IDBVD ver1116DE
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Management System
Gebrauchsinformation
ID Gene™ BVD/BD Triplex
Referenz: IDBVD-50 / IDBVD-100 50 / 100 Reaktionen
Real-Time PCR Kit für den qualitativen Nachweis von Bovine Viral Diarrhea Virus und Border Disease Virus
Geeignetes Probenmaterial:
Vollblut, Serum, Plasma von Rindern und Schafen sowie Ohrstanzenproben von Rindern
(Einzelproben oder Pools aus bis zu 50 Blutproben und 25 Ohrstanzen)
In vitro Diagnostikum
Zul.-Nr. FLI-C 031
Die deutsche Gebrauchsinformation ist nach § 11 TierGesG zugelassen
IDvet Genetics, 310, rue Louis Pasteur – Grabels - FRANCE Tel:+ 33 (0)4 67 41 49 33 - Fax: + 33 (0)4 67 45 36 95
www.id-vet.com - E-mail: info@id-vet.com
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Allgemeine Informationen
Beschreibung
Das ID Gene™ BVD/BD Triplex (IDBVD) Kit ist eine Real-Time RT-PCR zur Amplifizierung einer spezifischen Zielsequenz des Genoms des Bovine Viral Diarrhea Virus (BVDV) oder des Border Disease Virus (BDV).
Dieses Kit ist ein qualitativer Triplex Test. Er erlaubt die gleichzeitige Amplifizierung der Ziel-RNA und einer endogenen sowie einer exogenen internen Kontrolle.
Das Kit enthält eine Positivkontrolle (Target Positive Control, TPC-BVD) für die Serum- und Blutuntersuchung, eine Positivkontrolle für die Ohrstanzen-Untersuchung (Target Positive Control EN, TPC-EN-BVD) und eine exogene Extraktions- und Inhibitionskontrolle (Non-Target Positive Control, NTPC-BVD), die unter denselben Bedingungen extrahiert werden. So kann die Qualität der Extraktion überprüft werden und die Präsenz von PCR Inhibitoren ausgeschlossen werden.
Dieses Kit kann für Vollblut, Plasma und Serum von Rindern und Schafen verwendet werden. Es kann ebenfalls mit RNA Extrakten aus zellhaltigen Proben wie Ohrstanzenproben von Rindern verwendet werden.
Dieses Kit kann sowohl für Einzelproben oder auch für Pools aus bis zu 50 Blutproben und bis zu 25 Ohrstanzen verwendet werden.
Bestandteile des Kits und deren Lagerung Folgende Bestandteile sind im IDBVD Kit enthalten:
Referenz Bezeichnung Volumen Zusätzliche Informationen
TPC-BVD Target Positive control 550 µl 1 Röhrchen
BVDV-positive Vollblutprobe.
Gefriergetrocknetes Pellet in 550 µl destilliertem oder Nuklease-freiem Wasser auflösen.
TPC-EN-BVD Target Positive control EN
550 µl 1 Röhrchen
BVDV-positiver Pool aus lysiertem Ohrstanzengewebe.
Gefriergetrocknetes Pellet in 550 µl destilliertem oder Nuklease-freiem Wasser auflösen.
NTPC-BVD Non-Target Positive Control
2200 µl 1 Röhrchen
Nicht-pathogenes inaktiviertes RNA Virus
Gefriergetrocknetes Pellet in 2200 µl destilliertem oder Nuklease-freiem Wasser auflösen.
ARM-BVD Amplification Reaction Mix
400 µl 1 oder 2 Röhrchen weisser Deckel
Gebrauchsfertiges Reaktionsgemisch, enthält die reverse Transkriptase, Taq Polymerase und Oligonukleotide zum Nachweis des BVDV / BDV und der endogenen und exogenen internen Kontrollen.
Alle Bestandteile müssen bei -16°C (+/-3 C) aufbewahrt werden. Es wird empfohlen, die Reagenzien zu aliquotieren (mindestens 100 µl), um wiederholtes Aufzutauen und Einfrieren zu vermeiden (nicht mehr als drei Mal).
Erforderliches, nicht im Kit enthaltenes und empfohlenes Material Das benutzte Material muss für Molekularbiologie geeignet sein.
