Kultur
Hefen ohne Plasmide wurden auf YPAD-Medium oder -Platten bei 30°C gezogen:
YPAD-Medim: 10 g Hefe-Extrakt 20 g Pepton 0,1 g Adenin
20 g Glucose ad 1 l H2O Für Platten 20 g Agar
Zur Selektion auf Plasmide wurde „Dropout“-Minimal-Medium verwendet, dem jeweils die entsprechenden Komponenten nicht zugesetzt werden:
1,2 g/l Yeast Nitrogen Base (ohne Aminosäuren und ohne (NH4)2SO4) 5 g/l (NH4)2SO4
jeweils 0,1 g/l: Adenin, Arginin, Cystein, Leucin, Lysin, Threonin, Tryptophan, Uracil
jeweils 0,05 g/l: Aspartat, Histidin, Isoleucin, Methionin, Phenylalanin, Prolin, Serin, Tyrosin, Valin 20 g/l Glucose
( 20 g/l Agar, für Platten)
Transformation
Hefe-Transformationen wurden nach der Lithiumacetat-Methode von Schiestel & Gietz (1989) mit Erweiterungen nach Hill et al. (1991) und Gietz et al. (1992) durchgeführt:
Für jeden Stamm sollten die Transformationsbedingungen durch Überprüfung von Transformationseffizienz und Zellüberleben in jedem Schritt des Protokolls getestet werden.
Die Effizienz läßt sich im Bereich 102-106 / µg Plasmid optimieren und ist kritischer, wenn ein Plasmid-tragender Stamm auf Selektionsmedim mit einem zweiten Plasmid transformiert werden soll und auf größere Ansätze aufgestockt wird.
Mini-Transformation
Eine ÜNK des Hefestammes wird in 50 ml YPAD zu OD600 0,30,5 verdünnt und 2-4 h weiter geschüttelt. Die Zellen werden bei 5000g pelletiert, in TE gewaschen und anschließend in 2 ml 100 mM LiAcetat / 0,5 x TE aufgenommen und 10 min bei Zimmertemperatur inkubiert. 100 µl Zellsuspension wird zu 1 µg Plasmid und 100 µg denaturierter, gescherter Heringssperma-DNA (Scherung > 2 kb; Schiestl & Gietz, 1989) gegeben und 700 µl PLATE (40 % PEG-4000 / 100 mM LiAc / 1x TE) zugesetzt. Die Suspension wird gemischt und bei 25-30°C inkubiert (30 min bis über Nacht, Zeitspanne und Temperatur ist für jeden Stamm zu optimieren). Nach Zugabe von 1/10 Volumen DMSO wird 7 min bei 42°C inkubiert, zentrifugiert, einmal in H2O gewaschen und auf Selektionsmedium plattiert.
Genbanktransformation im Großansatz
Für die Genbank-Transformation wird der Bait(Köder)-Plasmid tragende Hefestamm auf 100 ml Selektionsmedium (-Trp) bis zur mittleren log-Phase angezogen (mikroskopische Kontrolle auf Knospung und Auszählen). Die Zellen werden zu 1x107/ml in 1 l YPAD verdünnt und 3 h bei 30°C geschüttelt, die Zellzahl sollte sich mehr als verdoppeln. Nach Zentrifugation (5 min, 5000 g) und Waschen in TE werden die Zellen in 20 ml 100 mM LiAc / 0,5x TE resuspendiert und 10 mg Heringssperma-DNA (s.o.) mit 10-500 µg Genbank-Plasmid-DNA (Präparation ohne RNase-Behandlung) zugegeben. Anschließend erfolgt die Zugabe von 140 ml PLATE und Inkubation bei 30°C für 30 min bis über Nacht wie oben beschrieben. 1/10 Volumen DMSO werden zugesetzt, 7 min bei 42°C inkubiert, zentrifugiert, in YPAD gewaschen und in 500 ml YPAD resuspendiert. Nach 1 h Schütteln bei 30°C werden die Zellen wieder zentrifugiert, mit H2O gewaschen, in 500 ml Selektionsmedium für beide Plasmide (-Trp,-Leu) überführt und 4 bis 16 h bei 30°C geschüttelt. Diese Inkubation („Recovery“) ist notwendig für die Expression der Hybrid-Proteine im L40-Stamm; nach 4 h findet man eine Plattierungseffizienz für aktivierende Paare von 5-50 %. Vor und nach dieser Inkubation werden verschiedene Verdünnungen auf Selektionsplatten für die Gegenwart der beiden Plasmide (-Trp, -Leu) plattiert, um die Vermehrung der Zellen (10-200x) während der
