Tierärztliche Hochschule Hannover
Charakterisierung des Caninen High – Mobility – Group A1 (HMGA1) Gens
und
Detektion von Punktmutationen
INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer
Doktorin der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae -
(Dr. med. vet.)
vorgelegt von Claudia Beuing Wuppertal - Elberfeld
Hannover 2010
Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. I. Nolte, Klinik für Kleintiere der Tierärztlichen Hochschule Hannover
Prof. Dr. J. Bullerdiek, Zentrum für Humangenetik der Universität Bremen
1. Gutachter:
2. Gutachterin/Gutachter:
Tag der mündlichen Prüfung:
Prof. Dr. Ingo Nolte
Prof. Dr. Marion Hewicker-Trautwein
03. September 2010
Für meine wundervollen Söhne
Niklas und Moritz
INHALTSVERZEICHNIS
1. Einleitung 1
2. Literaturübersicht 3
2.1 Single Nucleotide Polymorphism 3
2.2 Proteine der High - Mobility - Group 5
2.3 Das THADA - Gen 9
2.4 Der canine Karyotyp 9
3. Publikationen 13
3.1 Chromosomal Assignment of the Canine THADA Gene to CFA 10q25
13
3.2 Genomic Characterisation, Chromosomal Assignment and in Vivo Localisation of the Canine High Mobility Group A1 (HMGA1) Gene
14
4. Diskussion 15
5. Zusammenfassung 19
6. Summary 20
7. Literaturverzeichnis 21
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
bp Basenpaare
dATP Desoxyadenosin-5´-Triphosphat dCTP Desoxycytidin-5´-Triphosphat DNA Desoxyribonucleinacid
dNTP Desoxynukleosid-5´-Triphosphat g Erdbeschleunigung ( g = 981cm/sec-2) GFP Green Fluorescent Protein
h Stunde
H2O Wasser
HMG High Mobility Group
HMGA1 HMGA1-Gen
HMGA1 Proteine des HMGA1-Gens
kb Kilo Basenpaare
M Marker
MgCl Magnesiumchlorid
min Minute
ml Milliliter
ng Nanogramm
PBS Phosphate-buffered Saline
PCR Polymerase Chain Reaction (Polymerase-Kettenreaktion)
sec Sekunden
Taq Taq-Polymerase (DNA-Polymerase des Bakteriums Thermus aquaticus)
THADA Thyroid adenoma associated
U Units
µl Mikroliter
1. EINLEITUNG
Die vorliegende Arbeit beschäftigte sich mit der Charakterisierung der Struktur des tumorrelevanten caninen HMGA1 Gens auf genomischer Ebene sowie der Evaluation einer im Vorfeld beschriebenen Punktmutation im HMGA1 – Gen eines Teckels in einer größeren Teckelgruppe. Weiterhin wurde erstmals die in vivo Lokalisierung des caninen HMGA1 Proteins über Fluoreszenz vorgenommen sowie der Genlokus verifiziert. Zusätzlich zu den HMGA1 Arbeiten wurde der Genlokus des caninen THADA Gens, welches als tumorrelevantes Kandidatengen beim Menschen gilt, beim Hund erstmals physikalisch bestimmt.
Die genaue Kenntnis der Struktur von krankheitsassoziierten Genen ist für die Entwicklung von diagnostischen Ansätzen als auch die Charakterisierung von Tumorentstehungsmechanismen in vielfacher Hinsicht von großem Interesse. So stellt sie die Grundlage des Wissens über strukturelle Elemente dar, welche die Funktion der entsprechenden Gene charakterisieren und regulieren. So können etwa zytogenetisch charakterisierte Chromosomenbrüche mit strukturellen Veränderungen von eventuell hiervon betroffenen Genen in Verbindung gebracht werden und deren Effekte beschrieben werden. Dies bietet die Möglichkeit, in den verschiedenen Tumorentitäten wiederkehrende strukturelle Veränderungen zu identifizieren und zu evaluieren, ob diese Änderungen charakteristisch für die jeweiligen untersuchten Gruppen sind.
Die letztlich funktionelle Einheit in der Zelle, also das ausführende Medium, ist das Protein. Ein Protein oder eine Polypeptidkette stellt das mittels Translation entstandene Produkt eines Gens, bzw. das funktionelle Element eines Gens in einer Zelle dar. Zur genaueren Untersuchung der Funktionsweise eines Proteins ist es wichtig zu wissen, wo sich das Molekül in der Zelle befindet. Eine Lokalisation (in vivo) über Fluoreszenz in der Zelle bietet hier weitreichende Möglichkeiten zur Charakterisierung der Proteinbiologie in vivo. Vorteil einer GFP vermittelten in vivo Lokalisation ist hierbei der sichtbare Nachweis eines Proteins in der Zelle.
Zudem warf eine Untersuchung von Murua Escobar et al. (2004), bei der eine Punktmutation auf einem Allel im Exon 7 des caninen HMGA1 – Gens bei einem
Teckel nachgewiesen werden konnte [1] die Fragestellung nach der Auftrittswahrscheinlichkeit einer solchen Mutation in einer größeren Teckel – Population auf, um somit die mögliche Relevanz dieser Mutation zu evaluieren.
Punktmutationen sind die am häufigsten vorkommenden genetischen Mutationen, da diese lediglich auf dem Austausch einer einzelnen Base beruhen. Wird eine solche Mutation in einer Population in einer Häufigkeit von mindestens einem Prozent detektiert, so spricht man im Allgemeinen von einem sog. „Single Nucleotide Polymorphism“ (SNP). Die Detektion dieser Punktmutationen ist für Genetik und Medizin daher von großer Bedeutung, da bereits ein Austausch in der Basenabfolge zur Änderungen einer Aminosäure in einem Protein oder zur Modulation funktioneller genregulativer Elemente führen kann.
