Deutsche Zeitschrift fiir geriehtliche Medizin 50, 567--582 (1960)
Aus dem Institut Iiir Geriehtliche Medizin der Universit~it H~rnburg (Direktor: Prof. Dr. EnIc~I FRITz)
Versuch zum Nachweis eines Anti-Antikiirpers Von
MAx-WnR~Ea UNCKELL und GiJNTHER DOTZAUER Mit 4 Textabbfldungen
(Eingegangen am 28, August 1960)
A. Einleitung
In der vorliegenden Arbeit wird der Versuch unternommen, die Bildung yon Anti-Anti~drpern nachzuweisen.
Es wurden Meerschweinchen mit 3 verschiedenen Phyths
ninen sensibilisiert. Wir hielten es ffir m6glich, dab die Tiere auBer Antik6rpern gegen das pflanzliche Tr~gereiweiBmolekiil auch noch solche gegen die determinante Gruppe bilden, welche eine reproduzier- bare, gegen bestimmte Blutgruppen ausgerichtete Agglutination mensch- licher Blutk6rperchen bewirkt.
Unter der Voraussetzung, dab diese Gruppe identiseh mit der deter- minanten Gruppe der Isoh~magglutinine oder zumindest von sehr ~hn- licher S~ruk~ur is~, w a r eine R e a k ~ i o n der ss~sibilisier~en Tiere nich~
nut mit d a n betreffenden Pflanzenextrak~en zu erwarten, sondern a u c h mit d e n korrespondierenden menschliehen Isohamagglutininen. Prfifun- gen des aufgeworfenen Problems waren mSglich durch Prs
und Agglutinationshemmungsversuche und durch die anaphylaktische Reaktion der sensibilisierten Tiere. Wit sensibilisierten Meerschwein- chen und versuchten durch die anaphylaktische Reaktion naeh SC~ULTZ- DALv~ am isolierten, fiberlebenden Uterusmuskel eine eventuelle Anti- AntikSrperbildung nachzuweisen.
Prinzip der anaphyla/ctischen Reaktion nach SCHULTz-DAL~
Der fiberlebende Uterusmuskel eines sensibilisierten Meersehweinchens, der sich in einer physiologischen, yon Sauerstoff durchstr6mten, kSrper- warmen Salzl6sung befindet, antwortet auf Zugabe kleinster Mengen des spezifischen Antigens zur umgebenden SalzlSsung - - Badeflfissigkeit - - mit einer Kontraktion. Diese K o n t r a k t i o n entspricht in ihrer Spezifiti~t der serologischen Antigen-Antik6rperreaktion.
B. Material und Methode
Es standen drei verschiedene Phythgmagglutinine zu unserer Ver- fiigung. Ein selbst aufbereitetes, panagglutinierendes Agglutinin aus
568 MAx-WERNER UNCKELL und GUNTHER DOTZAUER:
d e m S a m e n v o n P h a s e o l u s l u n a t u s , eft1 A n t i - A ~ a u s d e m S a m e n v o n D o l i c h o s b i f l o r u s u n d ein A n t i - t t - A g g l u t i n i n a u s d e m S a m e n y o n L a b u r - n u m a l p i n u m .
1. Phaseolus lunatus
Ernte 1957. (Botanischer Garten der Universit~t Hamburg, Landwirtschaft- licher Botanischer Garten der Universit~t Bonn, Botanischer Garten der Techni- sehen Hoehsehule Dresden, Hortus Botanicus UdSSt~ Kiew, Hortus Botanicus Coimbra-Portugal.)
Die angetroekneten entkapselten Bohnen wurden feinst zerm~hlen. 1 g Samen- mehl w~rde mit 10 ml 0,9% NaC1-L5sung griindlich aufgeschiittelt. 2 Std im Erlenmeyer-Kolben bei 20~ belassen, in Abst~nden aufschiitteln. Dann wurde der Samenextrakt 12 Std im Kfihlschrank bei 4~ aufbewahrt. Ansehliel~end zentrifugiert bei 3000 U/min 20 min.
Das Supernatan~ hat~e bei sofortiger Untersnchung jeweils einen Titer yon:
1 : 256 gegen BlutkSrperehenaufsehwemmnngen der Gruppe A 1
1 : 128 gegen BlutkSrperchenaufschwemmungen der Gruppe A s 1 : 128 gegen BlutkSrperehenaufschwemmungen der Gruppe B
1 : 128/256 gegen BlutkSrperehenaufschwemmungen der Gruppe 0
2. A n t i - A 1- Phytagglutinin - - A S I D
Das ASID-Institut Mfinchen stellte einen E x t r a k t aus Dolichos biflorus-Samen ohne Farbstoffzusatz zur Verfiigung. Die injizierten Extrak~e stammten aus einer Charge und h~tten fiber die Dauer der Versuehe einen gleiehb]eibenden Titer yon 1:16 gegen BlutkSrperchenaufschwemmungen der Gruppe A r
3. Anti-A2-Reagens des S e r u m - I n s t i t u t s Dr. H a n s Molter
Dieser E x t r a k t stammte ebenfalls aus einer Charge und wurde als handels- iibliches Pr~parat ge]iefert. Es ist ein Anti-0 (H)-Phytagglutinin 1 aus dem Samen yon Laburnum alpinum. Der Titer war iiber die Dauer der Versuehe gleiehbleibend:
- - gegen Blu~kSrperehenaufschwemmungen der Gruppe A s
1 : 16 gegen BlutkSrperehenaufschwemmungen der Gruppe A s
1 : 4 gegen Blutk5rperchenaufschwemmungen der Gruppe B
1:32 gegen BlutkSrperchenaufsehwemmungen der Gruppe 0 Tiermaterial
24 virginelle Meerschweinchen. Bei Beginn der Versuche durehsehnittliches Gewicht der Tiere von 250--300 g. Vor dem Entbluten durchschnittliches Gewicht 350--400 g. Die Tiere einer Versuehsreihe wurden yon den Tieren anderer Ver- suchsreihen getrenn~ gehalten.
