrose und Zellstress freigesetzt werden was zur Bezeichnung des Zytokins als „Alarmin“ geführt hat. Nach der Freisetzung von IL-33 in den extrazellulären Raum erfolgt die Spaltung des Proteins in der Zentral-Domäne durch inflammatorische Proteasen wie Neutrophil Elastasen und Serinproteasen, was zur Bildung von einer kurzen 19 kDa Form des Zytokins mit einer bis zu 30-fachen Aktivität führt (Lefrancais and Cayrol, 2012; Lefrancais et al., 2014). Die biologische Wirksamkeit von IL-33 kann auch durch Caspasen reguliert werden. Um eine Fehlreaktion des Immunsystems auf den programmierten Zelltod zu vermeiden, wird natives Zytokin durch die Caspase 3 oder Caspase 7 in der IL-1 Domäne geschnitten und somit inaktiviert (Cayrol and Girard, 2009).
3.2.3. Aufbau und Funktion des IL-33-Rezeptorkomplexes
Im Jahr 2005 haben Schmitz und Kollegen als erste Gruppe den ST2 Rezeptor (auch genannt IL-1R4) als IL-33 Rezeptor identifiziert. Der heterodimere IL-33-Rezeptor besteht aus ST2 und dem IL-1 receptor accessory protein (IL-1RAcP). Nach Bindung von IL-33 an ST2 ist die Komplexierung der beiden Rezeptoren nötig für die anschließende Signalweiterleitung (Nakae et al., 2013). Während IL-1RAcP in der IL-1- Superfamilie als gemeinsame Komponente für IL-1α, IL-1β, IL-1F6, IL-1F8 und -1F9 Zytokin-Rezeptoren weit verbreitet ist (O'Neill, 2008), ist ST2 für die IL-33- Signalweiterleitung hoch spezifisch. Es existieren drei Spleißvarianten des ST2 Rezeptors: die membrangebundene Form ST2L, die kurz darauf entdeckte Form ST2V (Variante des ST2L) und die lösliche Form sST2 (soluble ST2) (Hayakawa et al., 2007; Li et al., 2000; Tago et al., 2001). ST2L besitzt zum einen eine extrazelluläre Immunoglobulin (Ig)-like Domäne und zum anderen eine intrazelluläre Toll/IL-1R Domäne im Zytoplasma (Liu et al., 2013). Die IL-33-Effekte werden durch die IL-33-ST2- Komplexierung und anschließende Rekrutierung von IL-1RAcP initiiert. Die anschließende intrazelluläre Signalkaskade läuft über die Rekrutierung von MyD88 (Myeloid Differentiation protein 88) an die TIR-Domäne (Toll-Interleukin-1-Rezeptor Domäne) in der zytoplasmatischen Region von ST2. Das führt zum Einen zur Translokation von NF-ƙB (Nuclear factor 'kappa-light-chain-enhancer' of activated B- cells) in den Zellkern über die Aktivierung von Inhibitor von NF-ƙB-Kinase-Komplex (IKK) und darauffolgende Ablösung von NF-ƙB von dem Komplex und zum Anderen zur Aktivierung des Apoptose regulierenden Transkriptionsfaktors (AP-1) über IRAK1/4 (Interleukin-1 receptor-associated kinase 1/4), TRAF6 (TNF receptor-associated factor 6) und MAP-Kinasen (Mitogen-activated protein kinase) Phosphorylierung (Andrade et al., 2011). Die negative Steuerung der ST2L-Signalweiterleitung kann durch das IL-1 receptor-like molecule SIGIRR (TIR8) erfolgen, wodurch es zum Beispiel zur
12 Regulierung des Typ2-Inflammationsprozesses kommt (Bulek et al., 2009). Die lösliche Form von ST2L, sST2 kann auch die proinflammatorische Wirkung von IL-33 regulieren in dem das lösliche ST2 Protein, welches eine Zytokin-Bindedomäne besitzt, freies IL-33 anlockt und bindet und somit die Bindung von IL-33 an den Rezeptor verhindert (siehe Abbildung 3) (Kuroiwa et al., 2000; Oshikawa et al., 2001).
3.2.4. Die Rolle von IL-33 bei Autoimmunerkrankungen
In aktuellen Studien konnte die Bedeutung von IL-33 in der Pathogenese von immunvermittelten Krankheiten wie Allergie, rheumatoide Arthritis, atopische Dermatitis und Psoriasis charakterisiert werden (Sattler et al., 2013).
Abbildung 3: Signalkaskade nach IL-33 Ligandenbindung.