Das canine HMGA1 – Gen stand für diese Arbeit deshalb im Blickpunkt des Interesses, da ihm eine wichtige Rolle im Zusammenhang mit verschiedenen Erkrankungen einschließlich Tumoren zugesprochen wird [2, 3].
In der vorliegenden Arbeit wurden Untersuchungen an genomischer DNA von Hunden und im Besonderen an Teckeln als Rasse vorgenommen. Sie ist in diesem Zusammenhang besonders interessant, da diese Rasse für eine Reihe von Erkrankungen prädisponiert ist, welche mit den High – Mobility – Group – Genen in Verbindung gebracht werden können. Dazu gehören beispielsweise gutartige, als auch bösartige Tumoren. So treten bei Tumoren der Mamma Adenokarzinome, Adenome und benigne Mischtumoren nach Mischlingen am zweithäufigsten bei Teckeln auf. Ebenso verhält es sich mit der Auftrittswahrscheinlichkeit von Liposarkomen [4]. Eine Evaluation der Auftrittswahrscheinlichkeit der initial beschriebenen HMGA1 Punktmutation in der Teckel - Population könnte zur Klärung eines möglichen Zusammenhanges zwischen der beschriebenen Mutation und rassespezifischen Prädispositionen führen.
Im weiteren Interesse lag die Lokalisation des caninen THADA – Gens. Ähnlich wie das HMGA1 Gen werden strukturelle Aberrationen dieses Gens beim Menschen bei der Entstehung von Schilddrüsentumoren diskutiert, und es wird daher als Kandidatengen diskutiert [5]. Um Aussagen treffen zu können, ob das Auftreten von
spezifischen Aberrationen wahrscheinlich ist, ist das Mapping des Gens die Grundvoraussetzung.
Da HMGA- sowie THADA - Gen im Zusammenhang mit der Pathogenese von Neoplasien gesehen werden, ist die Kenntnis von Lokalisation und Struktur für die Entwicklung möglicher Therapien von großer Bedeutung.
2. LITERATURÜBERSICHT
Genaufbau und strukturelle Aberrationen
Ein eukaryontisches Gen besteht auf genomischer Ebene aus mehreren unterschiedlichen charakteristischen Elementen. Hierbei codieren Exons die Teile, welche in mRNA umgeschrieben werden und werden durch die sogenannten Introns getrennt [6]. Dieser modulartige Aufbau bietet den Vorteil, dass während der Entwicklung der verschiedenen Spezies die Exons miteinander neu kombiniert werden und so neue Gene entstehen konnten. Weiterhin sind bei den meisten Genen für die Transkription typische regulatorische Elemente, wie Promotor, TATA – BOX und Silencer zu finden.
Dieser modulartige Aufbau der eukaryontischen Gene hat jedoch auch Nachteile.
Beim sog. „crossing over“ kommt es beispielsweise zum Bruch und erneuten Aneinanderlegen von jeweiligen am Prozess teilnehmenden Chromatiden. Diese natürliche Rekombination ermöglicht/erweitert die Entstehung in sich einzigartiger Individuen. Fehler während dieses Prozesses oder später an den hieran beteiligten Chromosomenanteilen können jedoch dazu führen, dass Teile von Genen verloren gehen oder neue Teile hinzukommen, welche die Funktion des jeweiligen Gens beeinflussen können (gain und loss of function). Beispielsweise treten bei verschiedenen Tumoren genetische Instabilitäten auf, die sich dadurch zeigen, dass Chromosomen brechen und neu kombinieren, Teile verloren gehen oder amplifiziert werden. Ein typisches Beispiel ist das sog. Philadelphia Chromosom. Dieses verkürzte Chromosom 22 des Menschen wurde erstmals 1960 von Peter Nowell als Chromosomenaberration beschrieben, welche mit der Entstehung von Tumoren in Verbindung gebracht werden konnte. So kann es bei mehr als 95 Prozent aller Fälle von Chronisch Myeloischer Leukämie nachgewiesen werden [7]. Dass es sich um eine reziproke Translokation von Chromosom 22 mit Chromosom 9 handelt, wurde im Jahre 1972 von Janet Rowley beschrieben [8]. Die für die zelluläre Wachstumsregulation wichtige Aktivität des Enzyms Tyrosinkinase wird unter Einfluss eines so neu entstehenden Fusionsproteins dauerhaft aktiviert, was unkontrollierte Zellvermehrung zur Folge hat.
Um Analysen durchführen zu können, die beschreiben ob und wie ein Chromosom bzw. Gen von solchen Mutationen betroffen ist, muss zunächst die Lage des Gens
festgestellt werden. Hierbei hat sich die Technik der „Fluoreszenz in situ Hybridisierung“ (FISH) als besonders wertvoll erwiesen. Diese Technik beruht darauf, dass spezifisch markierte Gen- bzw. DNA-Sonden auf Metaphase oder Interphase - Chromosomen hybridisiert werden. Die Auswertung erfolgt über die Fluoreszenz der markierten Sonden. FISH ermöglicht also die genaue Bestimmung über Lage eines Genes auf den Chromosomen und die Analyse, ob Teile des Gens von strukturellen Mutationen betroffen sind.
2.1. Single Nucleotide Polymorphism (SNP)
Single Nucleotide Polymorphisms sind Mutationen in Form einzelner Basenaustausche auf Ebene der genomischen DNA, die mit einer Häufigkeit von mehr als einem Prozent in einer Population vorkommen und stabil über mehrere Generationen bestehen [9]. Diese zufällig über das Genom verteilten Austausche einzelner Basen/Basenpaare können an beliebiger Position innerhalb und außerhalb von Genen vorkommen und entsprechend sehr unterschiedliche Auswirkungen haben. Liegen sie im Bereich der proteinkodierenden Sequenzen, ist möglicherweise der Austausch einer Aminosäure die Folge, die die Funktion des Proteins beeinflussen kann.
Auf Grund dieser Eigenschaft, Proteinstrukturen und somit deren Funktion verändern zu können, sind SNPs neben möglichen Effekten auf die Genregulation sowohl an der genotypischen als auch der phänotypischen Variationsbreite innerhalb einer Spezies maßgeblich beteiligt.
