Detektion und Charakterisierung von Proteinkinasen

Detektion und Charakterisierung von Proteinkinasen

Dissertation

zur Erlangung des Doktorgrades der Naturwissenschaften

vorgelegt beim Fachbereich

Biochemie, Pharmazie und Lebensmittelchemie der Johann Wolfgang Goethe - Universität

in Frankfurt am Main

von

Thomas Karn aus Frankfurt am Main

Frankfurt am Main, 1996

Dekan: Prof. Dr. B. Ludwig

1. Referent: Prof. Dr. H. Rübsamen-Waigmann 2. Referent: Prof. Dr. Dr. H. Fasold

Diese Arbeit wurde am Chemotherapeutischen Forschungsinstitut Georg-Speyer-Haus in Frankfurt am Main unter der Leitung von Frau Prof. Dr. H. Rübsamen-Waigmann angefertigt.

Frau Prof. Rübsamen-Waigmann danke ich für die Vergabe des interessanten Themas, den Arbeitsplatz, die Betreuung und die ständige Diskussionsbereitschaft.

Herrn Priv. Doz. Dr. K. Strebhardt, unter dessen Leitung diese Arbeit entstand, danke ich für sein großes Engagement bei der Betreuung und seine ständige Unterstützung.

Prof. K.-H. Grezschik danke ich für die DNA somatischer Zellhybride, Frau Dr. M. Adamski für rekombinante Nef-Baculoviren und Anti-Nef Serum und Herrn Dr. H. Kühnel für die Einführung in die Oligonukleotid-Synthese.

B. Böhme, A. Bräuninger, B. Hock, U. Holtrich und G. Wolf danke ich für die produktive Zusammenarbeit und allen weiteren Mitgliedern der Arbeitsgruppe Onkologie sowie den anderen Arbeitskreisen des Georg-Speyer-Haus für das gute Betriebsklima.

Karn, T., Holtrich, U., Bräuninger, A., Böhme, B., Wolf, G., Rübsamen-Waigmann, H. &

Strebhardt, K. (1993), Oncogene 8, 3433-3440: Structure, expression and chromosomal mapping of TKT from man and mouse, a new subclass of receptor tyrosine kinases with a factor VIII-like domain.

Kobelt, D., Karn, T., Hock, B., Holtrich, U., Bräuninger, A., Wolf, G., Strebhardt, K. &

Rübsamen-Waigmann, H. (1994). Oncology Reports 1, 12691-1275: Human and Xenopus MO15 mRNA are highly conserved but show different patterns of expression in adult tissues.

Holtrich, U., Wolf, G., Bräuninger, A., Karn, T., Böhme, B., Rübsamen-Waigmann, H. &

Strebhardt, K. (1994), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 1736-1740: Induction and downregulation of human PLK, a serine/threonine kinase expressed in proliferating cells and tumors.

Bräuninger, A., Karn, T., Strebhardt, K. & Rübsamen-Waigmann, H. (1993), Oncogene 8, 1365-1369: Characterization of the human CSK locus.

Strebhardt, K., Holtrich, U., Bräuninger, A., Karn, T., Böhme, B., Doermer, A. & Rübsamen- Waigmann, H. (1994), Oncology reports 1: 195-201: Oncogenic alterations in primary human lung tumors (Review).

Hradetzky, D., Schimpf, A., Karn, T., Strebhardt, K. & Rübsamen-Waigmann, H. (1992), BTE 9, 471-472: Taq cycle sequencing of plasmid DNA purified by various procedures.

Strebhardt, K., Holtrich, U., Karn, T., Bräuninger, A., Böhme, B., Wolf, G., Doermer, A. &

Rübsamen-Waigmann, H. (1994), J. Cell. Biochem. Suppl.18D, 103: FGFR4 and PLK, two protein kinase genes which show altered expression in human neoplasms, might serve as molecular marker for human lung tumors.

Gärtner, T., Luzius, H., Karn, T., Dörmer, O., Rübsamen-Waigmann, H. & Strebhardt, K.

(1996), Eur. J. Biochem., z.Publ. eingereicht: Alternative splicing of c-tkl.

Kongreßbeiträge:

Bräuninger, A., Karn, T., Strebhardt, K. & Rübsamen-Waigmann, H. (1992), 8th Ann. Meet.

on Oncogenes: Genomic organization of CSK represents an intermediate between the SRC family and FES.

Karn, T., Holtrich, U., Bräuninger, A., Böhme, B., Wolf, G., Strebhardt, K. & Rübsamen- Waigmann, H. (1993), 9th Ann. Meet. on Oncogenes: TKT, a novel receptor tyrosine kinase, has a unique extracellular domain with homologies to factor VIII like sequences.

Karn, T., Kobelt, D., Holtrich, U., Bräuninger, A., Böhme, B., Rübsamen-Waigmann, H. &

Strebhardt, K. (1994), 10th Ann. Meet. on Oncogenes: PLK and MO15, two human serine/threonine kinase genes, seem to be involved in cell cycle control.

Karn, T., Hock, B., Strebhardt, K. & Rübsamen-Waigmann, H. (1996), Cold Spring Harbor Meet. on Retroviruses: Two Hybrid analysis of the Nef protein of HIV2D205.

INHALTSVERZEICHNIS

INHALTSVERZEICHNIS 1

EINLEITUNG 4

Signaltransduktion über die Zellmembran 4

Rezeptor-Protein-Tyrosinkinasen (RPTKs) 4

Rezeptoren mit mehreren Untereinheiten 7

Intrazelluläre Signaltransduktion 9

Der Ras-Signalweg 9

Der Jak-Stat-Signalweg 10

Ein weiterer Signalweg zum Zellkern 11

Phospholipase C (PLC) 12

Phosphatidylinositol-3-Kinase (PI3K) 12

Proteindomänen als Module in der Signaltransduktion 12

SH2-Domänen 13

Die PTB-Domäne 14

Die PH-Domäne 15

SH3-Domänen 16

Aufgabenstellung 17

MATERIAL UND METHODEN 18

Material 18

Geräte 18

Chemikalien 18

Kits 20

Säulen 20

Sonstiges 20

Bakterienstämme 20

Phagen 20

Hefe-Stämme 20

Methoden 21

Index für Medien und Lösungen 21

Nukleinsäure-Präparationen 22

Quantifizierung von Nukleinsäuren 23

Reinigung und Konzentration von DNA 23

Enzymatische Reaktionen mit Nukleinsäuren 24

Synthese und Aufreinigung von DNA-Oligonukleotiden 24

PCR-Techniken 25

Analyse von Nukleinsäuren 26

DNA-Sequenzierung 28

Genbanken 29

E. coli Kultur und Transformation 30

Phagen-Techniken 32

Hefe-Techniken 33

Proteinexpression 36

ERGEBNISSE 38

Detektion von Proteinkinasen durch RNA-PCR 38

Detektion der Rezeptor-Proteintyrosinkinase K1/TKT 38

Darstellung der vollständigen K1/TKT cDNA 40

Isolation von K1-Klonen aus cDNA-Banken 40

Verlängerung der K1-Sequenz durch Anker- und LM-PCR 40

Analyse der K1/TKT-Sequenz 43

Das K1/TKT-Protein repräsentiert eine neue Subklasse von Rezeptor-Tyrosinkinasen 43

TKT enthält eine Faktor VIII - ähnliche Domäne 47

Isolation der TKT-cDNA der Maus 49

Expressionsanalyse von TKT 51

Herstellung einer spezifischen TKT-Sonde 51

Northern-Blot Analyse der TKT-Expression 51

Chromosomale Lokalisation des humanen TKT-Gens 54

Charakterisierung des genomischen Locus von TKT 55

Detektion von Proteinkinasen durch PCR mit Primern für konservierte Motive

von Kinase-Domänen 57

Isolation und Charakterisierung der Protein-Serin/Threonin-Kinase K3 59

2-Hybrid-System 63

Untersuchungen zu Rezeptor-Proteintyrosinkinasen im 2-Hybrid-System 65 Wechselwirkungen von Proteinkinasen mit dem Nef-Protein von HIV 66