Thermocycler zur Amplifizierung:
Real Time Thermocycler, die das Ablesen folgender Wellenlängen erlauben: 525 nm (FAM), 548 nm (Yakima Yellow, gleichwertig zu VIC) und 650 nm (Cy5).
Beispiele kompatibler Thermocycler: CFX96, Chromo 4 Biorad, LC 480 I, LC480 II, LC96 Roche, 7500 AB, Rotorgen Qiagen…
Bitte kontaktieren Sie IDvet Genetics für alle anderen Thermocycler.
Wegwerfbares Einmalmaterial:
- Präzisionspipetten oder Multikanalmikropipetten mit Nuklease freien Pipettenspitzen mit Filter für Volumina zwischen 1 µl und 1000 µl.
- Sterile 1,5 ml Röhrchen
- 96-Well PCR Platten, Streifen oder PCR Kapillaren (mit einer optischen Qualität, die mit dem Thermocycler kompatibel ist), Deckel oder Folien zum Abdecken der Platten und Verschließen der Röhrchen.
Reagenzien:
- Destilliertes oder Nuklease-freies Wasser
Anmerkungen und Vorsichtsmaßnahmen
Das verwendete Material enthält weniger als 0,1% gefährliche oder krebserregende Substanzen. Sicherheitsdatenblätter (MSDS) werden daher nicht verlangt. Trotzdem wird empfohlen, geeignete Vorsichtsmaßnahmen mit allen biochemischen Produkten einzuhalten und entsprechende Schutzkleidung zu tragen.
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Extraktions- und Amplifikationskontrollen
Positivkontrollen
Das IDBVD Kit enthält folgende Positivkontrollen:
- Exogene Non-Target-Kontrolle (NTPC-BVD), Extraktions- und Inhibitionskontrolle Die exogene Kontrolle ist ein nicht pathogenes inaktiviertes RNA Virus.
Diese Kontrolle ermöglicht eine Bewertung der Effizienz des Extraktionsprozesses und den Nachweis einer eventuellen Präsenz von PCR Inhibitoren. Diese Kontrolle wird jeder Probe und den anderen Kontrollen (TPC-BVD, TPC-EN-BVD, NEC) vor der Extraktion zugesetzt.
- Positivkontrolle für Zielsequenz BVD (Target Positive Control, TPC-BVD bzw. TCP-EN-BVD)
Diese Kontrollen bestehen aus einer BVDV-positiven Vollblutprobe (TPC-BVD, zur Anwendung mit Blut und Serum) bzw. einem BVDV-positiven Pool aus lysiertem Ohrstanzengewebe (TCP-EN-BVD, zur Anwendung mit Ohrstanzen). Diese Kontrollen wurden auf das 10-100-fache der Nachweisgrenze der Methode eingestellt. Mit diesen Kontrollen wird die Extraktion und Amplifikation der Zielsequenz validiert.
Diese Kontrollen werden wie eine Probe vorbereitet und extrahiert.
- Endogene Non-Target-Kontrolle (NTPCen), Extraktions- und Inhibitionskontrolle:
Diese Kontrolle ist natürlicherweise in den Zellen der zu testenden Proben enthalten. Mit dieser Kontrolle wird die Zelllyse und Amplifikation eines Non-Target Gens validiert. Außerdem bestätigt diese Kontrolle das Vorhandensein von Zellen und gibt Auskunft über den Probenzustand.
Negative Kontrollen
Es wird empfohlen, folgende Negativkontrollen mitzuführen, um eventuelle Kontaminationen nachzuweisen:
Negative Extraktionskontrolle (NEC)
Es wird empfohlen, bei jedem Testlauf eine Negativkontrolle mitzuführen. Diese Kontrolle wird wie eine Probe vorbereitet und extrahiert, enthält aber keine zu testende Probe. Das Volumen, das der Probe entspricht, kann durch eine nicht-reaktive Matrix oder Nuklease-freies Wasser ersetzt werden.
Negative Amplifikationskontrolle (NAC)
Diese Kontrolle enthält 8 µl des Reaktionsmix (ARM-BVD) und 5 µl Nuklease-freies Wasser. Sie wird in jedem Testlauf getestet, um die Abwesenheit von Kontaminationen in der Luft zu kontrollieren.
