Synthese neuer Inhibitoren für transmembranständige Proteinkinasen
Dissertation
zur Erlangung des akademischen Grades des Doktors der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.)
vorgelegt von Dana David
an der Universität Konstanz
Mathematisch-Naturwissenschaftliche Sektion Fachbereich Chemie
Tag der mündlichen Prüfung: 23.07.2012 1. Referent: Prof. Dr. U. Groth 2. Referent: Prof. Dr. A. Marx
Konstanzer Online-Publikations-System (KOPS) URL: http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:352-199769
„Tu was du kannst, mit dem was du hast, wo immer du bist.“
Theodore Roosevelt
Die vorliegende Arbeit wurde in der Zeit von Januar 2007 bis Januar 2012 im Arbeitskreis von Herrn Prof. Dr. U. Groth im Fachbereich Chemie der Universität Konstanz angefertigt.
Bei Herrn Prof. Dr. U. Groth möchte ich mich für das Überlassen eines interessanten Themas und seiner freundlichen Betreuung und Unterstutzung während der gesamten Arbeit bedanken.
Herrn Prof. Dr. A. Marx danke ich herzlich für die freundliche Übernahme des Zweitgutachtens.
Ich möchte meiner Familie für Ihre ganze Unterstützung danken, ohne die es mir nicht möglich gewesen wäre mein Studium erfolgreich abzuschliessen.
Meinen Freunden Nico, Radu, Irina und Cristi möchte ich für ein immerzu offenes Ohr, die ständige Hilfsbereitschaft und vor allem die Fähigkeit jedesmal erneut meine Motivation zu wecken, danken.
Lieben Dank auch an meiner Laborkollegin und Freundin Carmen Bucuroaia für die Unterstützung aller Art. Ohne sie wäre dieses Studium viel schwieriger und langweiliger gewesen.
Bei Hannes Leicht, Christoph Briegel, Roman Sommer und Philipp Roesle möchte ich mich für das Korrekturlesen dieser Arbeit bedanken. Ohne die Mühe dieser vier würde diese Arbeit unzählige Tippfehler mehr enthalten als nötig.
Vielen Dank an Angelika Früh für die schöne gemeinsame Zeit und ihre ständige Hilfsbereitschaft.
Allen meinen Mitarbeiterpraktikanten danke ich für ihre Mitarbeit.
Frau Anke Friemel danke ich recht herzlich für die Aufnahme und die Entschlüsselung der 2D-NMR-Spektren.
Bei meinem Laborkollege Joachim Braun möchte ich mich für das tolle Arbeitsklima, für das
„braunsche Chaos“ im Labor und für das ein oder andere kleine Schwätzchen in der Mittagspause bedanken.
Bei der Arbeitsgruppe Groth möchte ich mich für das angenehme Arbeitsklima und die gute Zusammenarbeiten bedanken.
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Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung... 1
1.1 Proteinkinasen ... 2
1.2 Proteinkinasen und Krebsentstehung ... 3
1.3 Die TGF-β-Familie ... 5
1.3.1 TGF-β ... 5
1.3.2 TGF-β Rezeptoren ... 5
1.3.3 Entwicklung von TGF-β-basierten Therapeutika ... 7
1.4 Struktur-Aktivitäts Beziehung ... 10
1.5 Chemische Hintergründe ... 14
1.5.1 Indolizine ... 14
1.5.2 Imidazo[1,2-a]pyridine ... 16
1.5.3 Imidazo[1,5-a]pyridine ... 18
1.5.4 Pyrazolo[1,5-a]pyridine ... 21
1.5.5 Pyridin-N-oxide ... 23
2 Aufgabenstellung ... 26
3 Ergebnisse und Diskussion ... 29
3.1 Synthese von 1,3-substituierten Isochinolin A ... 29
3.1.1 Synthese von 5-Chlor-2-fluorcarbonsäurederivaten ... 32
3.1.1.1 Synthese von 5-Chlor-2-fluorbenzonitril (16) ... 33
3.1.1.2 Synthese von 5-Chlor-2-fluorbenzoesäuremethylester (16a) ... 34
3.1.1.3 Synthese von 5-Chlor-2-fluoracetophenon (20) ... 35
3.1.2 Synthese von 3-(5-Chlor-2-fluorphenyl)-1-isochinolon (18) ... 37
3.1.3 Synthese von 1-Chlor-3-(5-chlor-2-fluorphenyl)isochinolin (19) und ... 47
1-Brom-3-(5-chlor-2-fluorphenyl)isochinolin (19a) ... 47
3.1.4 Synthese von 1-(4-Pyridylamin)-3-(5-chlor-2-fluorphenyl)isochinolin (A) ... 48
3.2 Synthese von Imidazo[1,2-a]pyridin C und Imidazo [1,5-a]pyridin D ... 50
3.2.1 Synthese von 4-Chlor-6-(5-chlor-2-fluorphenyl)picolinonitril (26a) ... 56
3.2.1.1 Synthese von 4-Chlor-2-iodpyridin (33a) ... 56
3.2.1.2 Synthese von 2-Chlor-4-methoxypyridin (40) ... 59
3.2.2 Synthese von 4-Brom-2-(5-chlor-2-fluorphenyl)pyridin (32b) ... 60
3.2.2.1 Synthese von 4-Brom-2-(5-chlor-2-fluorphenyl)pyridin-N-oxid (31b) ... 62
3.2.3 Synthese von 4-Brom-6-(5-chlor-2-fluorphenyl)picolinonitril (26b) ... 64
3.2.4 Synthese von 2,4,6-trisubstituierten Pyridinen ... 68
3.2.4.1 Synthese von 2-Halogen-4-methoxy-6-methylpyridinen 51a-c ... 68
3.2.4.2 Synthese von 4-Chlor-2-(5-chlor-2-fluorphenyl)-6-methylpyridin (53a) ... 74
3.2.4.3 Synthese von 6-Brom-4-nitropicolinsäure (83) ... 78
3.2.5 Synthese von 6-(5-Chlor-2-fluorphenyl)-4-(4-aminopyridin) picolinonitril (60) ... 80
3.2.5.1 Synthese von 2-Brom-6-(5-chlor-2-fluorphenyl)-4-nitropyridin (58) ... 80
3.2.5.2 Synthese von 2-Brom-6-nitropicolinonitril (87) ... 82
3.2.6 Synthese von 2-Amino-4-chlor-6-(5-chlor-2-fluorphenyl)pyridin (27a) ... 84
3.2.6.1 Synthese von 1-(5-Chlor-2-fluorphenyl)-1,3-butandion (20b) ... 84
3.2.6.2 Synthese von 2-Amino-6-(5-chlor-2-fluorphenyl)-4-pyridinon (63) ... 86
3.2.7 Synthese von 2-Amino-4-brom-6-(5-chlor-2-fluorphenyl)pyridin (27a) ... 87
3.3 Synthese von Indolizin B ... 89
3.4 Synthese von Pyrazolo[1,5-a]pyridin E ... 93
4 Zusammenfassung ... 97
5 Experimenteller Teil ... 106
5.1 Allgemeines ... 106
5.2 Synthese von 1,3-substituierten Isochinolin A ... 109
5.2.1 Synthese von 5-Chlor-2-fluorbenzoesäure (14) ... 109
5.2.2 Synthese von 5-Chlor-2-fluorbenzamid (15b) ... 110
5.2.3 Synthese von 5-Chlor-2-fluorbenzonitril (16) ... 111
5.2.4 Synthese von 5-Chlor-2-fluorbenzoesäurechlorid (15a) ... 112
5.2.5 Synthese von 5-Chlor-2-fluorbenzoesäuremethylester (16a) ... 113
5.2.6 Synthese von 5-Chlor-2-fluoracetophenon (20) ... 114
5.2.7 Synthese von 5-Chlor-2-fluorphenylboronsäure (22) ... 116
5.2.8 Synthese von N-tert-Butyl-o-tolylamid (17d) ... 117
5.2.9 Synthese von N-tert-Butyl-2-(2-(5-chlor-2-fluorophenyl)-2-oxoethyl) benzamid (25) ... 118
5.2.10 Synthese von 3-(5-Chlor-2-fluorphenyl)-1-isochinolon (18) ... 120
5.2.11 Synthese von 1-Chlor-3-(5-chlor-2-fluorphenyl)isochinolin (19) ... 121
5.2.12 Synthese von 1-Brom-3-(5-chlor-2-fluorphenyl)isochinolin (19a) ... 123
5.2.13 Synthese von 1-(4-Pyridylamin)-3-(5-chlor-2-fluorphenyl)isochinolin Hydrobromid ... 124
5.3 Synthese von Imidazo[1,2-a]pyridin C und von Imidazo [1,5-a]pyridin D ... 127
5.3.1 Synthese von 4-Nitropyridin-N-oxid (36) ... 127
5.3.2 Synthese von 4-Chlorpyridin-N-oxid (37) ... 128
5.3.3 Synthese von 4-Chlor-2-pyridin (33a) ... 129
5.3.4 Synthese von 4-Methoxypyridin-N-oxid (43) ... 130
5.3.5 Synthese von 4-Methoxy-2-pyridon (41) ... 131
5.3.6 Synthese von 2-Chlor-4-methoxypyridin (40) ... 132
5.3.7 Synthese von 2-(5-Chlor-2-fluorphenyl)-4-methoxypyridin (39) ... 133
5.3.8 Synthese von 4-Brom-2-(5-chlor-2-fluorphenyl)pyridin (32b) ... 134
5.3.9 Synthese von Pyridin-N-oxiden 45-47... 135
5.3.9.1 2-Chlorpyridin-N-oxid (45) ... 135
5.3.9.2 2-(5-Chlor-2-fluorphenyl)-4-methoxypyridin-N-oxid (46) ... 136
5.3.9.3 2-Chlor-4-methoxypyridin-N-oxid (47) ... 137
5.3.10 Synthese von 6-Chlor-4-methoxypicolinonitril (48) ... 138
5.3.11 Synthese von 2-(5-Chlor-2-fluorphenyl)pyridin (69) ... 139
5.3.12 Synthese von 2-(5-Chlor-2-fluorphenyl)pyridin-N-oxid (70) ... 141
5.3.13 Synthese von 6-(5-Chlor-2-fluorphenyl)picolinonitril (71) ... 142
5.3.14 Synthese von 6-(5-Chlor-2-fluorphenyl)picolinonitril-N-oxid (72) ... 143
5.3.15 Synthese von 2-Picolin-N-oxid (66) ... 144
5.3.16 Synthese von 4-Nitro-2-picolin-N-oxid (67) ... 145
5.3.17 Synthese von 4-Methoxy-2-picolin-N-oxid (68) ... 146
5.3.18 Synthese von 6-Iod-2-picolin-N-oxid (66a) ... 147