IL-33 bindet an den IL-33 Rezeptor, welcher durch Dimerisierung der ST2 und IL-1RAcp (IL-1 receptor accessory protein) zu einem Rezeptorkomplex aufgebaut ist. Dies führt zur Rekrutierung von Adaptormolekülen MyD88 (Myeloid Differentiation protein 88),TRAF6 (TNF receptor-associated factor 6), IRAK1 und IRAK4 (Interleukin-1 receptor-associated kinase 1/4) über die TIR-Domäne des Rezeptorkomplexes. Die Induzierung von TAK1(Transforming growth factor beta-activated kinase 1) resultiert in Aktivierung des Inhibitors von NF-ƙB-Kinase-Komplex (IKK) und NFƙB (Nuclear factor 'kappa-light-chain-enhancer' of activated B-cells) kann freigesetzt werden. Freier Transkriptionsfaktor NF-ƙB wandert in den Zellkern und führt zur Expression von Zytokinen und Chemokinen. IL-33 kann auch AP-1 (Apoptose regulierende Transkriptionsfaktor) unabhängig von NF-ƙB über IRAK1/4, TRAF6 und MAP-Kinase (Mitogen-activated protein kinase) aktivieren. Lösliche Form von ST2 (soluble ST2) kann die Wirkung von IL-33 reduzieren, sST2 bindet an IL-33 und verhindert somit die Interaktion des Zytokins mit dem Rezeptorkomplex. Modifiziert nach (Garlanda et al., 2013; Oboki et al., 2010).
13 3.2.4.1. Das Zytokin IL-33 in der Allergie
Neuere wissenschaftliche Erkenntnisse konnten zeigen, dass das Zytokin IL-33 als proinflammatorischer Faktor bei Asthma bronchiale eine kritische Rolle spielt. IL-33 kommt vor in gesunden Epithelzellen der Atemwege, der Bronchialmuskulatur und Lungenfibroblasten (Kurowska-Stolarska et al., 2009) und ist erhöht exprimiert in Asthma- und Allergie-Patienten (Kamekura et al., 2012; Prefontaine et al., 2010). Es konnte auch ein Zusammenhang zwischen multiplen Single Nucleotide Polymorphismus (SNPs) in IL-1RL1 und der Entwicklung der Erkrankung in Patienten mit schwerem Asthma festgestellt werden (Traister et al., 2015). Induzierte IL-33 Produktion in den Lungen in verschiedenen Mausmodellen führt zur Th2-Immunantwor (Kouzaki et al., 2011) und Aktivierung von Innate lymphoid cells (ILC2) (Beamer et al., 2013; Van Dyken et al., 2014). Die intranasale Applikation von IL-33 resultiert in einer hohen mRNA Expression von Zytokinen wie IL-4, IL-5 und IL-13 sowie einer Erhöhung der Anzahl eosinophiler Granulozyten, Monozyten und Alveolarmakrophagen in der bronchoalveolären Lavage (Kondo et al., 2008; Kurowska-Stolarska et al., 2009).
Das Zytokin IL-33 ist auch bei der Entwicklung anderer Allergieerkrankungen wie der allergischen Rhinitis und chronischen Rhinosinusitis beteiligt. In den Polypbiopsien von Patienten mit chronischer Rhinosinusitis konnte eine IL-33 abhängige Aktivierung von basophilen Granulozyten, Mastzellen und ILC2 beobachtet werden (Haenuki et al., 2012;
Mjosberg et al., 2011; Nakanishi et al., 2013).
3.2.4.2. IL-33 in der rheumatoiden Arthritis
Zytokine spielen eine entscheidende Rolle in der Pathogenese der rheumatoiden Arthritis (RA). Nach oder auch durch die Veränderung der Toleranz zu körpereigenen Strukturen und Proteinen (Autoantikörper wie ANA und ACPA) entsteht lokal und systemisch ein Zytokinungleichgewicht welches eine erhebliche Rolle bei der Entstehung der Entzündung spielt. Nicht nur die T-Zell-Zytokine wie IL-2 und INF-γ sondern auch von Makrophagen und Fibroblasten produzierte Zytokine wie IL-1, IL-6, IL-15, IL-18, TNF-α, verschiedene Chemokine und GM-CSF (granulocyte-macrophage colony- stimulating factor) sind in rheumatoiden Synovien detektierbar (Brzustewicz and Bryl, 2015). Neuere Erkenntnisse zeigen, das auch IL-33 zu den Schlüsselzytokinen in der Pathogenese der RA gehört. Erhöhte IL-33 Werte wurden in der Synovialflüssigkeit (Tang et al., 2013) und im Serum von RA Patienten (Kritas et al., 2013) nachgewiesen.
Zudem führt die Injektion von IL-33 in das Kniegelenk einer Maus zur Migration neutrophiler Granulozyten zur Injektionsstelle und es kommt schließlich zur Expression von proinflammatorischen Chemokinen/Zytokinen wie CXCL1, CCL3 und TNF-α (Verri et al., 2010). Zusätzlich wurde gezeigt, dass in einem Kollagen-induzierten Arthritis-
14 Mausmodel (CIA) IL-33 proinflammatorische Zytokine (IL-1, IL-6, IL-13) und Chemokine (MCP-1, MIP-1α) induziert; die Gabe eines anti-ST2 Antikörpers kann den durch IL-33 vermittelten Effekt jedoch hemmen (Palmer et al., 2009). Demzufolge wurde in IL-33 eine wesentliche Funktion in der frühen, inflammatorischen Phase der RA zugeteilt.
