Untersuchungen zur Expression von High-Mobility-Group-Genen und -Proteinen unter besonderer Berücksichtigung des Mammakarzinoms

Volltext

(1)Untersuchungen zur Expression von High-Mobility-Group-Genen und -Proteinen unter besonderer Berücksichtigung des Mammakarzinoms. Dissertation. zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaften - Dr. rer. nat. -. Dem Promotionsausschuß Dr. rer. nat. im Fachbereich Biologie / Chemie der Universität Bremen vorgelegt von. Aljoscha Michael Flohr. 1. Gutachter: Prof. Dr. Jörn Bullerdiek 2. Gutachter: Prof. Dr. Detmar Beyersmann Bremen, 31.03 2004.

(2) Hiermit erkläre ich, Aljoscha Michael Flohr, geboren am 12.03.1971, daß beim Verfassen der vorliegenden Dissertation „Untersuchungen zur Expression von HighMobility-Group-Genen und -Proteinen unter besonderer Berücksichtigung des Mammakarzinoms” folgende drei Aussagen zutreffen: 1. Ich habe die Arbeit ohne unerlaubte fremde Hilfe angeferigt. 2. Ich habe keine anderen als die von mir angegebenen Quellen und Hilfsmittel benutzt. 3. Ich habe die den benutzten Werken wörtlich oder inhaltlich entnommenen Stellen als solche kenntlich gemacht. Bremen, 31.03.2004. Aljoscha Michael Flohr.

(3) Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis 1.. Einleitung. 1. 2.. Material und Methoden. 8. 2.1. Gewebeproben. 8. 2.2.. Zellinien und Zellkultur. 8. 2.3. DNA-Isolierung. 8. 2.4. PCR. 9. 2.5. Gelelektrophorese. 9. 2.6. Klonierung und Sequenzierung von DNA-Sequenzen. 9. 2.7. RNA-Isolierung. 10. 2.7.1 RNA-Isolierung mit Hilfe des TRIzol-Reagenz. 10. 2.7.2 RNA-Isolierung mit Hilfe des RNeasy Mini-Kits. 11. 2.7.3 RNA-Isolierung aus HOPE-fixiertem Gewebe. 11. 2.8. cDNA-Erststrangsynthese. 11. 2.9. DNase I-Behandlung von cDNA-Präparationen. 12. 2.10. Reverse-Transkription-PCR. 12. 2.11. RNA-Gelelektrophorese und Northern Blotting. 12. 2.12. Herstellung von cDNA-Sonden. 13. 2.13. Radioaktive cDNA-Sondenmarkierung. 13. und Hybridisierung von Northern Blots 2.14. Fluoreszenzmarkierung des HMGA1b-Proteins. 14. 2.15. Nachweis des Kerntransports von HMGA1b in MCF-7-Zellen. 14. 2.16. Behandlung der Zellinie MCF-7 mit HMGA1b-Potein. 14. 2.17. Durchführung von Array-Hybridisierungen. 15. 2.18. Immunhistochemie. 16. 2.19. Statistische Auswertung. 16. 3.. Ergebnisse. 17. 3.1. Untersuchungen zur Expression der HMGA-Gene und -Proteine. 17. 3.1.1 Expression des HMGA1-Proteins in Mammakarzinomen. 17. (Flohr et al., 2003a) 3.1.2 Expression des HMGA1-Gens in Mammakarzinomen (nicht veröffentlicht). 17.

(4) 3.1.3 Differentielle Genregulation durch erhöhte HMGA1b-Konzentrationen. 18. in MCF-7-Zellen (nicht veröffentlicht) 3.1.4 Charakterisierung eines neuen Exons im Intron 3 des HMGA2-Gens. 19. (Hauke et al., 2002) 3.1.5 Expression des HMGA1-Proteins im menschlichen Trophoblasten. 20. (Bamberger et al., 2003) 3.2.. Untersuchungen zur Expression des HMGB1-Gens. 21. 3.2.1 Charakterisierung der Spleißvariante SP100-HMG (Rogalla et al., 2000) 21 3.2.2 Expression des HMGB1-Gens in Mammakarzinomen. 22. (Flohr et al., 2001) 3.2.3 Molekulare Charakterisierung des caninen HMGB1. 23. (Murua Escobar et al., 2003) 3.2.4 Expression des HMGB1-Gens in Sarkomen des Hundes. 24. (Meyer et al., im Druck) 3.3. Untersuchung zur Gewebe-spezifischen Expression des. 24. HMGB1-bindenden RAGE-Rezeptors und seiner löslichen Form (Schlueter et al., 2003) 3.4. Methodische Aspekte zur Untersuchung der Expression der HMG-Gene 25. 3.4.1 Eine DNase I-Behandlung von cDNA-Erststrangpräparationen. 25. garantiert spezifische RT-PCR-Analysen (Flohr et al., 2003b) 3.4.2 RNA aus HOPE-fixierten Mammakarzinomen kann für Northern Blot-. 26. und Microarray-Analysen eingesetzt werden (Goldmann, Flohr et al., zur Veröffentlichung angenommen) 3.4.3 RT-PCR-Analyse an HOPE-fixierten Mammakarzinomen. 27. (nicht veröffentlicht) 4.. Diskussion. 28. 5.. Zusammenfassung. 45. 6.. Summary. 48. 7.. Literatur. 50. Danksagung. 63. Publikationsübersicht. 64. Anhang.

(5) Abkürzungsverzeichnis AEC. 3-Amino-9-ethylcarbazol. AGE. advanced glycation end products. AK. Antikörper. AP. Alkalische Phosphatase. AS. Aminosäure. bp. base pair. BRCA1. breast cancer gene 1. CFA. canis familiaris. CGH. comparative genomic hybridisation. CO2. Kohlendioxyd. dATP. Desoxy-Adenosintriphosphat. dCTP. Desoxy-Cytosintriphosphat. dNTP. Desoxy-Nukleosidtriphosphat. DSMZ. Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen. EtOH. Ethanol. ER. estrogen receptor. ERE. estrogen responsive element. ERG. Eppendorf-Reaktionsgefäß. EST. expressed sequence tags. FKS. fötales Kälberserum. g. Gravitationsbeschleunigung. G. grading (Differenzierungsgrad). GAPDH. Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase. h. Stunde. HER-2. human epidermal growth factor receptor 2. HMG. high mobility group. HMGA. high mobility group protein A. HMGA1a. high mobility group protein A1 Isoform a. HMGA1b. high mobility group protein A1 Isoform b. HMGA2. high mobility group protein A2. HMGB1. high mobility group protein B1. HOPE. Hepes-Glutamic acid buffer mediated Organic solvent Protection Effect.

(6) IgG. Immunglobulin G. IRS. immunoreactive score. JNK. c-Jun N terminal kinase. kb. Kilo-Basenpaare. KCl. Kaliumchlorid. LB. Luria Bertani. M. molar. MgCl2. Magnesiumchlorid. MgSO4. Magnesiumsulfat. MAP. mitogen-activated protein. MAPK. mitogen-activated protein kinase. min. Minute. M-MLV. moloney murine leukemia virus. MOPS. 3-[N-Morpholino]propansulfonsäure. NaAc. Natriumacetat. NaCl. Natriumchlorid. NaOH. Natronlauge. ORF. open reading frame. PBS. phosphate buffered saline. PCR. polymerase chain reaction. PDGF. platelet-derived growth factor. PDGFA. platelet-derived growth factor A. PDGFR. platelet-derived growth factor receptor. PGK-1. Phosphoglyceratkinase 1. PGK-2. Phosphoglyceratkinase 2. PR. progesterone receptor. RAGE. receptor for advanced glycation end products. RNAi. RNA interference. RT. Raumtemperatur. RT-PCR. Reverse-Transkription-PCR. s. Sekunde. SDS. Sodiumdodecylsulfat. S-Phase. Synthesephase. SSC. standard saline citrat.

(7) SLO. Streptolysin O. TBP. TATA binding protein. U. unit. UTR. untranslated region. V. Volt. WB. Wasserbad. ZKH. Zentralkrankenhaus.

(8) Einleitung. 1. 1. Einleitung Die High-Mobility-Group (HMG)-Proteine sind kleine, Chromatin-assoziierte NichtHiston-Proteine, die unter anderem aufgrund ihrer funktionellen Sequenzmotive in drei Familien unterteilt werden: die HMGB-, HMGN- und HMGA-Familie (Goodwin et al., 1973; Bustin, 2001). Die HMG-Proteine wirken als molekulare Schalter der Chromatinorganisation. Sie haben Einfluß auf die Genregulation und werden daher auch als architektonische Transkriptionsfaktoren bezeichnet (Grosschedl et al., 1994). Zur HMGA-Proteinfamilie gehören die Proteine HMGA1 und HMGA2. Das HMGA1Gen ist in der chromosomalen Bande 6p21.3 lokalisiert, und es gibt drei Spleißvarianten des Gens, die für die Proteinisoformen HMGA1a, HMGA1b und HMGA1c kodieren (Friedmann et al., 1993). Es existieren im menschlichen Genom mindestens sieben Retropseudogene des HMGA1-Gens (Blank et al., 2000; Rogalla et al., 2001; Blank, pers. Mitteilung). Das HMGA2-Gen wurde in der chromosomalen Bande 12q13-15 lokalisiert (Schoenmakers et al., 1995), und es gibt mindestens zwei Spleißvarianten (HMGA2a und HMGA2b) dieses Gens (Chau et al., 1995; Hauke et al., 2002). Die HMGA-Proteine besitzen drei stark konservierte DNAbindende Domänen, die sog. „AT-hooks”, und eine saure C-terminale Domäne. Mit Hilfe der „AT-hooks” binden sie mit geringer Sequenzspezifität an die kleine Furche AT-reicher DNA-Sequenzen in der B-Form (Reeves und Nissen, 1990). Die HMGAProteine erkennen bei der Bindung an DNA eher eine bestimmte Struktur als eine Nukleotidsequenz. Sie können allein keine Transkription auslösen, sondern ermöglichen durch Änderung der DNA-Konformation definierte Protein-Protein- und Protein-DNA-Wechselwirkungen (Wolffe, 1994). Die HMGA-Proteine regulieren in vivo eine Vielzahl von Genen, wobei die Genregulation höchstwahrscheinlich auf der Entstehung eines sog. Enhanceosoms in der Promotorregion von regulierten Zielgenen beruht (Reeves, 2000). HMGA1 unterstützt z.B. bei dem gut untersuchten Interferon-beta-Enhanceosome durch eine Konformationsänderung der DNA die Bindung von drei weiteren Transkriptionsfaktoren (Falvo et al., 1995; Yie et al., 1997; Yie et al., 1999). Die HMGA-Gene werden in Zellen während der Embryonalentwicklung stark exprimiert, während ihre Expression in differenzierten und sich nicht-teilenden Zellen sehr gering oder nicht nachzuweisen ist (Rogalla et al., 1996; Chiappetta et al., 1996;.