5.3.19 Synthese von 2-Brom-6-picolin (74) ... 148
5.3.20 Synthese von 2-Brom-6-picolin-N-oxid (75) ... 149
5.3.21 Synthese von 2-Brom-6-methyl-4-nitropyridin-N-oxid (76) ... 150
5.3.22 Synthese von 2-Brom-6-methyl-4-nitropyridin (82) ... 151
5.3.23 Synthese von 4-Chlor-2-(5-chlor-2-fluorphenyl)-6-methylpyridin (53a) ... 152
5.3.24 Synthese von 1-(5-Chlor-2-fluorphenyl)-1,3-butadion (20b) ... 153
5.3.25 Synthese von 2-(1H-Pyrrolyl-2-methylen)bernsteinsäure-1-methylester (95) ... 155
5.3.26 Synthese von 5-Methoxycarbonyloxyindolizin-7-carbonsäure- methylester (97) 156 5.3.27 Synthese von 5-Chlorindolizin-7-carbonsäuremethylester (98) ... 157
5.3.28 Synthese von t-Butyl 2,4-dinitrophenoxycarbamat (106) ... 158
5.3.29 Synthese von O-(2,4-Dinitrophenyl)hydroxylamin (104) ... 159
6 Literaturverzeichnis ... 160
Abkürzungsverzeichnis
3CC Drei Komponenten Reaktion
abs. absolut, wasserfrei
ALK Activin-like kinases
ATP Adenosintriphosphat
BMP bone morphogenetic protein
Boc tert.-Butyloxycarbonyl
CAN Cerammoniumnitrat
5-Cl-2-F-Ph 5-Chlor-2-fluorphenyl
CML Chronische Myeloide Leukämie
DC Dünnschichtchromatographie
DCC Dicyclohexylcarbodiimid
DCE Dichlorethan
DCM Dichlormethan
DMA N,N-Dimethylacetamid
DMAP Dimethylaminopyridin
DME Ethylenglykoldimethylether
DMF N,N-Dimethylformamid
DMSO Dimethylsulfoxid
DNA Desoxyribonukleinsäure
FDA U. S. Food and Drug Administration
IC50 nötige Konzentration, um 50%ige Inhibition zu erzielen LiDMAE Lithiumdimethylaminoethanol
LDA Lithiumdiethylamid
MS Massenspektroskopie
Me Methyl
MeO Methoxy
MW Mikrowellen
NBS N-Bromsuccinimid
NMR Nuclear Magnetic Resonance
Rf Retentionsfaktor
RT Raumtemperatur
Rt Retentionszeit
Ph Phenyl
Py Pyridin
SAR structure-activity-relationship
SARA SMAD anchor for receptor activation
TBAI Tetrabutylammoniumiodid
TFA Trifluoressigsäure
TFAA Trifluoressigsäureanhydrid
TFPA Trifluorperessigsäure
THF Tetrahydrofuran
TMEDA N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin
TMS Trimethylsilyl
TβRI transforming groth factor Receptor 1
1 Einleitung
Der gezielte Weg zum Arzneimittel ist ein alter Menschheitstraum. Schon die Alchemisten haben das Elixir gesucht, das alle Krankheiten zu heilen vermag. Gefunden wurde es bis heute nicht. Ganz im Gegenteil, die Arzneitherapie ist mit zunehmender Kenntnis über verschiedenen Krankheitsursachen noch komplexer geworden.1
Die Suche nach neuen Wirkstoffen gegen bestimmte Krankheiten ist langwierig, oft kompliziert, aufwändig und endet nicht immer mit einem Erfolg. Von 5.000 bis 10.000 potentiellen Wirkstoffen, die in den Forschungslaboren getestet werden, landet im Durchschnitt nur einer als fertiges Medikament auf dem Markt. Dazwischen liegen oftmals mehr als zehn Jahre. Wenn sich Forscher mit einem neuen Krankheitsbild befassen, analysieren sie genau den biologischen Mechanismus hinter der Erkrankung. Sobald ein Target feststeht, wird nach einem geeigneten Wirkstoff gesucht. Target-Identifizierung allein ist nicht ausreichend, um eine erfolgreiche Behandlung einer Krankheit zu erreichen. Ein Wirkstoff muss nach der Einnahme an seinen Wirkort gelangen und dort mit einem biologischen Makromolekül in Wechselwirkung treten.
Spezifische Wirkstoffe haben hohe Affinität und ausreichende Selektivität zu einer Bindestelle dieses Makromoleküls. Nur so können sie die gewünschte biologische Wirkung ohne Nebenwirkungen entfalten.1
In den meisten Fällen müssen diese Wirkstoffe noch optimiert werden. Manchmal lässt sich die Wirksamkeit eines Stoffes beispielsweise steigern, indem seine Struktur geringfügig verändert wird. Anschließend wird erneut ihre Wirkung untersucht. Auf diese Weise verbessern Forscher schrittweise ihren Wirkstoffkandidaten bis die gewünschte Affinität und Selektivität erreicht ist.
Viele Arzneimittel wirken als Inhibitoren von Enzymen bzw. als Agonisten oder Antagonisten von Rezeptoren. Diese verhindern, durch Besetzung einer Bindestelle, die Anlagerung eines Substrats oder eines endogenen Rezeptorliganden.1
Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit dem Entwurf und der Darstellung verschiedener neuer „Small Molecules“ die eine potentielle Inhibition der Rezeptoren des Wachstumfaktors TGF-β bewirken könnten.
1.1 Proteinkinasen
Proteinkinasen stellen die zweitgrößte Proteinfamilie in höheren Zellen dar und nehmen eine zentrale Aufgabe bei der intrazellulären Signalübermittlung ein. Sie bewirken durch Phosphorylierung von Proteinen eine Veränderung der biologischen Aktivität, die erst durch die Wirkung von Proteinphosphatasen wieder rückgängig gemacht werden kann.2 Durch die Phosphorylierung verändert sich die Tertiärstruktur der Proteine und damit auch deren biologische Eigenschaften. Auf diese Weise wird die Enzymaktivität oder die Bindung an andere regulatorische Moleküle kontrolliert. Wichtige zelluläre Prozesse wie Wachstum, Differenzierung, Wanderung und Zelltod werden durch das Zusammenspiel dieser beiden Enzymgruppen reguliert. Diese werden nach ihrer Spezifität in zwei Gruppen eingeteilt. Die erste Gruppe phosphoryliert Proteine an den Aminosäuren Serin und/oder Threonin, die zweite an der Aminosäure Tyrosin.3 Allerdings sind auch Proteinkinasen bekannt, die sowohl Serin und Threonin als auch Tyrosin phosphorylieren können.4 Zu der Familie der Proteinkinasen gehören mehr als 500 Mitglieder, die gemeinsam das Kinom bilden.
Seit der Isolierung der ersten Ser-/Thr-spezifischen Kinase aus dem Muskel im Jahr 1959 dauerte es weitere 20 Jahre bis Tyrosin-Proteinkinasen entdeckt wurden und weitere 20 Jahre bis die erste 3D-Struktur einer Kinase bestimmt werden konnte. Mit der 3D-Struktur der Protein- Kinase A (1991), wurde der Weg zur Strukturaufklärung weiterer Proteinkinasen eröffnet. Diese Strukturen zeigen nicht nur die enge strukturelle Verwandtschaft zwischen allen Proteinkinasen, sondern auch die hohe Komplexität ihrer allosterischen Regulation.5
Innerhalb der beiden Gruppen werden die Proteinkinasen in weitere Untergruppen eingeteilt, wobei hier meist Enzyme mit Ähnlichkeit in der Selektivität bezüglich der Zielproteine, des Regulationsmechanismus sowie der Struktur zusammengefasst werden.
Proteinkinasen kommen im Cytosol gelöst oder in Membranen gebunden vor. Die membrangebundenen Proteinkinasen werden auch transmembranständige Proteinkinasen oder Rezeptorproteinkinasen genannt. Im Weiteren wird hauptsächlich auf diese Klasse eingegangen.
1.2 Proteinkinasen und Krebsentstehung
Krebs ist der allgemeine Begriff für eine Gruppe von Krankheiten, die sich durch Anomalien in Wachstum, Proliferation, Differenzierung und Absterben der Zellen auszeichnen. Die Folge solcher Defekte ist die unkontrollierte Expansion von Krebszellen, die zur Tumorbildung führen kann.
Die Mechanismen der Krebsentstehung wurden in den letzten Jahren immer besser verstanden.
Bestimmte Krebsformen entstehen, weil Chromosome, die Träger der genetischen Information in einer Zelle, auseinanderbrechen und wieder falsch zusammengeknüpft werden. Wenn sich an der schadhaften Stelle Gene für wichtige Proteine befinden, dann werden auch diese falsch zusammengesetzt. Das kann dazu führen, dass Proteine, die das Wachstum und die Ausreifung der Zelle steuern, permanent aktiv sind. Die betroffenen Zellen wachsen dann unkontrolliert und reifen nicht mehr aus. Das Verständnis dieser Vorgänge eröffnet die Möglichkeit einer zielgerichteten Therapie, die direkt das krebsauslösende Protein angreift.