3.2.4.3. IL-33 in Hauterkrankungen: atopische Dermatitis und Psoriasis
Wie bereits erwähnt, ist IL-33 in Endothelzellen und Keratinozyten hoch exprimiert. In entzündlichen Hauterkrankungen, wie in der atopischen Dermatitis (AD) und Psoriasis ist die Expression von IL-33 und seinem Rezeptor ST2 sowohl in entzündeter als auch in gesunder Haut erhöht (Balato et al., 2012; Hueber et al., 2011; Meephansan et al., 2013). Die Vermutung, das IL-33 bei autoinflammatorischen Hauterkrankungen eine Schlüsselrolle spielt, wurde durch mehrere Experimente unterstützt. Die Injektion von rekombinantem IL-33 (Hueber et al., 2011) oder Überexpression von murinen IL-33 in einem in vivo Maus-Modell (Imai et al., 2013) kann die Entzündungsprozesse in der Haut beeinflussen. Es konnte der Zusammenhang zwischen der genetischen Prädisposition zur erhöhten ST2-Promoter Expression und dem Risiko für die Entwicklung der AD in Patienten festgestellt werden (Shimizu et al., 2005).
Die AD (oder auch Neurodermitis genannt) ist eine chronisch-entzündliche Hauterkrankung mit dreifacher Erhöhung der Prävalenz in der letzten Dekade (Williams, 2000). Die AD ist klinisch durch eine Dermatitis mit starkem Juckreiz charakterisiert und zeigt eine Ansammlung von eosinophilen, basophilen Granulozyten und Mastzellen in entzündeter Haut und erhöhten IgE und Histamin Wert im Blut (Bieber, 2008). Patienten mit dem Einzelnukleotid-Polymorphismus (SNP, engl. Single Nucleotide Polymorphism) in IL1RL1/ST2 Promoter haben einen höheren sST2 und IL-33 Spiegel im Serum (Shimizu et al., 2005). Biopsien entzündeter Hautareale von AD-Patienten weisen im Vergleich zu gesunden Hautbiopsien der gleichen Patienten eine höhere Expression von IL-33 und ST2 auf (Savinko et al., 2012). Weiterhin, bestätigt eine weitere Studie bzgl.
der Isoform von Transkriptionsfaktor p63 (ΔNp63), dass der Zytokin IL-33 ein wichtiger Mitspieler in der Pathogenese der atopischen Dermatitis zu sein scheint. P63 ist in die Entwicklung des Epithelgewebes involviert wobei seine Isoform ΔNp63α in Keratinozyten besonders hoch exprimiert ist und hauptsächlich mit der Entwicklung der gesamten Haut in Verbindung gebracht wird (Kim et al., 2009; Romano et al., 2012; Shen et al., 2005).
Eine transgene Mauslinie mit epidermaler ΔNp63-Überexpression zeigte eine spontane Entwicklung eines Hautphänotyps welcher der humanen AD sehr ähnlich ist. Außerdem konnte gezeigt werden, dass ΔNp63 einen stimulierenden Effekt auf dieIL-33 Expression hat (Rizzo et al., 2016). Diese Ergebnisse könnten, unter Berücksichtigung anderer Studien über Effekte von IL-33 auf Immunzellen vom TH2-Typ (Nakae et al., 2013;
15 Salimi et al., 2013; Savinko et al., 2012), bedeuten, dass IL-33 eine Rolle von entscheidender Bedeutung in der AD spielt (siehe Abbildung 4).
Psoriasis (Psoriasis vulgaris) ist eine Autoimmunerkrankung, die durch stark durchblutete und entzündlich gerötete Hautareale, Schuppung und die Infiltration von Immunzellen (Neutrophile inbegriffen), die zur Bildung von Mikroabszessen („Munro- Abszess“) unter der Hornhaut führen, gekennzeichnet. Im Gegensatz zur AD, die eine TH2-Signatur (IL-4, IL-5, IL-10) aufweist, ist Psoriasis durch die Produktion von Th1 und Th17 Zytokinen, wie IFN-γ, TNF-α, IL-2, IL-17 und IL-22 gekennzeichnet. Die histologische Untersuchung der Psoriasisplaques zeigt eine Hyperkeratose (verstärkte Schuppung), Parakeratose (verstärkte Verhornung) und Akanthose (Verdickung), als auch verstärkte Angiogenese und die Infiltration von inflammatorischen Zellen wie Makrophagen, DC, Neutrophilen und T-Zellen. Immunhistologische Untersuchungen der erkrankten Haut von Psoriasis Patienten zeigen gesteigerte IL-33 Expression. In einem Psoriasis-Herd produzieren und sezernieren Keratinozyten große Mengen an IL-33 was zur T-Zell-Aktivierung und Freisetzung proinflammatorischer Zytokine wie IL-1, -6, -8, IFN-γ, TNF-α führt, die auch wachstumsstimulierend wirken (siehe Abbildung 4) (Balato et al., 2012). Außerdem induziert IL-33 die Reifung von Mastzellen und die Produktion von IL-13, CCL2 und CCL3 in Psoriasis-Läsionen (Allakhverdi et al., 2007) sowie die Freisetzung des Botenstoffes VEGF (Vascular endothelial growth factor), was zur Steigerung der Angiogenese in der Psoriasis führt (Theoharides et al., 2010). Ergebnisse dieser Studien demonstrieren wie wichtig die Rolle der Zytokine in der Hautimmunität und chronisch entzündlichen Hauterkrankungen ist und wie essentiell das weitere Verständnis von genauen immunologischen Vorgängen in der Haut für die Therapieentwicklung ist.
