Abbildung 8 zeigt die zusammengesetzte Nukleotidsequenz von 3,1 kb der K1 cDNA. Das längste offene Leseraster beginnt bei einem Startcodon an Nukleotidposition 354 und endet bei einem Stopcodon an Position 2919. Es gibt mehrere Hinweise, daß dieses Startcodon an Position 354 für die Initiation der Translation verwendet wird: Es ist von einer Nukleotidsequenz umgeben, die in Übereinstimmung mit den Kozak-Regeln für die Initiation der Translation ist (Kozak, 1984; 1986; 1987) und die darauf folgende DNA-Sequenz sagt ein hydrophobes Signalpeptid voraus (von Heijne, 1986). Weiterhin existieren Stopcodons in allen drei Leserastern vor diesem Startcodon.
Nach dem Ende des offenen Leserasters bei Nukleotid 2919 folgt ein 3'-untranslatierter Bereich von 178 Nukleotiden, der kein potentielles Polyadenylierungssignal und keinen Poly(A)-Schwanz enthält.
Das aufgrund des offenen Leserasters vorhergesagte Polypeptid von 855 Aminosäuren (in Abbildung 8 unter der Nukleotidsequenz im 1-Buchstaben-Code angegeben) enthält einen zweiten hydrophoben Bereich von Aminosäuren (Aminosäure 400-421), der eine transmembrane Domäne, gefolgt von einem basischen Stop-transfer-Motiv, repräsentiert. Dies läßt vermuten, daß es sich bei K1 um ein integrales Membranprotein handelt (von Heijne, 1986; Singer, 1990). Die extrazelluläre Region enthält 399 Aminosäuren mit sechs potentiellen Asparagin-Glykosylierungsstellen. Der cytoplasmatische Anteil besteht aus 434 Aminosäuren und umfaßt eine juxtamembrane Domäne von 139 Aminosäuren sowie eine Kinase-Domäne, die alle charakteristischen Merkmale einer PTK zeigt (Hanks et al., 1988):
Das ATP-Bindungsmotiv GxGxxG und das direkt am Phosphotransfer beteiligte konservierte Lysin sind in Abbildung 8 invertiert dargestellt. Das gleiche gilt für die drei invarianten Reste Asp-Phe-Gly (DFG), die an der ATP-Bindung beteiligt sind. Dieses DFG-Motiv wird eingerahmt von zwei weiteren Proteinkinase-spezifischen Motiven HRDLATRN (aa 708 - aa 715) und SDVWAFG (aa 768 - aa 774), wobei das erstere dieser beiden das Protein klar in die Familie der Tyrosin-spezifischen Kinasen einordnet. Eine mögliche Autophosphorylierungsstelle findet sich an Aminosäureposition 740. Da der offene Leseraster des Proteins unmittelbar im Anschluß an die Kinase-Domäne endet, besitzt das Protein im Gegensatz zu fast allen anderen Rezeptor-PTKs keinen C-terminalen Schwanz. Auch ein Kinase-Insert, wie es die PDGF-Rezeptor-Familie zeigt, ist nicht vorhanden. Bei anderen Rezeptor-Proteintyrosinkinasen wurde für solche Bereiche gezeigt, daß sie Phosphotyrosin-Reste enthalten, die mit SH2-Domänen interagieren.
Der Vergleich der Aminosäuresequenz mit bekannten Sequenzen zeigte, daß das K1-Protein ein Mitglied der Rezeptor-Tyrosinkinase-Familie ist, jedoch zu keiner der bisher
bekannten Subklassen gehört. Die nächstverwandten RPTKs sind Mitglieder der Familie der Neurotrophin-Rezeptoren (TRK, Martin-Zanca et al., 1989) mit 47-49 % Homologie zur K1-Kinasedomäne. Die Mitglieder der TRK-Familie besitzen weiterhin ähnlich dem K1-Protein einen äußerst kurzen C-terminalen Schwanz im Anschluß an die Kinase-Domäne, wobei dieser allerdings ein Tyrosin aufweist, das nach Autophosphorylierung für die Bindung der SH2-Domäne bestimmter Substrate wie der Phospholipase-C- verantwortlich ist (Obermeier et al., 1993). Zudem findet sich das Threonin im charakteristischen Motiv HRDLATRN von K1 sonst nur bei der TRK-Familie, im Gegensatz zum üblichen HRDLAARN bei anderen Rezeptor-PTKs. Daher wurde K1 der neue Name TKT gegeben für: Tyrosine Kinase related to TRK.