Die Anzahl und Wahrscheinlichkeit beschriebener SNPs variiert je nach Spezies erheblich, was sicherlich nicht allein auf das tatsächliche Vorkommen, sondern ebenso auf die unterschiedliche Anzahl der durchgeführten Untersuchungen bei einzelnen Spezies zurückzuführen ist. So ist zu erklären, dass Sachidanandam et al.
(2001) für den Menschen 1,42 Millionen SNPs mit einem SNP pro 1,9 kb detektierten, Kim und Misra (2007) hingegen über ca. 9 Millionen SNPs für das humane Genom berichten [10, 11]. Für den Hund (Canis lupus familiaris) ist in der Literatur eine Anzahl von 2,5 Millionen SNPs beschrieben, wobei die statistische Wahrscheinlichkeit abhängig von der Rasse zwischen einem SNP pro 900bp und 1500bp differiert [12]. Das Genom des Huhnes (Gallus gallus domesticus) beinhaltet 2,8 Millionen SNPs mit einer Auftrittswahrscheinlichkeit von 5 SNPs pro kb [13].
Als Folge eines Basenpaaraustausches wird beispielsweise eine Prädisposition für bestimmte Krankheiten beschrieben. So gilt ein Zusammenhang zwischen SNPs und der Entstehung von Tumoren, wie Plattenepithelkarzinomen, Lungen- und Prostatatumoren als erwiesen [14-16]. Dies ist durch eine aus einem SNP resultierende quantitative Dysregulation des Zellwachstums zu erklären.
Aguillon et al. (2006) beschrieben, dass die Häufigkeit des Auftretens der Rheumatoiden Arthritis signifikant erhöht war, wenn ein bestimmter SNP in der Promotorregion des TNF – Gens nachweisbar war, da die Entwicklung von TNF auf Grund dieses SNPs verändert war [17].
Einen weiteren Beleg für eine SNP - bedingte Prädisposition für bestimmte Erkrankungen erbrachten Khurana et al. im Jahre 2006. Sie stellten fest, dass die Wahrscheinlichkeit für Cerebralen Arteriospasmus auf Grund einer Punktmutation signifikant erhöht ist [18].
Weiterhin konnte man drei verschiedene SNPs nachweisen, welche zu veränderten Serumwerten einzelner Schilddrüsenparameter und daraus resultierend subklinisch zu einer Hypo- beziehungsweise Hyperthyreose führen [19]. Zwei dieser Mutationen sind lokalisiert in der extrazellulären Domäne des TSH-Rezeptors (Asp 36 His sowie Pro 52 Thr) [20, 21]. Eine dritte befindet sich in der intrazellulären Domäne (Asp 727 Glu) [22].
Als Folge eines Basenpaaraustausches beschrieben Dykxhoorn et al. (2006) einen Zusammenhang mit der Sichelzellanämie. Bei dieser autosomal-rezessiv vererbten Erkrankung kommt es durch den Austausch einer Aminosäure in Codon 6 (GAG → GTG) im Hämoglobin (HbS) bei abnehmendem Sauerstoffpartialdruck zur sichelförmigen Verformung der betroffenen Erythrozyten. Diese funktionsunfähigen Zellen werden in der Milz lysiert [23]. Eine Anämie und daraus resultierende Hypoxie ist die Folge.
Auch die Phenylketonurie, eine der häufigsten angeborenen Stoffwechselerkrankungen, wird durch SNPs hervorgerufen. Eine Mutation auf dem humanen Chromosom 12 (12q22 bis 12q24) verursacht die Dysfunktion der hier kodierten Phenylalaninhydroxylase. Hierbei hängt das Ausmaß der Aktivitätseinschränkung des Enzyms maßgeblich von der Art der etwa 400 bekannten Mutationen dieses Gens ab. Somit ist auch die tolerierbare Menge an aufgenommenem Eiweiß individuell verschieden. Kann die Aminosäure Phenylalanin mangels funktionsfähigem Enzym nicht zu Tyrosin abgebaut werden, können
beispielsweise eine Beeinträchtigung der Hirnentwicklung sowie Epilepsie die Folge sein [24].
Als Selektionsvorteil konnte die Laktosetoleranz beim Menschen nachgewiesen werden, welche aus einem SNP im LCT – Gen (Laktase – Gen) resultiert. Dieses kodiert für das bei der Laktosespaltung essentielle Enzym Laktase. Dem Menschen der Urzeit diente Rindfleisch als Nahrungsmittel, Milch konnte aufgrund der aus dem Fehlen der Mutation resultierenden Intoleranz als solches nicht verwertet werden. Im Laufe der Evolution stellte sich die Präsenz der genannten Mutation im Genom als Vorteil heraus, da diese die Überlebenschance auch in Zeiten des Nahrungsmangels erhöhte. So setzte sich dieses Merkmal insbesondere in Populationen mit Milchtierhaltung durch [25].
Punktmutationen wurden beim Menschen auch bei ras – Genen (Onkogenen) im Zusammenhang mit der Entstehung von Tumoren beschrieben. Diese Veränderungen konnten insbesondere an den Hotspots (Codon 12, 13 und 61) lokalisiert werden, also Regionen, welche eine erhöhte Auftrittswahrscheinlichkeit für Mutationen haben. Zwei Studien ergaben jedoch, dass für den Hund Mutationen an ras – Genen bei den untersuchten spontan vorkommenden Tumortypen keine große Rolle zu spielen scheinen [26, 27].
Schwanbeck et al. konnten 2000 nachweisen, dass der Austausch einer einzelnen Aminosäure in den AT – Hooks des HMGA1 Gens zum Verlust der Bindungsfähigkeit des Proteins an den Interferon β Gen Promotor führt. Der Funktionsverlust des Gewebehormons Interferon ist die Folge [28].