16 3.3. Ionisierende Strahlung
Jede Art von Strahlung bei welcher die neutralen Atome zu reaktiven Ionen durch Verlust der Elektronen umgewandelt werden bezeichnet man als Ionisierende Strahlung. Zur ionisierenden Strahlung wird sowohl Teilchen- als auch elektromagnetische, Röntgen- oder Gammmastrahlen gezählt. Die Energie der beiden Strahlenarten ist ausreichend um Atome zu ionisieren und dadurch die irreversiblen Schäden in lebendem Gewebe auszulösen (Herrmann et al., 2006).
3.3.1. Biologische Wirkung ionisierender Strahlung
Ionisierende Strahlung kann neben der direkten auch indirekte Wirkung auf biologische Systeme haben. Direkte Strahlenwirkung zeichnet sich in der unmittelbaren Wirkung auf Biomoleküle. Veränderung, sogar Zerstörung von Makromolekülen kann die Folge sein.
Wenn es durch Strahlung zur Bildung von freien Radikalen kommt, die dann Biomoleküle schädigen, spricht man von der indirekten Strahlenwirkung. Beiden Strahlungsarten bewirken als Folge eine DNA-Schädigung (siehe Abbildung 5) (Hall and Giaccia, 2012).
Abbildung 4: Schematische Darstellung von IL-33 in der Pathogenese der Psoriasis und atopischer Dermatitis.
Gezeigt sind Zellen und Zytokine welche bei der Pathogenese der beiden Krankheiten eine wichtige Rolle spielen. Nach Aktivierung durch IL-33 produzieren Immunzellen vom TH1 und TH17-Typ vermehrt proinflammatorische Zytokine wie IL-1, IL-6, IL-8, ITF-Ɣ, TNF-α, IL-2, IL-17 und IL-22. Diese Zytokine induzieren die Migration von Neutrophilen, Makrophagen und dendritischen Zellen und mitwirken bei der Entzündungsreaktion welche zur Psoriasis führt. Bei der Aktivierung von TH-2-Zellen durch IL-33 werden andere Zytokine wie IL-4, IL-5, IL-10 sezerniert. Durch Zytokine von TH-2-Typ werden basophile, eosinophile Granulozyten und Mastzellen mobilisiert. Diese Zellen sind die zentralen Mitspieler in der Entwicklung von der atopischen Dermatitis.
17 3.3.1.1. Schädigung der DNA
Biologische Wirkung ionisierender Strahlung basiert hauptsächlich auf Schädigung der DNA. Strahleninduzierte DNA-Schäden können zu Mutationen, Transformationen und Zelltod führen, wenn DNA-Reparaturmechanismen fehlerhaft oder gestört sind. Man unterscheidet bei den strahleninduzierten DNA-Schäden zwischen Strangbrüchen (Einzel- Doppelstrangbrüche) und Basenschäden (Basenverlust, falsche Basenverpaarungen, modifizierte Basen). Die häufigsten und die am einfachsten reparierbaren DNA-Strahlenschäden sind Einzelstrangbrühe und Basenschäden, wobei die Reparaturen an Doppelstrangbrüchen äußerst schwierig und fehlerhaft sind (Herrmann et al., 2006).
Säugertierzellen haben die Fähigkeit erlangt die strahleninduzierte DNA-Schäden zu erkennen und zu reparieren, wie gut sie darin sind hängt von der Kompliziertheit des Schadens ab und bestimmt ihre Erholungsfähigkeit (Sancar et al., 2004).
Abbildung 5: Direkte und indirekte Wirkung ionisierender Strahlung.
Die Abbildung zeigt eine schematische Darstellung einer DNA-Struktur und Schäden welche durch die Einwirkung ionisierender Strahlung entstanden sind. Direkte Strahlenwirkung ist gekennzeichnet durch die direkte Einwirkung der Energie, die mit der Strahlung transportiert wird (hier in Form eines Elektrons) auf die DNA-Doppelhelix, wodurch diese beschädigt wird. Indirekte Wirkung entsteht wenn ionisierende Strahlung zuerst auf ein Wassermolekül trifft. Durch Abspaltung eines Elektrons entstehen freie Radikale welche äußerst aggressiv sind und Oxidation der Basen verursachen. A (Adenin); T (Thymin); G (Guanin); C (Cytosin);P (Phosphat); S (Zucker); e- (Elektron); p+ (Proton). Modifiziert nach
(Hall and Giaccia, 2012).