I. Sensibilisierungsplan der u o i t Phaseolus lunatus (4 Tiere):
0,5 em ~ des Extraktes (0,646% Eiweil~ naeh KJELDAnL) intraperitoneal, je 0,1 cm 8 E x t r a k t am 3 , 6., 9., 12. und 15. Tag. - - Entblutung, Uterusexstirpation and Prfifung der anaphylaktisehen Reaktion 23--26 Tage n~eh der letzten Injektion.
II. Versuehsanordnung mit dem Anti-A1-Phytagglutinin (6 Tiere). 0,4 cm 3 des Extraktes (Eiweil3gehalt 0,301% naeh Kj~.LnAm~), eberffalls intraperitoneal. Je 1 Dem ASID-InstRut Miinchen and Herrn Dr. MOLTER, Heidelberg, sind wir zu Dank ffir die grol~ziigige Bereitstellung der Phytagglutinine verpflichtet.
Versuch zum Nachweis eines Anti-Antik6rpers 569
0,1 em 3 am 3., 5., 7., 9. und 11. Tag. Priifung der anaphylaktisehen l~eaktion unmittelbar naeh der Uterusexstirpation 21--29 Tage nach der letzten Injektion.
III. Versuehsanordnung bei der l~eihe mit Anti-A2-Reagens sensibilisierten Tieren (8 Tiere) 0,4 em 3 des Extraktes (EiweiBgehalt 2,37% naeh KJ~LDAHL) am 1. und 3. Tage; je 0,I em 3 am 5., 7., 9., 11., 13. und 15. Tage. GMehfalls sofortige Anstellung der anaphylaktisehen Reaktion naeh Uterusexstirpation 16--I8 Tage naeh der letzten Injektion.
Die tnjektionen erfolgten stets intraperitoneM mittels einer Tuberkulinspritze.
Kein Tier sehockte.
Die Phaseolusextrakte wurden vor jeder Injektion friseh zubereitet. Das Anti-A 1 bzw. Anti-A2-Phytagglutinin der Firmen ASID bzw. Molter wurden je- weils der gleiehen Charge entnommen.
Entbluten der Meersehweinehen
Nackensehlag, Er6ffnen der A. carotis einer tIalsseite durch Stiehschnitt. Auf- fangen des Blutes in einem Erlenmeyer-Kolben. Sofortige Entnahme des Uterus- muskels und Einlegen in eine mit kSrperwarmer - - 390 - - TyrodelSsung gefiillte Petrisehale. An]egung je eines Organhs an beiden Enden des Muske]s.
Technik
Apparatur zur Untersuehung des Spannungszustandes bzw. des ghythmus der Bewegung des friseh exstirpierten Uterus der Firma Braun, Melsungen, Monokymo- graph mit Synchronmotor 1040. - - Konstanthaltung der Tyrode-Badefliissigkeit des Muskels auf 390 dureh Thermomix. - - Die Papiergeschwindigkeit des 18 cm breiten Kymographen betrug bei unseren Versuehen 8 , 4 r a m / r a i n . - Mittels Magnetsignal wurden Zeitkontrollen im Abstand von einer 1/8 rain am unteren Rande des berul~ten Papiers markiert.
Ver8uchsanordnung
Apparatur zur Priifung der anaphylaktischen geaktion nach SCHULTZ-DALE (44; 9a, b; 10b): Im Gegensatz zu DALV. (9a, b) haben wir die Hiikehen nicht an den UterushSrnern befestigt. I n Vorversuchen mit 20 Meerschweinehen einer anderen Immunisierungsreihe ste]lten wir fest, dab die UterushSrner yon Meer- sehweinchen im Gewicht yon etwa 350 g zu zart waren. Die Organh/~kchen rissen Mcht aus.
Bei Verwendung des UteruskSrpers hatten wir stets ein Pr~parat yon 2 em L//nge einspannen k5nnen.