Proteinphosphorylierung, die durch Proteinkinasen katalysiert wird, stellt die häufigste biochemische Modifikation zellulärer Moleküle dar. Sie spielt eine fundamentale Rolle bei Signaltransduktions-Prozessen und könnte eine kausale Rolle bei der Entstehung von Krankheiten, insbesondere von Krebs, spielen.6
Alle Proteinkinasen zeigen eine hochkonservierte Bindungsstelle für ATP. Aus diesem Grund waren sie für lange Zeit unbedeutend als Ziele für eine Antikrebstheraphie. Diese Annahme wurde durch die Tatsache, dass der Naturstoff Staurosporin (ein Breitspektrum-Kinase Inhibitor) eine Vielzahl von Kinasen in einer sehr unspezifischen Weise hemmt, unterstützt.7 Nach genaueren Untersuchungen der Strukturen, wurden zusätzliche Bindungstaschen in unmittelbarer Nähe der Bindungsmotive des Adenin-Teils des ATP (die Hinge-Region: Eine kurze Sequenz von Aminosäuren, die an der Basis jedes der heavy chain Bereiche eines Immunglobulins liegt und eine flexible Bewegung des Moleküls ermöglicht) entdeckt. Schritt für Schritt wurden diese Taschen untersucht und Kinase-Inhibitoren höherer Spezifität entwickelt.5 Die Optimierung eines PCK-Inhibitors der Bcr/Abl-Tyrosinkinase, Imatinib (Gleevec®, Novartis), markierte einen Durchbruch in der spezifischen Tumortherapie (Abbildung 1, links).8 Der im Mai 2001 zugelassene Inhibitor wird für die Therapie von CML (chronische myeloische Leukämie) eingesetzt. Die Behandlung mit Gleevec® führte zu einer fast 100% Remission bei Patienten in
den frühen Stadien der Erkrankung. Kristallstrukturen haben gezeigt dass die N-terminale Myrostyl-Modifikation von Tyrosinkinase Abl (Akronym für Abelson murine leukemia) wichtig für die Autoinhibition ist, und der Verlust dieser Regulierung zu einer unkontrollierten Aktivität der Bcr/Abl-Tyrosinkinase führen kann (Abbildung 1, rechts). 8
Seit Mitte der 1990er Jahren wurden drei Inhibitoren von der U.S. Food and Drug Administration (FDA) für die Behandlung von CML, gastrointestinalen Stromatumoren (das oben erwähnte Gleevec®) und Lungentumoren (Iressa und Tarceva, Abbildung 2) zugelassen.
Viele andere befinden sich in klinischen Studien.9
Abbildung 1: Imatinib (Gleevec®, Novartis) (links) und Kinaseinhibitor-Protein Wechselwirkung (rechts).
Abbildung 2: Ausgewählte chemische Strukturen von zugelassenen Inhibitoren.
Aufgrund der Vielzahl von Tumorklassen, die auf verschiedenen Mechanismen beruhen, ist die Entwicklung neuer Kinase-Inhibitoren eines der aktuellsten Themen in der pharmazeutischen Industrie. Trotz dieser Motivation steht die Forschung vor maßgeblichen Herausforderungen wie die Medikamentenrezistenz, der Mangel an Inhibitor-Selektivität, die Wirksamkeit und die Schwierigkeiten bei der Targetvalidierung.
1.3 Die TGF-β-Familie
1.3.1 TGF-β
Die Geschichte von TGF-β (Transformig Growth Factor) began vor ca. 30 Jahren. Sporn et al.
erforschten als erste seine Struktur und Eigenschaften.10 Der Name wurde den Molekülen aufgrund ihrer Eigenschaft verliehen, Rattenfibroblasten in Zellkulturen morphologisch zu verändern.
Zur TGF-β-Superfamilie gehören über 100 Mitglieder (u.a. TGF-β, Bone Morphogenetic Proteins (BMP’s) und Activin). TGF-β ist ein multifunktionelles Cytokin, das aus 112 Aminosäuren besteht. Es beeinflußt verschiedenste biologische Prozesse, wie Proliferation, Zelldifferenzierung, Embrionalentwicklung, Migration und Apoptose. Außerdem leistet es einen Beitrag zur Modulation der Immunantwort.11 Es existieren drei Isoformen von TGF-β: TGF-β1, TGF-β2 und TGF-β3. Diese unterscheiden sich kaum in ihrer Expression, jedoch in ihrer Funktion.
1.3.2 TGF-β Rezeptoren
TGF-β reguliert die Zellprozesse durch Bindung an spezifische Zelloberflächenrezeptoren, bekannt als TGF-β-Rezeptor I und II. Die TGF-β-Rezeptoren I und II sind Serin-Threonin- Kinasen und induzieren so eine vom klassischen Weg abweichende Signal-Kaskade. Diese Kinasen bezeichnen den einzigen bekannten Signalrezeptor für die Mitglieder der TGF-β-Familie. Studien haben gezeigt, dass es sich um ein einmaliges Ligand-Rezeptor-System handelt. Anstatt über einem sehr spezifischen Ligand-Rezeptor-Paar zu funktionieren, spiegelt
die TGF-β-Rezeptor-Familie ein komplexes System von kombinatorischen Ligand-Rezeptor- Wechselwirkungen wider.12 Derzeit sind sieben Typ I-Rezeptoren oder „Activin-like kinases“
(ALKs) und fünf Typ II-Rezeptoren im menschlichen Genom bekannt.11 Die für diese Arbeit wichtigste Kinase ist ALK5.
Die Signalkaskade ist sehr komplex und bietet damit viele Ansatzmöglichkeiten für die Entwicklung von Wirkstoffen (Abbildung 3). Zunächst binden die TGF-β-Isoformen an den konstitutiv aktiven Typ II-Rezeptor (1). Anschließend wird der Typ I-Rezeptor ALK5 (Activin- like kinase) in diesem Komplex rekrutiert (2) und durch TGF-β-Typ II-Rezeptor vermittelte Phosphorylierung aktiviert (3). Der aktivierte Rezeptorkomplex löst eine Phosphorylierung von Smad2/Smad3 aus (5). Diese Reaktion wird durch die Interaktion von SARA (Smad Anchor for Receptor Activation) vermittelt. Die Smads sind Transkriptionsfaktoren, deren Name sich von deren kodierenden Genen ableitet. Diese wurden erstmals in genetischen Studien an Drosophila und C. elegans identifiziert. Das Drosophila-Gen wird als Mad (Mother against decapentaplegic), das Gen in C. elegans als Sma (Small body size) bezeichnet. Die Kombination dieser beiden Bezeichnungen liefert den Namen „Smad“.
Die oben erwähnte Phosphorylierung löst die Bildung eines heterodimeren oder heterotrimeren Komplexes mit Smad 4 aus (6). Der gebildete Komplex dringt in den Zellkern ein (7) und wechselwirkt dort mit DNA-bindenden Proteinen, Co-Aktivatoren und Co-Repressoren (8), um die Transkription (9) der TGF-β-Zielgene auszulösen.13
Abbildung 3: Signaltransduktionskette von TGF-β.
Die Rolle von TGF-β in der Biologie von Krebs ist komplex und beinhaltet sowohl Suppression als auch Promotion von Tumoren.
1.3.3 Entwicklung von TGF-β-basierten Therapeutika
Seit der Entdeckung von TGF-β vor ca. 30 Jahre, wurden auch andere Wachstumsfaktoren als therapeutische Ziele identifiziert, Wirkstoffe entwickelt und letztendlich auf den Markt gebracht.
Die komplexe Biologie von TGF-β in der Gewebehomöostase und die Tatsache, dass es in zahlreichen Krankheitsstadien beteiligt ist, fördert gleichzeitig Forscher, Kliniker und Industrie heraus.
Die meisten Krebszellen exprimieren tumorspezifische Antigene, die durch das Immunsystem erkannt werden, was dazu führen soll dass die Apoptose der Krebszellen eingeleitet wird.
Während der Tumorentstehung jedoch, erwerben diese Krebszellen die Fähigkeit, dem Immunsystem zu entgehen. Dieses Phänomen ermöglicht den Krebszellen Tumore zu bilden und zu metastasieren. Ein wichtiger Mechanismus der Überwindung des Immunsystems ist die Sekretion des potenten immunsupressiven Zytokins TGF-β.14 Weil TGF-β sowohl bei der Inhibition des Zellwachstums, als auch bei der Angiogenese eine wichtige Rolle spielt, kann es gleichzeitig als Tumorsupressor aber auch als Tumorpromotor wirken.15 Aufgrund der vielen weiteren Funktionen von TGF-β in der Zelle, wie zum Beispiel die Kontrolle der Zusammensetzung der extrazellulären Matrix, ist es nicht einfach, nebenwirkungsfreie Inhibitoren zu entwerfen.
