Molekulargenetische Untersuchungen zum Spleißen ausgewählter High Mobility Group Protein-Gene.

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(1)MOLEKULARGENETISCHE UNTERSUCHUNGEN ZUM SPLEIßEN AUSGEWÄHLTER. HIGH MOBILITY GROUP PROTEIN-GENE. DISSERTATION ZUR ERLANGUNG DES GRADES EINES. DOKTORS DER NATURWISSENSCHAFTEN. - DR. RER. NAT. -. DEM PROMOTIONSAUSSCHUß DR. RER. NAT. IM. FACHBEREICH BIOLOGIE / CHEMIE DER UNIVERSITÄT BREMEN. VORGELEGT VON. SVEN HAUKE BREMEN, 19.04.2004. 1. GUTACHTER: PROF. DR. JÖRN BULLERDIEK 2. GUTACHTER: PROF. DR. SÖRGE KELM.

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(3) Af kærlighed til Claudia..

(4) INHALTSVERZEICHNIS. INHALTSVERZEICHNIS ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS ........................................................................................... III 1. EINLEITUNG ........................................................................................................... 1. 2. MATERIAL UND METHODEN................................................................................... 11 2.1. NUKLEINSÄUREN..................................................................................................................................... 11. 2.1.1 GENOMISCHE KLONE ......................................................................................................................... 11 2.1.2 CDNA................................................................................................................................................. 11 2.2. ZELLMATERIAL ........................................................................................................................................ 12. 2.3. ZELLKULTUREN ....................................................................................................................................... 12. 2.3.1 KULTIVIERUNG VON ZELLEN .............................................................................................................. 12 2.3.2 KRYOKONSERVIERUNG VON ZELLKULTUREN .................................................................................... 12 2.3.3 AUFTAUEN EINGEFRORENER ZELLEN ................................................................................................ 13 2.4. ISOLIERUNG VON NUKLEINSÄUREN ........................................................................................................ 13. 2.4.1 PLASMID-DNA ISOLIERUNG .............................................................................................................. 13 2.4.2 COSMID-DNA ISOLIERUNG................................................................................................................ 13 2.4.3 PAC-DNA ISOLIERUNG ..................................................................................................................... 13 2.4.4 RNA ISOLIERUNG .............................................................................................................................. 14 2.5. RESTRIKTIONSVERDAU VON DNA.......................................................................................................... 15. 2.6. ADAPTATION EINES PUC 18 KLONIERUNGSVEKTORS ........................................................................... 15. 2.7. LIGATIONEN ............................................................................................................................................ 15. 2.8. TRANSFORMATION PROKARYOTISCHER ZELLEN.................................................................................... 16. 2.9. SUBKLONIERUNG VON PAC-DNA.......................................................................................................... 16. 2.10. CDNA-ERSTSTRANGSYNTHESE ............................................................................................................. 17. 2.11 PCR........................................................................................................................................................ 17 2.12 RT-PCR ................................................................................................................................................. 18 2.13 GELELEKTROPHORESE ........................................................................................................................... 18 2.14 HERSTELLUNG VON DNA-SONDEN ........................................................................................................ 18 2.15 SOUTHERN BLOT-HYBRIDISIERUNG ....................................................................................................... 19 2.16 NORTHERN BLOT-HYBRIDISIERUNG....................................................................................................... 20 2.17 DOT BLOT-HYBRIDISIERUNG .................................................................................................................. 20 2.18 SEQUENZIERUNGEN ............................................................................................................................... 20 2.19 IN SILICO-ANALYSEN ............................................................................................................................... 21. 3. ERGEBNISSE ....................................................................................................... 22 3.1. MOLEKULARGENETISCHE UNTERSUCHUNGEN ZUM SPLEIßEN DES HMGA2 ....................................... 22. 3.1.1 MOLEKULARGENETISCHE UNTERSUCHUNGEN ZUM SPLEIßEN DES HMGA2 UNTER BETEILIGUNG DES INTRON 4 .................................................................................................................................... 22 3.1.2 MOLEKULARGENETISCHE UNTERSUCHUNGEN ZUM SPLEIßEN DES HMGA2 UNTER BETEILIGUNG DES INTRON 3 .................................................................................................................................... 23 I.

(5) INHALTSVERZEICHNIS 3.2. MOLEKULARGENETISCHE CHARAKTERISIERUNG VON RETROPSEUDOGENEN DES HMGB1 ............... 28. 3.2.1 IDENTIFIKATION UND MOLEKULARGENETISCHE CHARAKTERISIERUNG VON HMGB1RETROPSEUDOGENEN ....................................................................................................................... 28 3.2.2 MOLEKULARGENETISCHE CHARAKTERISIERUNG DES AKTIVIERTEN HMGB1 RETROPSEUDOGENS HMG1L3.................................................................................................................................. 29 3.3. WEITERFÜHRENDE FUNKTIONELLE UNTERSUCHUNGEN DES HMGB1 UND SEINES REZEPTORS RAGE..................................................................................................................................................... 30. 3.3.1 UNTERSUCHUNGEN ZUM SPLEIßMUSTER DES HMGB1-REZEPTORS RAGE................................30 3.3.2 UNTERSUCHUNGEN ZUM EXPRESSIONSMUSTER DES HMGB1 IN CANINEN SARKOMEN ................31 3.3.3 UNTERSUCHUNGEN ZUR ANGIOGENETISCHEN WIRKUNG DES HMGB1 .......................................31. 4. DISKUSSION ........................................................................................................ 33. 5. ZUSAMMENFASSUNG ............................................................................................ 47. 6. SUMMARY ........................................................................................................... 49. 7. LITERATUR .......................................................................................................... 51. DANKSAGUNG ............................................................................................................ 68 PUBLIKATIONSÜBERSICHT ........................................................................................... 69. II.

(6) ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS. ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS adw. autosomal dwarf. AS. Aminosäure. bp. Basenpaare. CASH. Chromosome Assignment using Somatic Hybrids. cDNA. copy DNA. dATP. Desoxy-Adenosin-5’-Triphosphate. DBD. DNA-bindende-Domäne. dCTP. Desoxy-Cytosin-5’-Triphosphate. dGTP. Desoxy-Guanosin-5’-Triphosphate. DNA. Desoxyribonukleinsäure. dNTP. Desoxy-Nukleosid-5’-Triphosphate. dTTP. Desoxy-Thymidin-5’-Triphosphate. dUTP. Desoxy-Uracil-5’-Triphosphate. EMSA. Electrophoretic Mobility Shift Assay. ERG. Eppendorf-Reaktionsgefäß. EST. Expressed Sequence Tag. EtOH. Ethanol. FISH. Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung. FCS. Fötales Kälberserum. g. Gravitationsbeschleunigung. GAPDH. Glyceraldehyde-3-Phosphat Dehydrogenase. h. Stunde. Hg. Innendruckeinheit Quecksilbersäule. HMG. High Mobility Group. HMGA. High Mobility Group Protein A. HMGB. High Mobility Group Protein B. HMGN. High Mobility Group Protein N. J. Joule. kb, kDA. Kilo-Basenpaare, -Dalton. LINE. Long Interspersed Repetitive Element. LTR. Long Terminal Repeat. M. Molar III.

(7) ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS. Mb. Mega-Basenpaare. µg, µl, µm. Mikrogramm, -liter, -meter. mg, ml, mM Milligramm, -liter, -molar min. Minute. M-MLV. Moloney Murine Leukemia Virus. mRNA. messenger Ribonukleinsäure. ng, nm, nM Nanogramm, -meter, molar ORF. Offenes Leseraster. PAC. P1-derived artificial chromosome. PCR. Polymerase-Kettenreaktion. pmol. Pikomol. PRD. Positiv-regulatorische-Domäne. RAGE. Receptor for Advanced Glycation End products. RNA. Ribonukleinsäure. RT. Raumtemperatur. RT-PCR. Reverse-Transkription-PCR. sec. Sekunde. SINE. Short Interspersed Repetitive Element. snRNA. small nuclear RNA. sRAGE. soluble RAGE. tRNA. transfer Ribonukleinsäure. U. Unit. UTR. Untranslatierte Region. UV. ultraviolett. v. Volumen. w. Gewicht. IV.

(8) EINLEITUNG. 1 EINLEITUNG Ungefähr 30 Jahre nach Entdeckung der Desoxyribonukleinsäure (DNA) im Zellkern weißer Blutkörperchen durch den Chemiker Friedrich Miescher, identifizierten Theodor Boveri und Walter Sutton 1902 unabhängig voneinander die Chromosomen als Träger der von Mendel entdeckten Erbmerkmale. Der endgültige Nachweis der DNA als Träger der Erbinformation wurde 1944 von Oswald T. Avery anhand von Transformationexperimenten mit Pneumokokken erbracht. Untersuchungen zunächst an Rindern, später an weiteren Säugetieren, Vögeln und Fischen (Vendrely und Vendrely, 1948; 1949; 1950; Davidson et al., 1950), zeigten Ende der 50er Jahre, dass der nukleare DNA-Gehalt „jeder Zelle, jedes Individuums einer gegebenen Tierspezies bemerkenswert konstant ist“ (Vendrely und Vendrely, 1948), somit alle Zellen eines Organismus die gleiche chromosomale Ausstattung haben (Schrader und Leuchtenberger, 1949). Dies führte 1950 zur Prägung des Begriffs C-Wert (C-value) durch Hewson Swift, definiert als Masse der Zellkern-DNA des reduzierten, unreplizierten haploiden Chromosomensatzes (Swift, 1950). Bereits erste größere Studien dieser Zeit ergaben jedoch eine große Interspezies-Varianz der Genomgröße (Vendrely und Vendrely, 1949; Vendrely und Vendrely, 1950; Mirsky und Ris, 1951). Während der C-Wert von Prokaryoten nur um circa eine Zehnerpotenz von Arche- zu Eubakterien mit 0,5 zu 5 Mb variiert (Krawiec und Riley, 1990), variiert der Wert der Genomgröße bei Eukaryoten um mehr als das 80.000 fache (Li, 1997). Die Tatsache, dass kein Zusammenhang zwischen Genomgröße und Komplexität eines Organismus besteht (Li und Graur, 1990), wurde als C-Wert-Paradoxon (C-value paradox) bezeichnet (Thomas, 1971). „Es wird die Auffassung vertreten, dass Säugetiere eine höhere entwicklungsbiologische Komplexität aufweisen als primitive Fische, daher müssten sie mehr Gene aufweisen; warum sollten die niederen Formen also mehr DNA haben, wenn DNA die chemische Basis von Genen ist?“ (Thomas, 1971). Die Lösung des Paradoxons vermutete Thomas darin, dass entweder die niederen Formen möglicherweise mehr Gene für ihre „eintönigen Arbeiten“ benötigten oder dass über 98% der DNA nicht funktional sei, die Zahl der aktiven Gene sich somit nicht unterscheiden würde (Thomas, 1971). Untersuchungen zur Bestimmung der DNA-Renaturierungskinetik ergaben Anfang der 80er Jahre, dass die genomische DNA vieler Eukaryoten tatsächlich hohe Anteile 1.