C. Ergebnisse
I. Sensibilisierungsreihe mit Phaseolus lunatus-Extrakt
Die U t e r u s m u s k n ] a t u r der v e r s c h i e d e n e n Versuehstiere zeigt i n St/irke, D a u e r u n d zeitlieher Aufeinanderfo]ge u n t e r s c h i e d l i e h e Normal- kontraktionen. Die i n d i v i d u e l l e n N o r m a l k o n t r a k t i o n e n eines j e d e n Mus- kels gliehen sich a n n / i h e r n d i n der St/~rke a n d Dauer. I n der zeitlichen A u f e i n a n d e r f o l g e sind die N o r m a l k o n t r a k t i o n e n unregelmgBig (Tiere I I I , V), Tier V I zeigt keine ftir das bloBe Auge e r k e n n b a r e N o r m a l k o n t r a k t i o n . Versuche. Die Z u g a b e y o n 0,05 m l m e n s e h l i e h e r I s o - A n t i - A , Iso- A n t i - B u n d N u l l m i s e h s e r e n als k o r r e s p o n d i e r e n d e A n t i g e n e zu d e m
Dtsch. Z. ges. geriehtl. Med., Bd. 50 37
570 I~/~Ax-WEI~NER UNOKELL und GONTHER DOTZAIJER:
Panagglutinin - - Phaseolus lunatus - - in die Badefliissigkeit, fiihrt z'u lceinem fiir eine anaphylaktisehe geaktion typisehen Kontraktions- ablauf (Tiere I I I - - V I ) . ErhShung der Dosis um weitere 0,05 ml der mensehliehen Isoagglutinine (Tiere III, IV, VI) vermag gleiehfalls keine anaphylaktisehe I~eaktion auszul6sen. Lediglieh bei V ist auf Zugabe yon Iso-Anti-A, 0,05 ml, eine Anderung im Kontraktionsablauf siehtbar, die aber im Vergleieh mit den anaphylaktischen Reaktionen auf Zugabe von 0,05 ml des spezifisehen Antigens, Phaseolus lunatus (Ph), als nieht relevant anzusehen ist.
KontroUe. Um die GewiBheit zu haben, dab der vorgelegte Uterus- muskel die Fghigkeit, anaphylaktiseh zu reagieren, besaB, wurden Kon- trollen durch Zugabe des entspreehenden Antigens, bier Phaseolus lunatus-Extrakt, vorgenommen.
Die durch eine anaphylaktisehe Reaktion bedingte Kontraktion zeich:
net sieh durch den sehne]len Eintritt naeh der Antigengabe, dureh den steilen, die Normalkontraktion an Hubh6he welt fiberragenden Anstieg und durch das lange Verweilen des Muske!s in diesera verst/irkten Kontrak- tionszustand aus. Die anaphylaktische Reaktion war bei allen Tieren, be- sonders ausgeprggt bei VI, zu erkennen. Selbst der 1Vfuskel, der bis zur spezifischen Antigengabe keine auf dem Kymogramm sieh abzeiehnende Normalkontraktion gezeigt hatte, antwortete auf die Gabe des Phaseolus lunatus-Extraktes mit einer in ihrem Ausmag nieht erwarteten Reaktion.
II. Sensibilisierungsreihe mit Anti-A1-Phytagglutinin A SID Wit beobaehteten wieder die unterschiedlichen Hubh6hen der Normal- kontraktion.
Versuche. Zugabe yon menschlichen Iso-Anti-A-Mischseren hut keine ffir eine Anti-Antik6rperbildung beweisende Kontraktibn zur Folge. Der Eindruek besteht vielmehr, dab die Normalkontraktionen auf diese Zugabe hin eher etwas sehw/~eher und seltener werden (VII, IX).
Mensehliehes Immun-Anti-A fiihrt in dieser Versuchsanordnnng genau- sowenig zu einer anaphylaktisehen Reaktion (VII, XI), wie iibrigens aueh der fiir die Versuchsanordnung I so wirksame Phaseolus lunatus- Extrakt (X, XI). Entspreehend keine Reaktion auf Anti-A1-Reagens (IX).
Kontrolle. Das Anti-A1-Phytagglutinin, als sloezifisehes Antigen, ver- ursaeht in alien Versuehen eine Kontraktion, die in ihrer St/~rke der Wirkung von 0,1 ml Tenosin ,,Bayer", einem unspezifisehen KramloI=
gift, gleichkommt.
I I I . Sensibilisierungsreihe mit Anti-A2-Reagens (MoLTs~) GehSrige Normalkontraktion bei allen Muskeln. Auff/~llig groB ist die Ilubh5he der 2Vormalkontraktion yon XVII. Die Kontraktionsst/~rke
V e r s u c h z u m N a c h w e i s e i n e s A n t i - A n t i k S r p e r s 57t
mach~ die anaphylaktische l~eaktion auf Zugabe des spezifisehen Anti- gens undeutlich.
Versuche. Wie bei den vorherigen Kymogrammen verursaehten die korrespondierenden Antigene keine anaphylaktisehe Kontraktion des
l i t t t t t
o~13 W ~ ~ W Pi~
, I I 1 ~ I : I I Ill I I : I I I I I I ' I I I l ! r t l I I I I r I l s r ] 4 1 r ~ I I l l l i f I I I r l l r l l r f i l r E i I I I I I
A b b . 1 2 7
r ! i i i i r i i r ii , i i r ~ l i i i 1 1 1 1 1 1 1 1 r i i r r r i i [ [ ~ i i r t ~ I I l l i i i r l i I i i i I i i I ! i i i i i i I ;
A b b . 2 2 Z g
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I I i i l l ! i r I i I i E I I l ~ l l l l l l l ! l l l i l r ! l l l l l l i l l ~ l l I i l l l l l [ l l l r l l l l l l l l l l l f l l l l
A b b .