(9) Einleitung. 2. Hirning-Folz et al., 1998; Gattas et al., 1999; Liu et al., 2000). Es kann aber zu einer Reaktivierung der Expression der HMGA-Gene in neoplastischen Zellen kommen. Schoenmakers herausfinden,. et. al.. daß. (1995). das. konnten. HMGA2-Gen. mit von. Hilfe. der. Bruchpunktklonierung. Chromosomenveränderungen. in. verschiedenen benignen mesenchymalen Tumoren wie Lipomen, Uterusleiomyomen und pleomorphen Adenomen der Speicheldrüse betroffen ist. Auch das HMGA1Gen, welches in der chromosomalen Bande 6p21.3 lokalisiert ist, kann in vielen gutartigen. mesenchymalen. Tumoren. wie. Uterusleiomyomen,. chondroiden. Hamartomen der Lunge, Hamartomen der Brust und Endometriumpolypen von Chromosomenaberrationen betroffen sein (Dal Cin et al., 1997; Kazmierczak et al., 1998; Kazmierczak et al., 1999b). In benignen mesenchymalen Tumoren wie z.B. Uterusleiomyomen kann die Reaktivierung der Expression der HMGA-Gene auf chromosomalen Veränderungen in den Banden 6p21.3 bzw. 12q13-15 beruhen (Williams et al., 1997; Hennig et al., 1997; Gattas et al., 1999; Sornberger et al., 1999). Aber auch in malignen Tumoren kann es zu einer Expression der HMGAGene kommen, die im Vergleich zu der in adulten Zellen außergewöhnlich stark ist. Die Ursache für die Reaktivierung der HMGA-Genexpression beruht bei malignen Tumoren. wahrscheinlich. nicht. auf. Chromosomenaberrationen,. sondern. auf. Mechanismen der Genregulation. Für das HMGA1-Gen konnte eine Reaktivierung der Expression bzw. Überexpression in vielen verschiedenen Karzinomen wie dem Schilddrüsenkarzinom, kolorektalen Karzinom, Pankreaskarzinom, Prostatakarzinom, Zervixkarzinom, Ovarialkarzinom und Magenkarzinom gezeigt werden (Tamimi et al., 1993; Chiappetta et al., 1995; Fedele et al., 1996; Chiappetta et al., 1998; Bandiera et al., 1998; Abe et al., 1999; Abe et al., 2000; Chiappetta et al., 2001; Masciullo et. al, 2003; Nam et al., 2003). Die Untersuchungen zur Expression des HMGA2-Gens in malignen Tumoren sind weniger umfassend als die des HMGA1. HMGA2 wird u.a. in. Leukämien,. nicht-kleinzelligen. Lungenkarzinomen,. gut. differenzierten. Liposarkomen und Pankreaskarzinomen exprimiert (Rommel et al., 1997; Berner et al., 1997; Rogalla et al., 1998b; Abe et al., 2003). Rogalla et al. (1997) wiesen zudem eine HMGA2-Expression in Mammakarzinomen nach, wobei in erster Linie schlecht differenzierte Karzinome das Gen exprimieren. Eine HMGA1-Expression wurde in primären Mammakarzinomen bisher noch nicht untersucht. Die HMGA1-Proteinmenge in den Tumorzellen korreliert häufig positiv mit einer schlechten. Differenzierung. und/oder. erhöhtem. Metastasierungspotential. von.

(10) Einleitung. 3. Karzinomen (Tamimi et al., 1993; Fedele et al., 1996; Bandiera et al., 1998; Chiappetta et al., 1998; Abe et al., 1999; Abe et al., 2000). Aus diesem Grund wird eine erhöhte HMGA1-Expression als diagnostischer Marker für eine neoplastische Transformation und ein erhöhtes Metastasierungspotential von malignen Tumoren diskutiert (Bussemakers et al., 1991; Tamimi et al., 1993; Bandiera et al., 1998; Chiappetta et al., 1998; Abe et al., 1999). Im Hinblick auf das onkogene Potential des HMGA1-Proteins konnte in vivo gezeigt werden, daß eine erhöhte HMGA1Expression in verschiedenen Zellinien zu deren neoplastischer Transformation führt. Desweiteren können Zellinien, in denen eine erhöhte HMGA1-Expression induziert wurde, Tumoren in Mäusen ausbilden (Wood et al., 2000; Reeves et al., 2001). Berlingieri et al. (2002) haben zudem gezeigt, daß die Expression von HMGA1 bei Schilddrüsenzellen eine Voraussetzung für eine maligne Transformation ist. Zusammenfassend läßt sich feststellen, daß die HMGA-Proteine eine wichtige Rolle bei pathologischen Prozessen wie neoplastischer Transformation, Progression und Metastasierung von Tumoren spielen (Reeves und Beckerbauer, 2001). Eine Reaktivierung der Expression läßt sich sowohl in benignen mesenchymalen als auch malignen. Tumoren. feststellen.. Die. Ursachen. für. die. Reaktivierung. der. Genexpression der HMGA-Gene und die Rolle, welche sie in benignen bzw. malignen Tumoren spielen, sind jedoch grundsätzlich unterschiedlich. Eine andere HMG-Proteinfamilie ist die HMGB-Familie, zu der die drei Proteine HMGB1, HMGB2 und HMGB3 gehören. Die HMGB-Proteine bestehen aus zwei homologen DNA-bindenden Domänen (A- und B-Box) und einer sauren C-terminalen Domäne (Reeck et al., 1982). Das HMGB1 ist das am besten untersuchte Protein dieser Familie. Expressionsanalysen des HMGB1 bei Mäusen haben gezeigt, daß es vermutlich. ähnlich. wie. die. HMGA-Gene. stark. während. der. frühen. Embryonalentwicklung exprimiert wird. Während der weiteren Differenzierung ist die Expression abhängig vom Gewebetyp und Entwicklungsstadium (Pauken et al., 1994; Guazzi et al., 2003). Das HMGB1-Protein besteht aus 215 Aminosäuren und bindet Sequenz-unspezifisch an die kleine Furche doppelsträngiger DNA und verursacht eine lokale Krümmung der Doppelhelix. HMGB1 bindet zudem mit hoher Affinität an spezifische DNA-Strukturen wie z.B. „four-way junctions" oder DNACisplatin-Komplexe (Pil und Lippard, 1992; Webb und Thomas, 1999)..

(11) Einleitung. 4. Das HMGB1-Gen ist in der chromosomalen Bande 13q12 lokalisiert (Ferrari et al., 1996). Für dieses Gen konnten zunächst fünf Retropseudogene identifiziert und molekular charakterisiert werden (Stros und Dixon, 1993; Rogalla et al., 1998a). Strichmann-Almashanu et al. (2003) haben durch vergleichende Sequenzanalysen der HMGB1-mRNA sogar 57 HMGB1-ähnliche Sequenzen im menschlichen Genom gefunden. Für Gene der HMGB-Familie konnte bisher nicht nachgewiesen werden, daß sie wie die HMGA-Gene von wiederkehrenden chromosomalen Veränderungen in Tumoren betroffen sind. Kazmierczak et al. (1999) konnten z.B. zeigen, daß Chromosomenveränderungen in der Bande 13q12 bei Lipomen nicht zu Brüchen innerhalb und in naher Umgebung des HMGB1-Gens führen. Das HMGB1-Protein kann grundsätzlich zwei unterschiedliche Funktionen in der Zelle übernehmen, weswegen man auch von einem „Doppelleben” dieses Proteins spricht (Müller et al., 2001). Zum einen hat es mit Lokalisation im Zellkern die Funktion eines architektonischen Transkriptionsfaktors, und zum anderen kann HMGB1 extrazellulär als Ligand an RAGE (receptor for advanced glycation end products) binden (Hori et al., 1995). RAGE ist ein Transmembranrezeptor der Immunglobulinfamilie, an den u.a. die sogenannten advanced glycation end products (AGE) binden können (Neeper et al., 1992). Es gibt noch eine verkürzte lösliche Form von RAGE, die als sRAGE bezeichnet wird (Schmidt et al., 1994). In seiner Funktion als architektonischer Transkriptionsfaktor kann HMGB1 durch Biegen der DNA die Bindung verschiedener Transkriptionsfaktoren beeinflussen und dabei deren Bindungsaffinität entweder herauf- oder herabsetzen: HMGB1 kann die Transkription von Klasse II-Genen durch die RNA-Polymerase II um mehr als das 30fache inhibieren, indem es mit dem TATA-binding protein (TBP) einen Komplex bildet (Ge und Roeder, 1994). Zappavigna et al. (1996) konnten zeigen, daß HMGB1 die Bindung des Transkriptionsfaktors HOXD9 an DNA-Zielsequenzen erhöht und somit Einfluß auf die dadurch vermittelte Genexpression hat. Desweiteren kann HMGB1 die Bindung von Steroidhormon-Rezeptor-Komplexen an ihre DNA-Zielsequenzen (hormon responsive elements (HRE)) in erheblichem Maße verstärken (Onate et al., 1994; Verrier et al., 1997; Romine et al., 1998; Boonyaratanakornkit et al., 1998), womit HMGB1 einen starken Einfluß auf die durch Steroidhormone vermittelte Genexpression hat. Interessanterweise kann die HMGB1-Expression in MCF-7Mammakarzinomzellen wiederum durch Östrogen verstärkt werden, so daß HMGB1 selbst ein Östrogen-abhängiges Gen ist (Chau et al., 1998). Wie wichtig die Rolle.

(12) Einleitung. 5. des HMGB1 bei der Genregulation ist, konnten Calogero et al. (1999) mit einer HMGB1-Knockout-Maus zeigen, welche kurz nach der Geburt aufgrund einer unzureichenden Transkription des Glucocorticoid-Rezeptors an Hypoglykämie stirbt. In seiner Funktion als extrazellulärer Ligand von RAGE wird HMGB1 synonym auch als Amphoterin bezeichnet. HMGB1 kann von bestimmten Zellen wie z.B. stimulierten Monozyten und Makrophagen sezerniert werden und von nekrotischen oder beschädigten Zellen passiv abgegeben werden (Wang et al., 1999; Degryse et al., 2001). Extrazelluläres HMGB1 löst Entzündungsprozesse aus, stimuliert die Zellbewegung glatter Muskelzellen und hat bei Entwicklungsprozessen im Gehirn eine wichtige Funktion beim Auswachsen von Neuriten (Hori et al., 1995; Wang et al., 1999; Andersson et al., 2000; Abraham et al., 2000; Degryse et al., 2001). Es konnte zudem gezeigt werden, daß eine Bindung von HMGB1 an RAGE u.a. die MAP-Signalkaskaden p38MAPK, JNK und p42/p44MAPK in der Zelle aktivieren kann (Taguchi et al., 2000). Diese Signalkaskaden spielen bei der Wachstumsregulierung, Beweglichkeit und invasivem Wachstum von Zellen eine Rolle. In diesem Zusammenhang konnte gezeigt werden, daß eine Blockierung der Wechselwirkung von HMGB1 und RAGE das Wachstum, die Beweglichkeit, lokales invasives Wachstum und Metastasierung von Ratten-Gliomzellen in erheblichem Maße einschränkt (Taguchi et al., 2000). Huttunen et al. (2002) fanden zudem heraus, daß eine Blockierung dieser Wechselwirkung auch in einem in vivo-Modell die Metastasierung von Melanomzellen verhindert. Das Mammakarzinom ist bei Frauen in der westlichen Hemisphäre die häufigste Krebserkrankung und nach dem Lungenkarzinom die zweithäufigste Todesursache durch Krebserkrankungen (Jemal et al., 2003). In Deutschland liegt das Risiko einer Frau, im Laufe ihres Lebens an einem Mammakarzinom zu erkranken, bei etwa 1 : 9 und 1995 sind fast 19 000 Frauen daran gestorben (Angaben des Statistischen Bundesamtes).. Aus. diesen. Gründen. kann. das. Mammakarzinom. als. der. epidemiologisch bedeutendste maligne gynäkologische Tumor angesehen werden. Das HER-2-Gen gehört zu den wichtigsten Onkogenen beim Mammakarzinom und kodiert für den „human epidermal growth factor receptor 2”, eine transmembrane Rezeptor-Tyrosin-Kinase. Das HER-2-Gen liegt in ca. 30% aller Mammakarzinome amplifiziert vor, und eine HER-2-Überexpression korreliert mit einer schlechten Prognose für die Brustkrebspatientinnen (Slamon et al., 1987). Auf dieser Erkenntnis.