Die ersten Versuche TGF-β-basierte Therapeutika zu entwickeln, haben sich auf TGF-β selbst konzentriert. Die klinische Entwicklung von TGF-β endete aber Ende der 1990er Jahre als Folge der Tatsache, dass potenzieller klinischer Nutzen von TGF-β bei der Wundheilung durch Placebo oder die Auswirkungen von Standards der Pflege abgeschattet waren. Darüber hinaus ergab die systematische Verabreichung von TGF-β gravierenden Sicherheitsmängeln.16
In den letzten Jahren haben einige wichtige Studien das therapeutische Potenzial von Antagonisierung des TGF-β-Signalpfades hervorgehoben. Die Inhibition des TGF-β in vivo kann möglicherweise mehrere Mechanismen, die für Krebsentwicklung wichtig sind, sowohl in Krebszellen als auch in gesunde Zellen, modifizieren. Die wichtigsten Strategien für die
Inhibition erfassen Verbindungen, welche die Bindung des TGF-β an seinen Rezeptoren verhindern. Die am weitesten fortgeschrittene TGF-β-Antagonisten in klinischen Entwicklung sind „Large-molecules“, einschließlich monoklonaler Antikörper und Antisense- Oligonukleotide, von denen die meisten für die Behandlung von fibrotischen Erkrankungen entwickelt wurden (Abbildung 4).12
Wirkstoff/Phase Unternehmen Typ
Phase III Lerdelimumab (CAT-152/trabio)
Cambridge Antibody Technology monoklonarer Antikörper
Phase I/II Metelimumab (CAT-192)
Cambridge Antibody Technology Genzyme
monoklonarer Antikörper
Antisense TGF-β2 Impfstoff NovaRx Antisense
AP-12009 Antisense Pharma Oligonukleotid
Präklinik
GC-1008 Cambridge Antibody Technology monoklonarer Antikörper
AP-11014 Antisense Pharma Oligonukleotid
Aufgrund ihrer hohen Molekulargewichte, können sich Antikörper nicht schnell und/oder gleichmäßig in den Tumorgeweben verteilen und nicht durch die Blut-Hirn-Schranke dringen.
Sofern nicht humanisiert, können Antikörper schwere, aber seltene allergischen Reaktionen induzieren.11
Eine andere Kategorie von Antagonisten konzentriert sich auf den selektiven TGF-ß-Rezeptor Typ I (TβRI, auch als ALK-5 bekannt) als therapeutisches Ziel. Dazu gehören „Small- molecules“, die als kompetitive Inhibitoren für die ATP-Bindungsstelle der TβRI-Kinase wirken.
Diese kleinen Moleküle sollten eine bessere Verteilung in das Tumorgewebe aufweisen und könnten eine größere Effizienz als die Antikörper haben. Obwohl viele einzelne Strukturen als
„Small-molecules“ TGF-β Rezeptor-Kinase Hemmer entwickelt worden sind, haben die meisten
Abbildung 4: "Large-molecules" basierte Strategien zur Antagonisierung der TGF-β-Signalisierung.
von ihnen Eigenschaften, die mit einem einzelnen bekannten Pharmacophor übereinstimmen.
Dieser trägt einen passenden Wasserstoffbrückenakzeptor, welcher den Schlüssel für das Binden des „Small-molecule“ am reaktiven Zentrum der Kinase ist. In Abbildung 5 sind drei Stukturen dargestellt, die sich schon in den präklinischen Phasen befnden.17
Im Falle des LY580276 hat die 4-Fluorphenylgruppe die Rolle der essentiellen Funktionalität, bei der das Fluoratom die Funktion des Wasserstoffbrückenakzeptors übernimmt. Eine andere, häufig anzutreffende, essentielle Funktionalität ist Chinolin, das ein Stickstoffatom als Wasserstoffbrückenakzeptor enthält (z. B. im Fall des LY550410).
Gerüste, wie Imidazopyridine (Verbindung 2, Abbildung 6) und Pyrazolopyridine (Verbindung 1, Abbildung 6), die räumlich dem Dihydropyrrolopyrazol gleichen, wurden auch entwickelt.17
Abbildung 5: "Small-molecules" TGF-β Rezeptor Kinase Hemmer die sich in der präklinischen Phase befinden.
Abbildung 6: Weitere präklinische TGF-β Rezeptor Kinase Hemmer.
Der Inhibitor SD-208 von der Firma Scios Inc. ist als potenter TβRI-Inhibitor bekannt und unterscheidet sich von den anderen vorgestellten Inhibitoren durch seinen Grundkörper, einem Pteridinring (Abbildung 7).18
Diese Verbindung ist der Ausgangspunkt der Variationen, die das Ziel der vorliegenden Doktorarbeit darstellen.
1.4 Struktur-Aktivitäts Beziehung
Die Natur von Struktur-Aktivitäts-Beziehungen ist von herausragender Bedeutung für den Erfolg von Methoden zur Identifikation neuer Wirkstoffe. Die systematische Analyse von Struktur, Bindungskonformation und Wirksamkeit für eine Reihe von Enzyminhibitoren zeigt Zusammenhänge zwischen verschiedenen Arten von Struktur-Aktivitäts-Beziehungen auf und demonstriert deren Koexistenz für Inhibitoren desselben Enzyms. Diese Einsichten haben weitreichende Konsequenzen für die Wirkstoffentwicklung.19 Setzt man die molekulare Struktur verschiedener Wirkstoffe mit ihrer Wirkung zusammen, ist es möglich Aussagen über die Anforderungen eines potenten Inhibitors zu machen.
Das Zielprotein kann wesentliche Grundgerüstvariationen der Wirkstoffe zulassen ohne, dass diese an Wirkungskraft verlieren. Anderenfalls können geringfügige Strukturänderungen die Wirksamkeit der Wirkstoffe erheblich reduzieren oder auch komplett aufheben.
Abbildung 7: Inhibitor SD-208 der Firma Scios Inc.
N N
N N NH
F
Cl N
Frühere Struktur-Aktivitäts-Studien verschiedener TGF-β-Rezeptor Kinase Hemmer zeigten, dass besonders der 2-Fluor- 5-chlorphenylring entscheidend für die Bindung an den Rezeptor ist.
Auch der 4-Aminopyridinsubstituent spielt hier eine entscheidende Rolle. Wurden diese beiden Substituenten verändert, so verringerte sich die Aktivität der neuen Verbindungen drastisch.
Bereits kleine Modifikationen wie z. B. der Austausch eines Fluoratoms gegen ein Chloratom reichten aus, um die Aktivität stark zu beeinträchtigen. Ausgehend von den Erkenntnissen, die in meiner Diplomarbeit20 bezüglich der biologischen Aktivität von 4-(4-Pyridylamin)-2-(5-chlor-2- fluorphenyl)quinazolin (9) und 4-(4-Pyridylamin)-2-(5-chlor-2-fluorphenyl)chinolin (13) (Abbildung 8) gewonnen wurden, sollten Strukturvarianten synthetisiert weden.
Aus diesem Grund wurde in dieser Arbeit das Substitutionsmuster beibehalten und nur der Grundkörper variiert.21 Als Ziele für dieses Vorhaben wurden Isochinolin A, Indolizin B, Imidazo[1,2-a]pyridin C, Imidazo[1,5-a]pyridin D und Pyrazolo[1,5-a]pyridin E angestrebt (Abbildung 9), die teilweise vom gleichen Baustein aus synthetisiert werden sollten.
Abbildung 8: Ausgangspunkte der Variationen.
13
Der Grund für diese Auswahl greift auf docking Studien der Firma Merck KGaA und auf die Ergebnisse der biologischen Tests in meiner Diplomarbeit zurück.20 Auf Grund der in den docking Studien ermittelten, wahrscheinlichen Lage des Inhibitors in der Bindungstasche (Abbildung 10) wird vermutet, dass das Stickstoffatom des Pyridinrings eine Wasserstoffbrückenbindung zum Rückgrat-Amid des Histidins 283 eingeht, während das N1-Atom im Pteridinring eine Wasserstoff-Brücke zum Lysin 232 ausbildet.21 Der Fluorchlorphenylring muss eine oder mehrere Wechselwirkungen mit dem selectivity pocket eingehen, da Veränderungen an diesem Substituenten zu einem deutlichen Aktivitätsverlust führen.
Abbildung 9: Angestrebte Syntheseziele für diese Arbeit.
Die N5- und N8-Stickstoffatome scheinen nicht zur Bindung beizutragen. Aus den docking Studien geht auch hervor, dass der Stickstoff in 3-Position keine wichtige Rolle spielt.
Darauffolgend wurde das Pteridingerüst des SD-208 sowohl durch ein Chinazolin 9 als auch durch ein Chinolin 13 ersetzt um dies aufzuklären. Für das 4-(4-Pyridylamin)-2-(5-chlor-2- fluorphenyl)chinolin (13) wurde ein IC50-Wert von 12 nM bestimmt, was um den Faktor 6 besser als der IC50-Wert von 4-(4-Pyridylamin)-2-(5-chlor-2-fluorphenyl)chinazolin (9) war. Die erhaltenen Ergebnisse bekräftigten die vorherige Annahme, dass das N1-Stickstoffatom, die für die Bindung maßgebliche, Wechselwirkung eingeht. Um genauere Aussagen über die Rolle dieses Stickstoffatoms im Chinazolin machen zu können sollte es auch durch ein Kohlenstoffatom ersetzt werden, wobei das Isochinolin A entsteht. Diese aufgestellte These könnte definitiv bestättigt werden, wenn das Isochinolin A einen deutlich höheren IC50-Wert als das Chinazolin 9 und das Chinolin 13 aufweist. Als nächstes sollte das N1-Sticktoffatom in verschiedene fünfgliedrige Ringe eingebaut werden, was zu den Klassen von Indolizin B, Imidazo[1,2-a]pyridin C, Imidazo[1,5-a]pyridin D und Pyrazolo[1,5-a]pyridin E führen sollte.
Abbildung 10: Ergebnis des dockings von SD-208 (weiß) in der aktiven Domäne von TßRI.
1.5 Chemische Hintergründe
1.5.1 Indolizine
Indolizin wurde 1890 von Angeli22 entdeckt und erstmal 1912von Scholtz23 aus α-Picolin und Essigsäureanhydrid synthetisiert. Die IUPAC Nummerierung für Indolizin ist in Abbildung 11 gezeigt.Es gibt mehrere Synthesewege um zu Indolizinen zu gelangen. Die meisten davon gehen von Pyridinderivaten aus. Der traditionelle Syntheseweg zu Indolizinen ist die Chichibabin Synthese (Abbildung 12),24 welche eine Quaternisierung eines 2-Alkyl-pyridin mit einer α-Halogencarbonylverbindung erfordert. Es folgt eine basenkatalysierte Cyclisierung via Deprotonierung der aktivierten α-Methylgruppe des Pyridins und anschließend ein intramolekularer Angriff auf die Carbonylgruppe.25 Eine Einschränkung der Synthese ist jedoch, dass die Reaktion, im Falle von Indolizinen, die keine Substituenten am fünfgliedrigen Ring tragen, zu keinem Erfolg führt.