A b b . 1 - - 4 . ~ K y m o g r a m m e w e r d e n g e z e i g t . D i e r S m i s c h e n Z a h l e n b e z i e h e n s i c h a u f d e n B e f u n d e i n e s e i n z e l n e n V e r s u c h s t i e r e s . - - I I [ P h a s e o l u s l u n a t u s ; X I A n t i - A ~ ; X I X w a d X X A n t i A~. - - D i e P f e i l e w e i s e n m f f d e n Z e i t p u n k t u n d d i e A r t d e r v e r s c h i e d e n e n S e r u m - z u g a b e n h i n (a = I s o - A n t i - A - M i s c h s e r u m ; fl = I s o - A n t i - B - M i s c h s e r u m ; a fl = I s o - N u i 1 - Mischserv_ra; A n t i - A = I r n r n u n - A n t i - A - S e t n ] x n ; A n l i - B = I m m n n - A n ~ i - B - S e r u m ; P h = P h y t a g g l u t i n i n , m i t d e m d i e S e n s i b i l i s i e r u n g s 4es j e w e i l i g e n T i e r e s v o r g e n o m m e n w~]rde;
P l = P h ~ s e o l n s l u n a t u s ; I f = W e e h s e l t i e r B a d e f l i i s s i g k e i t . ) Z e i t m a r M e r u n g a m u n t e r e n R a n d e des K y m o g r a m m s ; Z a e k e n a b s t a n d 30 see
Uterusmuskels (Iso-Anti-A, Nullmischserum und Anti-At-Serum vom Aal).
Anti-A~-Phytagglutinin und Phaseolus lunatus sind in dieser Ver- suchsreihe v511ig wirkungslos.
Kontrolle. Da.s Ausmag und die Form der Kontraktionen auf Zugabe des spezifischen Antigens zeigen eine starke Ahnliehkei~ mit der Wir- kung yon Tenosin auf den Uterusmuskel. Versuch XIV is~ miBlungen.
3 7 *
572 MAx-Ws.RS~ UNeXELL und G~NTHER DOTZAUER:
Es bereitete groBe Schwierigkeiten, den sehr kleinen und zarten Muskel einzuspannen. Die Organhakchen rissen mehrmals aus. Das Uterus- praparat n u B t e verworfen werden.
Zusammen[assung
1. Der iiberlebende U t e r u s n u s k e l der Meerschweinehen war gegen den jeweiligen Pflanzenex~rakt sensibilisiert.
2. Eine Anti-AntikSrperbildung konnte nicht naehgewiesen werden;
eine gleiehzeitige Sensibflisierung gegen die korrespondierenden Anti- gene heterogener Herkunft konnte nieht iestgestellt werden.
3. Am Beispiel yon Phaseolus lunatus wird die hohe Enpfindlich- keit der Sehultz-Daleschen Reaktion denonstriert. Die Zugabe yon 0,05 ml E x t r a k t n i t e i n e n Eiwei~gehalt yon 0,646 g-% (entsprieht 6-~g Eiwei~) zur Badefliissigkeit des Muskels (50 ml) v e r n o c h t e den sensibilisierten Uterusmuskel zur kr~ftigen Kontraktion zu bringen.
D. Das Problem des Anti-AntikSrpers
1. Theoretische ~)berlegungen iiber die MSglichlceit tier Entstehung echter Anti-AntikSrper
D a der AntikSrper ein EiweiI~ ist, h u b er ffir einen artfrenden 0rganisnus ein Antigen sein. Es ist vorstellbar, dal~ die Molekfilgruppe, die spezifiseh nit d e n homologen Antigen reagiert, in einem fremden Organismus als determinante Grnppe wirkt. Der gegen sie gebildete AntikSrper (,,Anti-AntikSrper") ws dann in der Lage, die spezifisehen Funktionen des AntikSrpers, wie Agglutination, Praeipitation usw. auf- zuheben.
Das Problem der Bildung yon Anti-AntikSrpern ist haufig angespro- chen worden, hat aber zu wenig beiriedigenden Ergebnissen gefiihrt.
2. Literaturi~bersicht zum Problem des Anti-Antik5rper8
E ~ L I C H und I ~ O ~ O T ~ n i n m u n i s i e r t e n Ziegen mit Rinderblut lysierendem Kaninchenserum. Das Immunserum der Ziegen h e n n t e die Rinderblutlyse des Kaninehenserums. Andere Versuche zeigten aber, dab jedes Normalantikaninehenserum den gleichen Eifekt hatte.
FORD 13 imnunisierte Hiihner mit Normalkaninchenserum, das einen normalen Agglutinationstiter yon 1:5 gegenfiber Hiihnererythroeyten hatte. In einer anderen Versuchsanordnung wurden Hfihner n i t Im- munantihiihnerserum yon Kaninchen - - Agglutinationstiter 1 : 60 - - i n - nunisiert. Nach Mischung des yon diesen Hfihnern gewonnenen Serums in einem o p t i n a l e n Verhs n i t d e n Normal- und Immunlcaninchen- serum erfolgte nach Entfernung des Pr~eipitats im Supernatant im
Versuch zum Nachweis eines Anti-AntikSrpers 573 Gegensatz zu den Kontrollen mit Normalhtihnerserum keine Agglutina- tion der H/ihnererythrocyten. Die Untersuehungen yon FORD wurden durch HYD~ und P A r s o n s 22 wiederholt und noch dadureh erweiterg, dab sie Kaninehen mit Normal- und Immunantikaninchenserum yon Hfihnern immunisierten. Das normale Hiihnerserum enthielt ein krgfti- geres Agglutinin gegen Kaninehenerythroeyten als das normale Kanin- ehenserum gegen Htihnererythroeyten. Im Gegensatz zu den Befunden Fo~Ds wurde in den Immunseren keine ,,anti-agglutinierenden" Eigen- schaften ~estgestellt. Der Uberstand agglutinierte je naeh Versuchs- anordnung Kaninchen- oder HfihnerblutkSrperchen.