(13) Einleitung. 6. basierend wurde ein monoklonaler Antikörper (Trastuzumab) gegen HER-2 entwickelt. Trastuzumab wird bei Mammakarzinomen mit HER-2-Überexpression in der Klinik mit therapeutischem Erfolg eingesetzt. Trotzdem bedarf es weiterer kausaler. Therapieansätze. beim. Mammakarzinom,. zumal. nicht. alle. Gene. mit. Mammakarzinome für eine Therapie mit Trastuzumab in Frage kommen. Somit. sind. beim. Mammakarzinom. Untersuchungen. weiterer. prognostischem oder therapeutischem Potential von großer Bedeutung. Aus diesem Grund wurde in der vorliegenden Promotionsarbeit ein Schwerpunkt auf molekulare Studien zur Expression und Funktion der architektonischen Transkriptionsfaktoren HMGA1. und. HMGB1. in. menschlichen. Mammakarzinomen. gelegt.. Das. Expressionsmuster des HMGA1-Proteins wurde mit Hilfe der Immunhistochemie an Gewebeschnitten primärer Mammakarzinome und mit der Northern Blot-Analyse untersucht (Flohr et al., 2003a). Als Positivkontrolle der HMGA1-Immunhistochemie wurde das Zottenepithel menschlicher Plazenta gewählt. Die Immunhistochemie der Plazenta lieferte jedoch erste interessante Ergebnisse, so daß das HMGA1Expressionsmuster in diesem Gewebe genauer untersucht wurde (Bamberger et al., 2003). Desweiteren wurden Untersuchungen zur differentiellen Genexpression durch erhöhte HMGA1-Konzentrationen in Mammakarzinomzellen durchgeführt. Mit Hilfe der Hybridisierung von cDNA-Arrays kann untersucht werden, welche Zielgene durch eine erhöhte Konzentration an HMGA1-Protein in Mammakarzinomzellen hochoder herunter reguliert werden. Neben der HMGA1-Expression wurde in dieser Arbeit die HMGB1-Genexpression mit Hilfe der Northern Blot-Analyse in 13 primären Mammakarzinomen untersucht (Flohr et al., 2001). Desweiterten wurde die HMGB1-Expression in verschiedenen Geweben beim Menschen und beim Hund untersucht (Rogalla et al., 2000; Murua Escobar et al., 2003, Meyer et al., im Druck). Da es bekannt war, daß im menschlichen Genom besonders viele HMGB1-ähnliche Sequenzen existieren, war es im Hinblick auf Expressionsanalysen des HMGB1 erforderlich zu untersuchen, ob einige dieser Sequenzen transkribiert werden (Rogalla et al., 2000). In dieser Arbeit wurden ausgehend von den Expressionsanalysen der HMG-Gene und -Proteine auch methodische Aspekte berücksichtigt. Die Reverse-TranskriptionPCR (RT-PCR)-Analyse von Genen wie dem HMGA1 und HMGB1, für die Retropseudogene beschrieben wurden, kann aufgrund einer DNA-Kontamination in der cDNA-Präparation zu unspezifischen Amplifikationen führen. Deshalb wurde in.

(14) Einleitung. 7. dieser Arbeit eine neue methodische Variante der DNase I-Behandlung von cDNAErststrangpräparationen etabliert, die eine spezifische RT-PCR-Analyse garantiert (Flohr et al., 2003b). Ein weiterer methodischer Aspekt dieser Arbeit stellt die GenExpressionsanalyse von fixierten Gewebeproben dar. Es konnte gezeigt werden, daß RNA aus Mammakarzinomen, die mit der neuartigen Fixierungstechnik HOPE (Hepes-Glutamic acid buffer mediated Organic solvent Protection Effect) fixiert wurden, sowohl für Northern Blot- als auch Microarray-Analysen eingesetzt werden kann (Goldmann, Flohr et al., zur Veröffentlichung angenommen)..

(15) Material und Methoden. 8. 2. Material und Methoden 2.1. Gewebeproben. Es wurden zur RNA-Isolierung 13 primäre Mammakarzinomproben und diverse Gewebeproben von Normalgewebe ca. 15-20 min nach der Operation in flüssigem Stickstoff eingefroren. Diese Arbeiten wurden in Zusammenarbeit mit der Frauenklinik und dem Institut für Pathologie des ZKH St.-Jürgen-Str. in Bremen durchgeführt. Für die immunhistochemischen Analysen des HMGA1-Proteins wurden 170 in Paraffin eingebettete Mammakarzinom-Proben untersucht, von denen 51 normale 5 µm dicke Gewebeschnitte waren (Archivmaterial aus der Pathologie des ZKH Bremen-Nord) und 119 auf einen Tumorgewebe-Array (Archivmaterial aus dem Gerhard-Domagk-Institut, Münster) aufgebracht wurden. Die sieben HOPE-fixierten Mammakarzinom-Proben für die Studie von Goldmann et al. (zur Veröffentlichung angenommen) stammen aus dem Forschungszentrum Borstel und die vier Proben für RT-PCR-Analysen aus dem ZKH St.-Jürgen-Str.. 2.2.. Zellinien und Zellkultur. Die Zellinie MCF-7 wurde bei der DSMZ gekauft und ursprünglich aus einem menschlichen Adenokarzinom der weiblichen Brust etabliert (DSMZ, Nr. DSM ACC 115). Diese Mammakarzinomzellinie ist Östrogenrezeptor-positiv und besitzt noch viele der biochemischen und phänotypischen Merkmale normaler Brustepithelzellen (Levenson und Jordan, 1997). MCF-7-Zellen wurden mit dem Medium RPMI 1640 (Life Technologies, Paisley, England) mit 10% fötalem Kälberserum (FKS) kultiviert, für die HMGA1-ArrayExperimente wurde nur 5% FKS verwendet. Die Fibroblasten-Zellkulturen von verschiedenen Primatenspezies wurden in Chang-Medium (Laboserv, Staufenberg) mit 10% FKS kultiviert. Ein Mediumwechsel der Zellkulturen erfolgte alle drei bis vier Tage und alle drei bis sieben Tage wurden die Kulturen trypsiniert und passagiert. 2.3. DNA-Isolierung. Zur Isolierung von DNA wurden Zellinien trypsiniert, drei mal mit PBS (0,068 M NaCl, 0,058 M Na2HPO4, 0,017 M NaH2PO4, pH 7,5) gewaschen und pelletiert. Die DNAIsolierung erfolgte mit Hilfe der Salz-Methode nach Miller et al. (1988) mit den.

(16) Material und Methoden. 9. folgenden Modifikationen: Die Zellen wurden in Lysis-Puffer (10 mM Tris, 400 mM NaCl, 2 mM EDTA, pH 8.2), 1% SDS und 200-2000 µg/ml Proteinase K über Nacht bei 37 bis 50°C lysiert. Das Lysat wurde mit ¼ Volumen gesättigter NaCl-Lösung durch Schütteln für 30 s extrahiert und 15 min bei 1700 bis 2500 x g zentrifugiert. Nach Ethanol- oder Isopropanol-Fällung erfolgte das Lösen der DNA in entmineralisiertem Wasser oder 10 mM Tris (pH 7,5). 2.4. PCR. PCRs wurden standardmäßig mit 50-100 ng genomischer DNA, 0,5 U TaqPolymerase (Invitrogen, Groningen, die Niederlande), 200 µM der vier dNTPs, 1,5 mM MgCl2, 500 nM pro Oligonukleotid in einem Volumen von 20 µl angesetzt. PCRs wurde in einem Thermocycler (Biometra T-Gradient, Whatman Biometra, Göttingen) mit folgendem Programm durchgeführt: Denaturierung für 5 min bei 94°C, 35 Zyklen: 1 min 94°C, 1 min bei der den Oligonukleotiden entsprechenden Annealingtemperatur, 1 min 72°C und abschließend 10 min bei 72°C. 2.5 PCR-. Gelelektrophorese und. RT-PCR-Produkte. wurden. standardmäßig. in. einer. Agarose-. Gelelektrophorese (1,5% w/v) in TAE-Puffer (0,04 M Tris-Base, 0,04 M Essigsäure, 1 mM EDTA, pH 8,0) bei 80-120 V für 1 - 2,5 h getrennt. Anschließend wurden die Gele in einer Ethidiumbromidlösung (ca. 1 µg/ml) für 15-20 min gefärbt und mit einer Polaroidkamera photographiert. 2.6. Klonierung und Sequenzierung von DNA-Sequenzen. PCR- und RT-PCR-Produkte wurden aus Agarose-Gelen in Form von Gelstücken ausgeschnitten und mit Hilfe des QIAEX II-Kits (Qiagen, Hilden) gereinigt. Die Ligation der PCR-Produkte erfolgte mit Hilfe des Klonierungsvektors pGEM-T Easy (Promega, Mannheim). Anschließend wurde eine Thermotransformation des Ligationsansatzes mit Hilfe der kompetenten E.coli-Zellen DH5α (Stratagene, La Jolla,. USA). nach. Herstellerangaben. des. Vektorsystems. durchgeführt.. Zur. Transformation der Bakterien wurde SOB-Medium (2% w/v Bacto-Trypton, 0,5% w/v Hefeextrakt, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4, pH 7,0) und zum Ausplattieren sowie zur Übernachtkultivierung der Bakterien LB-Medium (1% w/v NaCl, 1% w/v Bacto-Trypton, 0,5% w/v Hefe-Extrakt, pH 7,0) eingesetzt. Die.

(17) Material und Methoden. 10. Isolierung der Plasmid-DNA aus 10 ml-LB-Übernachtkulturen erfolgte mit Hilfe des QIAprep. Plasmid-DNA. Sequenzierungen. Miniprep-Kits. wurden. in. (Qiagen). Auftrag. nach. gegeben. Herstellerangaben.. und. mit. einem. Die DNA-. Sequenzierautomaten (ABI 377, PE-Applied Biosystems) durchgeführt. Die DNASequenzen wurden mit Hilfe von Programmen des Softwarepaketes „Lasergene” (DNASTAR, Madison, USA) ausgewertet. 2.7. RNA-Isolierung. 2.7.1 RNA-Isolierung mit Hilfe des TRIzol-Reagenz RNA wurde aus Zellinien und Tumorgewebe u.a. mit Hilfe des TRIzol-Reagenz (Invitrogen) weitgehend nach Herstellerangaben isoliert. Für die RNA-Isolierung aus Zellkulturen wurden die Zellen nach Abnahme des Mediums mit 1 ml TRIzol durch Auf- und Abpipettieren homogenisiert. Zur RNAIsolierung von Tumorgewebe wurde dieses mit ca. 0,2 ml TRIzol-Reagenz versehen und sofort mit einem Skalpell in möglichst kleine Stücke geschnitten. Die anschließende Prozedur ist für die RNA-Isolierung aus Zellkultur und Tumorgewebe gleich: Zur Phasen-Trennung erfolgte eine Inkubation für 5 min bei RT. Es wurden pro RNA-Isolierung 0,2 ml Chloroform in das ERG gegeben. Die ERG wurden für 15 s mit der Hand geschüttelt und für 2-3 min bei RT inkubiert. Es erfolgte eine Zentrifugation bei 12.000 x g für 15 min bei 4°C. Zur RNA-Präzipitation wurde die wässrige obere Phase in ein neues 1,5 ml ERG überführt und mit 0,5 ml absolutem Isopropanol versehen. Die ERG wurden 10 Mal invertiert und für 10 min bei RT inkubiert. Zur Pelletierung der RNA wurde bei 12.000 x g für 10 min bei 4°C zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das RNA-Pellet zum Waschen mit 1 ml 75% (v/v) EtOH versehen. Die Probe wurde gevortext und bei 7.500 x g für 10 min bei 4°C zentrifugiert. Der Überstand wurde vollständig verworfen und das RNA-Pellet für 10-15 min unter der Sterilbank getrocknet, wobei ein vollständiges Trocknen des Pellets aufgrund schlechterer Löslichkeit der RNA vermieden wurde. Die RNA wurde in 50 µl RNase-freiem Wasser (Promega) gelöst, indem vorsichtig auf- und abpipettiert wurde. Zur vollständigen Lösung wurde die RNA für 10 min bei 55°C im WB inkubiert. Anschließend wurde die isolierte RNA photometrisch quantifiziert. Zur Qualitätsprüfung der RNA wurde eine Agarose-Gelelektrophorese.

