Plasmid-DNA und PCR-Produkte wurden mit Fluoreszenz-markierten Terminatoren mit dem automatischen DNA-Sequencer ABI 373A (Applied Biosystems) sequenziert. Die Sequenzreaktion wurde mit Taq Polymerase im Thermocycler durchgeführt.
Reaktionsansatz: 4 µl 5x"TACS-Puffer"
1 µl "dNTP-Mix"
je 1 µl der Farbstoff-Terminatoren "DyeDeoxy A/C/G/T"
0,5 µl Taq Polymerase 3,2-6,4 pmol Primer
1 µg Plasmid-DNA bzw. ca. 0,6 pmol / 100 bp PCR-Produkt H2O ad 20 µl, mit 20 µl Mineralöl überschichten
Reaktionsbedingungen: 20-30 Zyklen jeweils 30 sec 96°C, 15 sec 50°C, 4 min 60°C.
Die Farbstoff-markierten Reaktionsprodukte werden von den nichtinkorporierten Terminatoren durch Fällung mit 2,5 µl 5 % CTAB und 3 min Zentrifugation in einer Eppendorfzentrifuge abgetrennt, in 50 µl 1,2 M NaCl durch 30 sec vortexen gelöst, mit 125 µl Ethanol durch 3 min Zentrifugation erneut gefällt und 30 sec in 500 µl 70 % Ethanol durch Vortexen gewaschen. Nach Pelletieren durch kurze Zentrifugation und Trocknen bei Zimmertemperatur wird die markierte DNA in 4 µl Ladepuffer (Formamid, 50 mM EDTA, 6:1) gelöst, 2 min bei 90°C denaturiert und auf Eis überführt. Die Auftrennung erfolgt in einem 7 %igen Acrylamid-Harnstoffgel bei 29 Watt im ABI 373A Sequencer, der mittels Laser und Photozelle die Fluoreszenz detektiert.
Genbanken
Etablierung einer subgenomischen Genbank
Humane genomische DNA (30 µg) wurden mit EcoRI restringiert, im Agarosegel aufgetrennt, der Bereich zwischen 10 und 20 kb ausgeschnitten, mit "GeneClean" (BIO101) aufgereinigt und 600 ng DNA zusammen mit 2 µg Lambda EMBL4 EcoRI/BamHI (Stratagene) durch Ethanol gefällt. Nach Waschen mit 70 % Ethanol und Trocknen wurde in einem Volumen von 5 µl 24 h bei 4°C ligiert und anschließend in Phagenköpfe in vitro verpackt (s. u.). Nach Titern wurden insgesamt 2x105 unabhängige Rekombinante auf 10 Platten plattiert.
Screening von -Phagen-Genbanken durch Plaquehybridisierung
50.000 pfu werden pro 150 mm Petrischale plattiert und nach Inkubation über Nacht bei 37°C mindestens 1 h bei 4°C gehalten. Die Phagen-DNA wird durch 1 min Auflegen von durchnumerierten Nylon-Membranen (Hybond N, Amersham) auf diese übertragen und deren Orientierung markiert. Für das erste Screening wird anschließend noch eine zweite Membran als Replica für 2 min aufgelegt. Die Membranen werden luftgetrocknet, mit der DNA nach oben auf mit Denaturierungslösung (1,5 M NaCl / 0,5 M NaOH) getränktem Whatman-Papier 7 min denaturiert und zweimal 3 min auf mit Neutralisationspuffer (1,5 M NaCl / 0,5 M Tris-Cl pH 7,2 / 1 mM Na2EDTA) getränktem Whatman-Papier neutralisiert. Nachdem die Membranen kurz durch 2xSSC gezogen und luftgetrocknet wurden, wird die DNA 2 h bei 80°C fixiert.
Zur Hybridisierung werden die Membranen einzeln in Standard-Hybridisierungslösung eingelegt und mindestens 1 h auf einer Wippe bei 42°C prähybridisiert. Anschließend wird die denaturierte Sonde zugegeben, alle Membranen noch einmal gewendet, das Gefäß möglichst luftdicht verschlossen und über Nacht hybridisiert (42°C).
Zur Entfernung ungebundener Sonde werden die Membranen in fünf- bis zehnfachem Volumen 5xSSC / 0,1 % SDS gewaschen bis in der Waschlösung keine Aktivität mehr meßbar ist. Die Membranen werden dann über Nacht autoradiographiert.
Positive Signale auf beiden Replicas werden auf die entsprechende Region der Phagenplatte zurückverfolgt, der Bereich mit einer Pasteurpipette ausgestochen, in 500 µl SM-Lösung mit 20 µl Chloroform überführt und mindestens 2 h bei Zimmertemperatur inkubiert. Diese Abstiche werden erneut mit geringerer Phagen-Dichte plattiert und ein zweites Screening durchgeführt. Diese Screening-Prozedur wird wiederholt bis eine monoklonale Phagenkultur erhalten wird.
Alternativ wurden die Phagen auch nach dem ersten Screening durch PCR analysiert.
Um die Hybridisierung zu verkürzen, wurde sie auch in Hybridisierungsröhren mit QuickHyb-Solution (Stratagene) durchgeführt, wobei ohne Prähybridisierung nach jeweils 30 min eine neue Lage Membranen auf der vorherigen inkubiert wurde.
