Durch ein 2-Hybrid-Screening mit HIV2D205-Nef wurden 16 Klone isoliert, die eine spezifische Aktivierung des Reportergens in Kombination mit einer LexA-Fusion des Nef-Proteins von HIV2D205 im 2-Hybrid-System zeigten. Durch Sequenzierung ließen sich diese Klone sechs verschiedenen Proteinen zuweisen. Eines dieser Proteine, Nefin1, von dem insgesamt sechs unabhängige Fusionen isoliert wurden, zeigte auch in vitro als bakteriell exprimiertes Fusionsprotein eine Affinität zum HIV2D205-Nef-Protein, das durch Expression im Baculovirus-System gewonnen wurde. Grob geschätzt wurde etwa 1/10 des Nef Proteins aus dem Baculo-Zellysat im Bindungstest in vitro von dem Nefin1-Fusionsprotein (Konzentration 250 nM) gebunden. Bei Nefin1 handelt es sich um ein bisher unbekanntes Protein, dessen Sequenz in keiner Protein- oder DNA-Datenbank enthalten ist (EMBL-, Genbank- und SwissProt-Datenbanken, Dezember 1995). Aus der Überlappung der cDNAs der sechs isolierten Klone von Nefin1 läßt sich ein für die Bindung ausreichender Bereich von etwa 70 Aminosäuren bestimmen. Eine genauere Untersuchung dieses Bereichs zeigte, daß es sich um eine entfernt verwandte SH3-Domäne handelt. Aufgund der oben beschriebenen Versuche zur Interaktion von Nef mit der SH3-Domäne von HCK läßt sich vermuten, daß die Nefin1-Interaktionsdomäne mit dem prolinreichen Motiv von HIV2D205-Nef (s.o.) interagieren könnte. Die bisherige Eingrenzung des Bindungsbereichs des Nef-Proteins mittels des 2-Hybrid-Systems zeigte auch, daß dieses Motiv notwendig für die Interaktion ist.
Weiterhin reduzierten schon relativ kurze Deletionen des Carboxyterminus die Bindung stark, was bedeuten könnte, daß wie bei der Interaktion von HIV1-Nef mit der HCK-SH3-Domäne multiple Bereiche des Proteins in die Bindung involviert sind. Alternativ könnten die Deletionen auch zu Änderungen der Gesamtstruktur des Nef-Proteins führen.
SH3-Domänen finden sich in PTKs wie HCK, aber auch PSKs (Abbildung 5). Es ist daher möglich, daß es sich bei Nefin1 um die PSK handelt, welche sich mit dem Nef-Protein von HIV2 copräzipitieren läßt (O. Fackler et al., persönliche Mitteilung). Neue Untersuchungen lassen auch eine Interaktion von Nef mit der PTK LCK in vivo vermuten (Camonis et al., persönliche Mitteilung), die sich aber in vitro nicht verifizieren ließ. Es ist daher möglich, daß in vivo ein Adaptor-Protein für die Interaktion von Nef mit LCK verantwortlich ist. Da SH3-Domänen auch typisch für Adaptor-Proteine sind (Abbildung 5), eröffnet sich hier auch die Möglichkeit, daß es sich bei Nefin1 um eines dieser postulierten Adaptor-Proteine handelt. Da die mRNA von Nefin1 eine Größe von 4,4 kb zeigt (Abbildung 29) und bisher erst 416 bp der Nefin1-cDNA-Sequenz bekannt sind, ist zu erwarten, daß das Protein neben der SH3-Domäne noch weitere funktionelle Domänen enthält.
In humanen Geweben scheint ein zum murinen Nefin1 orthologes Gen exprimiert zu werden, da eine Northern-Blot-Analyse mit der murinen Sonde und poly(A)+-RNA aus humanen Geweben ein Transkript gleicher Länge detektierte wie mit RNA aus Maus-Geweben (Abbildung 29). Die humane Nefin1-mRNA zeigte weiterhin eine starke Expression in Geweben des Immunsystems.
Eine zukünftige Isolation der vollständigen cDNA von humanem Nefin1 wird die Fragen nach der Gesamtstruktur des Proteins beantworten. Darauf aufbauend sollten Versuche möglich werden, die Funktion von Nefin1 in humanen Zellen aufzuklären und möglicherweise der Funktion des Nef-Proteins auf die Spur zu kommen. Da Nefin1 keine Interaktion mit dem Nef-Protein von HIV1BRU zeigte, wäre es weiterhin interessant, noch mehrere verschiedene Nef-Proteine der Subtypen von HIV und SIV auf ihre Interaktion mit Nefin1 einerseits und HCK andererseits zu untersuchen. Für diese Untersuchungen bietet sich der hier etablierte Interaktionstest mittels des 2-Hybrid-Systems an. Um die Funktion von Nefin1 in normalen Zellen zu ergründen, sollte versucht werden den natürlichen zellulären Interaktionspartner der SH3-Domäne von Nefin1 zu isolieren. Hierzu könnte ein neues 2-Hybrid-Screening durchgeführt werden, bei dem nun die Nefin1-SH3-Domäne als Bait eingesetzt wird, oder biochemische Methoden angewandt werden.