(18) Material und Methoden. 11. (1,5 % w/v, TAE-Laufpuffer) durchgeführt, um zu überprüfen, ob die 18S- und 28SrRNA-Banden sichtbar waren. 2.7.2 RNA-Isolierung mit Hilfe des RNeasy Mini-Kits RNA wurde aus Zellkulturen und Gewebe auch mit Hilfe des RNeasy Mini-Kits (Qiagen) nach Herstellerangaben isoliert. Für die RNA-Isolierung aus Zellkulturen wurden die Zellen nach Abnahme des Mediums mit 600 µl Puffer RLT (Qiagen) lysiert und die RNA-Isolierung nach Herstellerangaben durchgeführt (Handbuch „RNeasy Mini”, Ausgabe Juni 2001, Seite 32-35). Für die RNA-Isolierung aus Gewebe wurde dieses zunächst mit dem Homogenisator Ultra-Turax (IKA-Werke, Staufen) in Puffer RLT (Qiagen) zerkleinert. Die weitere RNA-Isolierung erfolgte nach Herstellerangaben (Handbuch „RNeasy Mini”, Ausgabe Juni 2001, Seite 54-55). 2.7.3 RNA-Isolierung aus HOPE-fixiertem Gewebe Pro HOPE-fixierte Mammakarzinomprobe wurden 15 sechs µm dicke, Paraffineingebettete Schnitte vor der RNA-Isolierung entparaffiniert. Hierzu wurden die Schnitte zweimal für fünf min unter Rotation in 1 ml Xylol inkubiert und für 20 min bei 17.000 x g zentrifugiert. Der Xylol- und Paraffin-haltige Überstand wurde verworfen. Zu dem Gewebepellet wurde zweimal 1 ml absoluter EtOH gegeben, fünf min unter Rotation inkubiert und für fünf Minuten bei RT bei 17.000 x g zentrifugiert. Der Ethanol- und Xylol-haltige Überstand wurde verworfen. Nach der Entparaffinierung der Schnitte wurden diese in Puffer RLT (Qiagen) durch Auf- und Abziehen durch eine Kanüle einer sterilen Spritze lysiert. Die RNA-Isolierung erfolgte weiter mit dem RNeasy Mini-Kit. 2.8. cDNA-Erststrangsynthese. cDNA-Erststrangsynthesen. wurden. mit. Hilfe. von. 200. U. M-MLV. Reverse. Transkriptase (Invitrogen), 2 µg gesamt-RNA, 1 µM Oligonukleotid (dT)17, 0,5 mM der vier dNTPs, 0,01 M 1,4-Dithiotreitol und Erststrangpuffer (50 mM Tris-HCl, 75 mM KCl, 3 mM MgCl2, pH 8.3) in einem Volumen von 20 µl durchgeführt. Die enzymatische Reaktion erfolgte für 50 min bei 37°C und wurde durch eine Inkubation von 15 min bei 50°C gestoppt..

(19) Material und Methoden. 2.9. 12. DNase I-Behandlung von cDNA-Präparationen. Um genomische DNA-Kontaminationen von cDNA-Präparationen zu entfernen, wurden 35 µl einer cDNA-Präparation für 2 h bei 37°C mit 10 U DNase I (Roche Diagnostics, Mannheim) in einem geeigneten Puffer (10 mM Tris-HCl, 5 mM MgCl2, pH 7,4) in einem Volumen von 60 µl inkubiert. Dieser Ansatz wurde anschließend von der DNase getrennt, indem er mit dem QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen) nach Herstellerangaben gereinigt wurde. 2.10. Reverse-Transkription-PCR. RT-PCRs wurden standardmäßig mit 2-7 µl cDNA, 0,5 U Taq-Polymerase (Invitrogen), 200 µM der vier dNTPs, 1,5 mM MgCl2, 500 nM pro Oligonukleotid in einem Volumen von 20 µl angesetzt. Die PCR wurde in einem Thermocycler (Biometra T-Gradient) mit folgendem Programm durchgeführt: 5 min bei 94°C, 35 Zyklen: 1 min 94°C, 1 min bei der den Oligonukleotiden entsprechenden Annealingtemperatur, 1 min bei 72°C und abschließend 10 min bei 72°C. Für sensitivere Expressionsanalysen wurde die RT-PCR alternativ mit 0,5 U Qiagen Taq DNA-Polymerase in einem sonst entsprechenden Ansatz durchgeführt. 2.11. RNA-Gelelektrophorese und Northern Blotting. Eine RNA-Gelelekrophorese erfolgte standardmäßig zur Qualitätskontrolle isolierter RNA-Proben und für die Northern Blot-Analyse. Für die Northern Blot-Analyse wurden 20-40 µg gesamt-RNA in einem denaturierenden Agarosegel (1,2% w/v, 0,67% v/v Formaldehydlösung (37%)) in MOPS-Puffer (20mM MOPS, 5mM NaAc und 1mM EDTA, pH 8,0) bei 80 V für 2,5 bis 3h getrennt. Anschließend erfolgte eine Inkubation des Gels bei RT für 20 min in Denaturierungslösung (50 mM NaOH), zwei mal für 15 min in Neutralisierungslösung (1,8 M NaCl, 0,5 M Tris-HCL, pH 7,5) und zwei mal für 15 min in 10 x SSC (1,5 M NaCl, 0,15 M NaCitrat, pH 7,0). Das Northern Blotting erfolgte über Nacht mit Hilfe des Kapillarblots auf Hybond N+ positiv geladene. Nylonmembran. (Amersham. Pharmacia. Biotech,. Buckinghamshire,. England). Die RNA wurde mit Hilfe des Crosslinking unter UV-Licht (0,4 J/cm2) kovalent an die Nylonmembran gebunden. Die quantitative Auswertung der Northern Blot-Analyse. des. HMGB1-. und. GAPDH-Gens. erfolgte. mit. Hilfe. Computerprogramms „ImageQuant“ (Molecular Dynamics, Sunnyvale, USA).. des.

(20) Material und Methoden. 2.12. 13. Herstellung von cDNA-Sonden. cDNA-Sonden für die Northern Blot-Hybridisierung wurden mit Hilfe der RT-PCR an geeigneten cDNAs hergestellt. Nach Trennung der RT-PCR-Fragmente in einer Agarose-Gelelektrophorese wurden diese aus dem Gel ausgeschnitten und mittels QIAEX II-Kit (Qiagen) gereinigt. Anschließend erfolgte ein zweiter Reinigungsschritt mit. dem. QIAquick. PCR. Purification. Kit. (Qiagen).. Nach. photometrischer. Quantifizierung und Gel-elektrophoretischer Charakterisierung wurden die cDNASonden für die radioaktive Markierung eingesetzt. 2.12.1 GAPDH-spezifische Sonde (445 bp) Für die Herstellung einer GAPDH-spezifischen Sonde wurden MCF-7 cDNA und die Oligonukleotide GAPDH2.up (5´-GTG AAG GTC GGA GTC AAC G-3´) und GAPDH5.do (5´-AGG AGG CAT TGC TGA TGA T-3´) eingesetzt. 2.12.2 HMGB1-spezifische Sonde (659 bp) Für die Herstellung einer HMGB1-spezifischen Sonde wurden MCF-7 cDNA und die Oligonukleotide ORF.up (5´-AAT AAC TAA ACA TGG GCA AAG GA-3´) und ORF.do (5´-TTA TTC ATC ATC ATC ATC TTC TTC TT -3´) verwendet. 2.12.3 HMGA1-spezifische Sonde (1190 bp) Eine HMGA1-spezifische Sonde wurde in einer Semi-Nested-RT-PCR hergestellt. In der ersten PCR wurde Testis-cDNA und die Oligonukleotide HMGIYUTRup (5’-TCC ACC TGC TCC TTA GAG-3’) und HMGYlo5 (5’-GGA GGC AAT GAG GAT GAA CA3’) sowie für die Semi-Nested RT-PCR die Oligonukleotide HMGIYUTRup und HMGYdo4 (5’-GTT ATT GGT GCC CCA TCT GA-3’) verwendet. 2.13. Radioaktive cDNA-Sondenmarkierung und Hybridisierung von Northern Blots. cDNA-Sonden wurden für die Hybridisierung von Northern Blots mit dem Radionuklid [α-32P]dCTP mit Hilfe des Megaprime DNA labelling system (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, England) nach Herstellerangaben markiert. Nach einer fünfminütigen Prähybridisierung bei 68°C wurde die Hybridisierung für 2,5 h bei 68°C mit der PerfectHyb Plus-Hybridisierungslösung (Sigma, Saint Louis, USA) durchgeführt. Die Membranen wurden anschließend zweimal für fünf min bei RT mit einem Waschpuffer (2 x SSC, 0,1% SDS) und zweimal für 20 min bei 68°C mit einem stringenten Waschpuffer (0.5 x SSC, 0.1% SDS) gewaschen. Das Ergebnis der Northern Blot-Hybridisierung wurde mit Hilfe des STORM-Imagers (Molecular Dynamics) ausgewertet..