SM-Lsg.: 0,1 M NaCl / 10 mM MgSO4 / 50 mM Tris pH 7,5 / 0,01 % Gelatine
PCR-Analyse von Phagenlysaten
5 µl eines Phagenabstiches wurden im Reaktionsgefäß unter Öl 1 min in einem kochenden Wasserbad inkubiert. Nach Abkühlen wurde auf Eis der PCR-Ansatz (Gesamtvolumen 25 µl) zugegeben und anschließend eine 25-30 Zyklen-PCR durchgeführt. Mit je einem spezifischen Primer für das Insert und einem Vektor-Primer läßt sich schon aus den Abstichen des ersten Screenings die Insert-DNA amplifizieren und sequenzieren. Die Methode läßt sich auch für das komplette Lysat einer Genbank anwenden, wobei jedoch bei mehreren verschiedenen positiven Rekombinanten, die PCR-Produkte anschließend (z.B. durch Agarose-Gelelektrophorese) voneinander getrennt werden müssen.
E. coli Kultur und Transformation
Kultur
Wenn nicht anders angezeigt, werden alle E. coli in LB-Medium bei 37°C unter Schütteln kultiviert. Zur Verwendung als Phagenwirt wird mit 0,2 % Maltose und 10 mM MgSO4 supplementiert. Plasmid-tragende Klone werden mit 100 µg/ml Ampicillin kultiviert.
LB-Medium: 10 g Bacto-Trypton 5 g Bacto-Yeast Extract 5 g NaCl
2 Pellets NaOH
auf 1 l H2O autoklavieren, bei Zimmertemperatur lagern 20 % Maltose-Lsg., sterilfiltriert bei -20°C lagern
1 M MgSO4 autoklaviert bei Zimmertemperatur lagern
Herstellung und Transformation kompetenter E. coli - Bakterien Calciumchlorid-Transformation
1 l LB-Medium wird mit 1 ml einer JM 109 Vorkultur angeimpft und bis OD600=0,5 bei 37°C gezogen. Nach 5 min auf Eis werden die Zellen bei 5000 g, 4°C, 5 min (Heraeus-Zentrifuge) pelletiert, in 200 ml CM1 resuspendiert und nach 45 min auf Eis wie oben pelletiert. Nach vorsichtiger Resuspension in 20 ml CM2 werden 100 µl-Aliquots in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -70°C gelagert (bis 6 Monate, wobei die Transformationseffizienz der Bakterien mit der Zeit abnimmt).
Die Zellen werden auf Eis aufgetaut, maximal 5 µl Ligationsansatz zugegeben und 30 min auf Eis inkubiert. Nach 50 sec bei 42°C und anschließend 2 min auf Eis wird 0,5 ml SOC-Medium zugegeben und 1 h bei 37°C unter Schütteln inkubiert. Im Anschluß werden Verdünnungen des Ansatzes auf Selektionsplatten gespatelt (meist LB-Agar mit 100 µg/ml Ampicillin).
Für Blau/Weiß-Selektion durch -Komplementation von ß-Galactosidase werden auf die getrockneten Platten (150 mm) 160 µl X-Gal-Lösung (20 mg/ml in Dimethylformamid, lichtgeschützt bei -20°C lagern) und 60 µl IPTG (0,1 M, bei -20°C lagern) gespatelt.
CM1: 10 mM NaAcetat / 50 mM MnCl2 / 5 mM NaCl / pH 5,6 (sterilfiltriert bei Zimmertemperatur lagern)
CM2: 10 mM NaAcetat / 70 mM CaCl2 / 5 mM MnCl2 / 5 % Glycerin / pH 5,6 (sterilfiltriert bei Zimmertemperatur lagern)
SOC-Medium: 20 g/l Bacto-Trypton, 5 g/l Bacto-Yeast extract, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, pH 7,0, nach Autoklavieren 20 mM Glucose, 10 mM MgCl2 und 10 mM MgSO4 zusetzen, bei Zimmertemperatur lagern
Elektroporation
500 ml LB-Medium wird mit 5 ml einer Vorkultur von DH5-Zellen angeimpft und bis zu OD6000,8 gezogen. Nach Zentrifugation (5000 g, 4°C) und Waschen mit 1 l eiskaltem H2O werden die Bakterien wieder pelletiert und mit eiskaltem 5 % Glycerin gewaschen. Nach erneutem Pelletieren werden die Zellen in ein möglichst geringes Volumen (3 ml) 10 % Glycerin aufgenommen, in Aliquots von 50 µl mit flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -70°C gelagert.
Zur Elektroporation wird ein solches Aliquot Zellen auf Eis getaut, die DNA zugegeben (1 ng - 1 µg) und der Ansatz in eine kalte 0,2 cm-Elektroporationsküvette überführt. Für den
Genepulser (Biorad) werden folgende Einstellungen gewählt: R=200 , C=25 µF, U=2,5 kV (12,5 kV/cm), was zu einer Zeitkonstante von 4,4-4,8 msec und einem Überleben von 50 % führen sollte. Nach dem Puls wird sofort (!) 1 ml SOC-Medium zugegeben, in ein 50 ml-Falcon-Röhrchen überführt, 1 h bei 37°C geschüttelt und auf Selektionsmedium plattiert.