„Recovery“-Periode zu bestimmen und abzuschätzen wieviele Transfomanten gescreent werden müssen, um die Zahl der primären Transformanten abzudecken. Das Screening auf Aktivierung erfolgt durch Plattierung auf -His/-Trp/-Leu-Medium, dem die entsprechende
Menge 3-Aminotriazol (3-AT) zugesetzt wird, einem Hemmstoff der Histidin-Synthese, um Hintergrundaktivierung zu unterdrücken, die vom Bait-Protein allein verursacht wird. Die Menge an 3-AT muß bestimmt werden, indem zuvor das Wachstum auf einer Verdünnungsreihe von 3-AT (z.B. 1, 2, 3, 5, 7, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50 mM) einer Paarung des Bait-Plasmids mit dem leeren Bankvektor, also der isolierten VP16-Domäne, bestimmt wird. Oft zeigt sich jedoch bei Plattierung der Genbank trotzdem ein starker Hintergrund durch unspezifische Genbank-Klone, woraufhin die Plattierung auf höherer 3-AT-Konzentration wiederholt werden muß.
ß-Galactosidase Aktivitätsbestimmung
Zur direkten ß-Galactosidasebestimmung der Hefekolonien wird ein Whatman-50-Filter auf die Kolonien gelegt und anschließend für einige Sekunden in flüssigen Stickstoff getaucht.
Nach dem Auftauen werden die Filter mit 2 ml Z-Puffer+X-Gal (100 mM NaPi-Puffer pH 7.0, 10 mM Kcl, 1 mM MgSO4 + 1/100 Volumen 50 mg/ml X-Gal) in einer feuchten Kammer bei 30°C für 30 min bis über Nacht inkubiert und die Blaufärbung der Kolonien verglichen.
Plasmid-Segregation und Gegenselektion mit Fluor-Orotsäure (5-FOA)
Um die Genbank-Plasmide zu isolieren oder für Spezifitäts-Retransformationen Hefen zu erhalten, die das Bait-Plasmid mit dem Trp-Marker verloren haben, wurden die Klone in Medium mit Selektion nur auf das Genbank-Plasmid (-Leu) mehrfach auf Platten oder in Flüssigkultur überimpft. Anschließend wurden die Kulturen vereinzelt und individuelle Kolonien (mind. 10) durch Ausstriche auf Medium -Leu und -Leu/-Trp auf Verlust des Bait-Plasmids getestet. Der zusätzliche Einbau des URA3-Markers in das Bait-Plasmid erleichtert dieses Vorgehen, da nach Segregationskultur (-Leu) auf 5-FOA-Platten geimpft wurde, auf denen nur die Klone wachsen konnten, die das Bait-Plasmid bereits verloren hatten. Diese wurden anschließend nur noch einmal auf Verlust kontrolliert.
5-FOA-Platten: 100 mg 5-FOA in 50 ml H2O mit 0,5 ml Uracil-Lösung (2,4 mg/ml) durch Erwärmen lösen, sterilfiltrieren, mit 50 ml 2x –Leu–Ura-Agar mischen und in einer 150 mm Petrischale erstarren lassen.
Hefe-Plasmidpräparation
1-5 ml Hefekultur wird zentrifugiert und die Zellen in 300 µl Lysispuffer (2,5 M LiCl, 50 mM Tris-Cl pH 8.0, 4 % Triton X-100, 60 mM Na2EDTA) aufgenommen. Nach Zugabe von 150 µl Glas-Beads (0,45-0,50 mm) und 300 µl Phenol/Chloroform (1:1) und 1 min starkem Vortexen wird 1 min zentrifugiert. Aus der wässrigen Phase wird die DNA mit Ethanol gefällt und damit Bakterien transformiert.