Abbildung 11: Die Strukturformel mir der IUPAC Numerierung des Indolizins.
Das Ringsystem kann aber auch über eine 1,3-dipolare Additionsreaktion von Pyridinium-Yliden dargestellt werden (Abbildung 13).26
Eine Standardreaktion von Indolizinen ist die elektrophile Substitution, die bevorzugt am fünfgliedrigen Heterocyclus, in 1- oder 3-Stellung, stattfindet. Für einen Angriff am sechsgliedrigen Heterocyclus gibt es keine Hinweise.
Da in dieser Arbeit nur 5-Aryl-7-(4-pyridylamin)indolizine angestrebt waren, sind diese literaturbekannten Synthesewege nur partiell anwendbar. Weil eine spätere Funktionalisierung des Indolizins am sechsgliedriegen Ring nicht möglich ist, wäre es wünschenswert, dass das verwendete Pyridin bereits über das erwünsche Substitutionsmuster verfügt.
Abbildung 12: Chichibabin Indolizinsynthese.
N O Ph
Abbildung 13: Indolizinsynthese durch 1,3-dipolare Addition.
N+ NC
via
N
MeO2C CO2Me NC H
H
1.5.2 Imidazo[1,2-a]pyridine
Die Synthese von Imidazo[1,2-a]pyridinen und deren Analoga haben in den letzten Jahren stark an Aufmerksamkeit gewonnen, da diese Verbindungsklasse ein breites Spektrum an pharmakologischer Aktivität aufweist.27
Viele Synthesewege sind für die Synthese dieses Heterocyclus bekannt. Die meisten von ihnen beruhen auf der Bildung des fünfgliedrigen Rings. Der häufigste Ansatz für die Synthese von Imidazo[1,2-a]pyridinen umfasst den Aufbau des Imidazolrings auf entsprechend substituierte Pyridinvorstufen, wie z. B. 2-Aminopyridin (Abbildung 15).25 Die Reaktion mit dem α- Halogenketon findet regioselektiv am Pyridinstickstoff statt.
2-Aminopyridine können auch mit α-Diazoketonen, unter katalytischer Einwirkung von Kupfer(II)triflat, zu Imidazo[1,2-a]pyridinen reagieren. Dementspechend lieferte die Behandlung von Diazoacetophenon mit 2-Aminopyridin in Gegenwart von 10 mol% Cu(OTf)2 in Dichlorethan bei 80 °C, 2-Phenylimidazo[1,2-a]pyridin in 94% Ausbeute (Abbildung 16).28
Abbildung 15: Synthese von Imidazo[1,2-a]pyridin ausgehend von 2-Aminopyridin und α-Bromketon.
Abbildung 14: Die IUPAC Numerierung des Imidazo[1,2-a]pyridins.
7
6 5
N
4 8
3 2
N1
Ein vielseitiger Ansatz verwendet eine Drei-Komponenten-Reaktion (3CC), welche die Kondensation von 2-Aminopyridin, Aldehyden und Isocyaniden miteinbezieht. Die 3CC- Reaktion findet in Anwesenheit eines sauren Katalysators, meist Scandium(III)triflat, statt.29 Die Synthese von Imidazo[1,2-a]pyridinen mit Ringschluss des Sechsrings sind weniger dokumentiert. Die Verwendung von substituierten Imidazolen als Ausgangsmaterialien für die Synthese von Imidazo[1,2-a]pyridinen wurde schon in der Literatur beschrieben.30-32
Ein Beispiel dafür ist in der Abbildung 17 zu sehen.32 Die dargestellten 7-Phenylsubstituierten Imidazo[1,2-a]pyridine verschaffen, durch mögliche elektrophile Substitution an C-3 und Differenzierung der beiden Estergruppen, ein synthetisches Potential für eine weitere Funktionalisierung.
Allerdings besitzen die meisten dieser Methoden große Nachteile, wie geringe Ausbeuten, nicht kommerziel erhältliche Edukte, langwierige Aufarbeitungsverfahren, komplexe Synthesesequenzen und vor allem Einschränkungen für den Einbau von neuen Substituenten.
Imidazo[1,2-a]pyridine sind aromatische Systeme, in denen der N-4-Stickstoff mit seinem Elektronenpaar zur Aromatizität beiträgt. Daher ist dieses Stickstoffatom nicht nukleophil.
Elektrophile Angriffe erfolgen daher an der N-1-Position und elektrophile aromatische Substitution (SEAr) an C-3 (Abbildung 18).33
Abbildung 17: Synthese von Imidazo[1,2a]pyridin ausgehend von substituierten Imidazolen.
Abbildung 16: Synthese von Imidazo[1,2-a]pyridin ausgehend von 2-Aminopyridin und Diazoacetophenon.
Obwohl viele Methoden für die Synthese dieser Heterocyclen bekannt sind, ist es eine große Herausforderung 2,3-unsubstituierte Imidazo[1,2-a]pyridine aufzubauen.
Da im Rahmen dieser Arbeit 5-Aryl-7-(4-pyridylamin)imidazo[1,2-a]pyridine dargestellt werden sollten, ist es notwendig, dass das gewünschte Substitutionsmuster schon in den Edukten vorhanden ist.
1.5.3 Imidazo[1,5-a]pyridine
Die Imidazo[1,5-a]pyridine sind eine wichtige Klasse von heterocyclischen Verbindungen mit interessanten photophysikalischen und biologischen Eigenschaften. Wegen ihrer photophysikalischen Eigenschaften kommen sie in organischen Leuchtdioden (OLED), Dünnschicht-Feldeffekttransistoren (FET) zum Einsatz und dienen als Vorstufen für N-Heterocyclische-Carbenen. Außerdem wurde von vielen Imidazo[1,5-a]pyridinderivaten, als Kardiotonika,34 Aromatase-Inhibitoren in Östrogen-abhängigen Krankheiten35 und Angiotensin- II-Rezeptor-Antagonisten36 berichtet. Deshalb ist eine breit anwendbare und praktische Methode für die Synthese dieses Ringsystems von großem Interesse.
Die meisten der synthetischen Methoden, die für die Synthese dieser Heterocyclen bekannt sind, beruhen auf dem Aufbau des Fünfrings ausgehend von 2-Aminomethylpyridin entweder durch Acylierung und anschließender Cyclisierung mit Phosphoroxytrichlorid35,37 bzw.
Polyphosphorsäure38 (Abbildung 19) oder Thioacylierung und darauffolgendem Ringschluss unter Verwendung von Dicyclohexylcarbodiimid (DCC)39 oder Quecksilbersalzen.40
Abbildung 18: Reaktivität des Imidazo[1,2-a]pyridins.
Eine andere Strategie für den Aufbau des Fünfrings beruht auf einem Tandem-Aza-Wittig- Ringschluß von den, aus Phosphoniumyliden und 2-Cyanpyridinen erhaltenen, N-Phosphazenen (Abbildung 20).41 Obwohl die berichteten Ausbeuten zufriedenstellend waren, sind häufig lange Reaktionszeiten erforderlich.
Vor kurzem wurde eine neue und einfache Eintopf-Synthese von Bu et al. entwickelt.42 Diese Reaktion betrifft die Cyclokondensation von 1,2-dipyridin-2-yl-ethan-1,2-dion und Arylaldehyden in Gegenwart von Ammoniumacetat. Imidazo[1,5-a]pyridine wurden in guten Ausbeuten erhalten, aber auch Imidazole wurden als Nebenprodukte beobachtet (Abbildung 21).
Abbildung 20: Synthese von Imidazo[1,5-a]pyridinen via Tandem Aza-Wittig-Cyclisierung.
MeLi in Hexan, Benzol,RT
92% N N
Ph
R Abbildung 19: Synthese von Imidazo[1,5-a]pyridinen via Vilsmeier-Cyclisierung.
Abbildung 21: Eintopfsynthese von Imidazo[1,5-a]pyridinen nach Bu et al.42 N N
O N
R
N NH N N
R
Sasaki et al. haben festgestellt, dass eine Vilsmeier Reaktion des Pyridin-2-carbonitrils ein Gemisch von 1-Formyl-3-dimethylaminoimidazo[1,5-a]pyridinen, mit einem Chlor- oder einem Wasserstoffatom an der C-7-Position, liefert (Abbildung 22).43
Imidazo[1,5-a]pyridine sind aromatische Systeme, in denen der N-4-Stickstoff mit seinem Elektronenpaar zur Aromatizität beiträgt. Daher ist dieses Stickstoffatom nicht nukleophil und elektrophile Angriffe erfolgen an der N-2-Position (Abbildung 23). SEAr kann je nach den gewählten Bedingungen an C-1 oder C-3 erfolgen (Abbildung 23).33
Nukleophile Angriffe am sechsgliedrigen Ring sind nicht bekannt. Substitutionen von Halogenen durch metallkatalysierte Prozesse finden überraschenderweise nicht am neutralen Heterocyclus statt. Kürzlich wurde über Kreuzkupplungen von Imidazolium-Bromiden mit verschiedenen Boronsäuren (Suzuki-Miyaura-Typ) berichtet (Abbildung 24).44
Abbildung 22: Synthese von Imidazo[1,5-a]pyridinen nach Sasaki et al. 43 N N
CHO
NMe2 R1
R2
N N CHO
NMe2 R1
R2 Cl
Abbildung 23: Reaktivität des Imidazo[1,5]pyridins.