(21) Material und Methoden. 2.14. 14. Fluoreszenzmarkierung des HMGA1b-Proteins. Rekombinant hergestelltes HMGA1b-Protein wurde für die Experimente dieser Arbeit freundlicher Weise von Dr. Ralf Schwanbeck (3. Zoologisches Institut für Entwicklungsbiologie der Universität Göttingen) zur Verfügung gestellt. Das rekombinant hergestellte HMGA1b-Protein besitzt dieselbe Aminosäuresequenz wie das native Protein. HMGA1b-Protein wurde mit Hilfe des Fluorescein Labeling Kits (Roche Diagnostics) mit dem Fluoreszenzfarbstoff „Fluos" nach Herstellerangaben markiert. 2.15. Nachweis des Kerntransports von HMGA1b in MCF-7-Zellen. Um nachzuweisen ob MCF-7-Zellen HMGA1b-Protein aus dem Medium aufnehmen und in den Zellkern transportieren können, wurden diese Zellen in zwei Ansätzen mit RPMI-Medium (10% FKS) in sogenannten Leighton-Tubes kultiviert. Damit die MCF-7-Zellen das Protein in das Zytoplasma aufnehmen können, wurden die Zellen bei diesem Versuch mit Streptolysin O (Sigma) behandelt, das die Plasmamembran zur Aufnahme größerer Moleküle permeabilisiert. Zum Nachweis wurden die Zellen mit einer Lösung aus 350 µl Streptolysin O (0,1 U/ml) und 100 µl Fluoreszenzmarkiertem HMGA1b (0,15 µg/µl) für 15 min bei RT im Dunkeln behandelt. In einer Negativkontrolle wurden die Zellen mit einer Lösung aus 350 µl Streptolysin O (0,1 U/ml) und drei µl „Fluos" (2 µg/µl) für 15 min bei RT im Dunkeln behandelt. Anschließend wurde zu beiden Ansätzen je 1 ml eiskaltes RPMI-Medium gegeben. Beide Ansätze wurden für 1,5 h bei 37°C und 5% CO2 im Brutschrank inkubiert. Die Auswertung erfolgte mit Hilfe eines Axioplan Fluoreszenzmikroskops (Zeiss, Göttingen). 2.16. Behandlung der Zellinie MCF-7 mit HMGA1b-Potein. Die Mammakarzinom-Zellinie MCF-7 exprimiert nur geringe Mengen an HMGA1Proteinen (Reeves et al., 2001) und ist deshalb für das im folgenden beschriebene Experiment geeignet. Zur Untersuchung des Einflusses erhöhter Konzentrationen von HMGA1b-Protein auf das Genexpressionsmuster von MCF-7-Zellen wurden zwei Versuche durchgeführt, in denen MCF-7-Zellen unterschiedlichen HMGA1bKonzentrationen im Medium (0,5 µg/ml bzw. 1 µg/ml HMGA1b) ausgesetzt wurden. Beide Versuche unterschieden sich im Ablauf nur durch eine andere HMGA1bProteinkonzentration. Damit die MCF-7-Zellen das Protein in das Zytoplasma.

(22) Material und Methoden. 15. aufnehmen können, wurden die Zellen bei diesen Versuchen wieder mit Streptolysin O (Sigma) behandelt. Zur Versuchsdurchführung wurde das Medium von drei zu ¾ vollgewachsenen MCF7-Zellkulturflaschen, die in RPMI mit 5% FKS kultiviert wurden, abgenommen und die Zellrasen drei mal mit 1x PBS (0,068 M NaCl, 0,058 M Na2HPO4, 0,017 M NaH2PO4, pH 7,5) gewaschen. Anschließend wurden die Zellkulturen mit folgenden Lösungen beschickt: a) Ansatz mit HMGA1b-Protein (HMGA1b-Konzentration im Medium: 0,5 µg/ml bzw. 1µg/ml): 2250 µl SLO in 1x PBS (0,1 U/ml) + 250 µl HMGA1b-Lösung in H2O (10µg/ml) b) Ansatz mit SLO (Negativkontrolle): 2250 µl SLO in 1x PBS (0,1 U/ml) + 250 µl H2O c) Ansatz mit PBS: 2250 µl 1x PBS Es erfolgte eine Inkubation dieser Lösungen auf die Zellen für 15 min bei RT im Dunkeln. Anschließend wurden jeweils drei ml Medium RPMI (5% FKS) zu den Zellen gegeben, um die Permeabilität der Plasmamembran wieder aufzuheben. Darauf erfolgte eine Inkubation der Kulturen im Brutschrank für zwei h bei 37˚C und 5% CO2. Das Medium wurde von den Zellen abgenommen und durch fünf ml Medium RPMI (5% FKS) ersetzt. Nach genau 24 h wurde die gesamt-RNA aus den MCF-7 Zellen aller Ansätze mit Hilfe des RNeasy Mini-Kits (Qiagen) isoliert. 2.17. Durchführung von Array-Hybridisierungen. Es wurden zwei Hybridisierungsdurchgänge des „Atlas Human Oncogene/TumorSuppressor-Array” (Clontech, Palo Alto, USA) mit Hilfe des dazugehörenden Kits durchgeführt, um eine differentielle Genexpression von MCF-7-Zellen, die mit HMGA1b-Protein behandelt wurden, festzustellen. Die RNAs aus den mit HMGA1bProtein und SLO (Negativkontrolle) behandelten MCF-7-Zellen wurden unter Einbau von 35 µCi des Radionuklids [α-32P]dATP nach Herstellerangaben in cDNA umgeschrieben (Atlas cDNA Expression Arrays User Manual, Clontech). Die Hybridisierung von zwei Oncogene/Tumor-Suppressor-Arrays mit je einer der radioaktiv markierten cDNA-Präparationen erfolgte nach Herstellerangaben mit der ExpressHyb-Hybridisierungslösung (Clontech) bei 68°C über Nacht. Die Ergebnisse der Hybridisierung wurden mit einem STORM-Imager (Molecular Dynamics) dokumentiert.. Die. Ergebnisse. der. Hybridisierungen. wurden. mit. Hilfe. des.

(23) Material und Methoden. 16. Computerprogramms „AtlasImage 1.5” (Clontech) ausgewertet. Es wurden nur Gene als signifikant hoch- bzw. herunterreguliert bewertet, wenn diese mindestens 4-fach war (Reeves et al., 2001). 2.18. Immunhistochemie. Für. die. immunhistochemische. Mammakarzinomen eingebetteten. wurden. Materials. 5. (51. Untersuchung µm. dicke. Karzinome). des. HMGA1-Proteins. Gewebeschnitte. des. in. in. Paraffin. und ein Tumorgewebe-Array. (119. Karzinome) verwendet. Für die Immunhistochemie wurde ein polyklonaler Antikörper aus dem Kaninchen in der Verdünnung 1:10 verwendet (sc-8982, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, USA), der sowohl das menschliche HMGA1a- als auch das HMGA1b-Protein detektiert. Die immunhistochemischen Färbungen wurden mit dem automatisierten System „NexES IHC“ (Ventana Medical Systems, Straßburg, Frankreich) durchgeführt. Bei diesem Detektionssystem wird der gebundene primäre AK von einem zweiten biotinierten Anti-Kaninchen-IgG erkannt. An den zweiten AK bindet. wiederum. ein. Streptavidin-Meerrettichperoxidase-Komplex.. Zur. enzymatischen Detektion der Immunoreaktion wurde ein AEC (3-Amino-9ethylcarbazol)-Detektions-Kit. (Ventana. Medical. Systems). verwendet.. Gewebeschnitte von menschlicher Plazenta, von der bekannt ist, daß sie HMGA1 im Trophoblasten. exprimiert,. wurden. als. Positivkontrolle. eingesetzt.. Eine. Negativkontrolle, bei der Phosphatpuffer anstelle von primärem AK eingesetzt wurde, diente zum Ausschluß einer Immunoreaktion von endogenem Biotin und Peroxidase. Die Immunhistochemie wurde nach dem immunhistochemischen Score (IRS) nach Remmele und Stegner (1987) anhand der Farbintensität und des prozentualen Anteils positiver Zellkerne im Tumorepithel ausgewertet. Die Ergebnisse der immunhistochemischen Färbungen wurden mit einer digitalen Kamera (AxioCam, Zeiss) dokumentiert. 2.19. Statistische Auswertung. Für. die. in. dieser. Arbeit. durchgeführte. Korrelations-Analyse. zwischen. Differenzierungsgrad von Mammakarzinomen und HMGA1-Expressionsstärke wurde der Rang-Korrelationskoeffizient nach Spearman verwendet (Sachs, 1992)..

(24) Ergebnisse. 17. 3. Ergebnisse 3.1. Untersuchungen zur Expression der HMGA-Gene und -Proteine. 3.1.1 Expression des HMGA1-Proteins in Mammakarzinomen (Flohr et al., 2003a) Die HMGA-Proteine spielen als architektonische Transkriptionsfaktoren eine wichtige Rolle bei der Entwicklung und/oder Progression von verschiedenen benignen und malignen Tumoren. Es war jedoch noch nicht bekannt, ob HMGA1-Protein in primären Mammakarzinomen exprimiert wird. Daher wurde die HMGA1-Expression in 170 primären Mammakarzinomen mit Hilfe der Immunhistochemie untersucht. Als wichtigstes Ergebnis ergab sich eine unterschiedlich starke HMGA1-Expression der untersuchten. Karzinomen.. Mit. Hilfe. einer. immunhistochemischen. Auswertungsmethode (immunoreactive score (IRS)) wurden 14,1% (24) der Karzinome mit einem IRS 8-12 bewertet (starke HMGA1-Expression), 24,7% (42) mit einem IRS 4-6 (moderate Expression), 25,3% (43) mit einem IRS 1-3 (schwache Expression) und 35,9% (61) zeigten keine HMGA1-Expression. Eine HMGA1Expression. konnte. in. allen. untersuchten. histologischen. Gruppen. von. Mammakarzinomen außer in invasiv papillären und kribriformen Karzinomen nachgewiesen werden. Eine statistische Analyse der Daten ergab eine deutlich signifikant positive Korrelation zwischen Differenzierungsgrad der Karzinome und HMGA1-Expressionsstärke sowie eine deutlich negative Korrelation zwischen HMGA1-Expression und ER-Expression (rs=0,3516, p<0,0001; rs = -0,2974, p=0,0002). Aus diesem Grund kann die Intensität der HMGA1-Expression als prognostischer Marker beim Mammakarzinom diskutiert werden. 3.1.2 Expression des HMGA1-Gens in Mammakarzinomen (nicht veröffentlicht) Es wurde an neun primären invasiven Mammakarzinomproben, die nicht in der Studie von Flohr et al. (2003a) untersucht wurden, eine Northern Blot-Analyse mit einer HMGA1-spezifischen Sonde durchgeführt, um die HMGA1-Expression in Mammakarzinomen mit einer anderen Methode als der Immunhistochemie zu zeigen. Es konnte in allen neun Mammakarzinomen (sechs mit Differenzierungsgrad.

(25) Ergebnisse. 18. 2 und drei mit Differenzierungsgrad 3) ein ca. 1,4 kb HMGA1-spezifisches Transkript nachgewiesen werden. 3.1.3 Differentielle Genregulation durch erhöhte HMGA1b-Konzentrationen in MCF-7-Zellen (nicht veröffentlicht) Es konnte mit Hilfe von Fluoreszenz-markiertem HMGA1b-Protein gezeigt werden, daß MCF-7-Zellen dieses unter SLO-Einwirkung aus dem Medium in das Cytoplasma aufnehmen und anschließend in den Zellkern transportieren. Eine geeignete Negativkontrolle, in der MCF-7-Zellen nur dem Fluoreszenzfarbstoff ausgesetzt waren, zeigte kein Fluoreszenzsignal in den Zellkernen. Somit konnte für die Versuche zur differentiellen Genexpression durch eine erhöhte HMGA1Proteinkonzentration sichergestellt werden, daß das Protein in den Zellkern der MCF-7-Zellen transportiert wird, wo es als architektonischer Transkriptionsfaktor wirken kann. Es wurden zwei Hybridisierungsexperimente des „Atlas Human Oncogene/Tumor Suppressor Array” durchgeführt, um zu ermitteln, welche Zielgene durch eine erhöhte Konzentration an HMGA1b-Protein in MCF-7-Mammakarzinomzellen hochoder herunterreguliert werden. In einem ersten Experiment, in dem MCF-7-Zellen einer HMGA1b-Proteinkonzentration von 0,5 µg/ml ausgesetzt wurden, konnte keine signifikante Änderung der Genexpression (mindestens 4-fache Regulierung) festgestellt werden. In einem zweiten Experiment wurden die MCF-7-Zellen einer HMGA1b-Proteinkonzentration von 1 µg/ml ausgesetzt. Hierdurch ergab sich eine deutliche Hochregulierung des PDGFA (platelet-derived growth factor A)-Gens um den Faktor 7,5 gegenüber MCF-7-Zellen, die nicht mit HMGA1b-Protein behandelt wurden. Alle anderen auf dem „Atlas Human Oncogene/Tumor Suppressor Array” aufgebrachten Gene zeigten keine signifikante Regulierung durch HMGA1b. Interessanterweise konnte im ersten Versuchsansatz bereits eine zweifache Erhöhung der Expression des PDGFA festgestellt werden, die aber aufgrund der gewählten strengen Kriterien als nicht signifikant beurteilt wurde..