ZUSAMMENFASSUNG
Proteinkinasen nehmen eine Schlüsselposition in den zellulären Signaltransduktionswegen ein. Sie können für die Entartungen von Zellen verantwortlich sein, die bei Krebs oder Krankheiten des Immunsystems wie AIDS auftreten. Auch bei der Krebsdetektion können Veränderungen von Proteinkinasen, z.B. in ihrer Expression, von Nutzen sein. Aus diesen Gründen ist es von größtem Interesse neue, bisher noch unbekannte Proteinkinasen zu identifizieren und zu charakterisieren, was prinzipiell auf verschiedenen Wegen möglich ist.
In dieser Arbeit wurden drei verschiedene Strategien angewandt, um neue Proteinkinasen zu detektieren und zu isolieren.
Die beiden ersten Strategien verfolgten einen strukturellen Ansatz und machten sich die höchst sensitive Methode der RNA-PCR zunutze. Hierbei wurden degenerierte Primer für konservierte Aminosäuremotive von Proteinkinasen in PCRs mit revers transkribierter cDNA eingesetzt. Zum einen wurden stark degenerierte Primer verwendet, die anhand von hochkonservierten Motiven der Kinasedomäne konzipiert wurden, um ein sehr breites Spektrum von Proteinkinasen zu erkennen. Diese Methode führte zur Isolation der Protein-Serin/Threoninkinase (PSK) K3 sowie weiterer PSKs und Proteintyrosinkinasen (PTKs).
In einem zweiten Ansatz wurde ein spezifischeres Verfahren angewendet, indem ein Primer für ein charakteristisches Motiv im extrazellulären Bereich einer bestimmten Familie von Rezeptor-PTKs (RPTKs) verwendet wurde. Dieses Verfahren führte zur Isolation der Rezeptor-PTK TKT (Tyrosine Kinase related to Trk), die eine neue Subgruppe der RPTKs definiert. Der extrazelluläre Bereich des TKT-Rezeptors von Mensch und Maus zeigte keines der bisher bekannten Motive von RPTKs, stattdessen wurde in diesem Bereich eine Faktor VIII-ähnliche Domäne identifiziert, die sich auch bei zwei weiteren, sonst nicht verwandten Membranproteinen detektieren ließ. Das humane TKT-Gen wurde auf Chromosom 1 lokalisiert und der genomische Locus partiell charakterisiert.
Anstelle der strukturellen RNA-PCR-Ansätze wurde in der dritten Strategie ein funktioneller Ansatz verfolgt: Proteinkinasen oder andere Moleküle der Signaltransduktion, die mit dem Nef-Protein von HIV assoziieren, deren Identität jedoch noch nicht bekannt ist, sollten mit Hilfe des 2-Hybrid-Systems isoliert werden. Diese Versuche zeigten, daß sich die Nef-Proteine des HIV1-Prototyps LAI und des genetisch sehr divergenten Isolates HIV2D205, das die HIV2-B-Subgruppe repräsentiert, in ihren Bindungseigenschaften unterscheiden. Die SH3-Domäne der PTK HCK interagierte zwar mit Nef von HIV1LAI, jedoch nicht mit NefHIV2D205 . Aminosäureaustausche in einem für die Bindung essentiellen Prolin-reichen Motiv könnten für diesen Unterschied verantwortlich sein. Durch ein 2-Hybrid-Screening wurde ein spezifischer Interaktionspartner für NefHIV2D205 isoliert. Dieses bisher unbekannte Protein („Nefin1“) zeigte auch in vitro eine spezifische Bindung an Nef von HIV2D205 und wies eine SH3-verwandte Domäne von etwa 70 Aminosäuren auf, die für die Bindung ausreicht. Die Eingrenzung des Bindungsbereichs von NefHIV2D205 zeigte, daß im Gegensatz zum Aminoterminus das Prolin-reiche Motiv des Nef-Proteins für die Bindung notwendig ist, ebenso wie der gesamte mittlere Bereich und der Carboxyterminus von Nef.
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Phospholipase C- is a substrate for the PDGF and EGF receptor protein-tyrosine
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