(9) EINLEITUNG. repetitiver Sequenzen enthält (Bonner et al., 1973; Davidson et al., 1973). Unterschiede in der Genomgröße der verschiedenen Spezies sollten somit zum größten Teil durch Unterschiede des relativen Anteils repetitiver Sequenzen, welcher merklich variieren kann, erklärt werden (John und Miklos, 1988). Schätzungen. der. frühen. 80er. Jahre,. beruhend. auf. Studien. zur. DNA-. Renaturierungskinetik, extrapolierten für den Menschen eine Genzahl von ca. 40.000 (Lewin, 1980). Dieser Zahl wurde Ende der 80er Jahre der geschätzte Wert von ca. 100.000 Genen gegenübergestellt, beruhend auf einer durchschnittlichen Gengröße von ca. 3x104 bp bei einer Genomgröße von ca. 3x109 bp (Lander et al., 2001; Lewin, 1990). 70-80.000 Gene ergaben Extrapolationen, beruhend auf der Anzahl der CpG-Inseln, unter Berücksichtigung der Häufigkeit ihrer Assoziation mit damals bekannten Genen (Antequera und Bird, 1993). Unabhängig der zugrunde gelegten Methodik, d. h. Vergleich des Genoms mit EST-Datenbanken (Ewing und Green, 2000), Interspezies Genomvergleiche (Roest et al., 2000), Extrapolation über die Genzahl der zuerst komplett sequenzierten humanen Chromosomen 21 und 22 (Dunham, 2000), ergeben aktuelle Schätzungen eine Zahl von ca. 35.500 humanen Protein-kodierenden Genen (Lander et al., 2001; Venter et al., 2001). Nur ca. 1,1% (Venter et al., 2001) bis 1,5% (Lander et al., 2001) des Genoms stellt kodierende Bereiche dar, die restlichen ca. 98,5% bestehen aus nicht-kodierender DNA (Lander et al., 2001; Venter et al., 2001). Mehr als 50% des Genoms besteht aus repetitiven Elementen (Lander et al., 2001), welche sich im Wesentlichen in 4 Gruppen untergliedern lassen: 1.) Transponierbare Elemente Ungefähr 45% des humanen Genoms leiten sich von Transposons, unstabilen DNA-Elementen, ab, die an verschiedene Stellen im Genom springen können und daher auch „springende Gene“ genannt werden. Unterschieden wird dabei zwischen den DNA-Transposons, die durch einen “cut-and-paste“-Mechanismus, mittels einer durch sie kodierten Transposase, transponiert werden, und transponierbaren Elementen, die über ein RNA-Intermediat in das Genom integriert werden. Dazu wird die mRNA, der zu dieser Gruppe zählenden LINEs, SINEs und LTR-Retrotransposons, durch eine Reverse Transkriptase vor Integration in das Genom in komplementäre DNA umgeschrieben (Mathias et al., 1991; Smit et al., 1995; Kazazian, Jr. und Moran, 1998).. 2.

(10) EINLEITUNG. 2.) Einfache Sequenz Wiederholungen (Simple Sequenz Repeats) Ungefähr. 3%. des. humanen. Genoms. bestehen. aus. tandemartigen. Wiederholungen eines DNA-Abschnitts. Diese auch Satelliten-DNA genannten Sequenzen entstehen durch „Verrutschen“ der DNA-Polymerase während der Replikation oder ungleiches Crossing-Over zwischen homologen chromosomalen Abschnitten. Die Expansion von Trinukleotid-Wiederholungen, so genannten Mikrosatelliten, innerhalb eines Gens, ist dabei mit einer Reihe genetisch bedingter Erkrankungen assoziiert, wie z. B. Chorea-Huntington oder dem Fragilen X-Syndrom (Makalowski, 2001). 3.) Segmentale Duplikationen Ungefähr 5-10% des humanen Genoms besteht aus inter- oder intrachromosomal duplizierten Segmenten mit einer jeweiligen Länge von 10–300 kb (Mazzarella und Schlessinger, 1998; Dunham et al., 1999). Durch die Sequenzhomologie duplizierter Segmente kann es während der Meiose zur Falschpaarung kommen. Dies. führt. zu. chromosomalen. Rearrangierungen,. häufig. assoziiert. mit. „genomischen Krankheiten“ (Lupski, 1998), wie dem Prader-Willi/Angelman und dem DiGeorge-Syndrom (Ji et al., 2000). 4.) Prozessierte Pseudogene Prozessierte Pseudogene, auch Retropseudogene genannt, stellen zumeist inaktive Kopien zellulärer Gene dar, entstanden durch Retrotransposition prozessierter mRNA der Ursprungs-Gene. Es wird vermutet, dass ihre Reverse Transkription durch aktive LINE-L1 Elemente vermittelt wird (Feng et al., 1996; Jurka, 1997; Weiner, 2000; Esnault et al., 2000). Retropseudogenen fehlt, aufgrund ihrer Genese über ein mRNA-Intermediat, sowohl der nicht-transkribierte 5’ gelegene Promotorbereich, als auch intronische Sequenzen der funktionalen Ursprungs-Gene. Sie weisen eine 3’ terminale poly(A)-Sequenz auf und sind von direkten Sequenzwiederholungen eingerahmt. Aufgrund des fehlenden Selektionsdrucks akkumulieren sich typische Merkmale wie Deletionen, Insertionen und Basensubstitutionen (Blake et al., 1992; Ophir und Graur, 1997; Ophir et al., 1999). Trotz diesem hohen Anteil nicht kodierender, früher auch als „junk“ bezeichneter, DNA, verdeutlichen vergleichende Transkriptom/Genom-Analysen der letzten Jahre zunehmend den hohen Komplexitätsgrad des humanen Genoms. Alternatives 3.

(11) EINLEITUNG. Spleißen von Genen führt zu einem weitaus umfangreicheren Transkriptom und damit einhergehendem Proteom, als reine Genomanalysen vermuten ließen. Alternatives. Spleißen. stellt. somit. eine. „relativ. effiziente. Erweiterung. des. genomischen Vokabulars dar, indem multiple funktionale Formen eines Gens produziert werden“ (Modrek et al., 2001). Aktuelle Untersuchungen belegen, dass zwischen 35% und 60% aller humanen Gene alternativ gespleißt werden (Brett et al., 2000; Kan et al., 2001; Lander et al., 2001; Modrek et al., 2001). Veränderungen des Spleißverhaltens einzelner Gene, durch z. B. Basensubstitutionen innerhalb der Spleißstellen oder regulatorischer Bereiche, sind häufig die Grundlage humaner Erbkrankheiten, wie z. B. des Frasier Syndroms und der atypischen zystischen Fibrose (Klamt et al., 1998; Philips und Cooper, 2000; Faustino und Cooper, 2003). Bei vielen Genen ist die Veränderung des nativen Spleißmusters mit der Entstehung von Neoplasien und Metastasen assoziiert (Philips und Cooper, 2000; Nissim-Rafinia und Kerem, 2002). Insbesondere trifft dies auf Gene zu, die in die zelluläre Transkriptionsregulation involviert sind (Modrek et al., 2001; Faustino und Cooper, 2003). Hierzu werden auch die High Mobility Group Protein (HMG)-Gene gezählt, denen, zu der Gruppe der Chromatin-assoziierten Nicht-Histon-Proteine gehörend, eine architektonische Rolle bei der Organisation des Chromatins zukommt (Wolffe, 1994). Durch Konformationsänderung der DNA bzw. des Chromatins beeinflussen sie die Bindung von Transkriptionsfaktoren und sind somit indirekt an der Transkriptionsregulation beteiligt (Übersicht in Bustin und Reeves, 1996). Traditionell. ist. die. HMG-Proteinfamilie. aufgrund. von. physiko-chemischen. Eigenschaften definiert worden. So sind die Proteine mit 0,35 M NaCl aus dem Chromatin extrahierbar, in 5% Perchlorsäure oder 2% Trichloressigsäure löslich, reich sowohl an basischen als auch sauren Aminosäuren (je 20-30%) und besitzen mit über 7% Prolin ein ungewöhnlich hohen Gehalt dieser sonst eher seltenen Aminosäure (Johns, 1982). Die hohe Mobilität der Proteine im sauren Harnstoffgel war namensgebend für diese strukturell heterogene Protein-Klasse (Goodwin et al., 1973; Überblick in Wisniewski, 1998). Aufgrund charakteristischer funktioneller Motive werden die HMG-Proteine in drei Gruppen unterteilt: die HMGN (früher HMG14/17)-, die HMGB (früher HMG1/2)- und die HMGA (früher HMGI(Y))-Familie. Das funktionale Motiv der HMGA-Proteine ist ein AT-Hook, welcher mit hoher Affinität an die kleine Furche AT-reicher DNA bindet (Solomon et al., 1986; Elton et al., 1987; Reeves und Nissen, 1990). Die abundanten archetypischen HMGA-Proteine 4.

(12) EINLEITUNG. enthalten für gewöhnlich drei separierte AT-Hooks und einen C-terminalen sauren Schwanz (Lund et al., 1987; Eckner und Birnstiel, 1989; Johnson et al., 1989; Chau et al., 1995). Im Gegensatz zur HMG-Box der HMGB-Proteine fällt die räumliche Struktur der AT-Hooks kleiner aus, so dass das Motiv ohne signifikante Konformationsänderung der DNA in die kleine Furche passt (Geierstanger et al., 1994). Vielmehr werden intrinsisch gebogene homopolymere AT-reiche DNAAbschnitte (Koo et al., 1986) durch HMGA-Bindung zurück in Richtung der regulären B-Konformation der DNA gebogen (Falvo et al., 1995; Heyduk et al., 1997). Dabei scheinen sich die einzelnen Bindungsmotive in ihrer Wirkung synergetisch zu verstärken; ein Effekt der auch als intramolekulare Kooperativität der Bindung bezeichnet wurde (Claus et al., 1994; Maher und Nathans, 1996; Yie et al., 1997). Die archetypischen HMGA-Proteine scheinen eine der wichtigsten strukturellen Elemente der Metaphasechromosomen zu sein, die in die Bildung der klassischen chromosomalen Bänderung involviert sind (Saitoh und Laemmli, 1994). Das HMGA1 ist im AT-reichen konstitutiven und fakultativen Heterochromatin in den C- bzw. G/QBanden der Chromosomen der Maus und des Menschen lokalisiert (Disney et al., 1989) und konnte in Riesenchromosomen von Chironomus in transkriptionsaktiven Regionen lokalisiert werden (Ghidelli et al., 1997). Dabei wird durch HMGA-induzierte Konformationsänderung der DNA die Bildung stereospezifischer Transkriptions- oder Enhanceosomenkomplexe gefördert (Thanos und Maniatis, 1995b). Die Modulation der Transkriptionsrate kann sowohl positiv als auch negativ sein. So verstärkt die Bindung von HMGA1 an die positiv regulatorische Domäne (PRD) des IFN-β sowohl die kooperative Bindung des Transkriptionsfaktors NF-κB (Thanos und Maniatis, 1995a; Yie et al., 1997) als auch des aktivierenden-Transkriptionsfaktors-2 (ATF-2) (Du et al., 1993; Du und Maniatis, 1994), wodurch die Transkription des IFN-β stimuliert wird (Thanos und Maniatis, 1992). Ein Transkriptions-aktivierender Effekt des HMGA1 wurde u. a. auch bei der induzierbaren-Stickstoffoxid-Synthetase (iNOS) (Perrella et al., 1999), dem Gen der α-Kette des Interleukin-2-Rezeptors (John et al., 1995, John et al., 1996) und dem Gen des Zelladhäsionsproteins E-Selektin (Lewis et al., 1994) beschrieben. Eine supprimierende Wirkung des HMGA1 auf die Transkription ist dahingegen für das Interleukin-4 (IL-4)-Gen (Chuvpilo et al., 1993; Klein-Hessling et al., 1996), die Interferon-A Promotoren (Lopez et al., 1997) und des Gens der α-Kette des T-Zell-Rezeptors (Bagga und Emerson, 1997) nachgewiesen worden. 5.