18 Unterschiedliche enzymatische DNA-Reparaturmechanismen wirken bei Beseitigung von DNA-Schäden abhängig von Typ der Zerstörung. So erkennt und repariert oxidative Schäden an den Basen und Einzelstrangbrüche die Basenexzisionsreparatur (BER), die Doppelstrangbrüche werden durch homologe Rekombination (HR) und end joining (EJ) beseitigt (siehe Abbildung 6) (Hoeijmakers, 2001).
3.3.1.2. Zellzyklusveränderungen und strahleninduzierte Mechanismen des Zelltodes
In einem lebenden Organismus durchlaufen Zellen einen Prozess in dem sie sich durch teilen, wachsen und absterben ständig erneuern. Die Regulation von diesem Prozess muss fein abgestimmt sein um auf unterschiedlichste Umwelteinflüsse rechtzeitig und korrekt reagieren zu können. Im Fall einer strahleninduzierten Schädigung der DNA wird der Teilungsprozess gestoppt um Reparaturmechanismen Zeit zu geben und die auf der
Abbildung 6: Strahleninduzierte DNA-Schäden und Reparaturmechanismen.
Dargestellt sind DNA-Läsionen und DNA-Schadensantwort nach Einwirkung ionisierender Strahlung auf lebende Zellen. Zu strahleninduzierten DNA-Schäden gehören oxidative Basenschäden, DNA-Einzel und - Doppelstrangbrüche. Welche DNA-Reparaturmechanismen eingesetzt werden hängt von der Schadensgröße ab. Basenexzisionsreparatur wird bei oxidativen Basenschäden und Einzelstrangbrüchen eingesetzt und gehört zu den einfachsten Arten von DNA-Reparatur. Bei Doppelstrangbrüchen existieren zwei Hauptreparaturwege: die homologe Rekombination (HR) und die Endverknüpfung (End Joing-EJ).Modifiziert nach (Hoeijmakers, 2001).
19 DNA enthaltene Information, vollständig und fehlerfrei an die nächste Zellgeneration weiterzugeben. Bei der Zellzyklus-Verzögerung spielen die Proteine p53 und p21 (CDKN1A) eine entscheidende Rolle. Durch die strahleninduzierte DNA-Schäden steigt die Konzentration von p53 in der Zelle. P53 agiert als Transkriptionsfaktor des Proteins p21, welches den Zellzyklus-Arrest bei reparierbaren Schäden auslösen kann und bei irreparablen Schäden, die Initiierung der Apoptose startet (Vogelstein et al., 2000). Nach Einwirkung ionisierender Strahlung wird der Zellzyklus in der Interphase, genau in seiner Unterphase – G1 gestoppt (G1-Arrest). Nach erfolgreicher DNA-Reparatur kann die Zelle weiter durch den Zellzyklus laufen und ihre DNA an die nächste Generation vererben, wenn Schäden irreversibel sind verweilen Zellen in dauerhaften G1-Arrest gefolgt von einem strahleninduzierten Differenzierungsvorgang. Als letzte Möglichkeit treten geschädigte Zellen den programmierten Zelltod (Apoptose) ein und werden durch neue intakte Zellen ersetzt (Bartek and Lukas, 2001; Rodemann and Bamberg, 1995; Ross, 1999).
Zu den strahlenempfindlichsten Gewebearten zählen die, deren Zellen nach Bestrahlung und DNA-Schädigung Apoptose eingehen. Wenn geschädigte Zelle nicht genug Energie für apoptotischen Zelltod besitzt, da Apoptose ein Prozess ist, der Energie in Form von ATP braucht, kann die Zelle durch Nekrose sterben.
Im Gegensatz zur Apoptose löst Nekrose die irreversible Permeabilisierung der Plasmamembran aus, wobei es zu umfassenden Gewebeschäden durch anschwellen und platzen der Zellen kommt. Eine Entzündungsreaktion des geschädigten und umliegenden Gewebes ist die Folge mit der Entstehung von großen Mengen zellulären Abfalls, der durch Makrophagen beseitigt werden muss (Mullins et al., 2005). Unter den Faktoren, die Nekrose auslösen, findet sich auch ionisierende Strahlung, während die Strahlenstärke und Gewebeart eine entscheidende Rolle spielen. So lösen nur sehr hohe Strahlendosen, die durchschnittlich zwischen 32- 50 Gy liegen nekrotischen Zelltod bei Neuronen (in vitro) aus, wobei bei humanen Keratinozyten-Zelllinie (HaCat) schon 0.5 Gy ausreichend sind um Nekrose hervorzurufen (Hotchkiss et al., 2009; Jella et al., 2013).
Neben Apoptose und Nekrose gibt es auch andere Zelltodarten, wie mitotische Katastrophe, Autophagie und Seneszenz (Eriksson and Stigbrand, 2010; Stewart et al., 2011).