Testprotokoll
Extraktion der viralen RNA
Vor der RT-PCR muss die virale RNA aus dem Ausgangsmaterial extrahiert werden.
IDvet Genetics bietet dafür verschiedene Extraktionsmethoden an:
Beschreibung Produkt Name Produktreferenz
Magnetic Bead Extraktionssysteme ID Gene™ Mag Universal Extraction Kit MAG192/MAG384
ID Gene™ Mag Fast Extraction Kit MAGFAST384
Extraktion mit Spinsäulen ID Gene™ Spin Universal Extraction Kit SPIN50/SPIN250 Direktes Lysesystem für Ohrstanzen IDvet Genetics Direct Lysis Buffer DLB
Es können auch andere handelsübliche Extraktionskits angewendet werden (für mehr Informationen wenden Sie sich bitte an IDvet Genetics).
Extraktion der Kontrollen
Die Volumen der zu extrahierenden Kontrollen sind in der unten stehenden Tabelle beschrieben:
Wichtig:
- Die angegebenen Volumen gelten für alle Extraktionssysteme - Die Kontrollen müssen gleichzeitig mit den Proben extrahiert werden.
Kontrolle Volumen
TPC-BVD / TPC-EN-BVD 50 µl
NTPC-BVD
zu TPC-BVD, TPC-EN-BVD, NEC und allen zu testenden Proben hinzuzufügen
5 µl für Extraktionen mit magnetischen Beads oder Silica-Säulchen 20 µl für die direkte Lyse von Ohrstanzen
Anmerkung:Wenn die NEC Kontrolle mit einer negativen Matrixprobe hergestellt wird, orientieren Sie sich bitte an dem Protokoll für die Extraktion des entsprechenden Probenmaterials.
Vorbereiten der Real-Time PCR Amplifikationsreaktion
1. Vorbereiten eines experimentellen Analysenplans. Die Positivkontrolle (TPC-BVD) sollte möglichst separat von den anderen Proben bearbeitet werden.
2. Das IDBVD Kit auftauen, idealerweise bei +5°C (+/- 3°C) in gekühlten Röhrchenständern. Nur bei Raumtemperatur (21°C ± 5°C) auftauen, wenn die Reagenzien direkt nach dem Auftauen benutzt werden.
3. Den Inhalt des Röhrchens mit dem Reaktionsgemisch ARM-BVD mittels Vortex mischen und kurz anzentrifugieren.
4. Verteilen von 8 µl ARM-BVD pro Well (benutzen Sie Streifen oder Mikroplatten für Thermocycler) 5. Hinzufügen von :
- 5 μl der extrahierten RNA der zu testenden Proben oder - 5 μl der extrahierten RNA der TPC- BVD / TPC-EN-BVD oder - 5 μl der extrahierten RNA der NEC oder
- 5 µl Nuklease-freies Wasser (NAC)
6. Die Streifen oder Platte mit einer Folie oder einem passenden Deckel abdecken.
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Seite 4 Programmierung der Amplifikationsphase
1. In der Software des Real-Time PCR-Geräts die Filter für Reporter and Quencher gemäß unten stehender Tabelle einstellen:
Target Reporter λ (nm) Quencher
BVD FAM 495-525 Nicht fluorescent
NTPC Cy5 649 Nicht fluorescent
NTPCen VIC / Yakima Yellow 426-548 Nicht fluorescent (compatible VIC/HEX) Anmerkung: Der IDBVD Mastermix enthält die ROX für Geräte, die eine passive Referenz benötigen.
2. Wählen Sie zwischen zwei verschiedenen Amplifikationsprogrammen, die von IDvet Genetics validiert wurden:
- Das Standardprogramm (kann mit zahlreichen anderen Amplifikationskits gleichzeitig angewendet werden) oder - Das schnelle Programm
Schritt Standard Programm Schnelles Program Anzahl der Zyklen
(1) Reverse Transkription 10 min bei 45°C 10 min bei 45°C 1
(2) Polymerase Aktivierung 10 min bei 95°C 2 min bei 95°C 1
(3) RNA Denaturation/Elongation 15 s bei 95°C 60 s bei 60°C
10 s bei 95°C
30 s bei 60°C 40
Anmerkung: Die Fluoreszenz wird am Ende der Elongationsphase bei 60°C gemessen.