Abbildung 24: Suzuki-Miyaura Kreuzkupplung von Imidazolinium-Bromiden mit Boronsären.44
Eine Deprotonierung von Imidazo[1,5-a]pyridinen findet ausschließlich am fünfgliedrigen Ring, am C-3-Atom, statt. Damit gestaltet sich die Funktionalisierung des sechsgliedrigen Rings von Imidazo[1,5-a]pyridinen sehr schwierig.
1.5.4 Pyrazolo[1,5-a]pyridine
Pyrazolo[1,5-a]pyridine können als 8-Aza-Analoga von Indolen angesehen werden. Um Probleme im Zusammenhang mit der metabolischen Instabilität von Indolen zu umgehen, sind geeignete Bioisostere für die medizinische Chemie von großem Interesse. Als aussichtsreichster Kandidat bietet sich das stabilere Pyrazolo[1,5-a]pyridin an.
Der am weitesten verbreitete Zugang zu diesem Heterocyclus ist die Kondensation von N-Aminopyridinium-Derivaten (I) mit 1,2-ambidenten Synthesebausteinen (z. B. II), die zwei Kohlenstoffatome einbringen. Dadurch erfolgt der Ringschluss des Fünfrings. Wie in Abbildung 25 dargestellt, erfordert der Ringschluss die Dehydrogenierung der Zwischenstuffe III für die Herstellung von Pyrazolo[1,5-a]pyridin IV. Dieser Prozess tritt häufig spontan ein, kann aber durch Zufuhr von Luft oder Sauerstoff in das Reaktionsmedium begünstigt werden.33
Eine weitere synthetische Methode von zunehmender Bedeutung ist die Umlagerung eines transienten Nitren, das meist durch Thermolyse einer Azidogruppe entsteht (Abbildung 26).33
Abbildung 25 Synthese von Pyrazol[1,5-a]pyridinen ausgehend von N-Aminopyridiniumhalogenid.
Außer diesen wichtigen Synthesemethoden, wurden auch andere neue Ansätze untersucht, die je nach Größe des in dem Prozess gebildeten heterocyclischen Rings (fünf- oder sechsgliedrige Ringe) klassifiziert werden können.45-47
Pyrazolo[1,5-a]pyridine sind aromatische Systeme, in denen der N-8-Stickstoff mit seinem Elektronenpaar zur Aromatizität beiträgt. Daher hat der pyrrolartige-Stickstoff den niedrigeren pKa-Wert und ist damit weniger nucleophil. Der N-1-Stickstoff bezitzt einen ähnlichen basischen Charakter wie der Pyridinstickstoff und wird daher bevorzugt protoniert. Abbildung 27 fasst die wichtigsten Merkmale zusammen.
Die Chemie des Pyrazolo[1,5-a]pyridins dreht sich hauptsächlich um die elektrophile Substitution, die mit hoher Selektivität am C-3-Kohlenstoff stattfindet. Eine Deprotonierung von Pyrazolo[1,5-a]pyridinen ist nicht bekannt. Die Substitution von Halogenen, entweder durch direkte SNAr oder über metallkatalysierten Kupplungsreaktionen, ist ausreichend untersucht worden. Ein Beispiel für eine Suzuki-Kupplung an einem 7-Iod-2-methylpyrazol[1,5-a]pyridin ist in Abbildung 28 zu sehen.48
Abbildung 26: Synthese von Pyrazol[1,5-a]pyridine ausgehend von Nitren.
N R1
R2 N3
Abbildung 27: Reaktivität des Pyrazolo[1,5-a]pyridins.
Über die Möglichkeiten zur Einführung von Substituenten in der 7-Position des Ringsystems gibt es nur wenige Beispiele.49 Damit erweist sich eine Funktionalisierung von Pyrazolo[1,5-a]pyridinen als sehr problematisch.
1.5.5 Pyridin-N-oxide
Der Chemie von N-Oxiden und deren Anwendungen wurde kürzlich, aufgrund ihrer Verwendbarkeit als synthetische Zwischenprodukte und ihrer biologischen Bedeutung viel Aufmerksamkeit geschenkt. Die N-O-Einheit von Pyridin-N-Oxiden besitzt eine einzigartige Funktionalität, die sowohl als Elektronen-Donor, aber auch als Elektronen-Akzeptor-Gruppe wirksam funktionieren kann. Diese starke Push-Pull-Eigenschaft hat, als wesentliche chemische Konsequenz, die gleichermaßen einfache Einführung von Donor- wie auch Akzeptor-Gruppen in der 4-Position von Pyridin-N-Oxiden, In Abbildung 29 ist der Push-Pull-Charakter, am Beispiel von Pyridin-N-Oxide, dargestellt. Die kanonischen Strukturen des Typs (b) und (c) tragen zum Resonanzhybrid bei. Diese Situation steht im fundamentalen Gegensatz zu Pyridinen, in dem die Resonanz nur auf die kanonischen Formen von Typ (d) und (e) beschränkt ist.
Abbildung 28: Suzuki-Kupplung an 7-Iod-2-methylpyrazolo[1,5-a]pyridine.
Fast alle bekannten Methoden zur Herstellung von Pyridin-N-Oxiden können in drei Hauptgruppen eingeteilt werden:
(i) direkte N-Oxidation des entsprechenden Pyridins,
(ii) Cyclisierung die zur Bildung eines Ringsystems führt, der die N-Oxid-Gruppe enthält,
(iii) chemische Modifikation eines bestehenden cyclischen N-Oxids unter Erhaltung der N-Oxid-Funktion.
Im Rahmen dieser Arbeit war nur die direkte N-Oxidation von Bedeutung, weshalb hier auch nur auf diese näher eingegangen wird.
Alle wichtigen Oxidationsmittel sind Percarbonsäuren, von denen eine Vielzahl verwendet werden kann. Peressigsäure ist das am häufigsten verwendeten Reagenz für die N-Oxidation von heterocyclischen Verbindungen. N-Oxidationen mit Arylpersäuren (z. B. Perbenzoesäure) werden in der Regel für empfindlichere Verbindungen eingesetzt. Perameisen- und Pertrifluoressigsäure, die wesentlich stärkere Oxidationsmitteln als Peressigsäure darstellen, sind die Reagenzien der Wahl für Verbindungen, die sich schwer oxidieren lassen.50 All diese Reaktionen sind durch die Beschränkungen der unvollständigen Umsetzung, kontaminierenden Nebenprodukte und hohen Kosten limitiert. Darüberhinaus kommen umständliche Aufreinigungen oder der Umgang mit gefährlichen, flüssigen Oxidationsmitteln hinzu.
Eine neue und praktische Methode wurde für die Herstellung von heterocyclischen N-Oxiden entwickelt. Trifluorperessigsäure (TFPA) ist ein leistungsfähiges und wirksames
Abbildung 29: Rezonanzformel für Pyridin-N-oxid und Pyridin.
Oxidationsmittel aufgrund des Einflusses der drei elektronegativen Fluoratome. Es wird typischerweise aus hochkonzentriertem (60-90%) wässrigen Wasserstoffperoxid, welches instabil ist, eine Gefahr für den Transport darstellt und eine spezielle Handhabung erfordert, in-situ dargestellt.51 Hierbei wird ein Harnstoff-Wasserstoffperoxid-Komplex (UHP) (ein geruchloser, weißer Feststoff) der 35% H2O2 enthält, als Peroxid-Quelle für die in-situ Erzeugung von Trifluorperessigsäure verwendet. Ein wesentlicher Vorteil dieses Verfahrens gegenüber den erwähnten Reagenzien ist, dass alle Nebenprodukte in Wasser löslich sind. Das heißt, sie können durch Verteilung zwischen Wasser und einem organischen Lösungsmittel (z. B. Dichlormethan) von den gewünschten Reaktionsprodukten getrennt werden (Abbildung 30). Damit, nutzt die Methode sichere und kommerziell verfügbare Reagenzien und toleriert eine Reihe von funktionellen Gruppen und Substitutionsmustern.
Abbildung 30: Mechanismus für die N-Oxidation von Heterocyclen mit UHP und TFAA.
N N+ O-
2 Aufgabenstellung
Ziel dieser Arbeit war es, verschiedene „small molecules“ Kinaseinhibitoren verschiedener Substanzklassen zu synthetisieren, um neue Verbindungen für biologische Tests an verschiedenen Kinasen zur Verfügung zu stellen. Die Auswahl der Substanzklassen und deren Substitutionsmuster sollten sich an den bereits in Kapitel 1.4 erwähnten Verbindungen orientieren. Daraus ergab sich die folgende Aufgabestellung:
Synthese des Isochinolins A ausgehend von o-Tolylsäure und das entsprechende 5-Chlor-2-fluorphenyl-carbonsäurederivat (Abbildung 31).
Synthese des Indolizins B einschließlich des erforderlichen Bausteins 32a, 32b ausgehend von Pyridin (Abbildung 32).
Abbildung 31: Geplanter Syntheseweg für Isochinolin A.
Abbildung 32: Geplanter Syntheseweg für Indolizin.
Synthese des Imidazo[1,2-a]pyridins C und des Imidazo[1,5-a]pyridins D. Dabei sollte zunächst der gemeinsame Grundbaustein 26a/b, der bereits das gewünschte Substitutionsmuster trägt, synthetisiert werden (Abbildung 33).
Abbildung 33: Geplante Synthesewege für Imidazo[1,5-a]pyridin und Imidazo[1,2-a]pyridin.
N X
NC
F
Cl
Synthese des Pyrazolo[1,5-a]pyridins E ausgehend von Pyridin (Abbildung 34).
Abbildung 34: Geplanter Syntheseweg für Pyrazolo[1,5-a]pyridin E.