(13) EINLEITUNG. Obwohl für die Involvierung des HMGA2 in die transkriptionelle Regulation anderer Gene viel weniger Daten vorhanden sind, es induziert die Cyclin A Expression (Tessari et al., 2003) und supprimiert das ERCC1 (Borrmann et al., 2003), verdeutlichen in vitro- und in vivo-Experimente doch die entscheidende Rolle des Proteins in der Regulation der Zell-Proliferation. Natürlich vorkommende homozygote Mutationen des HMGA2-Lokus führen bei Mäusen zu Zwergenwachstum, welcher nicht durch den Mangel eines Wachstumshormons oder dessen Rezeptor erklärt werden kann (Zhou et al., 1995). In ähnlicher Weise scheinen Mutationen des HMGA2-Gens auch bei der Entstehung „autosomaler Zwerg“-Mutanten von Hühnern (autosomal dwarf) involviert zu sein (Ruyter-Spira et al., 1998). Knock-out Mäuse mit einer homozygoten Deletion des HMGA2 weisen darüber hinaus kaum Fettgewebe auf, so dass eine regulatorische Funktion des HMGA2 bei der Fettzellproliferation postuliert wurde (Anand und Chada, 2000). Das humane HMGA2-Gen ist in der chromosomalen Region 12q14-15 lokalisiert, besteht aus 5 Exons und überspannt ca. 142 kb (Chau et al., 1995; Schoenmakers et al., 1995). Die ersten drei Exons, welche jeweils ein AT-Hook kodieren, werden von einem ca. 112 kb langen Intron von den terminalen Exons 4 und 5 separiert, wobei letzteres den sauren Schwanz des Proteins kodiert (Chau et al., 1995; Hauke et al., 2002). Eine Expression des HMGA2 lässt sich zumeist nur in undifferenzierten Zellen embryonalen Gewebes und in neoplastischen Zellen nachweisen, während in differenzierten Zellen des Normalgewebes diese Proteine nicht oder nur in sehr geringer Konzentration detektierbar sind (Chiappetta et al., 1996; Rogalla et al., 1996; Hirning-Folz et al., 1998). Während eine Re-Expression des nativen HMGA2 hauptsächlich in malignen Tumoren, wie Mammakarzinomen und nicht-kleinzelligen Lungenkarzinomen (Rogalla et al., 1997; Rogalla et al., 1998b), beobachtet wird und mit. dem. Tumorgrading. zu. korrelieren. scheint,. ist. in. benignen. Tumoren. mesenchymalen Ursprungs häufig die Detektion aberranter HMGA2-Transkripte möglich. So führen chromosomale Rearrangierungen unter Involvierung des dritten Introns des HMGA2, dem häufigsten Ziel chromosomaler Aberrationen in humanen Tumoren (Kazmierczak et al., 1998a), häufig zur Entstehung und Expression von Fusionsgenen unter Beteiligung verschiedener Fusionspartner, wie z. B. dem LPPGen (Petit et al., 1996), LHFP (Petit et al., 1999), RAD51L1 (Schoenmakers et al., 1999), FHIT (Geurts et al., 1997), HEI10 (Mine et al., 2001a), ALDH2 (Kazmierczak et al., 1995) und COX6C (Kurose et al., 2000). Eine tumorentitätsspezifische 6.

(14) EINLEITUNG. Expression einzelner Fusionstranskripte wurde dabei nicht beobachtet, so wurde z. B. das HMGA2/LPP-Fusionstranskript sowohl in Lipomen (Schoenmakers et al., 1995; Petit et al., 1996), als auch Lungenhamartomen (Rogalla et al., 1998c) nachgewiesen. Vergleichende funktionelle Analysen des nativen HMGA2, dem HMGA2/LPP-Fusionstranskript und einer 3’ trunkierten HMGA2-Variante, die mit dem Exon 3 endete, ergaben, dass der Verlust des sauren Schwanzes des nativen HMGA2 und nicht der Zugewinn neuer funktioneller Domänen eine maligne Transformation von Zellen verursacht (Fedele et al., 1998). Transgene Mäuse, welche eine 3’ trunkierte HMGA2-Variante exprimieren, zeigten einen abnormal großen „giant“ Phänotyp, mit überwiegend abdominaler Lipomatose, ein weiteres Indiz für die entscheidende Funktion 3’ modifizierter HMGA2-Transkripte in der Tumorgenese (Battista et al., 1999). Neben den aberranten HMGA2-Transkripten, bei denen auf die, die AT-Hooks kodierenden, Exons 1 bis 3 ektopische Sequenzen bekannter Fusionspartner folgen, wurden in Tumoren verschiedenster Entitäten zahlreiche, häufig identische, HMGA2Transkripte mit ektopischen Anteilen unbekannter Herkunft detektiert (Schoenmakers et al., 1995; Kazmierczak et al., 1996; Meza-Zepeda et al., 2001; Mine et al., 2001b; Kottickal et al., 1998; Kurose et al., 2001). Mittels CASH-PCR konnte für einige dieser ektopischen Sequenzen das Chromosom 12 als Ursprung ermittelt werden (Schoenmakers et al., 1995). Zu Beginn der vorliegenden Arbeit wurde die Entstehung dieser Transkripte durch aberrantes Spleißen des HMGA2, in Folge lichtmikroskopisch nicht detektierbarer Mikroaberrationen, oder durch alternatives Spleißen des Gens kontrovers diskutiert (Schoenmakers. et. al.,. 1995).. Es. war. daher. Ziel. dieser. Arbeit,. den. Entstehungsmechanismus dieser tumorgenetisch relevanten kryptischen HMGA2Transkripte mit ektopischen Anteilen des Chromosoms 12 zu identifizieren. Die zu Beginn dieser Arbeit molekulargenetisch noch nicht charakterisierten Introns 3 und 4 des HMGA2-Gens wurden durch Klonierung, Sequenzierung und in silico-Analysen entschlüsselt und mit HMGA2 assoziierten Transkripten öffentlicher cDNADatenbanken verglichen. Das Expressionsprofil identifizierter Spleiß-Produkte des HMGA2-Gens wurde in verschiedenen Tumorentitäten mit und ohne bekannten zytogenetischen Aberrationen des HMGA2-Lokus sowie in diversen Normalgeweben vergleichend untersucht. Darüber hinaus erfolgten umfangreiche bioinformatische 7.

(15) EINLEITUNG. Analysen der Transkripte, wodurch, in Verbindung mit den Ergebnissen der Expressionsanalysen, auf den Entstehungsmechanismus zurück geschlossen werden konnte. Neben den direkten Verfahren zum Nachweis alternativer Spleißprodukte eines Gens,. wie. RT-PCR,. Northern. und. Western. Blot-Analysen,. stellen. molekulargenetische Untersuchungen von Retropseudogenen einen indirekten Nachweis des Spleißverhaltens von Genen dar. Aufgrund ihrer Genese durch revers transkribierte. Integrate. gespleißter. mRNAs,. kann,. durch. Detektion. eines. entsprechenden Retropseudogens, die alternative Transkription eines Gens verifiziert und sogar bis dato unbekannte Spleißvarianten identifiziert werden. So repräsentiert z. B. das murine Zfa-Retropseudogen eine alternative Spleißvariante des Zfx-Gens (Ashworth et al., 1990). Darüber hinaus wurde durch in silico-Analysen von Retropseudogenen des HMGB1, die Expression eines, im 3’UTR durch ein alternatives poly(A)-Signal, um 1 kb verlängerten Transkripts postuliert, welches durch anschließende EST-Datenbankanalysen sowohl im Mensch als auch Schwein nachgewiesen werden konnte (Strichman-Almashanu et al., 2003). Bedingt durch ihren Entstehungsmechanismus mit ungerichteter Integration in das Genom (Zhang et al., 2003), tragen prozessierte Pseudogene außerdem selbst wesentlich zur hohen Komplexität des Genoms/Transkriptoms bei. So belegen zahlreiche Studien die transkriptionelle Aktivierung von Retropseudogenen (Ashworth et al., 1990; Brosius, 1999; Elliott et al., 2000; Makeyev et al., 1999), ihren regulatorischen Einfluss auf die Expression ihrer Ursprungs-Gene (Hirotsune et al., 2003; Korneev et al., 1999) und die Evolution von Genen mit veränderten funktionellen Eigenschaften (Long und Langley, 1993; Rogalla et al., 2000). Die. Mitglieder. der. HMG-Genfamilie. stellen. eine. der. größten. humanen. Retropseudogenfamilien dar (Landsman und Bustin, 1986; Srikantha et al., 1987; Venter et al., 2001). Zu Beginn dieser Arbeit wiesen Stros und Dixon die Existenz mindestens eines HMGB1-Retropseudogens nach (Stros und Dixon, 1993). Darüber hinaus gab es Hinweise auf die Existenz weitere HMGB1 verwandter Gene oder Pseudogene im humanen Genom (Wen et al., 1989; Stros und Dixon, 1993; Stros et al., 1994; Ferrari et al., 1994). Die HMGB-Familie, zentrales Motiv ist die HMG-Box, ist die abundanteste Gruppe der HMG-Proteine (Bustin et al., 1990). Die kanonischen HMGB-Proteine binden mit hoher Affinität Sequenz-unspezifisch an AT8.