Optimierung des 2-Hybrid-Systems für Genbank-Screenings 69

2-Hybrid-Screening mit dem Nef-Protein von HIV2_D205 71

Überprüfung der Interaktionen in vitro 73

Analyse der Nefin1-Sequenz 74

Expressionsanalyse von Nefin1 77

Kartierung des Nefin1-Bindungsbereichs von NefHIV2D205 78

DISKUSSION 80

Die Rezeptor-Proteintyrosinkinase TKT 80

Die Protein-Serin/Threoninkinase K3 87

Interaktionen des Nef-Proteins von HIV mit Proteinkinasen 89

Interaktion mit der Proteintyrosinkinase HCK 89

Nefin1, ein spezifischer Interaktionspartner für HIV2_D205-Nef 91

ZUSAMMENFASSUNG 93

LITERATUR 94

Abkürzungen

aFGF saurer Fibroblasten-Wachstumsfaktor (acidic Fibroblast Growth Factor)

AS Aminosäure

ATP Adenosin-5'-Triphosphat

bFGF basischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor (basic Fibroblast Growth Factor)

BDNF Brain Derived Neurotrophic Factor

bp Basenpaare

BSA Rinderserumalbumin (Bovine Serum Albumin)

cDNA complementäre DNA

Ci Curie

Cip Calf Intestine Phosphatase

CSF-1 Colony Stimulating Factor I

CTAB Cetyltrimethylammoniumbromid

DAG Diacylglycerin

DKFZ Deutsches Krebsforschungszentrum

DNA Desoxyribonukleinsäure

dNTP Desoxynukleotid-5'triphosphat

DTT Dithiothreitol

EDTA Ethylendiamintetraessigsäure

EGF Epidermaler Wachstumsfaktor (Epidermal Growth Factor)

EMBL European Molecular Biology Laboratory

FGF Fibroblasten-Wachstumsfaktor (Fibroblast Growth Factor)

FN-III Fibronectin III

HUSAR Heidelberg Unix Sequence Analysis Resource

Ig Immunglobulin

IPTG Isopropyl-ß-D-thiogalactopyranosid

kb Kilo-Basenpaare

kD Kilo-Dalton

MMulV Moloney Murine Leukemia Virus

mRNA Boten-RNA (Messenger RNA)

NGF Nerven-Wachstumsfaktor (Nerve Growth Factor)

NT3, NT4/5 Neurotrophin-3, -4/5

OD Optische Dichte

PCR Polymerase-Kettenreaktion (Polymerase Chain Reaction)

PDGF Platelet Derived Growth Factor

pfu Plaque bildende Einheiten (Plaque forming units)

PI3K Phosphatidylinositol-3-Kinase

PIP2 Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat

PK Protein-Kinase

PSK Protein-Serin/Threonin-Kinase

PTK Protein-Tyrosin-Kinase

RNA Ribonukleinsäure

RT Reverse Transkriptase

RPTK Rezeptor-Protein-Tyrosin-Kinase

SH2-Domäne Src-Homology-2-Domäne

SH3-Domäne Src-Homology-3-Domäne

TKT Tyrosine Kinase related to TRK

ÜNK Übernachtkultur

upm Umdrehungen pro Minute

X-Gal 5-Brom-4-Chlor-3-Indoyl-ß-D-galactopyranosid

EINLEITUNG

Eine grundlegende Eigenschaft von Zellen ist die Fähigkeit, auf Signale aus ihrer Umgebung zu reagieren. In vielzelligen Organismen hat die Notwendigkeit, das Verhalten einer Zelle mit dem ihrer Nachbarzellen und den Bedürfnissen des Gesamtorganismus zu koordinieren, zu einer Entwicklung von komplexen Signalübertragungswegen zwischen den Zellen geführt. So veranlaßt die Zugabe von Serum oder isolierten Wachstums- oder Differenzierungsfaktoren zu Zellkulturen die Zellen zur Aktivierung von multiplen Signalübertragungswegen. In den Zellen werden Kaskaden von Informationsübertragungen in Gang gesetzt, die an der Zellmembran initiiert werden und im Zellkern kumulieren, um letztendlich die Genexpression und zelluläre Proliferation zu steuern. In Krebszellen ist die ordnungsgemäße Funktion dieser Signalwege gestört, was beispielsweise dazu führt, daß diese Zellen die Anweisung erhalten zu proliferieren, obwohl sie es eigentlich nicht tun sollten. Ebenso liegen Störungen der Signaltransduktion anderen wichtigen Krankheiten zugrunde, wie Diabetes oder Krankheiten des Immunsystems und Herz/Kreislauf-Systems.

In den letzten Jahren wurden viele Schritte dieser Signaltransduktionswege entdeckt und aufgeklärt. Dabei zeigte sich, daß viele der Schlüsselrollen bei diesen Prozessen von Proteinkinasen gespielt werden, deren enzymatische Aktivität darin besteht, Tyrosin-Reste (Protein-Tyrosinkinasen, PTKs) bzw. Serin- oder Threonin-Reste (Protein- Serin/Threoninkinasen, PSKs) von Proteinen zu phosphorylieren.

Signaltransduktion über die Zellmembran

Zellwachstum, Differenzierung, Wanderung und Apoptose werden durch Polypeptid- Wachstumsfaktoren oder Cytokine reguliert, die sich als sekretierte oder auch membrangebundene Proteine im Extrazellularraum befinden. Da diese Faktoren die hydrophobe Zellmembran nicht überwinden können, müssen die Signale durch Bindung an Rezeptoren, die sich in der Membran befinden, weitergeleitet werden. Die Bindung der Faktoren an die extrazellulären Bereiche dieser Rezeptoren führt zu einer Dimerisierung oder Oligomerisierung der Rezeptormoleküle in der Zellmembran, was die Initiierung der Signaltransduktion in der Zelle zur Folge hat (s. Übersicht: Heldin, 1995).

Rezeptor-Protein-Tyrosinkinasen (RPTKs)

Stuktur

Viele der bekannten Wachsumsfaktoren (wie FGF, EGF, PDGF, NGF) binden an Rezeptoren mit PTK-Aktivität. Diese Rezeptor-PTKs (RPTKs) zeigen eine ähnliche Grundstruktur, wie in Abbildung 1 dargestellt:

Der aminoterminale Anteil des Proteins bildet den glycosylierten extrazellulären Bereich, der den Liganden bindet. In diesem Bereich zeigen sich verschiedene Strukturmerkmale bei den unterschiedlichen Rezeptoren. Es folgt ein Abschnitt mit hydrophoben Aminosäuren, der die transmembrane Domäne darstellt und ein cytoplasmatischer Anteil, der als juxtamembrane Domäne bezeichnet wird. Daran schließt sich eine katalytische Domäne von 250 Aminosäuren an, die bei allen Proteinkinasen verwandt ist. Schließlich folgt ein carboxyterminaler Schwanz, der nur wenige oder auch bis zu 200 Aminosäuren lang sein kann. Anhand der Strukturmerkmale in der extrazellulären Region von RPTKs lassen sich diese in verschiedene Gruppen einteilen (Abbildung 1 und Tabelle 1). Diese Einteilung wird auch bestätigt, wenn man die Kinasedomänen anhand ihrer Primärstruktur auf Verwandtschaft hin analysiert (s. van der Geer et al., 1994).

TIE INS.R

EGFR cys

TKT F8

KD

EGF

EPH FNIII Ig

PDGFR KI

FGFR AXL

Cadh.

RET

NGFR HGFR

LRM

Kringle

ROR RYK

saure Box

Abbildung 1: Strukturelle Klassifizierung von Rezeptor-Proteintyrosinkinasen

Verschiedene Subtypen von Rezeptor-Protein-Tyrosinkinasen sind schematisch mit ihrer intrazellulären Region (KD = Kinase-Domäne, KI = Kinase-Insert) sowie den verschiedenen strukturellen Motiven in den extrazellulären Regionen gezeigt: Cystein-reiche Regionen (cys), Immunglobulin-ähnliche Domänen (Ig), EGF-ähnliche Repeats (EGF) und Fibronectin-Typ-III-ähnliche Repeats (FNIII), Leucin-reiche Motive (LRM) sowie die Cadherin-verwandte Domäne (Cadh.) von RET und die Kringle-Domäne der RORs.