BXniNY u versuehte dureh die parenterale Zufnhr von AntikSrper enthaltenden Seren eine Bildung yon Anti-Antik6rpern hervorzurufen und diese durch den Schultz-Daleschen Versueh nachzuweisen. 6 virgi- helle Meersehweinehen erhielten an 3 anfeinanderfolgenden Tagen je 0,25; 0,5 und 1,0 ems Anti-Diphtherie-P/erdeserum subeutan injiziert.
Naeh einer Inkubationszeit yon 3 Woehen wurde mit den Uterush6rnern der Sehultz-Dalesehe Versuch unternommen. In der einen Versnchs- anordnung wurden die Uteri yon 3 Tieren zuerst mit Normalpferde- serum abges~tttigt. Es erfolgte jeweils eine starke anaphylaktisehe Reaktion. Dann wurde das Anti-Diphtherie-P/erdeserum der Bade- fliissigkeit der Muskel zugetropft. Eine anaphylaktisehe Reaktion wurde yon B ~ i N u nieht beobaehtet..
In einer zweiten Versuehsanordnung wurden die Uteri der 3 weiteren Tiere zuerst mit Normalpferdeserum, dann mit Normalrinderserum ab- ges/~ttigt. Danaeh wurde ein Anti-Diphtherie-Serum vom Rind der Bade- flfissigkeit des Muskels zugegeben. Eine anaphylaktisehe Reaktion er- folgte nur auf das Normalpferdeserum.
Der Autor Iagt zusammen, der negative Ausfall der Versuehe sehliege nicht aus, dab Antik6rper als Antigene wirken k6nnten. In dieser Arbeit wird die Wiedergabe der K y m o g r a m m e vermigb. Es Iehlt aueh der Hinweis auf die Zeit, die der Autor vergehen lieB, his naeh der auf das Normalpferdeserum bin erfolgten anaphylaktisehen Reaktion, das Anti- Diphtherie-Serum yon P]erd und Rind der Badefl/issigkeit des Uterus- muskels zugesetz~ wurde. Es kann also nicht sieher ausgesehlossen werden, ob es sieh lediglieh u m eine Erm~dungserseheinung der Muskel gehandelt hatte.
Die Arbeit von K~Avs und EISENBEI~G 27 beseh/iftigt sieh mit der Frage, ob naeh der Behandlung versehiedener Tierarten mit Diphtherie- antitoxin, Typhusagglutinin und Ziegenlactoseserum Gegensubstanzen entstehen, die deren Wirkung aufheben. Das Diphtherieantitoxin nnd das Typhusagglutinin h a t t e n nach Zusatz der betreffenden Seren, die Anti-Antitoxine bzw. Anti-Anti-Agglutinine enthalten sollten, denselben Flockungs- bzw. Agglutinationstiter wie die Kontrollseren.
574 iV[Ax-WEI~NEI~ UNC:KELL und GUNTHEB~ DOTZAUEI~:
In einer anderen Versuchsanordnung immunisierten die Autoren Kaninchen gegen Ziegenmilch und erhielten auf diese Weise ein Lactose- serum, das neben einer praeipitierenden Wirkung auf das Ziegenmileh- eiweiB auch noeh Itamolysine gegen Ziegenerythroeyten besaB. Dieses Lactoseserum wurde Ziegen injiziert, aus denen die Autoren glaubten ein Antiserum gewonnen zu haben, das die Wirkung der Immunkanin- chenseren - - Pr/~eipitation des ZiegenmilcheiweiBes und Lyse der Ziegen- erythrocyten - - neutralisierte.
K~ACS und EISrC~B~I~G fiihren diese Wirkung auf ein Antih/~molysin und ein Antipr/~cipitin ohne einen gfiltigen Beweis zuriick. Die Ergeb- nisse dieser Versuehe lassen sieh folgendermaSen interpretieren: die Ziegen haben nur einen AntikSrper gegen das Kanineheneiweil~ gebildet.
Da die spezifiseh gegen ZiegenmilcheiweiB und Ziegenerythrocyten ge- richteten determinanten Gruppen Teilstiieke des KanincheneiweiBes sind, miissen sie von jedem Antikaninchenserum miterfaBt werden.
G O L D ~ G und D~ GAtCA 16 immunisierten K~ninchen mit Seren yon rheumatisehen Kindern. Das Serum dieser Kaninchen wurde mit dem Serum sicher nieht rheumatiseher Erwaehsener absorbiert und dann im Pr~cipitationsversuch gegen Rheumatikersera getestet. Eine Precipita- tion wurde nicht beobachtet.