(16) EINLEITUNG. reiche einzel- und doppelsträngige DNA (Isackson et al., 1979; Bonne et al., 1982), wobei irreguläre DNA-Strukturen wie negativ spiralisierte DNA (Sheflin und Spaulding, 1989), palindromische Sequenzen (Hamada und Bustin, 1985) sowie verbogene und kreuzförmige DNA (Bianchi et al., 1989) bevorzugt gebunden werden. Die HMGB1- und HMGB2-Proteine der Mammalia bestehen aus jeweils zwei HMG-Box-Domänen (A- und B-Domäne), gefolgt von einem sauren Schwanz (Reeck et al., 1982). Die Bindung der HMGB-Proteine an die kleine Furche doppelsträngiger DNA führt dazu, dass die α-Helix der HMG-Box diese Furche aufbiegt, wodurch die DNA in Richtung der großen Furche um ca. 150° gebogen und partiell entwunden wird (Werner et al., 1995; Heyduk et al., 1997). Diese Veränderung der ChromatinArchitektur ermöglicht die Bindung und Interaktion von Transkriptionsfaktoren (Bustin und Reeves, 1996). In vitro konnte eine Stimulation der RNA-Polymerase II und III abhängigen Transkription (Tremethick und Molloy, 1988; Watt und Molloy, 1988) sowie die Verstärkung der Bindung des Progesteronrezeptors an seine DNAZielsequenz durch HMGB1 gezeigt werden (Onate et al., 1994). Darüber hinaus kann durch Interaktion der HMGB-Proteine mit anderen Kernproteinen die Transkription von Genen inhibiert werden (Ge und Roeder, 1994). Neuere Untersuchungen zeigten, dass das HMGB1 neben seiner intranuklearen Lokalisation und Funktion eine extrazelluläre Funktion besitzt (Müller et al., 2001). Extrazellulär auch als Amphoterin bezeichnet, wird HMGB1 von stimulierten Monozyten und Makrophagen sezerniert und kann von beschädigten oder nekrotischen Zellen freigesetzt werden (Wang et al., 1999; Degryse et al., 2001). Die Bindung des HMGB1 an den Transmembranrezeptor RAGE (receptor for advanced glycation end products) (Sugaya et al., 1994; Hori et al., 1995) induziert das Wachstum sowie die Motilität und Migration von Neuriten des zentralen Nervensystems (Hori et al., 1995; Huttunen et al., 2000) sowie maligner Zellen (Fages et al., 2000). HMGB1 wird daher als autokriner/parakriner Regulator des invasiven Tumorwachstums und der Metastasierung von Tumoren angesehen (Rauvala et al., 2000; Taguchi et al., 2000). Das, zur Klasse der Östrogen-abhängigen Gene zählende (Chau et al., 1998), humane HMGB1-Gen ist in der chromosomalen Bande 13q12 lokalisiert (Ferrari et al., 1996), einer chromosomalen Region, die in zahlreichen benignen Tumoren von Rearrangierungen betroffen ist (Mitelman, 1994). Während Expressionsanalysen an Mäusen ergaben, dass das HMGB1 abhängig vom Entwicklungsstadium und 9.

(17) EINLEITUNG. Gewebetyp exprimiert wird (Pauken et al., 1994; Guazzi et al., 2003), wurde eine Überexpression. des. Gens. in. gastrointestinalen. Tumoren,. kolorektalen. Adenokarzinomen und in Leukämie-Zelllinien nachgewiesen (Xiang et al., 1997; Cabart et al., 1995). In der frühen Embryonalentwicklung ist dahingegen ganz generell eine starke, ubiquitäre Expression des HMGB1 zu beobachten (Pauken et al., 1994; Guazzi et al., 2003). Aufgrund der Genese über mRNA-Intermediate, begünstigt diese starke Expression eines Gens während der frühen Embryogenese die Entstehung von prozessierten Retropseudogenen (Goncalves et al., 2000; Zhang et al., 2003). Da es zu Beginn der vorliegenden Arbeit Hinweise auf die Existenz zahlreicher HMGB1 verwandter Gene oder Pseudogene im humanen Genom gab (Wen et al., 1989; Stros und Dixon, 1993; Stros et al., 1994; Ferrari et al., 1994), war es ein weiteres Ziel dieser Arbeit weitere Retropseudogene des tumorrelevanten HMGB1-Gens im humanen Genom zu lokalisieren, molekulargenetisch zu charakterisieren und so auf die zugrunde liegenden HMGB1-Transkripte zurückzuschließen. Mögliche (Spleiß-)Varianten des HMGB1 sollten so identifiziert und ihre biologische Relevanz verifiziert werden.. 10.

(18) MATERIAL UND METHODEN. 2 MATERIAL UND METHODEN 2.1. NUKLEINSÄUREN. 2.1.1 GENOMISCHE KLONE Der PAC-Klon 12/1 wurde mittels PCR mit einem Primerpaar spezifisch für das 3’UTR. des. HMGA2-Gens. (JC3267up (5’-ACGGCTTTTGTCAGTATGGCTTTTA-. 3’)/JC3584lo (5’-CCAGAGATGGAAATCACTCGGT-3’)). in. einer. humanen. genomischen PAC-Library (Genome Systems, St. Louis, USA) identifiziert (Dr. V. Rippe, Universität Bremen). Der PAC-Klon 20422 wurde mittels PCR mit Hilfe zweier Primerpaare spezifisch für das 5’-Ende des HMGA2 Intron 3 (5’Int3up (5’-CCTAGGAAATGGGTGAGTAATAAGATA-3’)/5’Int3do (5’-TAATGTTTGCATGTGGAGAATGACTAC-3’)) und das 3’ Ende des Intron 3 (STS Kup (5’-TCTCAGCTTAATCCAAGAAGGACTTC-3’)/STS Kdo (5’GGCATATTCCTCAACAATTTATGCTT-3’)) in einer humanen genomischen PACLibrary (Genome Systems, St. Louis, USA) identifiziert. Die Cosmide 202A1, 128A7, 260C7, 27E12, 185H2, 142H1 und 245E8 entstammen der LL12NC01-Cosmidbank des humanen Chromosoms 12 (Montgomery et al., 1993) und waren zuvor der Region multipler Aberrationen auf Chromosom 12q13-15 zugeordnet worden (Schoenmakers et al., 1995).. 2.1.2 CDNA cDNAs humanen Ursprungs von Blut, fetalem Gewebe, Testis, Glandula parotis, Nierenkarzinom, invasiv duktalen Mammakarzinomen und der MammakarzinomZelllinie EFM19 wurden von Herrn Dipl. Biol. A. M. Flohr (Universität Bremen) bereitgestellt. cDNAs humanen Ursprungs von Myometrium, Zervixkarzinom-Zelllinie MRIH186, Uterus Leiomyom-Zelllinie LM-30.1 und Hamartomen wurden von Herrn Dr. P. Rogalla (Universität Bremen) bereitgestellt.. 11.

(19) MATERIAL UND METHODEN. 2.2. ZELLMATERIAL. Insgesamt wurden für die molekulargenetischen Untersuchungen folgende, vom Zentrum für Humangenetik der Universität Bremen bereitgestellte, Zelllinien verwendet: EFM19. immortale Mammakarzinom-Zelllinie. HeLa. immortale Zervixkarzinom-Zelllinie. Li-14. SV40 transfizierte immortale Lipom-Zelllinie. Li-167. SV40 transfizierte immortale Lipom-Zelllinie. LM-30.1. SV40 transfizierte immortale Uterus Leiomyom-Zelllinie. MCF7. immortale Mammakarzinom-Zelllinie. MRIH186. immortale Zervixkarzinom-Zelllinie. Darüber hinaus wurden primäre humane Fibroblasten kultiviert und verwendet.. 2.3. ZELLKULTUREN. 2.3.1 KULTIVIERUNG VON ZELLEN Immortalisierte. Zelllinien. wurden. in. Medium TC199. (20% FCS/200 IU/ml. Penicillin/200 mg/ml Streptomycin) bei 37°C, 5% CO2, 95% Luftfeuchtigkeit kultiviert. Primäre humane Fibroblasten wurden unter Zusatz von 1,25 µg/ml Amphotericin B kultiviert. Ein Mediumwechsel erfolgte alle 3 bis 4 Tage. Bei konfluent gewachsener Zellschicht wurden die Zellkulturen trypsiniert (0,05% Trypsin/0,02% EDTA) und passagiert.. 2.3.2 KRYOKONSERVIERUNG VON ZELLKULTUREN Eukaryotische Zellen wurden zur Konservierung in Stickstoff eingefroren und gelagert. Dazu wurden konfluent gewachsene Zellkulturen trypsiniert und in 2 ml eiskaltem Medium TC199 mit 10% DMSO aufgenommen. In ein Kryoröhrchen überführt, erfolgte ein Einfrieren mit Hilfe eines Einfriergeräts (CZE 880, Cryotechnik Erlangen) stufenweise mit -0,7°C/min auf -13°C, -0,3°C/min auf -15°C und -1°C/min auf -120°C. Nach Beendigung des Programms wurden die Zellen in flüssigem Stickstoff gelagert.. 12.

(20) MATERIAL UND METHODEN. 2.3.3 AUFTAUEN EINGEFRORENER ZELLEN In Stickstoff gelagerte Zellen wurden in einem Wasserbad bei 37°C aufgetaut. Anschließend wurde die Zellsuspension in ein Sarstedt-Röhrchen mit 8 ml Medium TC199 überführt und 10 min bei 120 xg zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, das Pellet resuspendiert und mit 5 ml Medium TC199 in eine Zellkulturflasche überführt.. 2.4. ISOLIERUNG VON NUKLEINSÄUREN. 2.4.1 PLASMID-DNA ISOLIERUNG Die Isolierung von Plasmid-DNA aus Übernachtkulturen erfolgte mittels des QIAprep Plasmid Kits (Qiagen, Hilden) nach Angaben des Herstellers. Die Elution der gereinigten DNA erfolgte in einem adäquaten Volumen 10 mM Tris-HCl, pH 8,5.. 2.4.2 COSMID-DNA ISOLIERUNG Die Isolierung von Cosmid-DNA erfolgte mit einigen Modifikationen nach dem „Maxi Plasmid/Cosmid Purification“-Protokoll (Qiagen, Hilden). Dazu wurden 500 ml LBMedium mit 4 ml einer 10 ml Übernachtkultur beimpft, über Nacht bei 37°C im Schüttelschrank inkubiert und anschließend durch Zentrifugation bei 3.700 xg, 4°C pelletiert. Die DNA-Extraktion aus dem Bakterienpellet erfolgte unter Verwendung von jeweils 9 ml Puffer P1, P2 und P3. Die DNA-Aufreinigung erfolgte unter Verwendung äquilibrierter Qiagen-tip 500 Säulen. Die Elution der gereinigten und mittels Isopropanol- und Ethanolfällung aufkonzentrierten Cosmid-DNA erfolgte in 100 µl 10 mM Tris-HCl, pH 8,5.. 2.4.3 PAC-DNA ISOLIERUNG Die Isolierung der PAC-DNA erfolgte mit einigen Modifikationen nach dem „PAC Manual“ (Genome Systems, St. Louis, USA). 50 ml LB-Medium wurden mit 1,5 ml einer 10 ml Übernachtkultur beimpft und für 1,5 h bei 37°C im Schüttelschrank inkubiert. Nach Zugabe von IPTG (Endkonzentration 0,5 mM) erfolgte eine weitere. 13.