EGFR (Ullrich et al., 1984), INS.R (Ebina et al., 1985; Ullrich et al., 1985), PDGFR (Yarden et al., 1986; Claesson-Welsh et al., 1989), FGFR (Lee et al., 1989), EPH (Hirai et al., 1987), NGFR (Martin-Zanca et al., 1989), AXL (O'Bryan et al., 1991), TIE (Partanen et al., 1992), RET (Takahashi & Cooper, 1987; Iwamoto et al., 1993), HGFR (Bottaro et al., 1991), ROR (Masiakowsky & Carrol, 1992), RYK (Hovens et al., 1992).

Tabelle 1: Klassifizierung von Rezeptor-Proteintyrosinkinasen (im Georg-Speyer-Haus isolierte Mitglieder sind fettgedruckt)

RPTK-Familie Mitglieder

Die EGFR-Familie

Die vier Mitglieder der EGFR-Familie zeichnen sich in ihrem extrazellulären Bereich durch zwei Cystein-reiche Regionen aus.

-EGFR / ErbB / HER -ErbB2 / Neu -ErbB3 -ErbB4 Die Insulin-Rezeptor-Familie

Die Rezeptoren der Insulin-Rezeptor-Familie besitzen wie die der EGFR-Familie Cystein-reiche Regionen in ihren Liganden-bindenden extrazellulären Domänen. Die Rezeptoren bilden über Disulfidgruppen verbundene Heterotetramere von zwei extrazellulären -Ketten und zwei -Ketten, welche die transmembranen Regionen und die intrazellulären Kinase-Domänen enthalten.

-INS.R -IGF-1R -IRR -Ros

Die PDGFR-Familie

Die PDGFR-Familie zeichnet sich durch fünf oder sieben Immunglobulin-ähnliche Domänen aus. Die Kinase-Domäne dieser Rezeptoren zeigt eine große Insertion (60100 Aminosäuren) mit mehreren Phosphorylierungsstellen, die für die Substratbindung wichtig sind. Die Liganden dieser Rezeptoren sind relativ divergent. Es handelt sich jedoch immer um kovalent gebundene Dimere, was noch für keine bekannten Liganden einer anderen RPTK-Familie gezeigt wurde.

-PDGFR-

-PDGFR-ß -SCFR / Kit -CSF-R / Fms -Flk2 / Flt-3 -Flt-1 -Flk-1 / KDR -Flt-4 Die FGFR-Familie

Die extrazelluläre Domäne der vier FGF-Rezeptoren enthält drei Ig-ähnliche Domänen, wobei zwischen der ersten und zweiten Ig-Domäne eine Sequenz von 4-8 sauren Aminosäuren liegt. Die FGFRs bilden die Rezeptoren für die Fibroblasten-Wachstumsfaktoren (FGFs), von denen bisher neun bekannt sind, die verschiedenste Effekte ausüben können.

-FGFR-1 / FLG -FGFR-2 / Bek -FGFR-3 / FLG2 -FGFR-4 / TKF

Die eph -Familie von Rezeptor-PTKs

Diese Rezeptor-Familie mit den meisten Mitgliedern besitzt neben einer Ig-ähnlichen Domäne eine Cystein-reiche Region und zwei Fibronectin III (FNIII) Einheiten. Bei den Liganden der eph-Familie handelt es sich um eine Gruppe verwandter Proteine, die membrangebunden vorliegen. Neueste Ergebnisse deuten daraufhin, daß diese Rezeptoren eine Rolle bei der neuronalen Zielerkennung spielen (Übersicht: Tessier-Lavigne, 1995; Garrity & Zipusky, 1995).

-Eph -Elk -Eck -Eek -HEK -HEK2 u.a.

Die NGFR-Familie

Die drei Mitglieder der Familie (TrkA, B und C) haben einen ähnlichen extrazellulären Bereich, der ein Leucin-reiches Motiv und zwei Immunglobulin-ähnliche Domänen enthält. TrkA ist der Rezeptor für den Nervenwachstumsfaktor (NGF), TrkB bindet den „Brain Derived Neurotrophic Factor“ (BDNF) und Neurotrophin-4/5. TrkC ist der Rezeptor für Neurotrophin-3.

-TrkA -TrkB -TrkC

Die AXL-Familie

Neben dem AXL/UFO-Rezeptor (O’Bryan et al., 1994) wurden in neuerer Zeit zwei weitere Mitglieder dieser Familie gefunden: Eyk und SKY (auch als Tyro3, TIF oder Brt bezeichnet). Der extrazelluläre Bereich enthält Immunglobulin- und Fibronectin-III-ähnliche Domänen. Für diese Rezeptoren-Familie wurden in neuesten Arbeiten Gas6 und Protein S als Liganden beschrieben (Stitt et al., 1995; Varnum et al., 1995; Godowski et al., 1995).

-AXL / UFO / ARK -Eyk

-SKY / Tyro3 / TIF / Brt

Die TIE-Familie

Die TIE-Familie enthält bisher nur zwei Mitglieder (TIE und TIE2/Tek), für die noch kein Ligand bekannt ist. Diese beiden Rezeptoren enthalten außer einer Immunglobulin-ähnlichen Domäne und Fibronectin-III-ähnlichen Repeats auch noch EGF-ähnliche Repeats in ihrer extrazellulären Domäne.

-TIE -TIE2 / TEK

Die HGFR-Familie

Die extrazelluläre Domäne des „Hepatocyte Growth Factor Receptor“ HGFR/Met wird proteolytisch in zwei Untereinheiten gespalten, die über Disulfid-Brücken zusammengehalten werden.

-HGFR / Met -MSPR / Ron -Sea Weitere Rezeptoren: RET, RYK, ROR

Der RET-Rezeptor zeigt eine Domäne in seinem Liganden-bindenden Bereich, die auch in Cadherin, einem Zelloberflächen-Adhäsionsprotein, gefunden wird. Ryk besitzt nur einen relativ kurzen extrazellulären Bereich von 200 Aminosäuren, der keine der beschriebenen Motive enthält. ROR1 und ROR2 sind Trk-verwandte Rezeptoren, die Ig-ähnliche Domänen und Cystein-reiche Regionen aufweisen. KLG besitzt sieben extrazelluläre Ig-ähnliche Domänen wie die Mitglieder der PDGFR- Familie. Für alle diese Rezeptoren sind noch keine Liganden bekannt.

-RET

-RYK / Nyk-r / Vik / Mrk -ROR1

-ROR2 -KLG

Funktion

Durch die Ligandenbindung des extrazellulären Bereichs einer RPTK kommt es zu einer Dimerisierung oder Oligomerisierung des Rezeptors. Diese führt im Allgemeinen zu einer Transphosphorylierung eines bestimmten Tyrosins in der Kinasedomäne, was eine Steigerung der Kinaseaktivität verursacht. Ein wichtiger Weg der RPTK-Signaltransduktion ist die Autophosphorylierung bestimmter Tyrosine der RPTK selbst oder sogenannter „Docking“- Proteine (wie IRS-1, dem primären Substrat der Insulin-Rezeptor-PTK) durch die aktivierte Kinasedomäne. Diese phosphorylierten Tyrosine bilden dann Bindungsstellen für sogenannte SH2-Domänen (Src-Homology-2-Domain), die sich in vielen in Signaltransduktionswege involvierten Proteinen finden. Spezifische SH2-Domänen binden an Phosphotyrosine mit einer bestimmten umgebenden Aminosäuresequenz. Hierdurch werden spezifische zelluläre Proteine zu den aktivierten RPTKs rekrutiert. Die Bindung an den Rezeptor kann die rekrutieren Proteine auf mindestens drei Arten beeinflussen (Übersicht in van der Geer et al., 1994):

 Erstens kann das rekrutierte Protein nun selbst effizient durch die Rezeptor-Protein- Tyrosinkinase phosphoryliert und dadurch in seiner Funktion beeinflußt werden, so wird z.B. die Aktivität der Phospholipase-C- (PLC) durch Phosphorylierung erhöht.

 Zweitens kann es schon durch die Bindung der SH2-Domäne an das Phosphotyrosin der RPTK zu einer allosterischen Aktivierung des bindenden Proteins kommen. Dies gilt z.B.

für die Phosphatidylinositol-3-Kinase (PI3K) und die Proteintyrosinphosphatase SH-PTP2.