Die mitotische Katastrophe ist die zweithöchste Ursache des Zelltodes nach irreversiblen DNA-Schäden infolge der Bestrahlung (Verheij, 2008). Diese Art des Zelltodes tritt ein, wenn beschädigte Zellen nicht mehr in der Lage sind Mitose zu vollziehen. Solche Zellen sind durch verschiedene morphologische Veränderungen wie, vergrößertes Zellvolumen, Aneu- bzw. Polyploidie, dizentrische Chromosomen und dekondensiertes Chromatin
20 gekennzeichnet (Vitale et al., 2011). Die mitotische Katastrophe kann zur Apoptose oder Nekrose führen oder mit Seneszenz enden (Al-Ejeh et al., 2010).
Die sogenannte vorzeitige Zellalterung, die auch Seneszenz genannt wird, kann durch endogene, als auch exogene Stimuli, ausgelöst werden. Dazu zählen der oxidativer Stress, DNA-Schädigung, Chemotherapeutika, ionisierende Strahlung und proinflammatorische Zytokine, wie Interferon-α (IFN-α) und Transforming Growth Factor- β (TGF-β). Seneszente Zellen sekretieren große Mengen verschiedener Wachstumsfaktoren, Proteasen und Zytokinen, zeichnen sich aus durch erhöhte Genexpression der Zellzyklus-regulierenden Proteine, Anti-apoptotischen Faktoren und erhöhte β-Galactosidase Aktivität (Muller, 2009). Ob bestrahlte Zellen zu altern anfangen oder Apoptose bzw. Nekrose starten, ist von Strahlendosis und Gewebeart abhängig.
Nach Bestrahlung mit niedrigen Dosen zeigten die Zellen eine verstärkte Seneszenz, wobei die höheren Strahlendosen in gleichen Zellen Apoptose oder Nekrose induzieren (Panganiban et al., 2013). Allerdings zeigen andere Studien, dass gleiche Strahlendosen sehr unterschiedliche Wirkungen bei verschiedenen Zellarten auslösen können.
Während Endothelzellen relativ Strahlenresistent sind und somit nach mittlerer oder großer Strahlenbelastung in Seneszenz übergehen, wird bei humanen hämatopoetischen Zellen bei der gleichen Strahlendosis apoptotischer Zelltod ausgelöst (Kim et al., 2014; Panganiban et al., 2013).
Eine andere Alternative des Zelltodes ist Autophagie welche neben Apoptose zu den regulierbaren Zelltodarten gezählt wird. Autophagie ist ein homöostatischer Prozess, welcher bei niedrigen bis moderaten Stimuli ein Überlebensmechanismus darstellt und Recycling von zellulären Trümmern, Organellen und Proteinen übernimmt. Nach extremen Reizen wie oxidativer Stress, Nährstoffmangel, Akkumulation abnormer Proteine, strahleninduzierten Zell-Schädigung kann Autophagie zum sogenannten autophagischen Zelltod führen (Denton et al., 2012). Dabei wird die Induktion von Autophagie durch ionisierende Strahlung wahrscheinlich durch DNA-Schädigung ausgelöst. Aktuelle Studien zeigen, dass Strahlenschäden Produktion von DNA- Reparaturenzymen steigern, welche die Autophagie induzieren (Rodriguez-Rocha et al., 2011).
3.3.2. Zytokine und ionisierende Strahlung
Nach Einwirkung ionisierender Strahlung auf lebende Zellen und Organismen kommt es zur strahleninduzierten Zellschäden, wobei die Zellen trotzdem fähig sind Zytokine zu sezernieren. In unterschiedlichen Studien konnte ein Dosis-und Zeit-abhängiger Anstieg von proinflammatorischen Zytokinen in unterschiedlichen Geweben gemessen werden
21 (Ha et al., 2013; Li et al., 2013; Li et al., 2012; Linard et al., 2003; Meeren et al., 1997;
Zhou et al., 2001).
Bei der Induktion mittels Bestrahlung, kommt es zur IL-1β-Bildung und Zytokin- induzierter Signalkaskade, wodurch andere proinflammatorische Proteine wie, IL-6, IL-8, TNF-α und IFN-Ɣ gebildet werden. Diese Zytokine zählen zu den Schlüsselzytokinen der angeborenen Immunantwort und die dadurch in Gang gesetzten Signalkaskaden führen zur chronischen Entzündung (Carta et al., 2013; Dinarello, 2009; Shih et al., 2012).
Andere Maus-Studien zeigten Anstieg von IL-18 und IL-33 nach Einwirkung von ionisierender Strahlung auf hämatopoetische Organe wie, Thymus, Milz und Knochenmark und Sezernierung von IL-12 und IL-18 durch peritoneale Makrophagen nach Ganzkörperbestrahlung (Ha et al., 2014; Shan et al., 2007). Des Weiteren konnte ein direkter Zusammenhang zwischen strahleninduzierter IL-18-Bildung und Apoptose in der Studie von Hyun Soon Bang gezeigt werden (Bang et al., 2016). Zusätzlich kommt es zur Eosinophilen-vermittelten Immunreaktion nach Bestrahlung der Haut mit hohen Dosen von ionisierender Strahlung welche zur Fibrose führen kann, wobei IL-33 zu den Schlüsselzytokinen bei der Initiierung von Fibrose gezählt wird (Lee et al., 2015).