(21) MATERIAL UND METHODEN. Inkubation für 5 h. Anschließend erfolgte eine Pelletierung durch Zentrifugation bei 3.700 xg, 4°C. Die. DNA-Extraktion. aus. dem. Bakterienpellet,. resupendiert. in. GTE-Puffer. (50 mM Glucose/10 mM EDTA/25 mM Tris-HCl; pH 8,0), erfolgte, nach Inkubation mit Lysozym, durch alkalische Lyse. Nach Zentrifugation für 10 min bei 10.000 xg und 4°C erfolgte eine Inkubation des Überstandes mit RNase A (Endkonzentration 200 µg/ml) für 1 h bei 37°C. Die DNA-Aufreinigung erfolgte durch Zugabe eines äquivalenten Volumens Phenol/Chloroform (1:1). Nach 10 maligem Invertieren folgte eine Zentrifugation für 20 min bei 3.000 xg und 4°C. Dieser Vorgang wurde mit einem äquivalten Volumen Chloroform mit dem Überstand wiederholt. Die Elution der gereinigten und mittels Isopropanol- und Ethanolfällung aufkonzentrierten PAC-DNA aus dem Überstand der Chloroformfällung erfolgte zumeist in 100 µl 10 mM Tris-HCl, pH 8,5.. 2.4.4 RNA ISOLIERUNG RNA aus Zellkulturen wurde u. a. mit Hilfe des TRIzol-Reagenzes (Invitrogen, Groningen,. Niederlande). weitgehend. nach. Herstellerangaben. isoliert.. Nach. Verwerfen des Mediums aus den Zellkulturflaschen wurden die Zellen in 1 ml TRIzol homogenisiert, in ein ERG überführt und für 5 min bei RT inkubiert. Nach PhenolExtraktion und Isopropanol-Fällung wurde mit 1 ml 75% (v/v) EtOH gewaschen und die RNA in 60 – 100 µl RNase-freiem Wasser aufgenommen. Darüber hinaus wurde RNA aus Zellkulturen für Northern Blots auch mit Hilfe des „RNeasy Mini-Kits“ (Qiagen, Hilden) nach Herstellerangaben isoliert. Dazu wurde das Medium. verworfen,. der. Zellrasen. mit. PBS. (137 mM NaCl/2,7 mM KCl/. 4,3 mM NaH2PO4/1,47 mM KH2PO4; pH 7,4) gespült, 500 µl Trypsin-EDTA zugegeben und die Zellen nach 5 minütiger Inkubation bei 37°C mit wenig Medium aufgenommen. Nach Zentrifugation für 5 min bei 300 xg und RT wurde der Überstand verworfen, die Zellen mit 350 µl RLT-Puffer (Qiagen, Hilden) lysiert, mit Hilfe des QIAshredder (Qiagen, Hilden) homogenisiert und die RNA nach Herstellerangaben nach dem „RNeasy Mini Protocol for the Isolation of Total RNA from Animal Cells“-Protokoll (Qiagen, Hilden) isoliert. Die Elution der RNA erfolgte in 60 µl RNase-freiem Wasser.. 14.

(22) MATERIAL UND METHODEN. 2.5. RESTRIKTIONSVERDAU VON DNA. Für. den. enzymatischen. Restriktionsendonuklease. Verdau wurden. von die. jeweils. 3 µg. spezifischen. PAC-DNA. mit. 20 U. 10x Restriktionspuffer. der. Hersteller der jeweiligen Enzyme verwendet und auf 1x Konzentration verdünnt. Die Reaktion erfolgte unter Zusatz von 0,1 mg/ml acetyliertem BSA (Promega, Mannheim) für 2,5 h bei der vom Hersteller angegebenen optimalen Temperatur. Der enzymatische Verdau von jeweils 1 µg Plasmid-DNA erfolgte mit 5 U Restriktionsendonuklease für 1 h bei der vom Hersteller angegebenen optimalen Temperatur.. 2.6. ADAPTATION EINES PUC 18 KLONIERUNGSVEKTORS. Die Linearisierung des pUC 18 Vektors erfolgte mit der singulär schneidenden Restriktionsendonuklease SmaI bei 25°C. Nach Phenol-/Chloroformfällung erfolgte eine Dephosphorylierung der 5’-Enden mit einigen. Modifikationen. nach. Maniatis. et. al.. (1989).. Dabei. erfolgte. die. Dephosphorylierung von 2 pmol glatten Enden mit 1 U CIP-Enzym in einem Ansatz mit 1/10 Volumen 10x CIP-Reaktionspuffer (10 mM ZnCl2/10 mM MgCl2/100 mM Tris-HCl; pH 8,3) für 15 min bei 37°C. Nach erneuter Zugabe eines gleichen Aliquots CIP-Enzyms, wurde der Ansatz für weitere 45 min bei 55°C im Wasserbad inkubiert. Nach Abbruch der Reaktion durch Zugabe von 1/9 Volumen 10x CIP-Stoppuffer (5 % (w/v) SDS/50 mM EDTA; pH 8,0) erfolgte eine Inkubation mit 100 ng/µl Proteinase K für 30 min bei 56°C. Anschließend erfolgte eine Aufreinigung der DNA mittels dem QIAquick-Kit nach Angaben des Herstellers (Qiagen, Hilden).. 2.7. LIGATIONEN. Aufgereinigte DNA-Fragmente mit einem 3’-A-Überhang wurden mit Hilfe des Vektors pGEM-T Easy (Promega, Mannheim) kloniert. In 10 µl Gesamtvolumen wurden die DNA-Fragmente und pGEM-T Easy-DNA im molaren Verhältnis 1:1 mit 1 µl 10x Ligationspuffer (Promega, Mannheim) und 3 U T4-DNA-Ligase über Nacht bei 4°C ligiert. Die Ligation von Restriktionsfragmenten mit glatten Enden in einen linearisierten und dephosphorylierten pUC18 Vektor erfolgte mit einigen Modifikationen nach der 15.

(23) MATERIAL UND METHODEN. „Recommended Conditions for Plasmid Cloning“-Anleitung des „T4 DNA Ligase“Protokolls (GibcoBRL, Eggenstein). In 20 µl Gesamtvolumen wurden die Insert-DNA und pUC18 Vektor-DNA im molaren Verhältnis 3:1 mit 4 µl 5x T4-DNA-Ligase Puffer (GibcoBRL, Eggenstein) und 1 U T4-DNA-Ligase über Nacht bei 16°C ligiert.. 2.8. TRANSFORMATION PROKARYOTISCHER ZELLEN. Kompetente DH5α E. coli-Zellen (Stratagene, La Jolla, USA) wurden nach dem „Standard protocol for the preparation of competent cells by SEM“ (Inoue et al., 1990) hergestellt. Die Transformation der Zellen erfolgte mittels Thermotransformation nach dem „Standard protocol for SEM transformation“ (Inoue et al., 1990). Zur Transformation wurde SOB-Medium (2 % (w/v) Bacto-Trypton/0,5 % (w/v) Hefe Extrakt/10 mM NaCl/2,5 mM KCl/10 mM MgCl2/10 mM MgSO4; pH 7,0), zum Ausplattieren und zur Übernachtkultivierung der Bakterien LB-Medium (1 % (w/v) NaCl/1 % (w/v) BactoTrypton/0,5 % (w/v) Hefe Extrakt; pH 7,0) verwendet.. 2.9. SUBKLONIERUNG VON PAC-DNA. DNA des PAC 12/1 wurde mit einem Ultraschall-Stab (Sonifier B-12, Branson Sonic Power, Danbury, USA) auf Eis für 2x 20 sec geschert und gelelektrophoretisch aufgetrennt. Die DNA mit einer Größe zwischen 1,5 kb und 3 kb wurde dann mittels der QIAEx II-Methode nach Angaben des Herstellers (Qiagen, Hilden) aus dem Gel isoliert. Die Auffüllreaktion und Phosphorylierung der glatten Enden der DNA-Fragmente erfolgten mit einigen Modifikationen nach Maniatis et al. (1989). Die Auffüllreaktion wurden mit 1,4 µg DNA 1 mM dNTPs, 10 U T4-DNA-Polymerase und 10 U KlenowDNA-Polymerase für 30 min bei RT durchgeführt. Anschließend wurde die DNA mittels Phenol/Chloroformfällung aufgereinigt. Zur Phosphorylierung der glatten Enden der DNA-Fragmente erfolgte zunächst eine Inkubation für 10 min bei 70°C im Wasserbad nach Zugabe von 1/9 Volumen 10x Denaturierungspuffer (200 mM Tris-HCl/1 mM EDTA/10 mM Spermidin) zur DNA. Nach Zugabe von 10 mM ATP, 1/9 Volumen 10x One-Phor-All-Plus Puffer und 30 U T4-Polynukleotid-Kinase erfolgte eine Inkubation für 30 min bei 37°C im Wasserbad. 16.

(24) MATERIAL UND METHODEN. Anschließend wurde die DNA mittels Phenol/Chloroformfällung aufgereinigt, die DNA-Fragmente in den adaptierten pUC 18 Vektor ligiert und in DH5α Zellen kloniert. DNA des PAC 20422 wurde mit der Restriktionsendonuklease AclI geschnitten und im Gel aufgetrennt. Die einzelnen Banden mit einer Fragmentgröße >3 kb wurden mittels der QIAEx II-Methode nach Angaben des Herstellers (Qiagen, Hilden) aus dem Gel isoliert und mit weiteren Restriktionsendonukleasen erneut geschnitten. Anschließend wurde die DNA mit dem „QIAquick PCR Purification Kit“ (Qiagen, Hilden) nach Herstellerangaben aufgereinigt, die DNA-Fragmente in den pGEM-T Easy Vektor ligiert und in DH5α Zellen kloniert.. 2.10. CDNA-ERSTSTRANGSYNTHESE. Die cDNA-Erststrangsynthesen wurden mit Hilfe von 200 U M-MLV Reverser Transkriptase (Invitrogen, Carlsbad, USA) nach Herstellerangaben durchgeführt. Die Reaktion wurde in einem Volumen von 20 µl mit bis zu 5 µg gesamt-RNA, 1 µM Poly(A)-Adapter-Primer dNTP’s,. 0,01 M. (AP2). (5’-AAGGATCCGTCGACATC. 1,4-Dithiotreitol. und. (T)17-3’),. Erststrangpuffer. 0,5 mM. (50 mM Tris-. HCl/75 mM KCl/3 mM MgCl2; pH 8,3) (Invitrogen, Carlsbad, USA) durchgeführt. Nach einer Inkubation für 50 min bei 37°C wurde die enzymatische Reaktion durch Inkubation für 15 min bei 50°C abgebrochen.. 2.11 PCR Die Amplifikation von DNA-Fragmenten mittels PCR erfolgte standardmäßig mit 50 – 100 ng genomischer DNA, 10 – 50 ng PAC oder Cosmid DNA, 10 ng Plasmid DNA oder 10 ng aufgereinigtem PCR-Produkt als Matrize. Darüber hinaus wurden je nach Ansatz 0,5 U Taq-Polymerase verschiedener Hersteller (Invitrogen, Carlsbad, USA oder Qiagen, Hilden) mit dem jeweils zugehörigen 10x Puffer mit 50 mM MgCl2, 100 µM eines jeden dNTPs und je 200 nM Sense- und Antisense-Primer in einem Volumen von 20 – 50 µl in 0,2 - 0,5 ml PCR-Reaktionsgefäßen eingesetzt. Die Reaktion erfolgte im Mastercycler Gradient (Eppendorf, Hamburg) mit zumeist folgendem Programm: initial 5 min bei 95°C, 35 Zyklen: 30 sec 94°C, 30 sec bei der für die Primer ermittelten optimalen Annealingtemperatur, und Elongation bei 72°C für 60 sec/1 kb Amplifikatlänge. Final erfolgte eine Elongation für 10 min bei 72°C.. 17.