(26) Ergebnisse. 19. 3.1.4 Charakterisierung eines neuen Exons im Intron 3 des HMGA2-Gens (Hauke et al., 2002) Chromosomenaberrationen, die das HMGA2-Gen betreffen, wurden in vielen menschlichen Tumoren wie Uterusleiomyomen, Lipomen und Lungenhamartomen charakterisiert. Diese Veränderungen führen zur Entstehung von Fusionsgenen, verstärkter Expression oder aberranter Transkription des HMGA2. Bei einer aberranten Transkription entstehen häufig verkürzte Transkripte des HMGA2 bestehend aus den Exons 1 bis 3, die für die drei DNA-bindenden Domänen kodieren, aber auch ektopische Sequenzen aus dem Bereich des Chromosom 12. Es gibt mehrfache Hinweise dafür, daß sich verkürzte HMGA2-Proteinvarianten (mit allen DNA-bindenden Domänen, aber einer verkürzten sauren C-terminalen Domäne). hinsichtlich. ihrer. biologischen. Eigenschaften. und. Rolle. bei. der. Tumorentstehung deutlich vom normalen Protein mit einer langen C-terminalen Domäne unterscheiden. Es konnten nach vollständiger Sequenzierung des 112 kb langen dritten Introns des HMGA2 mehrere der ektopischen Sequenzen lokalisiert werden,. die. zuvor. als. Fusionsbestandteile. aberranter. HMGA2-Transkripte. beschrieben wurden. Mit Hilfe von Expressionsanalysen konnte gezeigt werden, daß eines dieser möglichen Transkripte zusätzlich zum normalen Transkript sowohl in Tumoren mit 12q14-15-Veränderungen als auch in anderen Tumoren (u.a. in einem Mammakarzinom) und in Normalgewebe exprimiert wird. Dieses Transkript (HMGA2b) besitzt ein alternatives terminales Exon, welches die terminalen Exons 4 und 5 des normalen Transkripts ersetzt. Die Expression des HMGA2b könnte bei der Tumorentstehung eine wichtigere Rolle als das „Wildtyp”-Transkript spielen, weil bei dieser Spleißvariante der für die saure Domäne kodierende Teil fehlt. Diese Ergebnisse zeigen deutlich, daß das HMGA2b-Transkript bei funktionellen Studien des HMGA2 berücksichtigt werden muß..

(27) Ergebnisse. 20. 3.1.5 Expression des HMGA1-Proteins im menschlichen Trophoblasten (Bamberger et al., 2003) Das High-Mobility-Group-Protein A1 spielt u.a. bei der Genregulation, Integration von Retroviren in Chromosomen, neoplastischer Transformation und Metastasierung von Tumorzellen eine Rolle. Der menschliche Trophoblast ist ein fetales Gewebe und besitzt wie neoplastisches Gewebe die Eigenschaft proliferieren und invasiv wachsen zu können, wobei diese Prozesse beim Trophoblasten jedoch strikt reguliert sind. Der Zytotrophoblast stellt die innere Schicht und der Synzytiotrophoblast die Außenschicht des Zottenepithels der Plazenta dar. In der vorliegenden Arbeit wurde die HMGA1-Expression in menschlicher Plazenta mit Hilfe der Immunhistochemie untersucht. Eine HMGA1-Expression konnte in den Zellkernen des ZottenZytotrophoblasten, einem stark prolieferierenden Gewebe, detektiert werden. Im Gegensatz dazu zeigten die meisten Zellkerne des Zotten-Synzytiotrophoblasten, einem differenzierten Gewebe, keine HMGA1-Expression. Interessanterweise war die HMGA1-Expression in Zotten, die an der Implantationsstelle verankert sind, und im intermediären Trophoblasten, der in die mütterliche Decidua einwandert, am stärksten. HMGA1-Protein konnte hier jedoch vorwiegend im Cytoplasma detektiert werden. Die HMGA1-Expression wurde in einer primären Zellkultur isolierter Trophoblasten mittels Western Blot-Analyse bestätigt. Diese Studie zeigt zum ersten Mal eine genaue Expressionsanalyse des HMGA1-Proteins in den verschiedenen Zelltypen der menschlichen Plazenta..

(28) Ergebnisse. 3.2.. 21. Untersuchungen zur Expression des HMGB1-Gens. 3.2.1 Charakterisierung der Spleißvariante SP100-HMG (Rogalla et al., 2000) Retropseudogene sind zumeist DNA-Sequenzen ohne Introns, die eine starke Sequenzübereinstimmung mit der cDNA ihrer aktiven Gene aufweisen. Sie entstehen durch reverse Transkription von mRNA in cDNA und anschließende Integration in das Genom. Man ging bisher davon aus, daß Retropseudogene evolutionärer Balast sind, weil sie aufgrund von Mutationen die Sequenzübereinstimmung zu ihren aktiven Genen verloren haben und somit keine funktionelle Rolle mehr spielen. In der vorliegenden Arbeit wurde ein interessanter Mechanismus beschrieben, wie die Transkription von Retropseudogenen reaktiviert werden kann. Es gibt eine Spleißvariante des SP100-Gens, deren 3’-Teil von einem alternativen Exon stammt, das für eine HMGB1-DNA-Bindungsdomäne kodiert. Es konnte herausgefunden werden, daß die HMG-Box kodierende Sequenz von einem Teil eines HMGB1Retropseudogens stammt. Dieser Spleißmechanismus ist damit zu erklären, daß das Retropseudogen HMG1L3 zunächst in 3’-Position zu SP100 in das Genom integriert wurde. Eine G-A-Transition hat in der Retropseudogensequenz HMG1L3 eine Spleißakzeptorstelle ((T/G)N(C/T)AGG)) entstehen lassen. Somit konnte dieses Retropseudogen als alternatives terminales Exon des SP100-Gens transkribiert werden. Die Expression des resultierenden Fusionstranskriptes SP100-HMG konnte in verschiedenen menschlichen Geweben wie Milz, Thymus-Drüse, Prostata, Testis, Uterus, Dünndarm, Grimmdarm und Leukozyten nachgewiesen werden. Zudem konnte das Fusionstranskript in Fibroblasten der Primatenspezies Pan troglodytes (Schimpanse), Gorilla gorilla, Hylobates lar (Weißhand-Gibbon), jedoch nicht von Macaca mulatta (Bergrhesusaffe) detektiert werden. Mit Hilfe von PCR-Analysen an genomischer DNA konnte der 5'- und 3'-Teil des Retropseudogens HMG1L3 in allen Primatenspezies bis auf Macaca mulatta nachgewiesen werden. Bei Macaca mulatta konnte zwar der 5’-Teil, der zusätzlich eine 300 bp lange Alu-Sequenz aufweist, aber nicht der 3’-Teil von HMG1L3 amplifiziert werden. Anhand dieser Ergebnisse kann man davon ausgehen, daß die zugrunde liegende Retrotransposition vor mehr als 35 Millionen Jahren stattgefunden hat. Die Aktivierung von Retropseudogenen könnte ein grundsätzlicher Mechanismus sein, wie neue Exons in der Evolution entstanden sind. Der hier beschriebene Mechanismus ist eines der ersten Beispiele dafür, daß.

(29) Ergebnisse. 22. ein Retropseudogen Teil eines aktiven Fusionsgens wird, bei dem beide beteiligten Gene gut charakterisiert sind und auf cDNA-Ebene im Leseraster bleiben. 3.2.2 Expression des HMGB1-Gens in Mammakarzinomen (Flohr et al., 2001) Bei Mammakarzinomen korreliert das Ansprechen auf eine endokrine Therapie mit Anti-Östrogenen. nicht. immer. mit. der. Expressionsstärke. der. Steroidhormonrezeptoren (Östrogen- und Progesteronrezeptor). Dies könnte u.a. daran liegen, daß die Bindung des Östrogenrezeptors an die sogenannten „estrogen responsive elements” (ERE) durch andere zelluläre Proteine beeinflußt wird. Das HMGB1-Protein ist z.B. in der Lage, die Bindung des Östrogenrezeptors an die ERE in erheblichem Maße zu verstärken. Daher wurde in dieser Arbeit erstmalig die Expression des HMGB1-Gens in Mammakarzinomen untersucht. Mit Hilfe von Northern Blot-Untersuchungen des HMGB1-Gens konnte in 13 Mammakarzinomen eine stark unterschiedliche Expression der 1,4 kb- und 2,4 kb-Spleißvariante des HMGB1 festgestellt werden. Die HMGB1-Expression variierte um den Faktor 8,5 (1,4 kb-Transkript) bzw. 14,5 (2,4 kb-Transkript). Die unterschiedlich starke Expression des HMGB1 in Mammakarzinomen kann möglicherweise dazu beitragen, daß Östrogenrezeptor-positive Mammakarzinome unterschiedlich gut auf eine endokrine. Therapie. ansprechen.. Die. HMGB1-Expression. kann. bei. Mammakarzinomen deshalb als interessanter klinischer Marker angesehen werden. In der für diese Studie durchgeführten Northern Blot-Analyse konnte in allen 13 Mammakarzinomen neben den zwei HMGB1-spezifischen Transkripten auch das 3,6 kb lange Fusionstranskript SP100-HMG nachgewiesen werden..

(30) Ergebnisse. 23. 3.2.3 Molekulare Charakterisierung des caninen HMGB1 (Murua Escobar et al., 2003) Beim Hund weisen viele Krankheiten eine große Ähnlichkeit zu den entsprechenden Krankheiten beim Menschen auf. Aus diesem Grund ist der Hund ein geeignetes Tiermodell, um die genetischen Ursachen komplexer Krankheiten wie z.B. Krebs und Stoffwechselerkrankungen besser zu verstehen und um Therapieansätze für den Menschen zu testen. Um solche Studien zu ermöglichen, müssen Gene, die beim Menschen für Krankheiten relevant sind, beim Hund charakterisiert werden. Das HMGB1-Protein ist aufgrund seines „Doppellebens” in der Zelle ein in der Krebsforschung interessantes Protein. HMGB1 wirkt im Zellkern als architektonischer Transkriptionsfaktor, kann aber auch von bestimmten Zellen sezerniert werden und als Ligand an den RAGE-Rezeptor binden. Die Bindung von HMGB1 an RAGE kann u.a. die MAP-Signalkaskaden p38MAPK, JNK und p42/p44MAPK in der Zelle aktivieren, so. daß. HMGB1. eine. Rolle. bei. entzünlichen. Prozessen. und. der. Tumormetastasierung spielt. Aus diesem Grund ist HMGB1 ein interessantes Protein für Therapieansätze, bei denen der Hund als Tiermodell eingesetzt werden kann. Daher wurde die genomische Struktur des caninen HMGB1-Gens, die cDNA- und Aminosäuresequenz, die genomische Lokalisation und das Expressionsmuster untersucht. Das canine HMGB1-Gen besteht aus fünf Exons und vier Introns und liegt auf Chromosom 25 (CFA25). Das ORF des caninen HMGB1 weist eine große Sequenzübereinstimmung zum menschlichen ORF auf (95,4%), und das canine HMGB1-Protein (215 AS) ist sogar zu 100% identisch zu dem des Menschen. Mit Hilfe der Northern Blot-Hybridisierung konnten beim Hund die homologe 1,4 kb- und 2,4 kb- Spleißvariante des HMGB1 in der Milz, Herz, Lunge und glatten Muskulatur nachgewiesen werden..