Im Itinbliek anf die Therapie des Sehwarzwasserfiebers versuehten Vomw und VOlGT 5~ die M6g]iehke]t der Bildung eines Antih/~molysins nachzuweisen. Hiimolysierende Seren erhielten sie van Kaninchen, die mit gewasehenen E r y t h r o c y t e n der Blutgruppen 0, A, B und AB vor- behandelt waren. Mit diesen Seren wurden normale Kaninchen immuni- siert. Die Antiseren der Kaninehen, die ein Antih/~molysin enthalten sollten, konnten aber die H~molyse dutch die hiimolysierenden Kanin- chenseren weder verhindern noeh hemmen. ,,Erfolg" hatten die Autoren durch Immunisierung eines Lammes mit HammelblutkSrperehen lysieren- dem Kaninchenserum. Das Immunserum dieses Lammes hob je nach dem Grad der Verdfinnung die Wirkung des lysierenden Kaninchenserums a.uf oder hemmte sie. Wurden die tIammelblutk6rperchen, die mit einem Gemisch yon ,,Antihdmolysin" und Hgmolysin behandelt wor- den waren, in physio]ogischer Kochsalzl6sung gewasehen, und lieB man nun das hdmolysierende Serum allein auf sie einwirken, so t r a t H~molyse ein. Die Blutk6rperchen waren also selbst nicht resistent gegenfiber dem Lysin. Ob es sich hier nm ein eehtes ,,Antihi~molysin" handelt, ist sehr ]raglich. Bei diesen Versuchen handelt es sich praktisch wiederum nur u m eine Absorption des Kanincheneiweil~es einsch]ieBlieh der deter- minanten Gruppe, die die H/~molyse bewirkt.
LAPO~T~, P ] ~ Z u. Mitarb. 31 haben Kaninehen mit den spezifischen Prdcipitaten der syphilitischen Flockungsreaktion behandelt und erhielten ein Serum, das spezifisch in Pracipitation und Komplementbindung mit
Versuch zum Nachweis eines Anti-AntikSrpers 575 dem Serum syphilitiseh erkrankter Menschen reagierte. Nach Ansicht der Autoren kann es sich hierbei nur um einen echten Anti-Antikbrper handeln. K ~ i ~ konnte die yon LAPO~TE U. Mitarb. gewonnenen Er- gebnisse nicht best/~tigen. Immunisierungsversuche zur Frage der Anti- AntikSrperbildung mit Antigen-Antik6rperkomplexen erscheinen uns sehr ungeeignet.
Br~GEL 5 immunisierte Kaninchen mit Paratyphus B agglutinierenden Seren yon Mensch und Kaninehen. Der Komplementverbrauch eines Gemisches yon agglutinierendem Serum und des Kaninchenimmun- serums sollte mit einem Gemisch des agglutinierenden Serums und eines indifferenten Serums - - als Kontrolle - - verglichen werden. Alle agglutinierenden Seren ergaben mit den Kontrollseren, die gleiche bzw.
verwandte Agglutinine besagen, keine Komplementbindung. Mit phy- siologiseher KoehsalzlSsung erfolgte gleichfalls keine Reaktion. Kom- plementbindung wurde jedoeh nachgewiesen, wenn die agglutinierenden Seren mit den betreffenden Antiseren zusammengebraeht wurden. Es ergaben sieh deutliehe Bindungs~iter, sowohl mit dem homologen als auch mit dem heterologen Antiserum. In der Diskussion seiner Arbeit erklgrt BING~L: Ob es tats/tehlich die Agglutinine sind, die in diesen Versuehen Antigeneharakter zeigten, oder andere Antik6rper der agglutinierenden Seren, ist irrelevant,, solange es darauf ankommt fest- zustellen, ob Bakterienantik6rper schlechthin ihrerseits antigen sein kSnnen.
MILGI~OM, I)UBISKI ulld WOZNICZKO 35 fanden unter 2000 menseh- lichen Blutproben 10 Seren, die, ghnlieh wie das Coombs-Serum, menseh- liche BlutkSrperchen, die mit inkompletten Rh-Antik6rpern beladen waren, agglutinierten. Der agglutinierende F a k t o r erwies sieh als thermostabil. Er lieB sich dutch mit l%h-AntikSrpern beladene Erythro- cyten sowie dureh AntikSrpereluate neutralisieren. Naeh Ansieht der Autoren handelt es sich am ehesten um einen gegen AntikSrperglobulin geriehteten Antik6rper. Misehungen solcher menschliehen Antiglobulin- seren mit inkompletten Anti-Rh-Sereu verhalten sieh wie komplette Anti-Rh-Seren, indem sie E r y t h r o e y t e n mit den entspreehenden Rh- Antigenen in NaC1-LSsung zu agglu~inieren vermSgen. Die mensch- lichen Antiglobulinseren kSnnen beim Coombs-Test die tierisehen Seren ersetzen. Dabei ist es unn6tig, die beladenen E r y t h r o e y t e n zu wasehen.
lVIILc~o~ u. Mitarb. fanden in der Krankengesehiehte und Familien- anamnese keine auffallenden Zusammenh~nge bei den Patienten, die diesen ,,Anti-Antik6rper" besagen. Sie halten die Anti-AntikSrper lfir eine Abnormit/~ in der Zusammensetzung der Serumproteine. Diese Abnormitgt konnte aber in der Elektrophorese nieht best~tigt werden:
Eine n e u e M6gliehkeit, das Problem des Anti-Antik6rpers zu 16sen, bietet sieh dutch Immunisierungsversuehe mit den Phyth~magglutininen.
576 i~Ax-WERNER UNCKELL und GUNTHER DOTZAUER:
Diese Substanzen wfirden in geradezu idealer Weise die Kriterien er- ffillen, die DoER~ 1~ a zum Naehweis des Anti-AntikSrpers aufgestellt hat.