Zur Erforschung verschiedener Krankheitsbilder sowie Entwicklung möglicher Therapiemethoden ist daher die qualitative und quantitative Detektion von SNPs für die Medizin von großem Interesse.
Es bleibt jedoch zu erwähnen, dass ein großer Teil aller Punktmutationen ohne Konsequenz bleiben.
2.2. Proteine der High - Mobility – Group Familie
Die Proteine der High - Mobility - Group Familie erhielten ihren Namen auf Grund ihrer charakteristisch hohen Mobilität in PAGE-Gelelektrophoresen. Unterteilt werden
diese Nicht-Histon-Proteine seit 2001 auf Grund ihrer Aminosäuresequenzmotive, der funktionellen Domänen sowie des Molekulargewichtes in die Familien HMGA, HMGB sowie HMGN. Bei HMGA sind drei AT-Hooks zu finden, welche als Bindungsdomäne an die DNA dienen, HMGB weist zwei HMG-Boxen auf, wohingegen HMGN eine nucleosomale Bindungsdomäne besitzt [29].
Die HMGA - Proteine binden mit ihren AT-Hooks an die AT-reichen Regionen der Minor-Groove der DNA und beeinflussen so über Konformationsänderungen die Transkription. Daher werden sie als architektonische Transkriptionsfaktoren bezeichnet [30]. Die HMGA – Familie beinhaltet die Proteine HMGA1 und HMGA2, wobei bei HMGA2 mindestens zwischen den beiden Splicevarianten HMGA2a und HMGA2b [31] und bei HMGA1 zwischen den Isoformen HMGA1a, HMGA1b und HMGA1c unterschieden werden muss. Diese Isoformen des HMGA1 - Proteins werden kodiert von den entsprechenden Splicevarianten des HMGA1 - Gens [32].
Das canine HMGA1 – Gen wurde im Vorfeld dieser Arbeit auf cDNA – Ebene charakterisiert und so die beiden Splicevarianten HMGA1a und HMGA1b beschrieben [1, 33].
HMGA1 – Proteine sind in Geweben zu finden, welche sich in Differenzierungsprozessen befinden. Daher sind diese unter physiologischen Bedingungen primär in embryonalem Gewebe nachweisbar. In den meisten adulten Geweben sind diese Proteine nur noch in geringer Menge zu detektieren [34]. Ein vermehrtes Auftreten von HMGA1 – Proteinen lässt sich jedoch auch in ausdifferenziertem Gewebe zum Beispiel in Endothelzellen der Gefäße nach Verletzungen [35] sowie bei apoptotischen Prozessen [36] nachweisen. Auch der Zusammenhang zwischen HMGA1 – Protein und Entstehung verschiedener Erkrankungen, insbesondere Tumoren gilt als erwiesen [2, 3]. Im adulten Individuum findet man eine hohe Expression von HMGA1 – Protein in verschiedenen Tumorgeweben [37, 38]. Aberrationen des humanen HMGA1 – Gens werden als Ursache für eine Reihe benigner Tumore, wie endometriale Polypen, Lipome, chondroide Lungenhamartome und uterine Leiomyome verantwortlich gemacht [39- 43]. Zudem wird HMGA1 auch im Zusammenhang mit malignen Tumoren diverser Organe, beispielsweise an Pankreas, Cervix, Prostata, Lunge, Kolorektum und Schilddrüse genannt [37, 44-58].
2.3. Das THADA - Gen
Ein weiteres Gen, welches neben dem HMGA1 Gen beim Menschen als Kandidatengen bei der Entstehung von Tumoren der Schilddrüse eine Rolle zu spielen scheint, ist das so genannte THADA – Gen. Chromosomale Aberrationen im THADA – Gens (2p21) treten gehäuft bei Adenomen der Schilddrüse auf [5]. Da THADA im Bruchpunkt liegt, gilt es als Kandidatengen, welches möglicherweise eine zentrale Rolle bei der Entstehung dieser Neoplasien spielt. Um später zu evaluieren, ob das canine THADA – Gen in einem Bereich liegt, welcher von Aberrationen betroffen ist, war ein weiteres Ziel dieser Arbeit die Lokalisation des caninen THADA – Gens über FISH Mapping.
2.4. Der canine Karyotyp
Grundvoraussetzung zu FISH Lokalisation von Genen ist die Verfügbarkeit einer standardisierten Chromosomennomenklatur für den zu untersuchenden Organismus.
Letztlich ist somit die Möglichkeit der Erkennung und Wiedererkennung von Chromosomen der Schlüssel. Im Falle des Hundes machen sowohl die hohe Anzahl an Chromosomen, als auch deren große Ähnlichkeit dieser in Form und Größe den Karyotyp des Hundes zu einem der kompliziertesten unter den Säugetieren. In Folge dessen sind in der Literatur diverse Veröffentlichungen über die Darstellung eines caninen Karyogramms mit verschiedenen Bandentechniken und unterschiedlicher Chromosomenanordnung zu finden [59-63]. Hunde besitzen 78 Chromosomen, davon 76 akrozentrische Autosomen und zwei metazentrische Geschlechtschromosomen, wobei es sich entweder um zwei X-Chromosomen oder jeweils ein X- sowie ein Y-Chromosom handeln kann. Das X-Chromosom stellt das größte, das Y-Chromosom das kleinste Chromosom im Genom des Hundes dar [62].
Die erste Beschreibung des caninen Karyotyps erfolgte durch Selden et al. (1975) [64] (Abb.1). Vergleichend ist die Nomenklatur nach Reimann et al. (1996) sowie die Abbildung der Chromosomen nach Giemsa–Trypsin–Giemsa Färbung (GTG- Banding) dargestellt.