(31) Ergebnisse. 24. 3.2.4 Expression des HMGB1-Gens in Sarkomen des Hundes (Meyer et al., im Druck) Das HMGB1-Protein kann beim Menschen eine Chemotherapie mit den Zytostatika Cisplatin und Carboplatin beeinflussen, indem es die Krebszellen für eine solche Behandlung sensibilisiert. Die verstärkende Wirkung des HMGB1 beruht darauf, daß es an Cisplatin-DNA-Komplexe binden kann, wodurch diese nicht mehr vom DNAReparatursystem der Zelle erkannt werden können. Cisplatin wird sowohl beim Menschen als auch beim Hund für eine adjuvante Therapie bei Osteosarkomen eingesetzt. Deshalb wurde die HMGB1-Expression in fünf caninen Osteosarkomen, einem Fibrosarkom und einem Leiomyosarkom mit Hilfe der Northern Blot-Analyse und einer semiquantitativen RT-PCR untersucht. Es konnte eine sehr unterschiedlich starke HMGB1-Expression in den Sarkomen festgestellt werden, was durch eine semiquantitative RT-PCR bestätigt wurde. Dieses Ergebnis ist ein weiterer Hinweis dafür, daß die Intensität der HMGB1-Expression ein interessanter klinischer Marker ist, der das Ansprechen auf eine Cisplatin- und Carboplatin-Therapie beeinflussen kann. Die in dieser Arbeit etablierte semiquantitative RT-PCR ermöglicht eine schnelle quantitative Bestimmung der HMGB1-Expression bei Sarkomen, so daß diese auch in der Klinik eingesetzt werden kann. 3.3. Untersuchung zur Gewebe-spezifischen Expression des HMGB1-bindenden RAGE-Rezeptors und seiner löslichen Form (Schlueter et al., 2003). Der RAGE-Rezeptor (receptor for advanced glycation end products) spielt bei einer Reihe von pathophysiologischen Prozessen wie entzündlichen Erkrankungen, Erkrankungen. des. Immunsystems,. der. Alzheimer-Krankheit,. Tumoren. und. Komplikationen bei Diabetes mellitus wie Arteriosklerose oder gestörte Wundheilung eine Rolle. Es konnten bisher menschliche cDNAs für RAGE und eine verkürzte lösliche Form des Rezeptors, der keine Transmembran- und cytoplasmatische Domäne besitzt, charakterisiert werden. Die lösliche Form des RAGE ist ein endogener kompetitiver Inhibitor von Signalkaskaden, die vom membranständigen RAGE ausgelöst werden. Um eine Aussage zur relativen Expressionsstärke beider RAGE-Varianten machen zu können, wurde daher eine RT-PCR-Analyse etabliert, mit Hilfe derer beide Transkripte gleichzeitig amplifiziert werden können. Es wurden.

(32) Ergebnisse. 25. drei neue menschliche RAGE-Transkripte charakterisiert, die für verschiedene Varianten der verkürzten löslichen Form des RAGE kodieren. Es konnten in den untersuchten. Geweben. starke. Unterschiede. hinsichtlich. der. relativen. Expressionsstärke des vollständigen RAGE-Transkriptes im Vergleich zur Summe der Spleißvarianten, die für die verkürzte lösliche Form kodieren, festgestellt werden. Deshalb unterliegt die prä-mRNA des RAGE anscheinend einem regulierten alternativen Spleißprozess, der von extrazellulären Botenstoffen von bisher unbekannten zellulären Signalkaskaden aktiviert wird. Diese Ergebnisse sprechen dafür, daß es einen komplexen Regulationsmechanismus für die Transkription des RAGE-Rezeptors gibt, bei dem verschiedene Isoformen beteiligt sind, die um die Bindung der Liganden konkurieren. 3.4. Methodische Aspekte zur Untersuchung der Expression der HMG-Gene. 3.4.1 Eine DNase I-Behandlung von cDNA-Erststrangpräparationen garantiert spezifische RT-PCR-Analysen (Flohr et al., 2003b) Die Reverse-Transkription-PCR (RT-PCR) ist eine häufig angewendete und sehr sensitive Methode, um die Expression von Genen nachzuweisen. cDNAPräparationen können jedoch mit genomischer DNA kontaminiert sein. Dies kann bei RT-PCR-Analysen zu einer unerwünschten Amplifikation von Retropseudogenen und Genen, die keine Introns besitzen, führen. Retropseudogene besitzen keine Introns und weisen eine starke Sequenzübereinstimmung zu der cDNA-Sequenz ihrer aktiven Gene auf. Es kann bei einer RT-PCR aus diesem Grund nicht unterschieden werden, ob die amplifizierten Sequenzen von Retropseudogenen oder cDNASequenzen der aktiven Gene stammen, weil eine Größenunterscheidung in der Gelelekrophorese nicht möglich ist. Die HMG-Familie ist bekannt dafür, daß viele ihrer Gene Retropseudogene besitzen. Ein ähnliches Problem stellt die spezifische Amplifikation von Genen ohne Introns dar. Die Standardmethode dieses Problem zu lösen, ist eine DNase I-Behandlung der RNA vor der cDNA-Synthese. In der vorliegenden Arbeit wurde eine elegante Variante dieser Methode etabliert, indem eine DNaseI-Behandlung erst nach der cDNA-Erststrangsynthese durchgeführt wird. Dies ist möglich, weil für die enzymatische Aktivität der DNase I eine bestimmte sterische Struktur erforderlich ist. DNase I erkennt vorzugsweise DNA-Duplexes in.

(33) Ergebnisse. 26. der B-Konformation und RNA-DNA-Hybridstränge liegen in der A-Konformation vor. Es konnten mit dieser Methode spezifische RT-PCR-Analysen der House-keepingGene GAPDH und beta-Aktin und der HMG-Gene HMGA1 und HMGB1 an MCF-7cDNA durchgeführt werden. Mit Hilfe dieser Methode lassen sich grundsätzlich spezifische RT-PCR-Analysen von Genen ohne Introns und Genen, für die Retropseudogene beschrieben wurden, durchführen. 3.4.2 RNA aus HOPE-fixierten Mammakarzinomen kann für Northern Blot- und Microarray-Analysen eingesetzt werden (Goldmann1, Flohr1 et al., zur Veröffentlichung angenommen) Es gibt einen großen Bedarf an Gewebeproben, die nach histologischer Begutachtung auch für molekularpathologische Analysen geeignet sind. Formalinfixiertes, Paraffin-eingebettetes (FFPE) Gewebe kann hierfür nur sehr eingeschränkt verwendet werden. HOPE (Hepes-Glutamic acid buffer mediated Organic solvent Protection Effect) ist eine neue Fixierungstechnik, bei der ein organischer Puffer, Azeton als einziges Reagenz zur Entwässerung der Schnitte und reines Paraffin mit einer Schmelztemperatur von 52-54°C eingesetzt wird. HOPE-fixiertes Gewebe kann für alle pathologischen Routineanwendungen verwendet werden. Im Gegensatz zu FFPE-Gewebe kann aus HOPE-fixiertem Gewebe hochmolekulare DNA (>20 kb) und RNA isoliert werden, so daß anschließende PCR-, RT-PCR- und RISH-Analysen möglich sind. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob aus HOPE-fixierten Mammakarzinomen isolierte RNA auch für Northern Blot-Analysen und Microarrays verwendet werden kann. Zwei RNA-Proben wurden vor der Durchführung einer Array-Hybridisierung spektrometrisch und mit Hilfe der Kapillarelektrophorese analysiert. Dies ergab eine gute Qualität der RNA-Proben: Die Quotienten von 28S rRNA zu 18S rRNA lagen bei > 1,5 (Quotienten <1 weisen auf eine Degradierung der RNA hin). Nach linearer Amplifikation der Proben zeigten diese zudem ein breites Spektrum an RNAs verschiedener Längen (0,2 bis 3,0 kb), was bedeutet, daß die verschiedenen RNA-Spezies der ursprünglichen Probe gut repräsentiert waren. Es konnte. mit. diesen. zwei. RNA-Proben. von. unterschiedlich. differenzierten. Mammakarzinomen (G2 und G3) eine Array-Hybridisierung durchgeführt werden. Das Ergebnis der Array-Hybridisierung war bei Vergleich der RNA-Probe des G31. Torsten Goldmann und Aljoscha M. Flohr sind gleichberechtigte Erstautoren dieser Veröffentlichung..

(34) Ergebnisse. 27. Karzinoms mit der des G2-Karzinoms, daß 46 von 642 Genen mehr als 2-fach hochreguliert und 45 von 642 Genen mehr als 2-fach herunterreguliert waren. Zum anderen konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, daß RNA aus HOPE-fixierten Mammakarzinomen auch für Northern Blot-Analysen verwendet werden kann, indem GAPDH- und HMGB1-spezifische Transkripte in sieben RNA-Proben nachgewiesen werden konnten. Die HOPE-Fixierungstechnik stellt somit für retrospektive molekularpathologische Methoden eine vielversprechende Alternative zur FormalinFixierung dar. 3.4.3 RT-PCR-Analyse an HOPE-fixierten Mammakarzinomen (nicht veröffentlicht) Es war von Interesse herauszufinden, ob eine spezifische RT-PCR zur Detektion der HMGB1-Expression wie von Flohr et al. (2003b) beschrieben, auch an cDNAErststrangpräparationen, die aus RNA aus HOPE-fixierten Mammakarzinomproben hergestellt. wurden,. möglich. ist.. Hierzu. wurde. aus. vier. HOPE-fixierten. Mammakarzinomproben RNA isoliert und eine cDNA-Erststrangsynthese mit anschließender DNase I-Behandlung durchgeführt. Es konnte durch eine Intronspezifische PCR des HMGA2 gezeigt werden, daß die vier cDNA-Präparationen keine mit dieser Methode detektierbare genomische DNA mehr enthalten. Mit Hilfe der RT-PCR konnte an cDNAs dieser vier invasiv duktalen Mammakarzinomproben sowohl eine Expression des GAPDH- als auch des HMGB1-Gens nachgewiesen werden..