Diese Zytokine initiieren Immunreaktionen und wirken proinflammatorisch indem sie als
„danger signals“ agieren und die verstärkte Einwanderung von Immunzellen fördern (Shan et al., 2007; Williams and McBride, 2011).
Die Auswirkungen von so immenser Ausschüttung von pro-entzündlichen Botenstoffen könnte zur Seneszenz, Autophagie, Apoptose und Nekrose in bestrahltem Gewebe führen (Haldar et al., 2015; Li et al., 2012; Zhang et al., 2012).
22
4. Fragestellung
Zytokin IL-33 wird in Geweben mit Barrierefunktion exprimiert und zeichnet sich sowohl als Transkriptionsfaktor, als auch als ein „Alarmin“ aus. IL-33 kann Proinflammatorische Reize induzieren und somit das Immunsystem in Alarmbereitschaft durch weitere Signale versetzen.
Als rezeptorunabhängiger Transkriptionsfaktor bindet IL-33 an DNA, wodurch der an IL- 33 gebundene Chromatinabschnitt kondensiert und unzugänglich für die Transkriptionsenzyme wird. In Folge scheint nukleares IL-33 die Expression von Genen zu unterdrücken. Als Alarmin wird IL-33 aufgrund von Gewebeschaden von nekrotischen Zellen in seiner kompletten Form (full length IL-33 (flIL-33)) in den Extrazellulärraum freigesetzt. Inflammatorische Proteasen verdauen dann IL-33 zu verkürzter der sog.
reifen Variante (mature IL-33 (mIL-33)), welche höhere biologische Aktivität besitzt.
Diese ca. zehnfach höhere Aktivität des mIL-33 im Vergleich zu kompletten Form, ist in der Lage weitere proinflammatorische Effekte im Gewebe hervorzurufen. Bei regulierten Zelltodprozessen, wie der Apoptose, wird IL-33 durch Caspasen 3 und 7 zu einer inaktiven Form gespalten.
In bisherigen Studien konnte nachgewiesen werden, dass IL-33 sowohl in TH1 als auch in TH2 und TH17 Immunantwort involviert ist und proinflammatorische Effekte in Autoimmunerkrankungen besitzt. In der jüngsten Zeit wurden viele neue Erkenntnisse über das IL-33 bei entzündlichen Hauterkrankungen gewonnen. So scheint das Zytokin IL-33, das von Endothelzellen und Keratinozyten hoch exprimiert wird, an der Pathogenese der atopischen Dermatitis und Psoriasis beteiligt zu sein. Die genauen Mechanismen, die zu dem komplexen Krankheitsbild der beiden Erkrankungen beitragen sind bislang noch nicht vollständig geklärt.
Das Ziel dieser Arbeit war es, die Rolle des Zytokins IL-33 in der Hautentzündung zu untersuchen und mögliche Unterschiede in der biologischen Wirkungsweise zwischen beiden IL-33-Formen (flIL-33 und mIL-33) aufzuzeigen. Hierfür wurden zwei transgene Mauslinien generiert, die jeweils eine der beiden IL-33-Formen in basalen Keratinozyten überexprimieren. Es wurden einerseits die Effekte von IL-33 auf typische Symptome der Hautentzündung, wie entzündlich gerötete Hautpartien, Schuppung, Haarverlust, Juckreiz und andererseits den Einfluss von IL-33 auf die Stärke der Expression der proinflammatorischen Zytokine, welche an der Immunreaktion in der Haut beteiligt sind, untersucht. Weiterhin wurde mittels unterschiedlicher Entzündungs-Modelle der Haut, der Einfluss der Stärke der IL-33 Expression auf die epitheliale Barriere geprüft.
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5. Ergebnisse
Ergebnisse und Daten dieses Kapitels wurden publiziert in:
Full length Interleukin 33 aggravates radiation induced skin reaction.
Olga Kurow1, Benjamin Frey2, Louis Schuster1, Verena Schmitt1, Susanne Adam1, Madelaine Hahn1, Derek Gilchrist3, Iain B. McInnes3, Stefan Wirtz4, Udo S. Gaipl2, Gerhard Krönke1, Georg Schett1, Silke Frey1 and Axel J. Hueber1*
Front. Immunol. | doi: 10.3389/fimmu.2017.00722
5.1. Phänotypische Hautveränderungen in der K14-mmIL-33-Maus
Das Ziel der vorliegenden Arbeit war, die pro-inflammatorische Wirkung des Zytokins IL- 33 in der Haut zu untersuchen. Hierzu wurde ein Mausmodell etabliert, in welchem IL-33 Keratinozyten-spezifisch überexprimiert wird.