Eine geringere Homologie von 39-41 % besteht zu den Mitgliedern der Insulin-Rezeptor-Familie. Abbildung 9 zeigt einen Vergleich der TKT-Kinasedomäne mit denen von Vertretern der TRK-Familie und verschiedenen Insulin-Rezeptoren. Statt eines konsekutiven Vergleichs zeigt TKT eine sehr ungewöhnliche Insertion von 11 Aminosäuren zwischen Subdomäne I und II der Kinase-Domäne (Hanks et al., 1988) und eine Vergrößerung der Subdomäne X um 5 Aminosäuren. Diese Unterschiede grenzen TKT klar von den beiden Subklassen (Insulin- und Neurotrophin-Rezeptoren) ab. Bestätigt wird diese Abtrennung durch einen phylogenetischen Stammbaum, der aufgrund eines Sequenzvergleichs der Kinase-Domänen verschiedener Rezeptor-PTKs berechnet wurde und in Abbildung 10 dargestellt ist. Er zeigt, daß die drei Subgruppen (TKT, Insulin-Rezeptor- und TRK-Familie) einen gemeinsamen Vorläufer besitzen. Es deutet sich daher an, daß TKT eine neue Subklasse von RPTKs repräsentiert, die noch nicht beschrieben wurde.
Abbildung 8: Nukleotidsequenz und abgeleitete Aminosäuresequenz von TKT (K1)
Die abgeleitete Aminosäuresequenz ist im 1-Buchstaben-Code unter der Nukleotidsequenz angegeben. Die transmembrane Domäne ist unterstrichen, potentielle N-Glykosylierungsstellen im extrazellulären Anteil sind durch Kästen gekennzeichnet. Die konservierten Motive der Kinase-Domäne (Hanks et al., 1988) sind durch invertierte Buchstaben aufgezeigt: Die Konsensus-Sequenz GxGxxG von Nukleotid-bindenden Proteinen wie PTKs, der in die Phosphotransfer-Reaktion involvierte konservierte Lysinrest (K) und die an der ATP-Bindung beteiligten invarianten Reste (DFG). Die Faktor VIII - ähnliche Sequenz (s.u.) im extrazellulären Bereich ist grau hinterlegt.
Abbildung 9: Vergleich der TKT-Kinase-Domäne mit verschiedenen anderen Rezeptor-Protein-Tyrosinkinasen
Ein Vergleich der Aminosäuresequenzen der Kinase-Domänen (Hanks et al., 1988) von humanem TKT, humanem TRK (h-TRK; Martin-Zanca et al., 1989), Maus-trkB (m-trkB;
Klein et al.; 1989), Ratten-trkB (r-trkB; Middlemas et al., 1991), dem Insulin-Rezeptor (INS.R; Ebina et al., 1985; Ullrich et al., 1985), dem Insulin-like-growth-factor-1-Receptor (IGF-1R; Ullrich et al., 1986) und dem Insulin-Receptor-related-Receptor (IRR; Shier &
Watt, 1989) ist gezeigt. Aminosäuren sind invertiert dargestellt, wenn sich identische Reste in mindestens zwei der drei Untergruppen (i.e. TRK-, Insulin-Rezeptor- und TKT-Untergruppe) finden. Das Alignment wurde mit Hilfe des Programms TREE des HUSAR-Software-Pakets (DKFZ, Heidelberg) erstellt, das auf der Methode des „progressive alignment“ von Feng & Doolittle (1987) basiert.
INS.R
Abbildung 10: Phylogenetischer Stammbaum der Kinase-Domänen von Rezeptor-Proteintyrosinkinasen
Aufgrund eines Sequenzvergleichs der Kinase-Domänen von verschiedenen Rezeptor-PTKs wurde mit dem TREE-Programm des HUSAR-Software-Package (DKFZ, Heidelberg) ein phylogenetischer Stammbaum berechnet. Die horizontale Länge der Äste gibt den Grad der Divergenz der Proteine wieder, Verzweigungen zeigen Gen-Duplikationen.
Insulin-Rezeptor (INS.R; Ebina et al., 1985; Ullrich et al., 1985), Insulin-like-growth-factor-1-Receptor (IGF-1R; Ullrich et al., 1986), Insulin-receptor-related-receptor (IRR; Shier &
Watt, 1989), c-ros (ROS; Matsushime et al., 1986), Maus-trkB (m-TRK-B; Klein et al.;
1989), humanes TRK (h-TRK; Martin-Zanca et al., 1989), Schwein-trkC (p-TRK-C;
Lamballe et al., 1991), TKT (Diese Arbeit und Karn et al., 1993), AXL (O'Bryan et al., 1991), MET (Bottaro et al., 1991); FGF-Rezeptor-4 (TKF/FGFR-4; Holtrich et al., 1991), FGF-Rezeptor-1 (FLG; Dionne et al., 1990), RET (Takahashi & Cooper, 1987; Iwamoto et al., 1993), TIE (Partanen et al., 1992), ECK (Lindberg & Hunter, 1990), EPH (Hirai et al., 1987), EGF-Rezeptor (EGFR; Ullrich et al., 1984), PDGF-Rezeptor A und B (PDGFR-A;
PDGFR-B; Yarden et al., 1986; Claesson-Welsh et al., 1989), c-KIT-Rezeptor (KIT;
Vandenbark et al., 1992; Andre et al., 1992); FLT (Shibuya et al., 1990), FLT-4 (Galland et al., 1993; Aprelikova et al., 1992), CSF1-Rezeptor (CSF1-R; Coussens et al., 1986).