 Drittens kann die Bindung an die RPTK einen Mechanismus darstellen, Enzyme in die Nähe ihrer Substrate an die Innenseite der Plasmamembran zu bringen. So wird durch die Bindung der SH2-Domäne von Grb2 an ein Phosphotyrosin der aktivierten EGF-Rezeptor- PTK das mit Grb2 konstitutiv assoziierte Sos, ein Ras-spezifischer Guanin-Nukleotid- Dissoziations-Faktor (GNRF), an die Membran gebracht, wo er auf sein Substrat Ras wirken kann (s.u.).

Rezeptoren mit mehreren Untereinheiten

Bei Antigen-Rezeptoren von lymphoiden Zellen sind die Liganden-bindende Region, die Proteintyrosinkinase und die durch Tyrosin-Phosphorylierung gebildeten SH2-Domänen- Bindungsstellen auf verschiedenen Polypeptiden organisiert (Abbildung 2):

Der T-Zell-Rezeptor (TCR) erkennt spezifische antigene Peptide, die mit dem Multi- Histokompatibilitätskomplex (MHC) auf Antigen-präsentierenden Zellen (APCs) assoziiert sind. Das MHC-Molekül wird von CD4 oder CD8-Molekülen in der T-Zell-Membran erkannt, an die im Cytoplasma der T-Zelle die PTK Lck aus der Src-Familie gebunden ist.

Der T-Zell-Rezeptor selbst ist mit mehreren Untereinheiten (, , , ) assoziiert, die mehrere

Tyrosin-Seitenketten enthalten, welche von Lck phosphoryliert werden (Reth, 1989; Weiss, 1993).

RPTK IL-R

Ligand

P P P

P P P

TCR

SH2 SH2

MHC + Peptid

/



CD4 / 8

Lck

ZAP70

Antigen-präsentierende Zelle

P P P P

P P

//

ITAMS P P

variabel

gemeinsam

Jak

SH2 P

IL

P Stat

Jak

SH2 SH2 P SH2 P

Substrat XY

Lymphozyt

Abbildung 2: Rezeptor-PTKs und Rezeptoren mit mehreren Untereinheiten bei der Immunreaktion Rezeptor-PTKs (RPTK) bestehen in der Regel aus einer Polypeptidkette. Sie assoziieren durch Ligandenbindung zu Dimeren oder Oligomeren, worauf es zu einer Transphosphorylierung an spezifischen Phosphotyrosinen kommt, an welche daraufhin SH2- Domänen von Signalproteinen binden können. Beim T-Zell-Rezeptor (TCR) sind Ligandenbindung (des MHC-präsentierten Peptids durch - und -Kette und des MHC- Moleküls durch CD4 oder CD8), Kinaseaktivität (durch die CD4-assoziierte Proteintyrosinkinase Lck) und Phosphorylierungsstellen (ITAMs in den -, -, - und - Ketten), an welche dann SH2-Domänen-Proteine wie die PTK ZAP70 binden, auf verschiedenen Polypeptidketten organisiert. Ähnliches gilt für die Interleukin- (IL-R) und Interferonrezeptoren, bei denen für einen Rezeptor spezifische variable Ketten gemeinsam mit konstanten Ketten, die von mehreren Rezeptoren genutzt werden, den Liganden (IL) binden und daraufhin von mit ihnen assoziierten Jak-Proteintyrosinkinasen phosphoryliert werden. An diese Phosphotyrosine binden die Stat-Proteine, die nach Phosphorylierung dimerisieren, in den Zellkern wandern und als Transkriptionsfaktoren wirken (s.u.).

Diese phosphorylierten Tyrosinreste bilden dann die Bindungsstellen (ITAMs:

Immunoreceptor Tyrosin Activation Motifs) für SH2-Domänen von weiteren Signal- Proteinen, wie der PTK ZAP-70.

Ein ähnlicher Mechanismus existiert für den B-Zell-Rezeptor (BCR) von B-Zellen mit der Src-Familien Proteintyrosinkinase Lyn und der ZAP-70-verwandten Kinase Syk (Weiss &

Littman, 1994).

Die Interleukin- und Interferon-Rezeptoren bestehen aus ein bis drei Polypeptiden, wobei für einen Rezeptor spezifische variable Ketten gemeinsam mit konstanten Ketten, die von mehreren Rezeptoren genutzt werden, den Liganden binden. Die Rezeptoren werden darauf hin durch mit ihnen assoziierte Mitglieder der Jak-Familie von intrazellulären Proteintyrosinkinasen phosphoryliert (Abbildung 2). Durch diese Tyrosin-Phosphorylierung des Rezeptors werden Bindungsstellen für verschiedene SH2-Domänen geschaffen (Übersicht in Kishimoto et al., 1994; Taniguchi, 1995). So binden Stat-Proteine an die Rezeptoren, werden wiederum selbst phosphoryliert, dimerisieren daraufhin und wandern in den Zellkern, wo sie als Transkriptionsfaktoren wirken (s.u.).

Intrazelluläre Signaltransduktion

Das von aktivierten Rezeptoren gelieferte Signal wird in der Zelle durch sogenannte „second messenger“ weitergeleitet. Schon längere Zeit als second messenger bekannt sind Ca²⁺-Ionen und Phosphoinositide. Hierbei handelt es sich um relativ grobe Signale, die mit einer generellen Aktivierung der Zellen verbunden sind. In den letzten Jahren wurden jedoch mehrere genauer definierte, distinkte Signalwege, die über verschiedene Proteine laufen und von der Zellmembran bis in den Zellkern reichen, charakterisiert:

Der Ras-Signalweg

Eine gut untersuchte Komponente der intrazellulären Signaltransduktion ist p21^ras. Ras gehört zu der Familie von kleinen GTP-bindenden Proteinen, die in einem aktiven, GTP-gebundenen Zustand oder einem inaktiven, GDP-gebundenen Zustand vorliegen. Das gebundene GTP im aktiven Proteinen wird durch die intrinsische GTPase-Aktivität nach einiger Zeit gespalten.

Diese G-Proteine können auf zweierlei Arten reguliert werden: Durch GTPase-aktivierende Proteine (GAPs) einerseits, oder Guaninnukleotid-Dissoziationsfaktoren (GDFs), die den Austausch des GDP durch GTP stimulieren, andererseits.

Ras nimmt an einem Signalweg teil, dessen Ablauf vom Rezeptor bis zum Zellkern in jüngster Zeit recht gut aufgeklärt wurde (Abbildung 3): Das Adaptorprotein Grb2, das nur aus zwei SH2-Domänen und einer SH3-Domäne (Src Homology 3-Domain) besteht, bindet über seine SH2-Domänen an spezifische Phosphotyrosin-Seitenketten des EGF-Rezeptors.

Über seine SH3-Domäne ist Grb2 konstitutiv mit Sos assoziiert, einem Guaninnukleotid- Dissoziationsfaktor für p21^ras. Durch die Translokation an die Plasmamembran kann Sos auf Ras wirken. Ras wiederum aktiviert die Protein-Serin/Threoninkinase Raf. Mittels des „Zwei- Hybrid-Systems“ konnten Vojtek et al. (1993) zeigen, daß es zwischen Ras und Raf zu einer direkten Interaktion kommt, und daß dies nur für die aktivierte GTP-gebundene Form von Ras gilt. Daraufhin aktiviert Raf durch Phosphorylierung die MAP-Kinase-Kinase (MEK), welche anschließend die MAP-Kinasen (Mitogen Activated Protein-Kinase) sowohl an Threonin als

auch an Tyrosin phosphoryliert (man bezeichnet MEK daher als dualspezifische Kinase). Die aktivierten MAP-Kinasen können in den Zellkern wandern und Transkriptionsfaktoren wie Elk-1 (Treisman, 1994) phosphorylieren.

SH2 Sos

SH2 Grb2 SH3

Zellkern Ligand

dimerisierte aktivierte RPTK

P P P

P

GTP Ras

GDP Raf

MAPKK (MEK1/2)

Rsk

Genexpression

Zellmembran

MEKK1

MKK4

(SEK) MKK3

?