(35) Diskussion. 28. 4. Diskussion Die HMGA-Proteine spielen eine entscheidende Rolle bei pathologischen Prozessen wie neoplastischer Transformation, Progression und Metastasierung von Tumoren. Eine HMGA1-Expression konnte bisher in zahlreichen Karzinomen wie dem Schilddrüsenkarzinom, kolorektalen Karzinom, Pankreaskarzinom, Prostatakarzinom, Zervixkarzinom, Ovarialkarzinom und Magenkarzinom gezeigt werden (Tamimi et al., 1993; Chiappetta et al., 1995; Fedele et al., 1996; Chiappetta et al., 1998, Bandiera et al., 1998; Abe et al., 1999; Abe et al., 2000; Chiappetta et al., 2001; Masciullo et al., 2003; Nam et al., 2003). In dieser Arbeit konnte erstmalig das Expressionsmuster des HMGA1-Proteins in primären Mammakarzinomen beschrieben werden, indem 170 Karzinome immunhistochemisch untersucht wurden. Es konnte eine stark unterschiedliche HMGA1-Expression in den untersuchten Karzinomen festgestellt werden: 38,8% der Karzinome waren deutlich positiv (IRS 4-12), 25,3% schwach positiv (IRS 1-3) und 35,9% zeigten keine HMGA1-Expression. Es konnte zudem eine statistisch signifikante, deutlich positive Korrelation zwischen schlechtem Differenzierungsgrad. der. Karzinome. und. einer. starken. HMGA1-Expression. herausgefunden werden. Um die HMGA1-Expression mit einer anderen Methode als der Immunhistochemie zu demonstrieren, wurde eine HMGA1-spezifische Northern Blot-Analyse an neun primären Mammakarzinomen durchgeführt. Da von den 170 Mammakarzinomen aus der Studie von Flohr et al. (2003a) keine Isolierung hochqualitativer RNA möglich war, wurden neun andere Mammakarzinome analysiert. Es konnte in allen neun Karzinomen mit einem Differenzierungsgrad von 2 und 3 ein ca. 1,4 kb langes HMGA1-spezifisches Transkript nachgewiesen werden. In anderen Studien konnte demonstriert werden, daß auch Mammakarzinomzellinien mit einem aggressiv malignen Phänotyp eine stärkere HMGA1-Proteinexpression aufweisen als solche mit einem weniger aggressiven Phänotyp (Reeves et al., 2001). Dolde. et. al.. (2002). Mammakarzinomzellinien. zeigten stärker. zudem, als. in. daß einer. HMGA1 normalen. in. menschlichen. Brustepithel-Zellinie. exprimiert wird. Untersuchungen zum Einfluß der HMGA1-Proteine auf den Phänotyp von Mammakarzinomzellinien ergaben, daß eine Herabsetzung der HMGA1Expression deren Wachstum und Fähigkeit unterbindet, unabhängig von einer Kontaktinhibition in Softagar wachsen zu können. Eine verstärkte Expression von.

(36) Diskussion. 29. HMGA1-mRNA in MCF-7-Zellen bewirkt jedoch genau das Gegenteil, so daß diese Zellen unabhängig von einer Kontaktinhibition in Softagar wachsen können. Zudem können MCF-7-Zellen mit einer HMGA1b-Überexpression Tumoren in Nacktmäusen ausbilden (Reeves et al., 2001). Diese Ergebnisse sprechen eindeutig dafür, daß es in schlecht differenzierten Mammakarzinomzellen zu einer Reaktivierung der Expression bzw. Überexpression des HMGA1-Gens kommt und eine verstärkte HMGA1-Expression positiv mit einem schlechten Differenzierungsgrad, aggressiven Phänotyp. und. hohem. Metastasierungspotential. von. Mammakarzinomzellen. korreliert. Eine solche Korrelation konnte ebenfalls für zahlreiche andere Karzinome ermittelt werden (Bussemakers et al., 1991; Tamimi et al., 1993; Bandiera et al., 1998; Chiappetta et al., 1998; Abe et al., 1999); deshalb kommt die Intensität der HMGA1-Expression in der Klinik als prognostischer Marker bei Mammakarzinomen in Frage. Auch Rogalla et al. (1997) haben hinsichtlich der HMGA2-Expression in Mammakarzinomen beschrieben, daß ebenfalls in erster Linie schlecht differenzierte Karzinome das Gen exprimieren. Während Rogalla et al. (1997) die Expression des HMGA2-Wildtyp-Transkriptes (HMGA2a) untersucht haben, konnte in dieser Arbeit im Rahmen der Studie von Hauke et al. (2002) eine neue Spleißvariante des HMGA2-Gens (HMGA2b) charakterisiert werden. Das HMGA2b-Transkript besitzt ein alternatives terminales Exon, das die Exons 4 und 5 des Wildtyp-Transkriptes ersetzt, so daß bei dieser Spleißvariante der für die saure Domäne des HMGA2 kodierende Teil fehlt. Die Expression von HMGA2b konnte in dieser Arbeit neben dem HMGA2a-Transkript u.a. in einem Mammakarzinom nachgewiesen werden. Die Expression eines verkürzten HMGA2-Proteins, das nur die drei DNA-bindenden Domänen besitzt, kann eine maligne Transformation der Fibroblasten-Zellinie NIH3T3 verursachen (Fedele et al., 1998). Zudem konnte gezeigt werden, daß transgene Mäuse, die das verkürztes HMGA2-Transkript verstärkt exprimieren, besonders groß werden, unter Lipomatose leiden und ungewöhnlich häufig Lipome bekommen. Dieses Ergebnis spricht dafür, daß die drei AT-Hooks des HMGA2Proteins ausreichend sind, um Lipomatose und eine Prädisposition für Lipome zu verursachen (Battista et al., 1999; Arlotta et al., 2000). Wenn man davon ausgeht, daß HMGA2b auch in Mammakarzinomen translatiert wird, konnte eine neue HMGA2-Proteinisoform in Mammakarzinomen charakterisiert werden. Diese könnte, wie es für das Fettgewebe transgener Mäuse gezeigt wurde, möglicherweise auch.

(37) Diskussion. 30. eine proliferierende Wirkung auf das Brustepithel haben. Zudem könnte HMGA2b vermutlich bei Prozessen beteiligt sein, die eine Rolle bei der malignen Transformation des Brustepithels spielen. Um herauszufinden, welche Zielgene in Mammakarzinomzellen durch eine verstärkte HMGA1-Konzentration hoch- bzw. herunterreguliert werden, wurden MCF-7-Zellen in zwei. Experimenten. unterschiedlichen. HMGA1b-Konzentrationen. im. Medium. ausgesetzt. Es konnte mit Hilfe von Fluoreszenz-markiertem HMGA1b-Protein gezeigt werden, daß MCF-7-Zellen dieses unter der Einwirkung von Streptolysin aus dem Medium aufnehmen und in den Zellkern transportieren. Die RNAs von MCF-7Zellen mit und ohne Proteinbehandlung wurden in Array-Hybridisierungen eingesetzt. In einem ersten Experiment konnte bei einer HMGA1b-Konzentration von 0,5 µg/ml in MCF-7-Zellen, die mit HMGA1b behandelt wurden, eine zweifache Erhöhung des PDGFA (platelet-derived growth factor A)-Gens gegenüber MCF-7-Zellen ohne Proteinbehandlung festgestellt werden. Diese Änderung und auch die der anderen auf dem Array aufgebrachten Gene wurde jedoch als nicht signifikant bewertet. Das Kriterium einer signifikanten Änderung der Genexpression war eine mindestens vierfache Regulierung der zu untersuchenden Gene (Reeves et al., 2001). Interessanterweise konnte bei gleicher Versuchsdurchführung mit einer doppelt so hohen (1 µg/ml) HMGA1b-Konzentration eine signifikante Hochregulierung des PDGFA-Gens um den Faktor 7,5 ermittelt werden. Dieses Ergebnis spricht dafür, daß das HMGA1b-Protein in Mammakarzinomzellen die Transkription des PDGFAGens. verstärken. kann,. indem. es. möglicherweise. die. Entstehung. eines. Enhanceosoms in der Promotorregion des PDGFA-Gens erleichtert. Aus dem Ergebnis dieser Arbeit läßt sich die Hypothese aufstellen, daß dieser Prozeß von der HMGA1b-Proteinkonzentration im Zellkern abhängig ist, weil bei unterschiedlichen HMGA1b-Konzentrationen auch eine unterschiedlich starke Regulierung des PDGFA-Gens beobachtet werden konnte. PDGF sind Wachstumsfaktoren im Serum, die aus Dimeren einer A- oder B-Domäne oder beiden bestehen und ihre Wirkung in der Zelle über zwei RezeptorTyrosinkinasen (PDGFRα und β) vermitteln (Ross et al., 1986). Das PDGFA-Gen kodiert für die A-Domäne und wird während der Embryonalentwicklung in vielen Geweben exprimiert (Rappolee et al., 1988; Mercola et al., 1990). PDGF regulieren die Proliferation mesenchymaler Zellen und deren Überexpression kann im.

(38) Diskussion. 31. Zusammenhang mit der Tumorgenese bzw. Neoplasie stehen (Heldin, 1997; Yu et al.,. 2003).. Insbesondere. hat. PDGFA. eine. spezifische. Funktion. bei. der. Differenzierung alveolärer Myofibroblasten (Boström et al., 1996). PDGFA trägt also während der Embryonalentwicklung in mesenchymalen Zellen zu einer vom Zellprogramm vorgesehenen Proliferation der Zellen bei. Eine durch HMGA1 ausgelöste verstärkte Expression des PDGFA in Mammakarzinomzellen weicht vermutlich vom normalen Genexpressionsprofil des Brustepithels ab, und die mitogene Wirkung des PDGFA könnte neben vielen anderen Faktoren auch in vivo zu dem verstärkten und unkontrollierten Wachstum der Karzinomzellen beitragen. Für diese Hypothese spricht, daß die Expression von PDGF in schlecht differenzierten Mammakarzinomen mit einem erhöhten Metastasierungspotential und einer geringeren Überlebensrate der Patientinnen korreliert (Seymour et al., 1993; Seymour und Bezwoda, 1994; Anan et al., 1996). Interessanterweise wird durch PDGF wiederum die HMGA1-Expression induziert (Lanahan et al., 1992), so daß die gegenseitige Hochregulierung beider Gene bei Mammakarzinomen einen autokrinen Mechanismus darstellen könnte. Reeves et al. (2001) haben ähnliche Experimente zur differentiellen Genexpression der HMGA1-Proteine mit Hilfe eines Vektorsystems in MCF-7-Zellen durchgeführt. Das Vektorsystem erlaubt eine verstärkte, aber nicht kontrollierte Expression von HMGA1-Transkripten. Obwohl die PDGFA-cDNA auf dem eingesetzten Array repräsentiert war, konnte keine signifikante Regulierung dieses Gens durch HMGA1b festgestellt werden. Das könnte zum einen daran liegen, daß Reeves et al. (2001) MCF-7-Zellen. mit. einem. Vektorsystem. transfiziert. haben,. das. HMGA1-. Fusionsproteine mit einem neun Aminosäuren langen Peptid des Hämagglutinins entstehen. läßt.. Dieses. Protein. könnte. möglicherweise. in. vivo. andere. Bindungseigenschaften aufweisen als das native Protein. In dieser Arbeit wurde hingegen rekombinant hergestelltes HMGA1b-Protein eingesetzt, welches dieselbe Aminosäuresequenz wie das native Protein besitzt. Zum anderen könnte man vermuten, daß der Einfluß der HMGA1-Proteine auf die Transkription von Zielgenen von dessen Proteinkonzentration abhängig ist, so daß im Experiment von Reeves et al. (2001) andere Ergebnisse aufgrund anderer HMGA1-Konzentrationen erzielt wurden. Reeves et al. (2001) konnten hingegen durch eine erhöhte Expression von HMGA1bmRNA in MCF-7-Zellen eine signifikant verstärkte Expression von Genen.