Proteinexpression
Bakterielle Expression im pGEX-System
Im bakteriellen pGEX Expressionssystem werden Proteine als Fusion der Glutathion-S-Transferase (GST) exprimiert, was ermöglicht das Fusionsprotein durch die spezifische Bindung des GST-Anteils an Glutathion-Agarose-Kugeln (GSH-Beads) zu isolieren. Zur Expression wird eine Übernachtkultur des Plasmid-tragenden Stammes 1:10 in frisches Medium (LB + 100 µg/ml Ampicillin) verdünnt und 1 h bei 37°C geschüttelt. Zur Induktion wird daraufhin 1 mM IPTG zugesetzt und 3 h weiter bei 37°C geschüttelt (wird keine Expression beobachtet, kann versucht werden, über Nacht bei 25°C zu inkubieren bzw. einen anderen E. coli Stamm zu nutzen). Die Bakterien werden abzentrifugiert, in 1/10 Volumen NETN (20 mM Tris-Cl, pH 8.0, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,5 % NP-40, 1 mM PMSF, 1 µg/ml Aprotinin und Leupeptin) aufgenommen und durch Ultraschall aufgeschlossen (2 x 1 min, 50 %, Stufe 4). Nach 30 min Zentrifugation (5000 g) wird der Überstand als Zellextrakt bei -70°C eingefroren.
Zur Isolierung des GST-Fusionsproteins wird Zellextrakt mit GSH-Agarose (Vorbehandlung:
80 mg in 1 ml Puffer ÜN bei 4°C quellen lassen und einmal waschen, die Bindungskapazität der gequollenen GSH-Agarose-Beads beträgt mindestens 5 mg/ml) bei 4°C auf einer Wippe für 1 h inkubiert. Anschließend wird 1 min bei 1000 g pelletiert und dreimal mit 1 ml Puffer gewaschen.
Baculovirus-Expressionssystem
Kultivierung von Spodoptera frugiperda Insektenzellen (Sf-9 Zellen)
Sf-9 Zellen wurden als Monolayerkulturen bei 28°C in TC100-Medium (Gibco), supplementiert mit 10 % dekomplementiertem fötalem Kälberserum (FCS), Gentamycin (50 µg/ml) und 2 mM Glutamin, kultiviert. Die Kultivierung erfolgte in 25 cm2, 75 cm2 oder 175 cm2 Zellkulturflaschen, wobei die Zellen mit etwa 10 mm Medium bedeckt sein sollten.
Alle 3-4 Tage wurden die Zellen bei nahezu konfluentem Zellrasen durch Klopfen gelöst und etwa ein Viertel in eine neue Kulturflasche mit frischem Medium überführt.
Zur längeren Lagerung werden die Zellen einer logarithmischen Kultur 10 min bei 2000 g, 4°C zentrifugiert, in 1/3 Volumen Medium mit 50 % FCS und 12 % DMSO aufgenommen, als 1 ml-Aliquots 2 h bei -20°C in mehreren Lagen Zellstoff verpackt aufbewahrt und schließlich in flüssigem Stickstoff gelagert. Das Auftauen von 1 ml eingefrorener Zellen erfolgt schnell in der Hand, anschließend werden die Zellen einmal mit Komplettmedium gewaschen (1000 g) und mit 7 ml Medium in einer 25 cm2-Kulturflasche angezogen.
Infektion mit rekombinantem Baculovirus, Zellernte und -extrakt
Ein konfluenter Zellrasen von Sf-9 Zellen entspricht etwa 1x105 Zellen/cm2. Für die Infektion wurde daher von vier fast konfluenten Sf-9 Zellkulturen in 175 cm2-Flaschen das Medium
entfernt und jeweils 10 ml hochtitriges Viruslysat von Monolayer-Kulturen (ca. 107 pfu/ml) mit 30 ml frischem Medium zu den Zellen gegeben, um eine Infektionsmultiplizität >5 zu erreichen. Nach 3 Tagen weiterer Kultivierung wurden die Zellen abgeklopft und bei 1000 g abzentrifugiert und in 5 ml NP40-Lysispuffer aufgenommen (20 mM Tris-Cl pH 8,0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,5 % NP40, frisch zusetzen: 1 mM PMSF, 1 µg/ml Leupeptin und Aprotinin). Die Lyse erfolgte durch dreimaliges Einfrieren in fl. N2 und Auftauen bei 37°C.
Anschließend wurde 20 min bei 5000 g zentrifugiert und der Überstand als Zellextrakt bei -70°C eingefroren.