?

MAPK (ERK1/2)

T-E-Y

SAPK (JNK) T-P-Y

p38 (HOG1)

T-G-Y

Elk Jun-

NH2-Term.

ATF2

Abbildung 3: Der Ras-Signalweg

Die durch Ligandenbindung dimerisierte Rezeptor-PTK transphosphoryliert spezifische Tyrosine, wodurch Bindungsstellen für die SH2-Domänen des Adaptor-Proteins Grb2 gebildet werden. Grb2 ist durch seine SH3-Domäne mit dem Guaninnukleotid- Dissoziationsfaktor Sos assoziiert, der nun durch seine Translokation zur Membran auf sein dort befindliches Substrat Ras wirken kann. Das durch den Austausch von GDP durch GTP aktivierte Ras assoziiert direkt mit der Protein-Serin/Threoninkinase Raf, die die MAP- Kinase-Kinase (MEK) phosphoryliert. MEK-1 und -2 sind dualspezifische Kinasen, d.h. sie phosphorylieren die MAP-Kinasen (Mitogen-Aktivierte Proteinkinasen) ERK1 und -2 sowohl an Threonin als auch an Tyrosin in dem Motiv T-E-Y. Die MAP-Kinasen phosphorylieren sowohl Proteine im Cytoplasma (wie die Ribosomale-S6-Kinase, Rsk) als auch im Zellkern (wie den Transkriptionsfaktor Elk). Parallel zum Weg über Raf, MEK1/2 und ERK1/2 existiert ein ähnlicher Signalweg über MEKK1, SEK und SAPK/JNK (die Stress-Aktivierte Proteinkinase oder Jun-N-terminale Kinase) sowie noch mindestens ein weiterer Weg.

Der Jak-Stat-Signalweg

Wie schon weiter oben angesprochen, sind die cytoplasmatischen PTKs der Jak-Familie mit den Interleukin- und Interferon-Rezeptoren assoziiert. Nach Aktivierung durch Ligandenbindung an die Rezeptoren werden spezifische Tyrosine des Rezeptors von ihnen phophoryliert. Neben einigen anderen Substraten binden spezifische Stat-Proteine („Signal

transducers and activators of transcription“) mittels ihrer SH2-Domänen an diese Phosphotyrosine (s. Abbildung 2). Es handelt sich hierbei um eine Familie von Transkriptionsfaktoren, die nachdem sie an den Rezeptor gebunden haben, selbst an einem Tyrosin unmittelbar hinter ihrer SH2-Domäne phosphoryliert werden. Die Stat-Proteine bilden daraufhin Homo- oder Heterodimere, wahrscheinlich durch Interaktion des Phosphotyrosins eines Stat-Proteins mit der SH2-Domäne des anderen Partners (Shuhai et al., 1994). Die Stat-Dimere wandern in den Zellkern, binden (z.T. unter Assoziation mit noch weiteren Proteinen) an spezielle Promoter-Elemente und induzieren die Genexpression. Als ein Beispiel sei Interferon  genannt, das zu Stat1-Dimeren führt, die an Interferon-- activated-sites (GAS) binden, welche sich in durch Interferon  induzierbaren Genen befinden. Ein wichtiges Merkmal des Jak-Stat-Signalweges ist seine Unabhängigkeit von Ras (Silvennoinen et al., 1993).

Ein weiterer Signalweg zum Zellkern

Ein weiterer Signalweg zum Zellkern, der Ras umgeht, wurde kürzlich beschrieben (Barone

& Courtneidge, 1995). Dieser Weg nutzt die cytoplasmatischen PTKs Src, Fyn und Yes. Er wird durch die Bindung von PDGF (Platelet derived growth factor) an den PDGF-Rezeptor aktiviert, ebenso wie auch der Ras-Signalweg. Wie in Abbildung 4 dargestellt, wirkt der neue Weg jedoch auf die Expression des Transkriptionsfaktors Myc anstelle von Fos, dessen Expression der Ras-Signalweg erhöht. Beide Signalwege (und wahrscheinlich noch weitere Signale) scheinen notwendig zu sein, um Zellen aus der G1-Phase des Zellzyklus in die S- Phase zu bringen, in der es zur Replikation der DNA kommt, was eine anschließende vollständige Runde des Zellzyklus einleitet.

PDGF-R

Src / Fyn / Yes

Ras

Weitere notwendige Signale

myc-Genexpression

fos-Genexpression

Myc

Fos

G1

G2 S M

Zellzyklus

Abbildung 4: Ein Ras-unabhängiger Signalweg über Src und Myc (nach Eisenman & Cooper, 1995)

Phospholipase C (PLC)

Die Phospholipase C (PLC) bindet über ihre SH2-Domänen an viele aktivierte RPTKs (Meisenhelder et al., 1989, Rottapel et al., 1991; Burgess et al., 1990; Mohammadi et al., 1991; Obermeier et al., 1993) und wird von diesen phosphoryliert. Diese Aktivierung von PLC hat die Spaltung von Phosphatidylinosit-4,5-bisphosphat (PIP2) zu Diacylglycerol (DAG) und Inositol-1,4,5-trisphosphat (IP3) zur Folge. DAG aktiviert die Proteinkinase C (PKC), IP3 mobilisiert Ca²⁺ aus intrazellulären Speichern, was viele zelluläre Prozesse beeinflußt (zur Übersicht s. Berridge, 1993).

Phosphatidylinositol-3-Kinase (PI3K)

Ein weiteres Enzym, das von vielen RPTKs aktiviert wird, ist die Phosphatidylinositol-3- Kinase (PI3K), die Phosphatidylinosite am dritten Kohlenstoff des Inositringes phosphoryliert. Sie besteht aus einer katalytischen Untereinheit von 110 kD (p110) und einer regulatorischen Untereinheit (p85), die über ihre zwei SH2-Domänen an spezifische Phosphotyrosine aktivierter Rezeptoren bindet. Die PI3K phosphoryliert mindestens drei Intermediate des Inositstoffwechsels (PtdIns, PtdIns-4-P und PtdIns-4,5-P2/PIP2). Lange Zeit war unklar, auf welche Komponenten der intrazellulären Signaltransduktion die 3’- phosphorylierten Inosite wirken. Neueste Arbeiten zeigen jedoch ein mögliches Ziel für die PI3-Kinase auf: Franke et al. (1995) und Burgering & Coffer (1995) zeigten, daß die PI3- Kinase die Protein-Serin/Threoninkinase AKT aktiviert. Möglicherweise bindet die PH- Domäne (Pleckstrin Homology-Domain) von AKT die Produkte der PI3-Kinase (an Position 3 phosphorylierte Phosphoinosite), was durch eine Dimerisierung über diese Domäne zu einer Aktivierung von AKT führen könnte. Das aktivierte AKT wirkt mitogen, das Protein wurde ursprünglich als retrovirales Onkogen (v-akt) isoliert, das ein Fusionsprotein von gag und akt darstellt (Staal, 1987; Bellacosa et al., 1991).

Proteindomänen als Module in der Signaltransduktion

Die oben schon genannten SH2- und SH3-Domänen (Src-Homology-2/3-domains) wurden zuerst als Domänen der cytoplasmatischen PTKs der Src-Familie beschrieben, die neben der Kinase-Domäne (= SH1-Domäne) als homologe Bereiche in der Primärstrukur verschiedener Mitglieder der Familie gefunden wurden. Bald zeigte sich, daß diese Domänen auch in sehr vielen anderen Signaltransduktionsproteinen vorkommen und spezifische Protein-Protein- Interaktionen vermitteln können.

In neuerer Zeit wurden noch weitere solche modularen Domänen gefunden und ihre Funktion zum Teil aufgeklärt. Diese Forschungsergebnisse führten dazu, daß ein besonderes Augenmerk auf Protein-Module gerichtet wurde, die die Signaltransduktion durch ihre Fähigkeit regulieren, Protein-Protein-Interaktionen zu vermitteln. Diese konservierten Module repräsentieren gemeinsame regulatorische Merkmale von verschiedenen Signalwegen, die benutzt werden um ein komplexes Netzwerk von interagierenden Proteinen aufzubauen (Übersicht s. Cohen et al., 1995; van der Geer et al, 1994; Pawson, 1995).