Abb.1: Schematische Darstellung der Nomenklatur eines Karyotyps nach GTG-Banding (rechts), nach SELDEN et al. (1975) (links) und REIMANN et al. (1996) (Mitte)
Zur Erstellung einer international anerkannten Bandennomenklatur für den caninen Karyotyp wurde im August 1994 das „Committee for the Standardized Karyotype“
gegründet, da keine der bis zu diesem Zeitpunkt beschriebenen Nomenklaturen den Ansprüchen einer Standardnomenklatur entsprach [65]. So gelang es, Empfehlungen zur Verwendung von Nomenklaturen für den caninen Karyotyp zu erstellen. Für die Chromosomen 1 bis 21 kann demnach die Nomenklatur des Standard Committee verwendet werden [66]. Bei Chromosomenpräparationen mit höherer Bandenauflösung empfiehlt sich die Nomenklatur von Reimann et al. 1996 [60].
Diese enthält zusätzliche Subbanden, welche eine genauere Zuordnung der Gene ermöglichen. Für die kleineren Chromosomen 22 bis 38 wird ausschließlich die Nomenklatur von Reimann et al. (1996) bevorzugt (Abb.2).
Abb. 2 : Ideogramm des caninen Karyotyps von REIMANN et al. (1996) mit 460 nummerierten Banden
Zusammenfassend ist die Verfügbarkeit einer Nomenklatur zusammen mit dem Wissen über die genaue Struktur eines Genes und dessen Lokalisation die Grundlage, um Analysen durchzuführen, die strukturelle Veränderungen von Genen charakterisieren. In dieser Arbeit wurde sowohl das canine THADA Gen erstmals lokalisiert, als auch die genauere Struktur des caninen HMGA1 und dessen Lokalisation bestimmt. Dies ermöglicht beim HMGA1 Gen Aussagen, welche Teile des Gens genau von Chromosomenabberationen betroffen sind.
Im Falle des caninen THADA-Gens ermöglicht die vorgenommene Lokalisierung erste Aussagen, ob der Lokus des Gens überhaupt von wiederkehrenden Chromosomenaberrationen betroffen ist.
Zusätzlich zu diesen strukturellen Arbeiten wurde für das caninen HMGA1 Gen die Lokalisierung des Gens in vivo vorgenommen. Hierzu wurde ein HMGA1-GFP Fusionsprotein verwendet, welches eine Fluoreszenzdetektion ermöglicht.
Das „Green Fluoreszenz Protein“ (GFP) wurde im Jahr 1961 von Osamu Shimomura aus der Qualle Aequorea victoria erstmals isoliert [67]. Für die Entdeckung des GFP erhielten Osamu Shimomura, Martin Chalfie und Roger Tsien 2008 den Nobelpreis in Chemie. Dieses Protein kann bei Wellenlänge 395nm sowie 475nm angeregt werden und emittiert dann grünes Licht der Wellenlänge 509nm. Dieses 238 Aminosäuren große Protein kann wie hier geschehen über DNA - Expressionsvektoren mit jedem anderen Protein gekoppelt werden. Somit kann man über GFP-Fusionsproteine in vivo darstellen, wo Proteine in Zellen vorliegen bzw. wohin sie transportiert werden.
3. VERÖFFENTLICHUNGEN
Im Folgenden sind die im Verlaufe der Arbeit entstandenen Publikationen aufgeführt.
3.1.
Am 23. Juli 2008 wurde in BMC Genetics veröffentlicht:
Genomic Characterisation, Chromosomal Assignment and in Vivo Localisation of the Canine High Mobility Group
Claudia Beuing†1, Jan T Soller†1,2, Michaela Muth2, Sigfried Wagner2, Gaudenz Dolf3, Claude Schelling4, Andreas Richter2, Saskia Willenbrock1,2, Nicola Reimann- Berg1,2, Susanne Winkler2, Ingo Nolte1, Jörn Bullerdiek1,2 and Hugo Murua
Escobar*1,2
1 Clinic for Small Animals and Reserch Cluster of Excellence *REBIRTH*, University of Veterinary Medicine Hanover, Bischofsholer Damm 15, 30173 Hanover, Germany 2 Centre for Human Genetics, University of Bremen, Leobener Str. ZHG, 28359 Bremen, Germany
3 Institute of Animal Genetics, Nutrition and Housing, University of Berne, Switzerland
4 Department of Animal Sciences, Swiss Federal Institute of Technology Zurich and Vetsuisse Faculty Zurich, University of Zurich, Zurich, Switzerland
* Corresponding author
† Equal contributors
3.2.
Am 3. Juni 2008 wurde in Molecular Cytogenetics publiziert:
Chromosomal Assignment of the Canine THADA Gene to CFA 10q25
Jan T Soller†1,2, Claudia Beuing†2,Hugo Murua Escobar*1,2,Susanne Winkler1, Nicola Reimann-Berg1, Norbert Drieschner1, Gaudenz Dolf3, Claude Schelling4, Ingo Nolte2, Jörn Bullerdiek1,2
1 Centre for Human Genetics, University of Bremen, Leobener Str. ZHG, 28359 Bremen, Germany
2 Small Animal Clinic and Reserch Cluster of Excellence *REBIRTH*, University of Veterinary Medicine Hanover, Bischofsholer Damm 15, 30173 Hanover, Germany 3 Institute of Genetics, Vetsuisse Faculty, University of Berne, Bremgartenstr. 109a PO Box 8466, 3001 Bern, Switzerland
4 Department of Animal Science, Swiss Federal Institute of Technology Zurich, Vetsuisse Faculty Zurich, University of Zurich, Winterthurerstrasse 204, 8057 Zürich, Switzerland
* Corresponding author
† Equal contributors
4. DISKUSSION
Das Wissen über die Struktur von Genen und Proteinen ist Voraussetzung für eine Nutzung als potenzielle therapeutische Ziele, Marker oder für die Aufdeckung von Mechanismen, die an relevanten pathogenen Ereignissen beteiligt sind.
Die Beteiligung der Proteine der High Mobility Group A1 an verschiedenen Zellprozessen wurde vielfach beschrieben [39-41, 68]. Diese Proteine induzieren Konformationsänderungen auf genomischer DNA Ebene und regulieren so indirekt die Bindung von unterschiedlichen Transkriptionsfaktoren [30].