N N HN
N
F
Cl
3 Ergebnisse und Diskussion
Alle im Folgenden diskutierten Verbindungen wurden dargestellt, um neue Daten für Struktur- Wirkungsbeziehungsstudien (SAR) zu erhalten. Da der Fokus dieser Arbeit auf der Darstellung kleiner Bibliotheken unterschiedlicher Verbindungsklassen lag, wurden mehrfach auch schlechte Ausbeuten ohne Optimierungsversuche in Kauf genommen.
3.1 Synthese von 1,3-substituierten Isochinolin A
Um das Isochinolin mit dem gewünschten Substitutionsmuster aufzubauen wurden mehrere Synthesewege verfolgt.
Bei der Synthese des Isochinolins A, wurde zuerst versucht, das 5-Chlor-2-fluorbenzonitril (16) mit den Anionen der o-Methylbenzoesäure (17a) oder verschiedenen o-Methylbenzoesäreamiden (17b, 17c) in das 3-(5-Chlor-2-fluorphenyl)-1-isochinolon (18) zu überführen. Dabei verlief die Reaktion mit sehr geringen Ausbeuten (2 bis 17%). Das Isochinolon wurde anschließend mit POCl3 zum 1-Chlor-3-(5-chlor-2-fluorphenyl)isochinolin (19) umgestezt. Dieses sollte, durch anschließende nukleophile Substitution mit 4-Aminopyridin, in Anwesenheit einer Base, zum Zielmolekül A führen. Die Reaktion wies jedoch auch nach langen Reaktionszeiten und hohen Temperaturen keinerlei Umsetzung auf (Abbildung 35).
Es wurde als nächstes von 5-Chlor-2-fluoracetophenon (20) als Edukt ausgegangen. Das Enolat des 5-Chlor-2-fluoracetophenons (20) sollte mittels einer SRN1-Reaktion mit dem o-Iodbenzamid (21) zu 3-(5-Chlor-2-fluorphenyl)-1-isochinolon (18) umgesetzt werden (Abbildung 36). Bei dieser Reaktion erfolgte jedoch keine Umsetzung. Ausgehend von 18 sollte durch Chlorierung mit Phosphoroxytrichlorid und anschließender Kupplung mit 4-Aminopyridin das gewünschte Endprodukt synthetisiert werden.
Abbildung 36: Syntheseweg für 1-(4-Pyridylamin)-3-(5-chlor-2-fluorphenyl)isochinolin über 5-Chlor-2-fluoracetophenon (20).
NH2 O
I
F
Cl O
21 20
Abbildung 35: Retrosynthese von 1-(4-Pyridylamin)-3-(5-chlor-2-fluorphenyl)isochinolin über 5-Chlor-2-fluorbenzonitril (16).
Da die Synthese von 3-(5-Chlor-2-fluorphenyl)-1-isochinolon (18) auf diesem Weg misslang, wurde die Synthesestrategie geändert. Als alternative Syntheseroute wurde der Weg über 3-Chlor-1-isochinolon (24) ausgehend von o-Methylbenzoesäure (17a) und anschließender Suzuki-Kupplung mit 5-Chlor-2-fluorphenylboronsäure (22) untersucht (Abbildung 37).
Aufgrund der verschiedenen Hindernisse, die im Kapitel 3.1.2 detailiert diskutiert werden, konnte das gewünschte Zielmolekül auch mittels dieser Strategie nicht synthetisiert werden.
Deshalb wurde der Syntheseweg ausgehend von 5-Chlor-2-fluorbenzoesäuremethylester (16a) und N-tert-Butyl-2-methylbenzamid (17d) gewählt. Durch Deprotonierung der Methylgruppe des N-tert-Butyl-2-methylbenzamids (17d) mittels TMEDA/n-BuLi wurde ein Anion erzeugt, welches die Carbonylgruppe des Esters 16a unter Bildung von N-tert-Butyl-2-(2-(5-chloro-2- fluorophenyl)-2-oxoethyl)benzamid (25) angreift. Unter sauren Bedingungen erfolgte der Ringschluß zum 3-(5-Chlor-2-fluorphenyl)-1-isochinolon (18) in 73% Ausbeute, das weiter mit Phosphoroxytribromid in 1-Brom-3-(5-chlor-2-fluorphenyl)isochinolin (19a) umgewandelt wurde. Im letzten Schritt wurde 4-Aminopyridin mit dem 1-Bromisochinolin 19a in
Abbildung 37: Retrosynthese von 1-(4-Pyridylamin)-3-(5-chlor-2-fluorphenyl)isochinolin über 5-Chlor-2-fluorphenylboronsäure (22).
N Cl
F
Cl
OH O
Anwesenheit von Triethylamin umgesetzt, wobei das 1-(4-Pyridylamin)-3-(5-chlor-2- fluorphenyl)isochinolin (A) erhalten wurde (Abbildung 38).
3.1.1 Synthese von 5-Chlor-2-fluorcarbonsäurederivaten
Die 5-Chlor-2-fluorbenzoesäurederivate 16, 16a und 20 stellten für die in diesem Teil der Arbeit durchgeführten Synthesen entscheidende Ausgangsverbindungen dar (Abbildung 39). Die Synthesen gehen in jeden Fall von der 5-Chlor-2-fluorbenzoesäure (14) aus. Diese wurde nach der Methode synthetisiert, die in meiner Diplomarbeit entwickelt worden war.20
Abbildung 39: 5-Chlor-2-fluorbenzoesäurederivate 16, 16a, 20.
F
Cl O
20
Abbildung 38: Synthese von 1-(4-Pyridylamin)-3-(5-chlor-2-fluorphenyl)isochinolin (A) über N-tert-Butyl-2-(2-(5-chloro-2-fluorophenyl)-2-oxoethyl)benzamid (25).
17d
3.1.1.1 Synthese von 5-Chlor-2-fluorbenzonitril (16)
Das 5-Chlor-2-fluorbenzonitril (16) wurde in einer dreistufigen Reaktionsfolge dargestellt (Abbildung 40). Zunächst wurde die 5-Chlor-2-fluorbenzoesäure (14) mit 5.0 Äquiv.
Thionylchlorid für 3 Stunden unter Rückfluss gekocht und das überschüssige Thionylchlorid abdestilliert. Der Rückstand wurde, aufgrund der Hydrolyseempfindlichkeit des Säurechlorids 15a, ohne weitere Aufreinigung, in absolutem 1,4-Dioxan aufgenommen und mit 25%igem wässrigem Ammoniak umgesetzt. Nach Aufarbeitung und säulenchromatographischer Reinigung wurde das Produkt 15b, in 77% Ausbeute, über 2 Stufen, isoliert. Das 5-Chlor-2-fluorbenzamid (15b) wurde, nach einer literaturbekannten Vorschrift,52 mit Trifluoressigsäureanhydid in Anwesenheit von absolutem Pyridin bei Raumtemperatur zum 5-Chlor-2-fluorbezonitril (16) dehydratisiert.
Die Konstitution der Verbindung wurde durch 1H-NMR-, 13C-NMR-, HSQC-NMR- Spektroskopie und Massenspektrometrie bestimmt. Im 1H-NMR-Spektrum ist das Auftreten von drei aromatischen Protonen (7.09, 7.45 und 7.49 ppm) charakteristisch. Im 13C-NMR-Spektrum ist das Signal bei 112.46 ppm der Nitrilgruppe zuzuordnen. Im Massenspektrum ist der Molekularionpeak bei m/z = 155 zu finden.
Abbildung 40: Synthese von 5-Chlor-2-fluorbenzonitril (16) über 5-Chlor-2-fluorbenzamid (15b).
F
Cl CN
16
3.1.1.2 Synthese von 5-Chlor-2-fluorbenzoesäuremethylester (16a)
Der 5-Chlor-2-fluorbenzoesäuremethylester (16a) wurde ausgehend von der 5-Chlor-2- fluorbenzoesäure (14), in zwei Stufen, dargestellt (Abbildung 41). Die Säure 14 wurde zuerst mit 3.0 Äquiv. Thionylchlorid in absolutem CH2Cl2 zum 5-Chlor-2-fluorbenzoesärechlorid (15a) umgesetzt. Nach Abdestillieren des Lösungsmittels und des überschüssigen Thionylchlorids wurde das Säurechlorid 15a in 65% Ausbeute durch Vakuumdestillation erhalten. Die mäßige Ausbeute ist auf die Tatsache zurückzuführen, dass das Säurechlorid sehr feuchtigkeitsempfindlich ist. Zur Darstellung des Esters 16a wurde das 5-Chlor-2-fluorbenzoesäurechlorid (15a) zu einer Lösung aus Methanol (19.0 Äquiv.) und absolutem Pyridin (1.1 Äquiv.) bei 0 °C zugetropft. Die Reaktion wurde mittels Dünnschichtchromatographie verfolgt. Bereits nach einer Stunde war eine vollständige Umsetzung feststellbar. Nach Aufarbeitung und säulenchromatographischer Aufreinigung wurde der 5-Chlor-2-fluorbenzoesäuremethylester in 87% Ausbeute erhalten.
Die Konstitution von 16a konnte durch 1H-NMR-, 13C-NMR-, HSQC-NMR-Spektroskopie und Massenspektrometrie gesichert werden. Auffallend im 1H-NMR-Spektrum ist ein Singulett bei 3.94 ppm, das auf die CH3-Gruppe des Esters hinweist. Charakteristisch sind auch die zwei Dublett vom Dublett (7.10 und 7.91 ppm) und ein Dublett vom Dublett vom Dublett (7.47 ppm) der drei aromatischen Protonen. Im 13C-NMR-Spektrum kann das Signal bei 52.78 ppm der CH3- Gruppe des Esters zugeordnet werden. Im Massenspektrum ist der Molekularionpeak bei m/z = 188 zu finden.
Abbildung 41: Synthese des 5-Chlor-2-fluorbenzoesäuremethylester (16a).