5.1.1. Etablierung und Genotypisierung einer IL-33 transgenen Mauslinie In Rahmen dieser Arbeit wurde eine transgene Mauslinie generiert und charakterisiert, welche hautspezifisch die reife Form des murinen Zytokins IL-33 (mmIL-33) überexprimiert.
Als Basis für diese Maus diente ein Mausstamm mit einem IL-33-Transgen, dem ein mit loxP flankiertes Stopkodon vorgeschalten ist, welches die Expression des Transgens verhindert. Diese mmIL-33-GFP-Cre-Maus wurde mit einem Mausstamm verpaart, der eine Tamoxifen-abhängige Cre-Rekombinase unter dem K14-Promotor besitzt (K14-Cre- ERTM-Maus), welcher nur in Keratinozyten aktiv ist. Die Cre-Rekombinase schneidet in den Nachkommen das Stopkodon über die loxP-Stellen heraus, so dass das IL-33- Transgen in Keratinozyten überexprimiert wird. Gleichzeitig wird ein dem IL-33 vorgeschaltetes GFP herausgeschnitten, so dass IL-33-überexprimierende Zellen aufgrund des fehlenden GFP Signals nicht mehr grün leuchten (siehe Abbildung 7).
24 Da die mmIL-33-GFP-Cre-Maus heterozygot für GFPmmIL-33 ist, können bei der Kreuzung der beiden Mauslinien sowohl K14-CreERTM/WT als auch K14- CreERTM/GFPmmIL-33 (K14-mmIL-33) -Mäuse entstehen (siehe Abbildung 8).
Der Genotyp der Mäuse wurde durchflusszytometrisch anhand der GFP Expression bestimmt. Die Expression von IL-33 zeigte sich in einem positiven GFP Signal, was an einem Anstieg der Fluoreszenzintensität (FI) zu erkennen ist. (siehe Abbildung 9).
Abbildung 7: Schematische Darstellung der Generierung einer IL-33 transgenen Mauslinie.
Die Maus, mit loxP- flankiertem GFP und Stopkodon, welches das Ablesen des Transgens (mmIL-33) verhindert, wurde mit einer Tamoxifen-induzierbaren K14-Cre-ERTM-Maus verpaart. Nach Verabreichung von Tamoxifen wird das loxP-flankierte GFP und Stoppkodon deletiert und die Expression von mmIL-33, unter Kontrolle des K14-Promoters, spezifisch in Keratinozyten induziert.
Abbildung 8:Kreuzungsschema zur Generierung und Etablierung transgener K14-Cre- ERTM/GFPmmIL-33 Mäuse und deren Kontrolltiere (K14-Cre-ERTM/WT).
K14-Cre-ERTM Mäuse wurden mit mmIL-33-GFP/WT Mäusen gekreuzt um K14-Cre-ERTM/GFPmmIL-33 und K14-Cre-ERTM/WT Geschwistertiere zu züchten.
25 Die K14-CreERTM/GFPmmIL-33 -Mäuse zeigten keine Abweichungen im Verhalten und Phänotyp im Vergleich zu einer Wt Maus oder Kontrollmaus (K14-Cre-ERTM/WT). Um einen direkten Vergleich von transgenen (K14-CreERTM/GFPmmIL-33) und Kontrolltieren (K14-CreERTM/WT) ohne mmIL-33 zu haben, wurden jeweils Geschwisterpaare eines Wurfes herangezogen (siehe Abbildung 8).
Um den Zeitpunkt der Rekombination kontrollieren zu können wurde das System mit einer Tamoxifen-aktivierbaren Cre-Rekombinase ausgewählt, die sich durch den Östrogenrezeptor-Antagonisten Tamoxifen aktivieren lässt. Die Cre-Rekombinase ist zunächst inaktiv kann aber durch die Tamoxifenverabreichung induziert werden, was zur Überexpression von mmIL-33 in Keratinozyten in der K14-CreERTM/GFPmmIL-33 (iIL- 33)-Maus führt.
In Abbildung 10 ist das Verabreichungsschema von Tamoxifen dargestellt, welches eine effektive Rekombination und somit die Überexpression von mmIL-33 in der Haut induziert.
Abbildung 9: Genotypisierung transgener K14-Cre-ERTM/GFPmmIL-33 Mäuse und deren Kontrolltiere (K14-Cre-ERTM/WT).
Nachweis der GFP Expression mittels der Durchflusszytometrie. Die Darstellung im Histogramm rechts zeigt Zellpopulation von GFP-negativen Zellen in K14-Cre-ERTM/WT-Maus in Vergleich zu GFP- positiven Zellen (Histogramm links) in K14-Cre-ERTM/GFPmmIL-33-Maus. Dargestellt ist die relative Fluoreszenz des Kanals 4 für beidenPopulationen.
Abbildung 10: Schematische Darstellung der Verabreichung von Tamoxifen.
Tamoxifen wurde täglich in der Menge von 20 mg in 200 µl auf die rasierte Haut am Rücken innerhalb von 6 Tagen aufgetragen.