Beim Menschen wurden chromosomale Aberrationen des HMGA1 Genlocus auf HSA 6p21 als Grund für verschiedene gutartige mesenchymale Tumore beschrieben, während hohe Konzentrationen von HMGA1 Proteinen mit einem malignen Potential unterschiedlicher Tumortypen in Verbindung gebracht werden [39-41].
Da es im biologischen Verhalten und den jeweiligen Erscheinungsbildern von Tumoren viele Parallelen zwischen Mensch und Hund gibt, wird der Hund als Model für therapeutische und vorklinische Studien herangezogen [69, 70]. Das Genom des Hundes wurde zwar vollständig sequenziert, die Struktur des HMGA1 - Gens konnte jedoch bislang nicht evaluiert werden, was in der vorliegenden Arbeit erfolgte.
Um vergleichende Studien zwischen caninen und humanen Tumoren erstellen zu können, ist das Verständnis/ die Kenntnis der jeweiligen caninen Kandidatengene sowie deren Genprodukte eine Grundvoraussetzung. Die Struktur des HMGA1 – Gens konnte nun in der vorliegenden Arbeit entschlüsselt und beschrieben werden.
Das Hauptziel der Studie war es, die genomische Struktur des caninen HMGA1 - Gens zu charakterisieren, um einen Vergleich der Struktur mit den Gegenstücken anderer Säugetiere zu ermöglichen und somit weitere Analysen zur evolutionären
Konservierung der Gene und eine vergleichende Analyse von eventuellen chromosomalen Abberationen bei verschiedenen Arten zu erlauben.
Weitere Ziele dieser Arbeit bestanden in der in vivo Lokalisierung des caninen HMGA1 Proteins und die Evaluation einer im Vorfeld beschriebenen Punktmutation, die ein mutiertes Protein verursacht.
Während frühere Studien die Lokalisierung einer HMGA1 - Gen positiven BAC auf CFA 23 [71] beschrieben, unterstützen die durchgeführten in silico Analysen und die kürzlich veröffentlichte Genom Anordnung des Hundes [12] die in dieser Untersuchung durch FISH beschriebene Zuordnung des hündischen HMGA1 - Gens auf CFA 12q11.
Die genomische Struktur des caninen HMGA1 - Gens besteht insgesamt aus 7 Exons und 6 Introns. Insgesamt umfasst das canine HMGA1 - Gensequenz 9524 bp.
Ein Teil des caninen Intron 2 blieb aufgrund einer vielfachen CG Wiederholung unsequenziert, es konnte lediglich die Anzahl der Nukleotiden mit 311bp bestimmt werden. Eine solche Sequenz existiert ebenso im menschlichen Genom.
Die Exon/Intron Struktur, Größe und Homologien zu ihren menschlichen Gegenstücken wurden analysiert und bestimmt.
Die Identität zu der entsprechenden humanen Region beträgt 62,8 %, wobei die Homologie zu den menschlichen Gegenstücken im Einzelnen bei den Exons zwischen 74,6 % und 97,8 %, bei den Introns zwischen 58,9 % und 92,4 % schwanken.
Die neu charakterisierten Sequenzen haben in Verbindung mit den in silico Analysen aufgedeckt, dass das Exon 4, welches beim Menschen existiert, im caninen, wie im Übrigen auch im entsprechenden Gen der Maus, fehlt.
Da die genomische Charakterisierung des caninen HMGA1 - Gens nicht verfügbar war, als die Exonen in der Vergangenheit benannt wurden, beruhte die Nummerierung zu der Zeit auf den entsprechenden menschlichen Exon- Nummerierung, wie sie von Friedmann et al.[32] definiert wurden. Demzufolge sollte die bisher verwendete canine Exon-Nummerierung in dem Sinne überarbeitet
werden, dass das bisherige canine Exon 5 nun als Exon 4 und fortlaufend bezeichnet wird.
Bei der Charakterisierung des canine HMGA1 - CDS von zwölf Hunderassen zeigte ein Dackel in Exon 6 eine Punktmutation von A nach G. Dies hatte einen Aminosäurenaustausch von Threonin nach Alanin zur Folge [1].
Um die Häufigkeit dieser Mutation zu evaluieren, wurden DNA-Proben von 55 Dackeln untersucht.
Das mittels Sequenzierung und Restriktions-Fragment-Analyse ermittelte Ergebnis zeigt deutlich, dass es sich um ein seltenes Ergebnis handelt. Bei der vorliegenden Untersuchung des Genoms von 55 Teckeln wurde die gesuchte Punktmutation in keinem Fall gefunden. Betrachtet man das Ergebnis dieser Untersuchung isoliert, ergibt sich gemäß Sachs [72], Formel 6.28, ein Konfidenzintervall von 0,00% bis 2,69%. Bezieht man hingegen den bereits auf einem Allel nachgewiesenen SNP mit in die Berechnung, so lässt sich eine wahre Wahrscheinlichkeit von 0,893%
vermuten. Der 95% - Vertrauensbereich liegt in diesem Fall bei 0,023% bis 4,9%.
Somit deutet dieses Ergebnis darauf hin, dass die vormals gefundene Mutation wahrscheinlich keine wichtige Rolle in der HMGA1 Pathogenese bei Dackeln spielt.
Bei verschiedenen Spezies werden deutliche Unterschiede im Hinblick auf Anzahl und Wahrscheinlichkeit auftretender SNPs beschrieben, wobei diese Tatsache im direkten Zusammenhang mit der Gesamtzahl der Studien für die unterschiedlichen Spezies zu sehen ist. Es kann angenommen werden, dass ebenso wie bei dem Menschen die Gesamtzahl der gefunden SNPs bei den einzelnen Spezies mit entsprechend höherem Forschungsaufwand signifikant ansteigen wird.