14 15a
3.1.1.3 Synthese von 5-Chlor-2-fluoracetophenon (20)
Zur Herstellung des 5-Chlor-2-fluoracetophenon (20) wurde zuerst die von Campiani etablierte Methode, ausgehend von der entsprechenden Carbonsäure und Methyllithium durchgeführt (Abbildung 42).53 Dafür wurde bei 4 °C einer Lösung der 5-Chlor-2-fluorbenzoesäure (14) in THF, sehr langsam Methyllithium (4.0 Äquiv., 1.6 M in Et2O) zugetropft. Nach 2 Stunden Rühren bei 0 °C wurde die Reaktion mit TMS-Cl gequencht. Nachdem die Reaktionsmischung Raumtemperatur erreicht hatte wurde der Silylenolether mit einer 1 N HCl-Lösung abgespalten.
Die anschließende Aufarbeitung ergab ein dunkelgrünes Öl, welches mittels GC-MS analysiert wurde. Obwohl das GC-MS-Chromatogramm zahlreiche Peaks enthielt konnte trotzdem eine molekulare Masse von 172 dem Produkt zugeordnet werden. Aufgrund der zahlreichen Nebenprodukten blieb der Versuch, zur Isolierung des Produktes mittels säulenchromatographischer Trennung, leider erfolglos.
Da die Synthese des 5-Chlor-2-fluoracetophenons (20) unter Verwendung von Methyllithium misslang, wurde auf Methylmagnesiumbromid zurückgegriffen (Abbildung 43).54 Für die Synthese wurde die 5-Chlor-2-fluorbenzoesäure (14) in THF gelöst und im Eisbad zunächst auf 0 °C abgekühlt. Zu dieser Reaktionslösung wurden langsam 5.0 Äquiv. MeMgBr (3 M Lösung in THF) getropft und die erhaltene Lösung unter langsamem Erwärmen bei Raumtemperatur gerührt. Weil die DC-Kontrolle keinen weiteren Umsatz mehr erkennen lies, wurde die Reaktionslösung bei 50 °C über Nacht gerührt. Die Reaktionsmischung wurde auf Eis gegossen und mit halbkonzentrierter Salzsäure auf pH = 6 gebracht. Nach der Aufarbeitung, zeigte die GC-MS-Analyse des Rückstandes neben der erwarteten Masse von 172 g/mol auch eine molekulare Masse von 188 g/mol, die auf die Anwesenheit des Carbinol 20a zurückgeführt
Abbildung 42: Synthese von 5-Chlor-2-fluoracetophenon (20) nach Campiani et al.53 F
Cl
OH
O F
Cl O
14 20
werden kann. Dem GC-MS-Chromatogram konnte ein Verhältnis von Haupt- zu Nebenprodukt von 1:4 entnommen werden.
Auch in der Literatur ist die Reaktion mit geringen Ausbeuten sowie der Bildung von tertiären Alkoholen verbunden.55-57 Das Gemisch kann zwar mittels Säulenchromatographie getrennt werden, jedoch sollte ein System gefunden werden, das den Reinigungsaufwand möglichst gering hält und nicht unnötig große Mengen an Nebenprodukten ergibt.
Deshalb wurde eine andere Synthesestrategie verfolgt. Hierbei sollte die höhere Reaktivität des Säurechlorid 15a ausgenutzt werden (Abbildung 44).
Zu diesem Zweck wurde zu einer auf -50 °C gekühlte Suspension aus AlCl3 (1.0 Äquiv.) in DCM eine Lösung vom 5-Chlor-2-fluorbenzoesäuresäurechlorid (15a) in DCM zugetropft und für eine Stunde bei dieser Temperatur gerührt. Zum AlCl3/Säurechlorid-Komplex wurde bei -50 °C eine AlMe3-Lösung in DCM (0.4 Äquiv.) sehr langsam zugetropft und unter langsamem Erwärmen auf Raumtemperatur für 2 Stunden gerührt. Anschließend wurde die Reaktionslösung auf 0 °C abgekühlt und mit Wasser gequencht. Nach darauffolgender Aufarbeitung und säulenchromatographischer Aufreinigung konnte das 5-Chlor-2-fluoracetophenon (20) in einer Ausbeute von 92% isoliert werden.
Abbildung 44: Synthese von 5-Chlor-2-fluoracetophenon (20) ausgehend von Säurechlorid 15a.
F
Cl
Cl O
Abbildung 43: Synthese von 5-Chlor-2-fluoracetophenon (20) nach Zhang et al.54 F
Cl OH
20
Die Konstitution der Verbindung 20 konnte durch 1H-NMR-, 13C-NMR-Spektroskopie und Massenspektrometrie gesichert werden. Im 1H-NMR-Spektrum von 20 konnten im aliphatischen Bereich dem Signal bei δ = 2.57 ppm die Methylprotonen zugeordnet werden. Das 13C-NMR- Spektrum enthielt Signale im charakteristischen Bereich für aromatische Kohlenstoffe von δ = 118.07 bis 161.81 ppm. Die zwei Signale bei 31.17 und 31.25 ppm wurden dem Methylkohlenstoff zugeordnet. Das Kohlenstoffatom der Carbonylfunktion zeigt im 13C-NMR- Spektrum Resonanz bei δ = 194.29 ppm. Die Konstitution konnte zusätzlich durch den Molekularionpeak (m/z = 174) des Massenspektrums gesichert werden.
3.1.2 Synthese von 3-(5-Chlor-2-fluorphenyl)-1-isochinolon (18)
Der erste Ansatz für die Synthese des 3-(5-Chlor-2-fluorphenyl)-1-isochinolons (18) basierte auf einer Tandem-Reaktionssequenz, wobei zunächst die Methylgruppe der o-Methylbenzoesäure (17a) bzw. der o-Methylbenzoesäureamide (17b, 17c) deprotoniert wurde, gefolgt von der Reaktion des enstandenen Anions mit dem 5-Chlor-2-fluorbenzonitril (16). Dafür wurden 0.4 Äquiv. Diethylamin zu einer auf -78 °C abgekühlte n-BuLi-Lösung (1.6 M in n-Hexan, 2.2 Äquiv.) getropft und anschließend für 30 Minuten bei 0 °C gerührt. Die auf diese Weise dargestellte LDA-Lösung wurde auf -78 °C abgekühlt und mit o-Methylbenzoesäure (17a) (1.0 Äquiv.) in THF versetzt. Nach 30 Minuten Rühren bei 0 °C wurde die dunkelgrüne Reaktionslösung wieder auf -78 °C abgekühlt. Zu dieser Lösung wurde eine Lösung des 5-Chlor-2-fluorbenzonitril (16) in THF getropft und das erhaltene Reaktionsgemisch über 24 Stunden unter langsamem Erwärmen auf Raumtemperatur gerührt. Die Aufarbeitung dieser Reaktion verläuft problemlos, da die Reaktionslösung nur mit Wasser verdünnt wurde, wobei sich ein amorpher grauweißer Feststoff bildete, welcher eine Ausbeute von 5% entsprach.
Die Ursache dafür könnte die geringere Reaktivität der Carboxylgruppe gegenüber einem nukleophilen Angriff des Stickstoffs sein, da die positive Teilladung des Carbonylkohlenstoffes durch das Sauerstoffanion kompensiert wird.
Die Tatsache, dass eine erhebliche Menge an Nitril 16 zurückgewonnen werden konnte, bestätigt diese Vermutung.
In der Abbildung 45 ist der mögliche Mechanismus, gestützt auf Brun et al.,58 für den Bildungsprozess des Isochinolons schematisch dargestellt. Wie man dem Mechanismus entnehmen kann, ist die Addition des Dianions an der Cyanidgruppe ein Gleichgewichtprozess und der bevorzugte Angriff könnte auf thermodynamische Kontrolle zurückzuführen sein, was zusätzlich eine Erklärung für die geringe Ausbeute sein könnte. Um dieses Problem zu umgehen, wurden o-Methylbenzoesäureamide als Edukte verwendet. Dafür wurden das N-Methyl-o-methylbenzoesäureamid (17b) und das N,N-Diethyl-o-methylbenzoesäureamid (17c) synthetisiert. Zuerst wurde das N-Methyl-o-methylbenzoesäureamid (17b) analog zu der Carbonsäure 17a umgesetzt. Ausgehend von den Carbonsäureamiden 17b und 17c verläuft die Reaktion über ein Lithiumchelat, das in Abbildung 46 zu sehen ist. Durch den von Poindexter
Abbildung 45: Mechanismus der Isochinolonbildung.
O O-
N- F
Cl 17a
postulierten Mechanismus wurde vorgeschlagen,59 dass die Zugabe des Nitrils 16 zum Dianion I das Addukt II liefert, welches beim Quenchen mit Ammoniumchlorid und anschließender Tautomerisierung das Enaminamid III bildet. Obwohl dieses Zwischenprodukt noch nie isoliert wurde, erwartet man eine rasche Cyclisierung zu IV. Die darauffolgende Abspaltung von Methylamin sollte zum Produkt 18 führen.
Es zeigte sich bereits nach den ersten Cyclisierungsversuche, dass das Verfahren keine reproduzierbaren Ergebnisse, bezüglich der Ausbeuten und den Verlauf der Reaktion, lieferte. Es wurden verschiedene Optimierungsversuche unternommen, die in Tabelle 1 aufgeführt sind.
Durch eine Erhöhung der Reaktionstemperatur von 0 °C auf RT (Eintrag 2) bzw. der Nitrilmenge von 1.2 Äquiv. auf 3.0 Äquiv. bezogen auf die Stoffmenge des Amids 17b (Eintrag 9) konnte die Ausbeute geringfügig verbessert werden. Eine Ursache für die geringe Aubeute könnte der sterische Anspruch des Intermediats I sein, wodurch dessen Angriff am Nitril 16 erschwert wird.
Abbildung 46: Mechanismus der Isochinolonbildung ausgehend von N-Methyl-o-methylbenzoesäure nach Pointdexter.59 NH
O
CH3 NH2
F
Cl II