Wie in Abbildung 5 schematisch gezeigt, finden sich diese modularen Domänen in verschiedenen Kombinationen sowohl in PTKs als auch PSKs, in Protein-Phosphatasen, den schon genannten Enzymen des Phosphatidylinosit-Stoffwechsels, aber auch in Transkriptionsfaktoren (Stat, s.o.). Eine weitere interessante Gruppe sind Adaptor-Proteine, die keinerlei enzymatische Aktivität zeigen, sondern Verbindungen zwischen anderen Signaltransduktions-Proteinen herstellen, wie oben für Grb2 beschrieben.

Aus phylogenetischer Sicht läßt das Vorkommen dieser homologen Domänen in solch vielen verschiedenen Proteinen vermuten, daß eine einmal „erfundene“ funktionelle Domäne, durch Genduplikation als solcher „Modulbaustein“ in verschiedensten Proteinen zum Einsatz kommt.

SH2-Domänen

SH2-Domänen haben eine Größe von etwa hundert Aminosäuren. Sie binden an phosphorylierte Tyrosine mit einer spezifischen Umgebungssequenz (s.u.). Obwohl die Übereinstimmungen in ihrer Aminosäuresequenz unter 40 % liegen und nur ein Arginin vollständig konserviert ist, zeigen sie sehr ähnliche dreidimensionale Tertiärstrukturen: Auf der einen Seite der globulären Gesamtstruktur liegt die Phosphotyrosin-Bindungsstelle, ihr gegenüber auf der anderen Seite liegen N- und C-Terminus der Domäne eng beieinander.

Dies ermöglicht, daß die SH2-Domäne so modular in ein Gesamtprotein eingebaut werden kann, aus diesem herausragt und die Phosphotyrosin-Bindungsstelle zur Umgebung exponiert, wodurch sie relativ unabhängig interagieren kann. Das gebundene Phosphotyrosin liegt in einer Tasche der SH2-Domäne. Es scheint aufgrund der Strukturanalysen so zu sein, daß nur drei bis fünf Aminosäurereste C-terminal vom Phosphotyrosin mit der Oberfläche der SH2- Domäne interagieren. Diese Aminosäuren sind entscheidend für die Bindungsspezifität und es ließ sich ein „Bindungscode“ aufstellen, der für jede individuelle SH2-Domäne die präferentiellen Aminosäuren in Position +1, +2 und +3 nach dem Phosphotyrosin angibt (Songyang et al., 1993; Songyang et al., 1994). Zum Teil scheinen jedoch auch Aminosäurereste N-terminal vom Phosphotyrosin die Bindung zu beeinflussen (Nishimura et al., 1993). SH2-Domänen binden Phosphopeptide mit optimaler Sequenz mit einem KD-Wert von 10-100 nM, die Bindung an zufällige Phosphopeptide ist 1000x schlechter, für unphosphorylierte Peptide zeigen sie praktisch keine Affinität (Felder et al., 1993; Panayotou et al., 1993).

Src-Familie SH3 SH2 PTK pY Proteintyrosin-

kinasen (PTKs):

Btk, Tec PH SH3 SH2 PTK

SH2 PTK

ZAP70, Syk SH2

SH2 PTP

SHPTP-1, -2/Syp SH2 pY

Proteintyrosin- Phosphatasen (PTPs):

Protein- Serin/Threonin- kinasen (PSKs):

Akt-1, -2 PH/AH PSK

ß-adrenergic-receptor-

kinase (ßARK) PSK PH

GAP1^m GAP PH

p120^GAP SH2 SH3 SH2 PH GAP

Sos PH Cdc25 Pro

G-Protein- Regulatoren:

p85^PI3K SH3 Pro SH2 SH2

PLC PH PLC pY SH2 SH2 SH3 PLC

PtdIns- Stoffwechsel:

Crk SH2 SH3 pY SH3

Shc PTB pY SH2

Nck SH3 SH3 SH3 SH2

3BP2 PH Pro SH2

Grb2 SH3 SH2 SH3

Adaptor- Proteine:

IRS-1, IRS-2/4PS PH PTB pY pY pY pY pY pY pY

Docking- Proteine:

Transkriptions-

faktoren: Stat SH3 SH2 pY

MST, PTK1/MLK-3 SH3 PSK Pro

Abbildung 5: Proteindomänen als Module in Signaltransduktionsmolekülen

Verschiedene in Signaltransduktionswege involvierte Proteine sind schematisch dargestellt und die verwandten Domänen hervorgehoben: Src-Homology-2-Domain (SH2), Src- Homology-3-Domain (SH3), Pleckstrin-Homology-Domain (PH), Phosphotyrosin-Binding- Domain (PTB), Prolin-reiche Regionen (Pro), Phosphotyrosine als SH2-Bindungsstellen (pY). Weitere Abkürzungen sind: PTK, Proteintyrosinkinase-Domäne; PSK, Protein- Serin/Threoninkinase-Domäne; PTP, Proteintyrosinphosphatase-Domäne; PLC, Phospholipase C; GAP, GTPase Activating Protein (Übersicht s. Cohen et al., 1995; van der Geer et al., 1994; Pawson, 1995).

Die PTB-Domäne

In dem Adaptor-Protein Shc und dem „Docking“-Protein IRS-1 (Insulin Receptor Substrate-1) der Insulin-Rezeptor-PTK wurde eine Domäne detektiert, bei der es sich nicht um eine SH2- Domäne handelt, die jedoch ebenfalls Phosphotyrosin bindet (Kavanaugh & Williams, 1994;

Bork & Margolis, 1995). Sie hat eine Größe von etwa 200 Aminosäuren und erkennt Motive mit der Konsensus-Sequenz Asparagin-Prolin-X-Phosphotyrosin (N-P-X-pY), wobei X einen variablen Rest darstellt. Diese PTB-Domäne (Phosphotyrosin binding domain) benötigt also

spezifische Aminosäuren N-terminal vom phosphorylierten Tyrosin (und nicht C-terminal wie die SH2-Domäne) für die Bindung. Die Assoziation der PTB-Domäne von Shc mit einem Phosphopeptid aus dem TrkA-Rezeptor besitzt einen KD von  50 nM (Zhou et al., 1995). Die NMR-Struktur dieses Komplexes von Shc-PTB-Domäne und TrkA-Peptid zeigt, daß die PTB-Domäne mehr Unterschiede als Gemeinsamkeiten mit der SH2-Domäne aufweist (Zhou et al., 1995). Zwar wird die Phosphotyrosin-Bindungstasche in beiden Domänen durch gleiche Aminosäuren gebildet, doch werden durch einen hydrophoben Bereich der PTB- Domäne die N-terminal vom Phosphotyrosin gelegenen fünf Aminosäuren gebunden, während die SH2-Domäne die drei bis fünf C-terminalen Reste bindet. Weiterhin bindet das Phosphopeptid in der PTB-Domäne parallel zum ß-Faltblatt im Gegensatz zu einer senkrechten Orientierung in der SH2-Domäne. Die Gesamttopologie der PTB-Domäne findet sich auch in anderen Proteinfamilien, interessant ist jedoch vor allem eine starke Ähnlichkeit zur Struktur der PH-Domäne (Pleckstrin Homology domain), für die eine Bindung von sauren Phospholipiden wie PIP2 beschrieben wurde (s.u.). Entsprechende Untersuchungen zeigten, daß die PTB-Domäne auch PtdIns-4-P und PIP2 binden kann. Durch eine vorherige Bindung des Phosphotyrosin-Peptides wird die Affinität für diese Phospholipide vermindert (Zhou et al., 1995).

Aufgrund ihrer Phosphotyrosin-Bindung verknüpft die PTB-Domäne von Shc dieses Adaptor- Protein mit aktivierten Rezeptoren wie TrkA, Insulin-, EGF-, PDGF- und Interleukin- Rezeptoren. Shc wird an einem Tyrosin phosphoryliert, das dann die SH2-Domäne des Adaptor-Proteins Grb2 bindet. Über Sos wird daraufhin eine Verbindung zum Ras-Signalweg hergestellt (s. oben). Auch durch die neuentdeckte Ca²⁺-aktivierte Proteintyrosinkinase PYK2 kommt es zu einer Aktivierung von Shc und damit des Ras-Signalwegs (Lev et al., 1995).