Während 2001 Sachidanandam et al. [10] 1,42 Mio SNPs im menschlichen Genom bei einem SNP pro 1,9 kb bestimmten, wird die Anzahl von berichteten SNPs in den öffentlichen Datenbanken mit ca. 9 Mio. für das menschliche Genom geschätzt [11].
Für den Hund berichteten Lindblad-Toh et al. von 2,5 Mio SNPs, wobei die Wahrscheinlichkeit abhängig von der Rasse zwischen einem SNP pro 1500 bp und 900 bp schwankt [12].
Mittels in vivo Lokalisierung des caninen HMGA1 Proteins unter Verwendung eines GFP Fusionsproteins konnte der seinem menschlichen Gegenstück entsprechende Ort (im Zellkern) nachgewiesen werden.
In der vorliegenden Arbeit konnte das canine THADA – Gen auf der chromosomalen Bande 10q25 lokalisiert werden. Es wurde untersucht, ob diese Lokalisation als Hotspot zu sehen ist für chromosomale Mutationen der Schilddrüse. Durch die vorgenommene Lokalisation ist es nun möglich zu untersuchen, ob das canine THADA – Gen eine Rolle als Kandidatengen bei caninen Schilddrüsenadenomen eine Rolle. Obgleich es bezüglich zytogenetischer Daten canine Schilddrüsenadenome betreffend in der Literatur noch mangelt, kann man aufgrund der vorgenommenen Gen-Lokalistion und der beschriebenen zytogenetischen Untersuchungen davon ausgehen, dass die Region, auf welcher das THADA – Gen lokalisiert werden konnte, nicht als Hotspot für die Entstehung chromosomaler Aberrationen gesehen werden kann.
Die durchgeführten Charakterisierungen des caninen HMGA1 Gens und Proteins erlaubt eine vergleichende Analyse von Abweichungen bezüglich der Gene und Proteine von Menschen und Hunden als Grundlage für die Aufdeckung von Mechanismen, die an HMGA1 bezogenen Pathogenesen bei beiden Spezies beteiligt sind. Die durchgeführten Lokalisationen des caninen HMGA1 und THADA Gens ermöglichen die Untersuchungen, ob die Loki dieser Gene von chromosomalen Abberationen betroffen sind.
5
.ZUSAMMENFASSUNG
Claudia Beuing
Charakterisierung des Caninen High – Mobility – Group A1 (HMGA1) Gens und Detektion von Punktmutationen
In der vorliegenden Arbeit wurden molekularbiologische Untersuchungen am caninen HMGA1 – Gen sowie des THADA – Gen durchgeführt.
Dabei ging es zum einen um die Evaluierung einer bereits bei einem Teckel gefundenen Punktmutation auf dem HMGA1 – Gen.
Bei der vorliegenden Untersuchung des Genoms von 55 Teckeln wurde die gesuchte Punktmutation in keinem Fall gefunden. Man kann also sagen, dass das Vorkommen der gesuchten Genveränderung als sehr unwahrscheinlich einzuschätzen und die Relevanz für die Gesamtpopulation an Teckeln als fraglich anzusehen ist.
Im weiteren Verlauf der Arbeit konnten große Teile der genomischen Struktur des HMGA1 – Gens charakterisiert sowie dessen genaue Lokalisation auf CFA 12q11 (Canis familiaris) festgelegt werden.
Die in vivo Lokalisierung des caninen HMGA1 Proteins zeigte, dass dieses entsprechend seinem humanen Gegenstück im Nukleus lokalisiert ist.
Das canine THADA – Gen konnte auf der chromosomalen Bande 10q25 lokalisiert werden. Die vorliegende Untersuchung ergab, dass das canine THADA – Gen auf einer chromosomalen Region lokalisiert ist, welche bei Hunden keinen Hotspot für chromosomale Aberrationen darstellt.
6. SUMMARY
Claudia Beuing
Genomic characterisation of the canine High – Mobility – Group A1 (HMGA1) gene and detection of pointmutations
In the present dissertation a molecular biological investigation of the canine HMGA1 – gene as well as the THADA – gene was conducted.
This consisted on one hand of the evaluation of a previously described point mutations of the HMGA1 – gene in the dachshund.
In the present study of the genomes of 55 dachshunds the targeted pointmutation was not found in a single case. One can therefore say that the occurrence of the gene mutation under investigation is very improbable and the relevance for the general population of dachshunds is to be regarded as questionable.
On the other hand in the further stages of the study part of the genomic structure of the HGMA1 – gene were characterized and its precise localization on the CFA 12q11 (Canis familiaris) was performed.
The in vivo localization of the canine HMGA1 proteins showed that equivalently to its human counterpart the protein is located in the nucleus.
The canine THADA – gene could be localized on chromosomal band 10q25. The present study shows that the canine THADA – gene is located in a region, which does not represent a hotspot for chromosomal aberration in dogs.
7. LITERATURVERZEICHNIS
1. Murua Escobar H, Soller JT, Richter A, Meyer B, Winkler S, Flohr AM, Nolte I, Bullerdiek J: The canine HMGA1. Gene, 2004. 330: p. 93-9.
2. Kazmierczak B, Wanschura S, Rommel B, Bartnitzke S, Bullerdiek J: Ten pulmonary chondroid hamartomas with chromosome 6p21 breakpoints within the HMG-I(Y) gene or its immediate surroundings. J Natl Cancer Inst, 1996. 88(17): p. 1234-6.
3. Dal Cin P, Fusco A, Belge G, Chiappetta G, Fedele M, Pauwels P, Bullerdiek J,Van den Berghe H: Involvement of the HMGI(Y) gene in a microfollicular adenoma of the thyroid. Genes Chromosomes Cancer, 1999. 24(3): p. 286-9.
4. Bomhard D von, Praxis der Onkologie bei Hund und Katze : Epidemiologie. 2001, Stuttgart: Enke. IV, 118 S3777314714 (kart.).