Nach Demur kann man erst yon der Existenz echter Anti-AntikSrper iiberzeugt sein, wenn das im Immnnisierungsversuch gewonnene Anti- serum nieht nur mit dem homologen ,,Anti/cSrperantigen", sondern auch mit AntikSrpern, die, in ihrem Artglobulinaufbau g~nzlich yon dem homologen AntikSrperantigen verschieden, beziiglich der serologischen Spezifit~t aber gleieh sind, in signifikant deutlicher St~irke in Reaktion tritt.
RENKONEN r immunisierte Kaninehen mit gereinigten EiweilL extrakten aus Vicia cracca-Samen (Anti-A). AntiIcdrper wurden erhal- ten, die in der Komplementbindung spezifisch mit Vicia cracca-Extra/c- ten reagierten. Im Agglutinationshemmungstest hoben sie die A1-Ham- agglutination auf, aber nicht die der menschliehen Iso-Anti-A-Seren.
RENKONEN zog aus diesen Versuehen den Schlul~, dal~ das Vieia cracca- Globulin veto menschlichen Iso-Anti-A verschieden ist.
M. K~f3P~ 290 halt diese Folgerung ffir zu weitgehend. RENKONEN babe einen AntikSrper gegen das Vieia cracea-Globulin erhalten, ohne aber zu wissen, ob /iberhaupt AntikSrper gegen die spezifisehe Anti-A- Molektilgruppe des Vieia-eraeca-Globulins entstanden seien.
X~f3~E ~ge immunisierte K~niachen mit gereinigten Iso-Anti-A- AgglutininlSsungen, in einer zweiten Versuchsanordnung Mause mit den pflanzlichen Anti-O-Globulinldsungen aus Cyt. Laburnum alpinum-Samen.
In der Pr~cipitationsreaktion konnte mit den Immunkaninchenseren kein Anhalt ffir die Bildung eines Anti-AntikSrpers gefunden werden. Die Reaktionen der Seren gegeniiber Iso-Anti-B und Iso-Anti-AB-Seren waren yon gleieher Starke. In der Agglutinationshemmungsreaktion sehien n u t eine schwaeh erkennbare starkere Hemmung der Iso-Anti-A- Agglutination gegeniiber A 1 vorhanden zu sein, im Vergleieh zu derjeni- gen der Iso-Anti-B-Agglutination gegentiber B-Erythrocy~en.
Bei den mit pflanzlichen Anti-O(H)-Agglutininen immunisierten M~usen beobaehtete K~OsE lediglieh in der Agglutin~tionshemmungs- reaktion Antiglobuline, die die spezifisehe Agglutination der Cyt. Labur- num alpinum-Extrakte gegenfiber 0-Erythroeyten in gewisser Starke hemmten.
Befunde der Komplementreaktion mit den lmmunkaninehenseren sprachen deutlieh fiir eine gewisse Spezifitat der erhaltenen Antik6rper gegen die Anti-A-Gruppe der Agglutinintrager, indem sowohl das homo- loge Iso-Anti-A starker ale das Iso-Anti-B in Reaktion trat, als aueh pflanzliche Anti-A-Agglutinine aus Limabohnen deutliehe Bindungstiter aufwiesen.
Kaf3PE will seine Untersuehungsergebnisse mit Vorsicht im positiven Sinne des Problems bewertet wissen. Er ist der Ansicht, dab man erst
Versuch zum Nachweis eines An~i-Antik6rpers 577 dann v o n d e r antigenen Eigenschaft der prosthetisehen Antik6rper- gruppe iiberzeugt sein kann, wenn es gelingen sollte, ein Anti-Agglutinin zu gewinnen, das in der Agglutinationshemmungsreak~ion mit dem homo- logen und anderen, giinzlieh heterologen, Agglutinintr~gern mit gleich- sinniger Wirkungsgruppe zu reagieren in der Lage ist.
E. Kritik der Ergebnisse der Voruntersueher I. Ergebnisse mit ,,positivem" Resultat
~) Absorption des Tr/igereiweiBmolekfils der Antilcdrper t/iuscht ein positives Ergebnis vor, da die determinanten Gruppen miterfaBt wet- den (EHRLICII, MORGENROTII, FORD, EISENBERG, VOIGT u n d VOIGT).
Die B e l u n d e y o n F o R D sind insofern bemerkenswert, weft sie y o n den N a c h u n t e r s u c h e r n H Y D E u n d P A R S O N S nicht best~tig~ w e r d e n konn- ten. W ~ h r e n d F O R D seine U n t e r s u c h u n g e n auf optimale Mischungsver- h~Itnisse der Antik6rper mit den ,,Anti-Antik6rpern" abstellte, sind die Ergebnisse y o n H Y D E u n d P A R S O N S unter U m s t ~ n d e n dadureh erkl~rbar, d a b ihr A n g e b o t des ,,Anti-Antik6rpers" quantitativ un- zureichend war.
b) Als ein Fehler im Ansatz der Versuche mul~ das Ergebnis yon LArORTE U. Mitarb. bewertet werden, da die Immunisierung nicht mit dem An~ikSrper Mlein, sondern mi~ dem P r o d u k t der Antigen-Anti- k6rperreaktio~ erfolgte. Ganz abgesehen davon konnten die Nach- untersuehungen yon KRi~PE diesen Befund der Autoren nieh~ bestgtigen.