PYK2 stellt dadurch eine Verbindung der Signalwege von mit heterotrimeren G-Protein- gekoppelten Membranrezeptoren mit dem Ras-Weg dar (Bourne, 1995).

Die PH-Domäne

PH-Domänen (Pleckstrin Homology domains) wurden in sehr verschiedenen Proteinen gefunden, wie PSKs oder PTKs, Substraten dieser Kinasen, Phospholipasen, Regulatoren von kleinen G-Proteinen sowie Zytoskelett-Proteinen (Mayer et al., 1993; Haslam et al., 1993).

Die PH-Domänen zeigen eine ähnliche Struktur, bisher unbekannt ist jedoch ihr Bindungspartner in vivo. Für Phospholipide, speziell PIP2, wurde eine Bindung beschrieben (Harlan et al., 1994), die sich anhand der Strukturdaten jedoch noch nicht erklären läßt.

Ebenso gibt es Berichte über die Bindung von kleinen G-Proteinen und PKC. Indirekte Hinweise deuten darauf hin, daß Proteine durch ihre PH-Domäne zur Zellmembran gebracht werden. Die PH-Domäne von Akt-1 und -2, bei der es sich möglicherweise jedoch nur um eine mit der PH-Domäne verwandte Domäne (AH-Domäne: Akt Homology domain) handelt, scheint die Produkte der PI3-Kinase zu binden, wie oben beschrieben.

Einen klaren Hinweis auf die Bedeutung einer PH-Domäne liefert die Beobachtung, daß ein einzelner Aminosäureaustausch in der PH-Domäne der cytoplasmatischen PTK Btk die B- Zell-Entwicklung der Maus verhindert (Thomas et al., 1993).

SH3-Domänen

Die etwa 50 Aminosäuren großen SH3-Domänen erkennen keine Phosphotyrosine, sondern binden an bestimmte Prolin-reiche Sequenzen. Strukturanalysen zeigten, daß die SH3- Domäne wie die SH2-Domäne als Modul aus dem Gesamtprotein herausragt, da N- und C- Terminus der Domäne in der Tertiärstruktur nahe beieinander liegen (Kohda et al., 1993;

Koyama et al., 1993; Noble et al., 1993; Eck et al., 1994). Ein Beispiel für eine SH3- Domänen vermittelte Interaktion ist die oben bei der Ras-Signaltransduktion beschriebene Bindung des Adaptor-Proteins Grb2 an den Guaninnukleotid-Dissoziationsfaktor Sos. Die prinzipielle Sequenz von SH3-Domänen-bindenden Peptiden besteht aus etwa 10 Aminosäuren um einen Kernbereich mit der Sequenz X-Pro-X-X-Pro, wobei es sich bei X meist um aliphatische Reste handelt. Strukturelle Analysen zeigten, daß das Peptid eine linkshändige Polyprolin-TypII-Helix (PPII-Helix) mit drei Resten pro Windung annimmt. Die Helix hat daher drei Kanten, von denen zwei mit der SH3-Domäne in Kontakt sind und die dritte die Helix stabilisiert. Jedes X-P Paar sitzt in einer hydrophoben Tasche, die von aromatischen Resten der SH3-Domäne gebildet wird. Eine dritte Tasche ist variabler, obwohl sie häufig ein Arginin bindet. Ein besonderes Merkmal von SH3-Domänen bindenden PPII- Helices ist, daß sie pseudosymetrisch sind, und daher potentiell in zwei Orientierungen binden können (Lim et al., 1994, Feng et al., 1994). Entweder N- zu C-terminal, was als Plus- Orientierung oder Klasse-1-Ligand bezeichnet wird, oder C- zu N-terminal, was man auch Minus-Orientierung oder Klasse-2-Ligand nennt. Sos-Peptide binden z.B. in Minus- Orientierung (Klasse-2) an die Grb2-SH3-Domäne. Untersuchungen mit Peptid-Banken zeigten, daß jede SH3-Domäne unterschiedliche Bindungspräferenzen aufweist (Rickles et al., 1994), was durch die Nicht-Prolin-Reste und zwei variable SH3-Schleifen, die die hauptsächlich hydrophobe Bindungsoberfläche flankieren, verursacht wird.

Die Bindungskonstanten von Peptiden an SH3-Domänen sind im Vergleich zu SH2- Phosphotyrosin-Interaktionen relativ gering (KD 5100 M). Doch zeigten neueste Untersuchungen, daß vollständige Proteine sehr viel bessere Bindungen (> 300x) aufwiesen als die isolierten Peptide (Lee et al., 1995), was schließen läßt, daß weitere Kontakte aufgrund der Tertiärstruktur der Proteine einen Einfluß haben.

Aufgabenstellung

Proteinkinasen nehmen eine Schlüsselposition in den zellulären Signaltransduktionswegen ein. Sie können für die Entartungen von Zellen, die bei Krebs oder Krankheiten des Immunsystems wie AIDS auftreten, verantwortlich sein. Veränderungen von Proteinkinasen, z.B. in ihrer Expression, können auch bei der Krebsdetektion von Nutzen sein. Daher ist es von größtem Interesse neue, bisher noch unbekannte Proteinkinasen zu identifizieren und zu charakterisieren. Die Identifikation ist prinzipiell auf verschiedenen Wegen möglich. In dieser Arbeit sollten drei verschiedene Strategien angewandt werden, um neue Proteinkinasen zu detektieren und zu isolieren.

Die beiden ersten Strategien verfolgen einen strukturellen Ansatz und machen sich die höchst sensitive Methode der RNA-PCR zunutze. Hierbei sollten degenerierte Primer für konservierte Aminosäuremotive von Proteinkinasen in PCRs mit revers transkribierter cDNA eingesetzt werden. Zum einen sollten stark degenerierte Primer verwendet werden, die anhand von hochkonservierten Motiven der Kinasedomäne konzipiert wurden, um ein sehr breites Spektrum von Proteinkinasen zu erkennen.

Diese Methode führte zur Isolation der Protein-Serin/Threoninkinase K3 und weiterer PSKs und PTKs.

In einem zweiten Ansatz sollte ein spezifischeres Verfahren angewendet werden, indem ein Primer für ein charakteristisches Motiv im extrazellulären Bereich einer bestimmten Familie von Rezeptor-PTKs verwendet wird.

Dieses Verfahren führte zur Isolation der Rezeptor-PTK TKT/K1.

Anstelle dieses strukturellen Ansatzes sollte die dritte Strategie einen funktionellen Ansatz verfolgen: Proteinkinasen oder andere Moleküle der Signaltransduktion, die mit dem Nef- Protein von HIV assoziieren, deren Identität jedoch noch nicht bekannt ist, sollten mit Hilfe des 2-Hybrid-Systems isoliert werden.

Diese Versuche zeigten, daß die SH3-Domäne der PTK HCK zwar mit dem Nef-Protein von HIV1_LAI interagiert, jedoch nicht mit dem nur entfernt verwandten Nef-Protein von HIV2_D205. Ein 2-Hybrid-Screening führte zur Isolation des für HIV2_D205-Nef spezifischen Interaktionspartners Nefin1, einem bisher unbekannten Protein mit einer SH3-verwandten Domäne.

MATERIAL UND METHODEN

Material

Geräte

Beckmann Ultrazentrifuge L8-60M mit den Rotoren SW28 und Ti50 Sigma Zentrifuge 2K15

Heraeus Christ Minifuge GL Beckmann Mikrofuge E Beckmann Mikrofuge 12 DNA Thermal Cycler, Biomed DNA Thermal Cycler, Perkin Elmer DNA Thermal Cycler 480, Perkin Elmer 373A DNA Sequencer, Applied Biosystems 381A DNA Synthesizer, Applied Biosystems Spektralphotometer DU 64, Beckmann Warring Commercial Blender, Schrader

Gieß- und Elektrophoresekammern für Agarosegele verschiedener Größe, BRL Spannungsgeber für Agarosegelelektrophorese von BioRad, LKB und BRL Gefriertrockner Vakufuge, Bachofer

Melag Autoklav Typ 23

Braun Schüttelinkubator Certomat H

Filmentwicklungseinrichtung von Koch und Sterzel Hybridisierungsofen und -röhren von Appligen

Chemikalien

In der folgenden Liste nicht aufgeführte Chemikalien wurden von der Fa. Merck (p.A.