3. Geben Sie eines der Programme in das PCR-Gerät ein und wählen Sie ein Endvolumen von 13 µl pro PCR an. Wenn verschiedene Volumina in einem Testlauf verwendet werden, geben Sie das größte Volumen auf der Platte an.
4. Geben Sie die PCR Platte oder Streifen oder Kapillaren in das PCR Gerät und starten Sie das Programm.
Validierung und Auswertung der Ergebnisse
Validierung des Testlaufs
Die Auswertung der Ergebnisse erfolgt mit den CT Werten jeder Probe, die von jedem Filter erhalten werden.
Der Test wird mittels der unten stehen Kriterien validiert. Werden die Validierungskriterien nicht erfüllt, können die Ergebnisse nicht zuverlässig ausgewertet werden.
Kontrolle Erwartetes Ergebnis Validierungskriterien
TPC-BVD
TPC-EN-BVD Nachweis im FAM-Kanal Siehe CT Werte im Qualitätskontrollzertifikat NTPC-BVD Nachweis im Cy5-Kanal in jeder Probe + 3 Ct im Vergleichzu der NEC Kontrolle
NTPCen Nachweis im VIC-Kanal in jeder Probe Präsenz einer charakteristischen Kurve
NEC
Nachweis im Cy5-Kanal, wenn Wasser benutzt wird
+ 3 CT im Vergleich zu dem im Qualitätskontrollzertifikat angegebenen CT Wert.
Nachweis im Cy5- und VIC-Kanal, wenn eine
negative Probe benutzt wird Präsenz einer charakteristischen Kurve
NAC Kein Nachweis Fehlen einer charakteristischen Kurve
Anmerkung: TPC-BVD kann als Laborkontrolle (“Sentinel”) benutzt werden, da es sich um eine Positivkontrolle an der Nachweisgrenze handelt.
Ausnahmefall: Wenn die NTPC-BVD nicht nachgewiesen wird, aber die Probe als positiv für BVD (FAM) nachgewiesen wird, kann die Probe als positiv bewertet werden (siehe unten stehende Tabelle).
Vorschlag zur Auswertung der Ergebnisse
Die Ergebnisse der Proben können entsprechend der folgenden Kriterien ausgewertet werden:
Probe BVD Signal NTPC-BVD Signal Auswertung
Einzelprobe
Nachweis Nachweis oder kein
Nachweis BVDV- oder BDV-positives Tier
Kein Nachweis Kein Nachweis oder
CTNTPC-BVD > CTNEC + 3 PCR Reaktion inhibiert
Kein Nachweis Nachweis BVDV- und BDV-negatives Tier
Poolprobe
Nachweis Nachweis oder kein Nachweis
Mindestens ein BVDV- oder BDV-positives Tier
Untersuchung der Einzelproben ist nötig Kein Nachweis Kein Nachweis oder
CT NTPC-BVD > CTNEC + 3 PCR Reaktion inhibiert
Kein Nachweis Nachweis Pool aus negativen Proben
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Seite 5 Nicht valide Proben :
- Wenn die NTPCen Kontrolle nicht nachgewiesen wird, ist das ein Hinweis auf ein Problem bei der Probenpipettierung oder beim Extraktionsprozess. In diesem Fall sollte die Probe erneut extrahiert und analysiert werden.
- Wenn CT NTPC-BVD > CTNEC + 3 und kein BVD Signal nachgewiesen wird, ist die PCR Reaktion inhibiert. In diesem Fall können Sie eine neue Amplifikation nach folgendem Protokoll ansetzen:
Protokoll, wenn die PCR Reaktion inhibiert war:
1. Verdünnung der extrahierten RNA in einer 1:10 Verdünnung in Nuklease-freiem Wasser.
2. Wiederholung der Amplifikationsphase mit 5 µl dieser Verdünnung.
3. Wenn die NTPC nachgewiesen wird, kann die Probe nach obenstehender Tabelle ausgewertet werden.
4. Wenn die NTPC nicht nachgewiesen wird, muss die Probe erneut extrahiert werden oder als nicht auswertbar angegeben werden.
Dokumentation und Support
Für Fragen und technische Unterstützung, kontaktieren Sie bitte: support.genetics@id-vet.com Für zusätzliche Informationen besuchen Sie auch unsere Homepage: www.id-vet.com