MILGRO~ u. Mitarb. verkermen die serologisehe Wirksamkeit der yon ihnen gefundenen mensehliehen Antiglobulinseren, wenn sie diese f/Jr Anti-An~ik6rper halten. 5Iit dem gleiehen Reeht k6nnten dann aueh tierisehe Coombs-Seren als Anti-Angik6rper bezeiehnet werden. Ein Coombs-Serum ist naeh heutiger Vorstellung ein Antik6rper gegen das mensehliehe Globulin und nieht gegen die determinante Gruppe dieses Globulins, die bereits dureh die Rh-An~igene spezifiseh gebun- den ist.
e) BING~EL k o m m t auf Grund der Komp~ementbindungsrealction zu einer Bejahung der Existenz yon Anti-Antik6rpern. Die Komplement- bindungsreak~ion is~ aber in ihrer Spezifi~/i~ umstri~ten l~ aa und er- schein~ daher ungeeignet, eine sichere Aussage zu unserer Problem- stellung zuzulassen. Es sei hierzu DOERR ]0b zitiert: ,,Aus diesen Bei- spielen geht hervor, da[~ das Komlolementbindungsverfahren versagen oder zu irrigen Schliissen verleiten kann, wenn es sich datum handelt, den An~igencharakter einer unbekannten Substanz sicher festzustellen."
Hierunter fallen auch die Ergebnisse, die KRi2P~ mi~ der Komplement- bindungsreak~ion erhalten hat.
578 ~Lkx-WERNER UI~CKELL u n d GffNTHER DOTZAUER:
I I . Ergebnisse mit ,negativem " Resultat
a) Den Versuchen yon GOLDBEI~G und Dn GARA ist entgegenzuhalten, dab das Tr~gereiwei0molekiil vom Kaninchen gleichzeitig determinante Gruppen gegen das menschliche Globulin ganz allgemein und gegen das Immunglobulin yon Rheumatikern besitzen kann. Absorption mit Seren yon Niehtrheumatikern kSnnte also beide determinante Gruppen aus dem Kaninchenserum entfernen und damit das negative Ergebnis erkl~ren.
b) B ~ R ~ u hat praktiseh nur seine Befunde verSffentlicht. Eine eingehende Kritik ist daher nieht mSglieh.
c) Im Agglutinationshemmungsversuch ist es I~ENKONEN nieht ge- lungen, mit Kaninehenimmunserum gegen Vicia cracca-Extrakte (Anti- A1-Phytagglutinin ) die A1-H~magglutination menschlicher Iso-Anti-A- Seren zu hemmen oder aufzuheben. Dieser Befund ls folgende Deu- tung zu :
1. Es gibt keine Anti-AntikSrper.
2. Die Tiere haben keinen AntikSrper gegen die Anti-A1-Gruppe des Vieia eraeca-Eiwefl~es gebildet.
3. Die Anti-A-Grnppe des Pflanzenextraktes ist v511ig yon der Anti- A-Gruppe mensehlieher Isoagglutinine verschieden.
Vor diese Situation, dab er keinen dieser Punkte sicher beantworten kann, wird jeder Untersueher gestellt, der zur Problemstellung des Anti- Antik6rpers mit pflanzlichen Hi~magglntininen immunisiert und zu einem negativen Ergebnis kommt.
F. Kritik der eigenen Untersuehungsergebnisse
Wir sensibilisierten 4 Meerschweinchen mit einem panagglutinieren- den Pflanzenextrakt (Phaeolus lnnatus), 6 Meerschweinchen mit einem Anti-A1-Phytagglutinin (Dolichos biflorus) und 8 Meerschweinchen mit einem Anti-A~-Phytagglutinhl (Laburnum alpinum).
Wir gingen yon der Voraussetzung aus, dal~ die determinanten Grup- 13en der Phyth/~magglutinine, die gegen bestimmte mensehliehe Blnt- gruppen spezifisch ausgerichtet sind, identisch oder zumindest yon ver- wandter Struktur mit denen der menschlichen Isoh/~magglutinine sind.
Durch die anaphylaktische Reaktion nach SCttULTZ-DALE konnte gezeigt werden, dab si~mtliche Tiere nur gegen das spezifische Pflanzenantigen sensibilisiert waren und nicht gleichzeitig gegen die heterogenen Antigene der gleichen serologischen Aktivit/~t. Es ist uns also nicht gelungen, den Beweis ffir die Bfldung eines Anti-AntikSrpers zu bringen.
Unsere Untersuchnngen sind mSglicherweise eine Stfitze der ttypo- these yon I t o o x E ~ und BOYD 21. Danach gibt es keine prosthetische Anti-
Versueh zum Naehweis eines Anti-AntikSrpers 579 kSrpergruppe a m Globulinmolekiil. Der Antik6rperbezirk des Globulins entsprieht einer Tasche, in deren F o r m das entsprechende Antigen ein- gep~Bt wird.
Die W a h l der Phytagglutinine erschien uns besonders geeignet, die strengen Bedingungen zu erfiillen, die D o v ~ fiir den Beweis einer Existenz eehter Anti-Antik6rper sufgestellt hat.
Auf jede chemische Behandlung der Samenmaterialien wurde ver- ziehtet, u m eine D e n a t u r a t i o n der PflanzeneiweiBe zu vermeiden.
Die phytoserologischen Arbeiten y o n M o ~ z b a t t e n uns dazu an- geregt, die anaphylaktisehe Reaktion fiir die Problemstellung zu ver- werten. Die Empfindlichkeit der anaphyl~ktischen Reaktion nach S c ~ u L ~ z . D A n ~ , sa, b, ~0b ist der Prfieipitationsmethode iiberlegen s~ g.
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