(25) MATERIAL UND METHODEN. 2.12 RT-PCR RT-PCRs wurden in der Regel mit cDNA, entsprechend 125 – 250 ng gesamt RNAÄquivalent, 0,5 U Taq-Polymerase (Qiagen, Hilden), dem zugehörigen PCRReaktionspuffer mit 1,5 mM MgCl2, 1x Q-Solution (Qiagen, Hilden), 100 µM eines jeden dNTPs und je 200 nM Sense- und Antisense-Primer in einem Volumen von 20 µl in 0,2 ml PCR-Reaktionsgefäßen angesetzt. Die Reaktion erfolgte im Mastercycler Gradient (Eppendorf, Hamburg) mit zumeist folgendem Programm: initial 5 min bei 95°C, 10 Zyklen: 30 sec 94°C, 30 sec bei der für die Primer ermittelten optimalen Annealingtemperatur, 30 sec Elongation bei 72°C. In den folgenden 25 Zyklen wurde die Elongationszeit um 1 sec pro Zyklus verlängert. Abschließend erfolgte eine Elongation für 10 min bei 72°C.. 2.13 GELELEKTROPHORESE PCR- und RT-PCR-Produkte. wurden. standardmäßig. in. einem. 1,0 %. (w/v). Agarosegel in 1x TAE-Puffer (0,04 M Tris-Base/20 mM Essigsäure/1 mM EDTA; pH 8,0) bei 80 - 120 V für 1 - 2,5 h aufgetrennt. Restriktionsfragmente wurden standardmäßig in einem 0,8 % (w/v) Agarosegel in TAE-Puffer bei 30 - 120 V für 1 – 12 h aufgetrennt. Anschließend wurden die Gele in einer Ethidiumbromidlösung (1 µg/ml) für 15 - 20 min gefärbt und im UV-Durchlicht bei 254 nm Wellenlänge mit einer Polaroidkamera dokumentiert. Die Auftrennung von RNA-Proben erfolgte in einem denaturierenden 1,2 % (w/v) Agarosegel mit 0,65 % (v/v) Formaldehyd und 10 µg Ethidiumbromid in MOPS-Puffer (20 mM MOPS/5 mM NaAc/1 mM EDTA; pH 8,0) bei 80 V für 2,5 – 3 h.. 2.14 HERSTELLUNG VON DNA-SONDEN Die Herstellung von DNA-Sonden für radioaktive Hybridisierungen von Northern Blots erfolgte. mittels. PCR. an. Plasmid-DNA. oder. PCR-Produkten,. die. durch. Sequenzierungen verifiziert wurden. Das PCR-Produkt wurde im Agarosegel aufgetrennt und die distinkte Bande mit einem Skalpell ausgeschnitten. Die Extraktion der DNA aus dem Gelfragment erfolgte nach Herstellerangaben mit dem „QIAquick PCR Purification Kit“ (Qiagen, Hilden). Die DNA, gelöst in 10 mM Tris-HCl (pH 8,5), wurde anschließend mit dem Radionuklid [α-32P]dCTP mit Hilfe des 18.

(26) MATERIAL UND METHODEN. „Megaprime DNA labelling system” (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, England) nach Herstellerangaben am Zentrum für Humangenetik der Universität Bremen markiert. Die Herstellung Digoxigenin-markierter DNA-Sonden für nicht-radioaktive Southern Blot-Hybridisierungen erfolgte ebenfalls mittels PCR, jedoch unter Zusatz von 0,3 nM DIG-11-dUTP. Die anschließende Aufreinigung erfolgte analog der Sonden für radioaktive Hybridisierungen.. 2.15 SOUTHERN BLOT-HYBRIDISIERUNG Der DNA Transfer mittels Vakuum wurde nach einem modifizierten „Hybond-N+“Protokoll (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK) durchgeführt. Das Gel wurde zweimal für je 15 min in 0,5 M NaOH inkubiert. Nach Neutralisation für 30 min in 1,5 M NaCl/0,5 M Tris-HCl/1 mM EDTA (pH 7,2) erfolgte der Transfer auf eine positiv geladene Nylon-Membran für 45 min bei 7 inch Hg Unterdruck. Eine kovalente Bindung der DNA an die Nylonmembran erfolgte anschließend durch UVCrosslinking (0,4 J/cm2). Die Hybridisierung wurde nach einem modifizierten „ExpressHyb Hybridization Solution“-Protokoll (BD Biosciences Clontech, Palo Alto, USA) durchgeführt. Die Membran wurde für 30 min bei 60°C mit 5 ml vorgewärmter ExpressHyb-Lösung (BD Biosciences Clontech, Palo Alto, USA) pro 100 cm2 Membran prähybridisiert und anschließend 1 h bei 60°C mit 5 ml/100 cm2 vorgewärmter ExpressHyb-Lösung mit ca. 5 ng/ml denaturierter Sonde hybridisiert. Das Waschen der Membran erfolgte für zweimal 15 min mit 2x SSC/0,1 % SDS bei RT, anschließend zweimal 15 min mit 0,1x SSC/0,1 % SDS. bei. 60°C,. dann. 5 min. mit. 0,1 M Malein-. säure/0,15 M NaCl/0,3 % Tween20 (pH 7,5) bei RT. Die Detektion der Digoxigenin-markierten DNA-Sonden erfolgte nach einem modifizierten „Dig Application Manual for Filter Hybridization“-Protokoll (Roche Diagnostics, Mannheim). Die Membran wurde für 30 min mit 0,1 M Maleinsäure/0,15 M NaCl/1 % Blocking-Reagenz (pH 7,5) bei RT inkubiert. Im Anschluß erfolgte eine Inkubation für 30 min mit 0,1 M Maleinsäure/0,15 M NaCl/1 % BlockingReagenz (pH 7,5) mit 75 mU/ml Anti-Digoxigenin-Antikörper bei RT. Die Membran wurde dann zweimal 15 min mit 0,1 M Maleinsäure/0,15 M NaCl/0,3 % Tween20 (pH 7,5). bei. RT. gewaschen.. Nach. Inkubation. für. 5 min. mit. 0,1 M Tris19.

(27) MATERIAL UND METHODEN. HCl/0,1 M NaCl/50 mM MgCl2 (pH 9,5) bei RT erfolgte die Nachweisreaktion mittels 12,5 mM CDP-Star Substrat auf einem Film (Hyperfilm ECL; Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK) nach Angaben des Herstellers.. 2.16 NORTHERN BLOT-HYBRIDISIERUNG Der. RNA. (Amersham. Transfer. wurde. Biosciences,. nach. einem. modifizierten. Buckinghamshire,. UK). „Hybond-N+“-Protokoll. durchgeführt.. Das. zu. de-. naturierende Gel wurde für 20 min in 50 mM NaOH bei RT inkubiert. Anschließend erfolgte eine Inkubation für zweimal 15 min in 1,8 M NaCl/0,5 M Tris-HCL (pH 7,5) und zweimal 15 min in 1,5 M NaCl/0,15 M NaCitrat (pH 7,0) bei RT. Der Transfer auf eine positiv geladene Nylon-Membran erfolgte über Nacht in Form eines Kapillarblots. Eine kovalente Bindung der RNA an die Nylonmembran erfolgte anschließend durch UV-Crosslinking (0,4 J/cm2). Die Hybridisierung mit cDNA-Sonden, markiert mit dem Radionuklid [α-32P]dCTP, erfolgte nach dem „PerfectHyb Plus”-Protokoll (Sigma, Saint Louis, USA) am Zentrum für Humangenetik der Universität Bremen. Das Ergebnis der Northern BlotHybridisierung wurde mit Hilfe eines STORM-Imagers (Molecular Dynamics, Sunnyvale, USA) ausgewertet.. 2.17 DOT BLOT-HYBRIDISIERUNG Der Dot Blot wurde nach einem modifizierten „Hybond-N+“-Protokoll (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK) durchgeführt. 1 µg DNA wurde für 10 min in kochendem H2O denaturiert und danach sofort in Eiswasser überführt. Anschließend wurde die DNA auf eine positiv geladene Nylon-Membran pipettiert und mittels UVCrosslinkings (0,4 J/cm2) kovalente gebunden. Eine Hybridisierung mit radioaktiv markierten DNA-Sonden erfolgte nach dem „PerfectHyb Plus”-Protokoll (Sigma, Saint Louis, USA) am Zentrum für Humangenetik der Universität Bremen.. 2.18 SEQUENZIERUNGEN Sequenzierungen wurden in der Regel von der Firma MWG-Biotech (Ebersberg) mit dem „BigDye Terminator Version 3.1 Cycle Sequencing Kit“ (Applied Biosystems, 20.

(28) MATERIAL UND METHODEN. Weiterstadt) auf einem ABI 3730XL durchgeführt. Für die Sequenzierung klonierter Fragmente wurden zumeist die Standardprimer M13 uni (5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3’). und. M13 rev. (5’-CAGGAAACAGCTATGACC-3’). verwendet.. Die. Sequenzierung von PCR-Produkten erfolgte jeweils mit den Primern, mit denen diese Produkte generiert worden waren. Alle Sequenzdaten wurden manuell durch Überprüfung der Chromatogramme verifiziert.. 2.19 IN SILICO-ANALYSEN Die Editierung und Bearbeitung von Sequenzdaten wurden mit dem Software-Paket „Lasergene“ (DNASTAR, Madison, USA) durchgeführt. Datenbankvergleiche mit öffentlichen Nukleinsäure- und Proteinsequenzen wurden mit Online-Programmen des National Center for Biotechnology Information (Bethesda, USA) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) durchgeführt.. 21.

(29) ERGEBNISSE. 3 ERGEBNISSE 3.1. MOLEKULARGENETISCHE. UNTERSUCHUNGEN. ZUM. SPLEIßEN. DES. HMGA2 3.1.1 MOLEKULARGENETISCHE UNTERSUCHUNGEN ZUM SPLEIßEN DES HMGA2 UNTER BETEILIGUNG DES INTRON 4. I: Hauke et al., Genes, Chromosomes & Cancer, 30: 2001 unpublizierte Ergebnisse HMGA2 Rearrangierungen resultieren häufig in der Entstehung eines chimären Gens, welches für Transkripte kodiert, die aus den ersten 3 Exons des HMGA2 bestehen, gefolgt von Exons der Fusionspartner-Gene. Nur sehr selten werden Transkripte beschrieben, die aus den ersten 4 Exons des HMGA2 bestehen, gefolgt von ektopischen Sequenzen bekannter Herkunft, wie dem NFIB-Gen (Geurts et al., 1998) oder unbekannter Herkunft (Kazmierczak et al., 1996; Schoenmakers et al., 1995). In den Fällen unbekannter Herkunft waren entweder keine zytogenetischen Aberrationen unter Involvierung des HMGA2-Lokus detektierbar (Kazmierczak et al., 1996) oder aber wurde als Ursprungsort der ektopischen Sequenzen, trotz sichtbarer Translokationen, das Chromosom 12 mittels CASH-PCR ermittelt (Schoenmakers et al., 1995). Als Entstehungsmechanismus dieser Transkripte wurde aberrantes Spleißen unter Beteiligung von Sequenzen aus dem Intron 4 oder die Entstehung von. Fusionsgenen. durch. lichtmikroskopisch. nicht. sichtbare. chromosomale. Rearrangierungen, wie kleine Deletionen oder Inversionen, postuliert (Schoenmakers et al., 1995; Kazmierczak et al., 1998b). Um den Entstehungsmechanismus dieser Transkripte zu klären, wurde im Rahmen dieser Arbeit erstmalig das gesamte bis dato noch nicht sequenzierte Intron 4 des HMGA2-Gens kloniert, sequenziert und in silico Analysen unterzogen. Dazu wurde mittels PCR der PAC-Klon 12/1 gescreent, dessen Enden durch Dot-Blot Hybridisierungen mit Cosmiden bekannter Lokalisation (Schoenmakers et al., 1995) zum einen innerhalb des Intron 3, zum anderen stromabwärts des 3’UTRs des HMGA2-Gens lokalisiert werden konnten. Nach Subklonierung und Sequenzierung von 116 Klonen wurden 10 Klone identifiziert, die das Intron 4 überspannen. Lücken. 22.