Qualität) bezogen:

Acrylamid, Forschungsqualität Serva

Agar Difco

Agarose, Molekularbiologie-Qualität BRL

Ampicillin, Forschungsqualität Serva

Bacto-Tryptone Difco

Bacto-Yeast Extract Difco

Borsäure, p.A. Roth

Bromphenolblau, Forschungsqualität Serva

BSA, Standardqualität Sigma

Casein-Hydrolysat Difco

DEPC, Forschungsqualität Sigma

Dextransulfat, Av. Mol. Wt. 500.000 Sigma

Diethylether, p.A. Fluka

N,N-Dimethylformamid, p.A. Fluka

DTT, Forschungsqualität Serva

Eisessig, p.A. Roth

Ethanol, p.A. Roth

Ethidiumbromid, Forschungsqualität Serva

Formaldehyd, p.A. Sigma

Formamid, p.A. Fluka

Gelatine Sigma

Glycerin, doppelt dest. Serva

Guanidiniumisothiocyanat, > 99 % BioMol

Harnstoff, Forschungsqualität Roth

8-Hydroxychinolin, p.A. Serva

IPTG, Forschungsqualität Roth

Isopropanol, p.A. Roth

Kanamycin Sigma

Maltose Sigma

ß-Mercaptoethanol, Forschungsqualität Serva

Methanol, p.A. Roth

N,N'-Methylen-bisacrylamid, Forschungsqualität Serva

Mineralöl, Light White Serva

3-(N-Morpholino)propansulfonsäure, > 99 % BioMol

Na2EDTA, p.A. Serva

Orange G, pract. Serva

PEG 6000, Polymerisationsgrad 140-170 Serva

PEG 4000 Serva

Phenol, redestilliert (Roth): mit 50 mM Tris-Cl, pH 8 äquilibriert

Polyvinylpyrollidin, mittleres MG 360.000 Serva

Sarkosyl, Sigma

SDS, Serva

Spermidin, Sigma

TEMED, Elektrophorese-Qualität BioRad

Tris Base, Sigma

X-Gal, Forschungsqualität Roth

Xylen Cyanol, pract. Serva

Nukleotide, Oligonukleotide, Nukleinsäuren

Nukleotide:

dATP, dCTP, dGTP, dTTP Pharmacia

[32P-]-dCTP, 6000 Ci mmol-1, 3,3 µM (NEG013Z) NEN

Oligonukleotide (5'  3'):

K1U12 (TKT, 1260-1283) CAGTGCTACTTCCGCTCTGAAGCC K1L11 (TKT, 1476-1410) CTCACTGAACATCATCCAGGTATCTGC

N-End-8: TGCAAGGAGACATTCAATCT

P6(4): CCATAGGTCCAGACATCACT

EB-L: CTGAATTCGGATCCGACTGGTCTGACTCG

3'-aminomodifiziert, MWG-Biotech

Ebcom: CGAGTCAGACCAGTCGGATCCGAATTCAG

P12-dT: GCAGAATTCGTGAACTGCGGCCGCA(dT)12

Eco-VHRDL: TTTGAATTCGTNCAYMGNGAYYT

P6(2DEA): TTGGAATTCCATCCCNNNNNNCCACACATC

Nukleinsäuren:

EMBL4 EcoRI/Cip Stratagene

Zap II EcoRI/Cip Stratagene

100 bp Ladder-Größenstandards Pharmacia, BRL

Bluescript KS + Stratagene

Lambda-DNA BRL

Multiple Tissue Northern Blot Clontech

RNA-Ladder-Größenstandard BRL

Ultraschall-behandelte Heringssperma DNA Sigma

Enzyme

Calf Intestine Phosphatase Boehringer

MMuLV-Reverse Transkriptase Stratagene

Proteinase K Amresco

Restriktionsendonucleasen NEB, BRL, Boehringer, Eurogentec

RNase A Sigma

T4 DNA-Ligase Boehringer, Pharmacia

T4 Polynukleotidkinase Boehringer

T4 RNA-Ligase NEB

Taq Polymerase Perkin Elmer, Eurogentec

Kits

"YouPrime" und "TimeSaver" cDNA Synthesis Kits Pharmacia

First strand cDNA Synthesis Kit Pharmacia

Taq Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing Kit Applied Biosystems

Säulen

NAP 10 Pharmacia

Nick Pharmacia

Sonstiges

Hybond C, Hybond N und Hybond N+ - Membranen Amersham

QuickHyb-Solution Stratagene

Hyperfilm MP Amersham

UFC3TTK25 Ultrafilter Millipore

Whatmanpapier (maid-stone) Schleicher & Schüll

Bakterienstämme

E. coli JM 109 recA1, endA1, gyrA96, thi-1, hsdR17, (rk-, mk+), supE44, relA1, (lac-proAB), [F' traD36, proAB, lacIqZM15]

E. coli SRB(P2) sbcC, recJ, uvrC, umuC::Tn5(kanr), supE44, lac, gyrA96, relA1, thi-1, endA1, mcrA,

(mcrBC-hsdRMS-mrr)171, [F'proAB, lacIqZM15], P2 lysogen E. coli K802 hsdR2, galK2, galT22, mcrA, mcrB1, supE44, metB1

E. coli XL1 Blue recA1, endA1, gyrA96, thi-1, hsdR17, supE44, relA1, lac, [F'proAB, lacIqZM15, Tn10]

E. coli SOLR e14-(mcrA), (mcrCB-hsdDMR-mrr)171, sbcC, recB, recJ, umuC::Tn5(kanr), uvrC, lac, gyrA96, relA1, thi1, endA1, ^R, [F'proAB, laqIqZM15].Su-(non suppressing)

E. coli DH5 F 80dlacZM15 (lacZYA-argF)U169 deoR recA1 hsdR17(r_K^-, m_K⁺) phoA supE44 ^- thi-1 gyrA96 relA1

Phagen

R408 Stratagene

ExAssist Stratagene

humane Herz cDNA Bank in ZAPII Stratagene

5'-extended humane Thymus cDNA Bank in MaxI Clontech

Hefe-Stämme

L40 MATa, his3-200, trp1-901, leu2-3,112, ade2, LYS::(lexAop)₄-HIS3, URA3::(lexAop)₈- lacZ, GAL4, gal80?? (Genotyp inkomplett, Hollenberg et al., 1995)

L40^ura- MATa, his3-200, trp1-901, leu2-3,112, ade2, LYS::(lexAop)₄-HIS3, GAL4, gal80??

(Genotyp inkomplett)

HF7c MATa, ura3-52, his3-200, lys2-801, trp1-901, ade2-101, leu2-3,112, gal4-542, gal80-538, LYS2::GAL1-HIS3, URA3::(GAL4_17mers)₃-CYC1-lacZ (Feilotter et al., 1994)

Methoden

Soweit nicht anders erwähnt, wurden Methoden gemäß Sambrook et al. (1989) und Ausubel et al. (1993) verwendet.

Index für Medien und Lösungen

Seite:

100x Denhardts Lösung 28

2xYT-Medium 33

CM1 31

CM2 31

Denaturierungs-Lösung 29

DNA-Dephosphorylierungs-Puffer 24

Dropout-Minimal-Medium 33

FOA-Platten 35

Kinasierungs-Puffer 24

LB-Medium 31

Ligations-Puffer f. LM-PCR 26

NETN-Puffer 36

Neutralisations-Puffer 29

NP40-Lysispuffer 37

NZY-Medium 32

NZY-Topagar 32

PLATE 34

RNA-Gelpuffer 27

RNA-Ladepuffer 27

SM-Lösung 30

SOC-Medium 31

Southern-Denaturierungslösung 27

Southern-Neutralisationspuffer 27

SSC 27

Standard-Hybridisierungs-Lösung 28

STET-Puffer 22

TAE 26

YPAD-Medium 33