(30) ERGEBNISSE. zwischen diesen Klonen wurden mittels Primer-Walking geschlossen. Es zeigte sich, dass das Intron 4 des HMGA2 eine Gesamtlänge von 11.839 bp hat. Datenbank Analysen ergaben, dass eine der zwei von Kazmierczak et al. (1996) und alle drei von Schoenmakers et al. (1995) nachgewiesenen ektopischen Sequenzen, die in chimären HMGA2-Transkripten dem Exon 4 folgen, aus dem Intron 4 stammen. Die in dem Uterus Leiomyom LM-163.1 detektierte Sequenz (GenBank Nummer U29120) liegt 121 bp, die in der Uterus Leiomyom-Zelllinie LM-30.1 sowie dem chondroiden Lungenhamartom H7 detektierte Sequenz (GenBank Nummer U29115) liegt 941 bp und die in der Lipom-Zelllinie Li-14 detektierte Sequenz (GenBank Nummer U29114) liegt 7.218 bp stromabwärts des Exon 4. Die. Spleißakzeptorstellen. entsprechen. im. Wesentlichen. dem. gängigen. (T/C)nN(C/T)AG-Motiv (Mount, 1982). Weiterhin ergaben in silico-Analysen, dass vor jedem der o. g. HMGA2 Sequenzen, innerhalb eines Abschnittes von 10 bis 50 Nukleotide stromaufwärts des AG-Dinukleotids der Spleißakzeptorstelle, eine branch site, eine Lariat-Verzweigungsstelle lokalisiert ist, die der Konsensussequenz (T/C)N(C/T)(T/C)(A/G)A(C/T) (Senapathy et al., 1990; Harris und Senapathy, 1990; Ruskin et al., 1984) entspricht (s. Tabelle 2). Während bei den Transkripten aus LM-163.1 und Li-14 die 16 Aminosäuren, kodiert durch das HMGA2 Exon 5, durch lediglich 3 bzw. 2 AS ersetzt werden, diese HMGA2-Transkripte somit trunkierte Varianten darstellen, kodiert die Sequenz aus LM-30.1 und H7 für 25 zusätzliche Aminosäuren. In allen hier beschriebenen terminalen Exons ist in den 3’UTRs mit der Sequenz AATAAA bzw. AATAGA ein potentielles poly(A)-Signal vorhanden (MacDonald und Redondo, 2002) (s. Tabelle 2). Die kryptischen HMGA2-Transkripte stellen somit Spleißprodukte des HMGA2Gens dar.. 3.1.2 MOLEKULARGENETISCHE UNTERSUCHUNGEN ZUM SPLEIßEN DES HMGA2 UNTER BETEILIGUNG DES INTRON 3. II: Hauke et al., Genes, Chromosomes & Cancer, 34: 2002 III: Hauke et al., in Vorbereitung unpubliziert Ergebnisse Chromosomale Rearrangierungen unter Involvierung des dritten Introns des HMGA2Gens, dem häufigsten Ziel chromosomaler Aberrationen in humanen Tumoren (Kazmierczak et al., 1998a), resultieren häufig in der Expression chimärer HMGA223.

(31) ERGEBNISSE. Transkripte bestehend aus den ersten drei, für die AT-Hooks kodierenden, Exons, gefolgt von ektopischen Anteilen nicht geklärter Herkunft. Analog der oben beschriebenen Situation für HMGA2-Transkripte bei denen die ektopischen Sequenzen dem Exon 4 folgen, konnte für einige dieser ektopischen Anteile die Herkunft mittels CASH-PCR auf das Chromosom 12 eingegrenzt werden, wobei der Entstehungsmechanismus unklar blieb. Daher wurde im Rahmen dieser Arbeit erstmalig das gesamte Intron 3 des HMGA2 kloniert, sequenziert und in silico Analysen unterzogen. Dazu wurde mittels zweier PCRs der PAC-Klon 20422 gescreent, dessen eines Ende im Intron 2, das andere Ende im Intron 4 lokalisiert war und somit das komplette dritte Intron überspannte. Einzelne Restriktionsfragmente wurden subkloniert und insgesamt 83 dieser Klone sowie 89 der im Intron 3 lokalisierten Sub-Klone des unter Pkt. 3.1.1 charakterisierten PAC-Klons sequenziert. Lücken zwischen diesen Klonen wurden mittels PrimerWalking geschlossen. Es zeigte sich, dass das Intron 3 des HMGA2 eine Gesamtlänge von 112.846 bp hat. Mittels Datenbank Analysen konnte von insgesamt 5 verschiedenen chimären HMGA2-Transkripten die 3’ terminale ektopische Sequenz innerhalb des Introns 3 lokalisiert werden. Die Sequenz mit der GenBank Nummer U29113, erstmalig in der Uterus Leiomyom-Zelllinie LM-30.1 detektiert (Schoenmakers et al., 1995), ist 4.022 bp stromabwärts des Exon 3 lokalisiert. Die Sequenz mit der GenBank Nummer U29117, erstmalig im Lipom Li-192 detektiert (Schoenmakers et al., 1995), ist 35.448 bp, die Sequenz mit der GenBank Nummer H98218, erstmalig in Melanozyten nachgewiesen, ist 46.196 bp, die Sequenz mit der GenBank Nummer U29119, erstmalig im Uterus Leiomyom LM-196.4 detektiert (Schoenmakers et al., 1995), ist 76.174 bp und die Sequenz mit der GenBank Nummer U29112, erstmalig in der Lipom-Zelllinie Li-538 detektiert (Schoenmakers et al., 1995), ist 76.513 bp stromabwärts des Exon 3 lokalisiert. Die. Spleißakzeptorstellen. entsprechen. im. Wesentlichen. dem. gängigen. (T/C)nN(C/T)AG-Motiv (Mount, 1982). Ebenso ließen sich mittels in silico-Analysen jeweils. 10. bis. Spleißakzeptorstelle. 50. Nukleotide Abschnitte. stromaufwärts lokalisieren,. die. des der. AG-Dinukleotids. der. Verzweigungsstellen-. Konsensussequenz (T/C)N(C/T)(T/C)(A/G)A(C/T) (Senapathy et al., 1990; Harris und Senapathy, 1990; Ruskin et al., 1984) entsprechen (s. Tabelle 2).. 24.

(32) ERGEBNISSE. Anstatt der 27 AS, kodiert durch die Exons 4 und 5 des HMGA2, kodieren die oben beschriebenen terminalen Sequenzen für 8, 14, 10, 65 bzw. 24 Aminosäuren. Datenbankvergleiche zeigten dabei keine Homologie zu bekannten funktionellen Proteindomänen. Mit Ausnahme der H98218 Sequenz ist in den 3’UTRs aller beschriebener Exons mit der Sequenz AATAAA bzw. CATAAA ein potentielles poly(A)-Signal vorhanden (MacDonald und Redondo, 2002) (s. Tabelle 2). Literatur und erweiterte Datenbank Analysen ergaben, dass, mit Ausnahme der Sequenz U29119, jedes der chimären HMGA2-Transkripte von verschiedenen Arbeitsgruppen in unterschiedlichen Tumoren und Geweben nachgewiesen worden waren (Schoenmakers et al., 1995; Kazmierczak et al., 1996; Kottickal et al., 1998; Meza-Zepeda et al., 2001; Mine et al., 2001b; Quade et al., 2003). Da hierzu sowohl Tumoren ohne Aberrationen des HMGA2-Lokus, als auch Normalgewebe gehörten, wurden in dieser Arbeit erstmalig mittels RT-PCR umfassende Expressionsanalysen zu den einzelnen chimären HMGA2-Transkripten durchgeführt. Hierbei zeigte sich, dass die Transkripte im Wesentlichen mit dem nativen HMGA2-Transkript, sowohl in Normalgewebe, als auch in Tumorgeweben, koexprimiert werden (s. Tabelle 1). Darüber hinaus konnten drei weitere Sequenzen innerhalb des HMGA2 Intron 3 detektiert werden, die als interne Exons „B“, „D“ und „G“ in einigen der o. g. Transkripte zwischen das Exon 3 und eines der neuen terminalen Exons gespleißt werden (s. Tabelle 1). Auch hier konnten im Wesentlichen die charakteristischen Merkmale interner Exons, wie stromaufwärts gelegene branch site und Intron/Exonund Exon/Intron-Konsensussequenzen nachgewiesen werden (s. Tabelle 2). Mittels Northern Blot-Analysen konnten darüber hinaus, zumindest in der LipomZelllinie Li-14, neben dem nativen HMGA2-Transkript, bestehend aus den Exons 1 bis 5, fünf weitere Transkripte nachgewiesen werden, die zwar die Exons 1 bis 3, nicht jedoch die Exons 4 bis 5 umfassen.. 25.

(33) ERGEBNISSE. Tabelle 1: Zusammenfassende Darstellung des Expressionsmusters verschiedener HMGA2-Transkripte (Hauke et al., 2002; Hauke et al., in Vorbereitung; unveröffentlichte Ergebnisse). Grau hinterlegt sind die von der Expression des HMGA2 abweichenden Expressionsereignisse. Transkript-Bezeichnungen: Auf die Exons 1-3 folgt jeweils die Sequenz U29117 (HMGA2b), bzw. die Sequenzen U29113 (HMGA2c); das potentielle Exon B, gefolgt von U29113 (HMGA2c’); H98218 (HMGA2d); das potentielle Exon D, gefolgt von H98218 (HMGA2d’); U29119 (HMGA2e); U29119,. HMGA2. HMGA2b. HMGA2c. HMGA2c’. HMGA2d. HMGA2d’. HMGA2e. HMGA2e’. HMGA2f. gefolgt vom potentiellen Exon G, gefolgt von U29112 (HMGA2e’); U29112 (HMGA2f).. Peripheres Blut. -. -. -. -. -. -. -. -. -. Fetus. +. +. +. -. +. -. +. +. +. Testis. +. -. +. -. -. -. -. -. +. Myometrium. -. -. -. -. -. -. -. -. -. Glandula parotis. -. -. -. -. -. -. -. -. -. Nierenzellkarzinom. -. -. -. -. -. -. -. -. -. Mammakarzinom, invasiv ductal, Grading 2. +. -. -. -. -. -. -. -. -. Mammakarzinom, invasiv ductal, Grading 3. +. +. -. -. -. -. -. -. -. Fibroblasten. +. +. +. -. +. -. +. +. +. Li-14 (Lipom). +. +. +. +. +. +. +. +. +. Li-167 (Lipom). +. +. +. -. +. -. +. +. +. LM-30.1 (Uterus Leiomyom). +. +. +. +. +. +. +. +. +. Ha115 (Lungenhamartom, chondroides). +. +. +. -. +. -. +. +. +. Ha269 (Lungenhamartom, chondroides). +. +. +. -. +. -. +. +. +. EFM19 (Mammakarzinom). -. -. -. -. -. -. -. -. -. MCF7 (Mammakarzinom). +. -. -. -. -. -. -. -. -. HeLa (Zervixkarzinom). -. -. -. -. -. -. -. -. -. MRIH186 (Zervixkarzinom). +. +. +. -. +. -. +. +. +. Primäre Normalgewebe. Primäre Tumorgewebe. Kultivierte Zellen. 26.

(34) ERGEBNISSE. Tabelle 2: Zusammenfassende Darstellung der molekulargenetischen Charakterisierung neuer, alternativer Exons des HMGA2, lokalisiert im Intron 3 und 4 des Gens im Vergleich zu den bereits beschriebenen Exons 1 bis 5 (Hauke et al., 2001; 2002; Hauke et al., in Vorbereitung; unveröffentlichte Ergebnisse). Grau hinterlegt sind die von der jeweiligen Konsensussequenz abweichenden Nukleotide. Exon-Typen: (p) 5’ terminal, (i) intern, (t) 3’ terminal. Durchgestrichene Felder: Keine Relevanz bei dem jeweiligen Exon-Typ.. Typ. Lokal.. Intron | Exon1. C ⎛T⎞ Bezeichnung ⎜ ⎟ N AG | G C ⎝ ⎠n T. Verzweigungsstelle2 poly(A)-Signal3 T C T A C N A Pos.4 C T C G T. 2. A C AA T TAG | G. A A G | G TG A G A. C C AC A AC. -24. i. 3. A T TT G CAG | A. T G G | G TG A G T. C T AT A AT. -19. i. 4. C T CC T TAG | C. C A G | G TA A G A. C T AT A AT. -41. t. 5. T G TT C CAG | G. T A AC G AT. -32. i. B. T T TT A TAG | T. A A G | G TA T A T. G G TA A AT. -28. i. D. T G TT T AAG | C. A G G | G TA A G A. C C TT A AT. -18. G. A A TAA C T. A A G | T CA G T A. -. C T TC T GAG | G. i/t F (U29119). T T GC T CAG | G. t. A (U29117). t. 5. -. 6. A A TA A A. -6. T T TT G AG. -24. C A TA A A. C T CT A TAG | C. A A TT A AT. -39. A A TA A A. C (U20113). C T AT T AAG | G. T T TT A AT. -14. A A TA A A. t. E (H98218). C C TC C CAG | T. C A CT G AC. -19. t. H (U29112). A T CC A CAG | G. T C CT G AT. -10. C A TA A A. t. U29120. T C CT G CAG | T. C C CC A AA. -44. A A TA A A. t. U29115. G G GC T TAG | G. T A CA A AT. -22. A A TA A A. t. U29114. T G TG A CAG | G. T G CT G AA. -25. A A TA G A. nach Mount et al., 1982;. 1990;. C A AG | GT AGT A G. i. i. Intron 4. Intron 3. p 1. 1. Exon | Intron1. Exon-. 3. 2. G A G | G TA T T C. -. nach Ruskin et al., 1984; Harris und Senapathy, 1990; Senepathy et al.,. nach MacDonald und Redondo, 2002;. 4. Position stromaufwärts des AG-Dinukleotids (in bp);. 5. es schließt sich direkt das Exon H an; 6 Exon H folgt immer Exon F. 27.

(35) ERGEBNISSE. 3.2. MOLEKULARGENETISCHE CHARAKTERISIERUNG. VON. RETROPSEUDO-. GENEN DES HMGB1. 3.2.1 IDENTIFIKATION UND MOLEKULARGENETISCHE CHARAKTERISIERUNG VON HMGB1-RETROPSEUDOGENEN IV: Rogalla et al., Cytogenetics and Cell Genetics, 83: 1998 Zum Nachweis genomisch integrierter HMGB1-Retropseudogene wurde eine PCR etabliert, die die Basen 91 bis 567 des 648 bp langen HMGB1 ORF amplifiziert. Einhergehend mit aus der Literatur bekannten Southern Blot-Untersuchungen (Stros und Dixon, 1993) gelang es dadurch an humaner genomischer DNA eine distinkte Bande zu amplifizieren, wodurch die Existenz zumindest eines Retropseudogens des HMGB1 im humanen Genom bestätigt wurde. Das Durchmustern einer humanen PAC-Bank mittels der etablierten PCR ergab 25 PAC-Klone mit einer starken Positivität, wovon 8 Klone zur näheren Charakterisierung ausgewählt wurden. Vergleichende FISH- und Sequenzanalysen zeigten, dass es sich hierbei um 5 unterschiedliche Klone bzw. 5 HMGB1-Retropseudogene handelte, die von unterschiedlichen chromosomalen Ursprungsorten abstammten: HMG1L1, HMG1L3, HMG1L4, HMG1L5 und HMG1L6, lokalisiert in den chromosomalen Regionen 2q32, 2q35, 3p24, 15q22 und 20q13. Der o. g. 477 bp lange ORF Abschnitt wurde von jedem der 5 HMGB1Retropseudogenen. mittels. PCR. amplifiziert,. kloniert. und. sequenziert.. Die. Sequenzanalyse ergaben eine Homologie der einzelnen Sequenzen zur publizierten HMGB1 ORF-Sequenz (Wen et al., 1989) von 91,7% bis zu 99,4%. Lediglich im ORF des HMG1L6 wurde eine Leseraster-Mutation durch Deletion zweier Basen an Position 66 und 67 des ORF und Insertion an Position 118 nachgewiesen. Das Leseraster der anderen Retropseudogene wies nur Transitionen und Transversionen, jedoch keine, zur Generierung eines neuen Stop-Kodons führende, Nonsense-Mutationen auf.. 28.

(36) ERGEBNISSE. 3.2.2 MOLEKULARGENETISCHE CHARAKTERISIERUNG DES AKTIVIERTEN HMGB1 RETROPSEUDOGENS HMG1L3 V: Rogalla et al., Genomics, 63: 2000 Datenbankvergleiche. der. in. der. vorangegangenen. Untersuchung. erzielten. Sequenzdaten von HMGB1-Retropseudogenen mit bekannten ESTs ergaben, dass die HMG1L3 Sequenz über weite Teile homolog zum 3’ Ende einer, in der Brustkrebszelllinie ZR-75-1 nachgewiesenen, Spleißvariante, genannt SP100-HMG, des nuklearen Autoantigens SP100 war (Seeler et al., 1998). Zur Erstellung eines Expressionsprofils der SP100-HMG Spleißvariante wurden Northern Blot-Analysen an mRNA von Milz, Thymus, Prostata, Testis, Uterus, Dünndarm, Dickdarm und Leukozyten durchgeführt. Eine Hybridisierung mit einer für das 3’UTR des HMGB1 spezifischen Sonde zeigte in jedem der getesteten Gewebe drei distinkte Banden in Höhe von 1,4 kb, 2,4 kb und 3,6 kb. Die beiden kürzeren Transkripte entsprechen dabei den bekannten Transkriptlängen des HMGB1 (Wen et al., 1989; Xiang et al., 1997). Durch erneute Hybridisierung mit einer SP100-HMG 3’UTR spezifischen Sonde wurde verifiziert, dass es sich bei dem 3,6 kb Transkript um die SP100-HMG Spleißvariante handelt. Zur Charakterisierung der genomischen Struktur des HMG1L3 wurde ein 1.718 bp langes PAC-DNA Fragment, mit dem zum HMGB1 ORF homologen Abschnitt, sequenziert. Es zeigte sich, dass ein Abschnitt von 1.163 bp homolog zur bekannten HMGB1 cDNA ist und Teile des 5’UTRs, den kompletten ORF und Teile des 3’UTRs umfasst.. Flankiert. wird. diese. Region. von. 15-16 bp. langen. direkten. Sequenzwiederholungen, was die Genese der HMG1L3 Sequenz als prozessiertes Retropseudogen bestätigt. An die 3’ gelegene direkte Sequenzwiederholung schließt sich ein 436 bp langer Abschnitt spezifisch für das 3’Ende der SP100-HMG mRNA (Seeler et al., 1998) an. Potentielle Polyadenylierungs-Signale finden sich sowohl im HMG1L3 generierten Teil des 3’UTRs als auch im SP100-HMG spezifischen Teil. Vergleiche zwischen der genomischen Sequenz und der cDNA zeigten, dass das HMG1L3 als alternatives terminales Exon des SP100 dient. Dabei liegt die 5’Grenze dieses Exons 72 bp stromabwärts des ursprünglichen Begins des HMGB1 ORFs. Durch eine G zu A Transition an dieser Position, spezifisch für das HMG1L3, ist an dieser Stelle eine 3’ Spleißakzeptorstelle entstanden, die der Konsensussequenz (T/G)nN(C/T)AG|G entspricht (Mount, 1982). Das durch diese Punktmutation induzierte Spleißen beeinträchtigt jedoch weder das Leseraster noch die damit 29.

(37) ERGEBNISSE. verknüpfte Kodierung der zweiten HMG-Box, die durch die Basen 283-489 des ursprünglichen ORF kodiert wird. Die durch die Basen 25-237 des ursprünglichen ORF kodierte erste HMG-Box ist dahingegen 5’ trunkiert. Dies ist der erste Beleg dafür, dass ein aktives Gen eines Mammalia, durch Insertion eines prozessierten Retropseudogens in das Genom, ein neues Exon hinzugewinnt, wodurch das translatierte Protein neue, funktionelle Domänen gewinnt.. 3.3. WEITERFÜHRENDE FUNKTIONELLE UNTERSUCHUNGEN DES HMGB1 UND SEINES REZEPTORS RAGE. 3.3.1 UNTERSUCHUNGEN ZUM SPLEIßMUSTER DES HMGB1-REZEPTORS RAGE VI: Schlueter et al., Biochimica et Biophysica Acta, 1630: 2003 Neuere Studien zeigten, dass die Bindung des HMGB1 an den ZelloberflächenRezeptor RAGE in die Genese einer Reihe von Erkrankungen, sowohl entzündlicher Prozesse, als auch der Tumorproliferation, -invasion und -metastasierung involviert ist (Taguchi et al., 2000; Huttunen et al., 2002). In vivo konkurriert der RAGE Rezeptor dabei kompetitiv mit seiner löslichen Form sRAGE, einer Spleißvariante, der sowohl die Transmembran-, als auch die zytosolische Domäne des Rezeptors fehlt (Hofmann et al., 1999; Schmidt et al., 1994; Wautier et al., 1996). Um das Spleißmuster des RAGE-Gens zu entschlüsseln, wurde in dieser Arbeit eine PCR etabliert, mit der die relative Expression der beiden bekannten RAGE-Varianten in verschiedenen Geweben/Tumoren gegeneinander verglichen werden sollte. Zusätzlich zu den beiden erwarteten Fragmenten konnten mindestens 3 weitere Fragmente identifiziert werden, die, verifiziert mittels Sequenzierung, alle für verkürzte, lösliche RAGE-Varianten kodieren. Eine vergleichende quantitative Auswertung ergab ein stark variierendes Verhältnis des RAGE-Transkripts zu der Summe der identifizierten sRAGE-Transkripte in den untersuchten Proben. Diese Varianz, von 1,72 in Myometrium zu 0,56 in Lymphknoten, deutet darauf hin, dass das Spleißen der RAGE prä-mRNA einem komplexen regulatorischen Netzwerk unterliegt.. 30.