5. Rippe V, Drieschner N, Meiboom M, Murua Escobar H, Bonk U, Belge G, Bullerdiek J: Identification of a gene rearranged by 2p21 aberrations in thyroid adenomas.
Oncogene, 2003. 22(38): p. 6111-4.
6. Tilghman SM, Tiemeier DC, Seidman JG, Peterlin BM, Sullivan M, Maizel JV, Leder P: Intervening sequence of DNA identified in the structural portion of a mouse beta- globin gene. Proc Natl Acad Sci U S A, 1978. 75(2): p. 725-9.
7. Nowell PC: The minute chromosome (Phl) in chronic granulocytic leukemia. Blut, 1962. 8: p. 65-6.
8. Rowley JD: Letter: A new consistent chromosomal abnormality in chronic
myelogenous leukaemia identified by quinacrine fluorescence and Giemsa staining.
Nature, 1973. 243(5405): p. 290-3.
9. Kruglyak L, Nickerson DA: Variation is the spice of life. Nat Genet, 2001. 27(3): p.
234-6.
10. Sachidanandam R, Weissman D, Schmidt SC, Kakol JM, Stein LD, Marth G, Sherry S, Mullikin JC, Mortimore BJ, Willey DL, Hunt SE, Cole CG, Coggill PC, Rice CM, Ning Z, Rogers J, Bentley DR, Kwok PY, Mardis ER, Yeh RT, Schultz B, Cook L, Davenport R, Dante M, Fulton L, Hillier L, Waterston RH, McPherson JD, Gilman B, Schaffner S, Van Etten WJ, Reich D, Higgins J, Daly MJ, Blumenstiel B, Baldwin J, Stange-Thomann N, Zody MC, Linton L, Lander ES, Altshuler D: A map of human genome sequence variation containing 1.42 million single nucleotide polymorphisms.
Nature, 2001. 409(6822): p. 928-33.
11. Kim S, Misra A: SNP genotyping: technologies and biomedical applications. Annu Rev Biomed Eng, 2007. 9: p. 289-320.
12. Lindblad-Toh K, Wade CM, Mikkelsen TS, Karlsson EK, Jaffe DB, Kamal M, Clamp M, Chang JL, Kulbokas EJ, 3rd, Zody MC, Mauceli E, Xie X, Breen M, Wayne RK, Ostrander EA, Ponting CP, Galibert F, Smith DR, DeJong PJ, Kirkness E, Alvarez P, Biagi T, Brockman W, Butler J, Chin CW, Cook A, Cuff J, Daly MJ, DeCaprio D,
Gnerre S, Grabherr M, Kellis M, Kleber M, Bardeleben C, Goodstadt L, Heger A, Hitte C, Kim L, Koepfli KP, Parker HG, Pollinger JP, Searle SM, Sutter NB, Thomas R, Webber C, Baldwin J, Abebe A, Abouelleil A, Aftuck L, Ait-Zahra M, Aldredge T, Allen N, An P, Anderson S, Antoine C, Arachchi H, Aslam A, Ayotte L, Bachantsang P, Barry A, Bayul T, Benamara M, Berlin A, Bessette D, Blitshteyn B, Bloom T, Blye J, Boguslavskiy L, Bonnet C, Boukhgalter B, Brown A, Cahill P, Calixte N, Camarata J, Cheshatsang Y, Chu J, Citroen M, Collymore A, Cooke P, Dawoe T, Daza R, Decktor K, DeGray S, Dhargay N, Dooley K, Dooley K, Dorje P, Dorjee K, Dorris L, Duffey N, Dupes A, Egbiremolen O, Elong R, Falk J, Farina A, Faro S, Ferguson D, Ferreira P, Fisher S, FitzGerald M, Foley K, Foley C, Franke A, Friedrich D, Gage D, Garber M, Gearin G, Giannoukos G, Goode T, Goyette A, Graham J, Grandbois E, Gyaltsen K, Hafez N, Hagopian D, Hagos B, Hall J, Healy C, Hegarty R, Honan T, Horn A, Houde N, Hughes L, Hunnicutt L, Husby M, Jester B, Jones C, Kamat A, Kanga B, Kells C, Khazanovich D, Kieu AC, Kisner P, Kumar M, Lance K, Landers T, Lara M, Lee W, Leger JP, Lennon N, Leuper L, LeVine S, Liu J, Liu X, Lokyitsang Y, Lokyitsang T, Lui A, Macdonald J, Major J, Marabella R, Maru K, Matthews C, McDonough S, Mehta T, Meldrim J, Melnikov A, Meneus L, Mihalev A, Mihova T, Miller K, Mittelman R, Mlenga V, Mulrain L, Munson G, Navidi A, Naylor J, Nguyen T, Nguyen N, Nguyen C, Nguyen T, Nicol R, Norbu N, Norbu C, Novod N, Nyima T, Olandt P, O'Neill B, O'Neill K, Osman S, Oyono L, Patti C, Perrin D, Phunkhang P, Pierre F, Priest M, Rachupka A, Raghuraman S, Rameau R, Ray V, Raymond C, Rege F, Rise C, Rogers J, Rogov P, Sahalie J, Settipalli S, Sharpe T, Shea T, Sheehan M, Sherpa N, Shi J, Shih D, Sloan J, Smith C, Sparrow T, Stalker J, Stange-Thomann N, Stavropoulos S, Stone C, Stone S, Sykes S, Tchuinga P, Tenzing P, Tesfaye S, Thoulutsang D, Thoulutsang Y, Topham K, Topping I, Tsamla T, Vassiliev H,
Venkataraman V, Vo A, Wangchuk T, Wangdi T, Weiand M, Wilkinson J, Wilson A, Yadav S, Yang S, Yang X, Young G, Yu Q, Zainoun J, Zembek L, Zimmer A, Lander ES: Genome sequence, comparative analysis and haplotype structure of the domestic dog. Nature, 2005. 438(7069): p. 803-19.
13. Wong GK, Liu B, Wang J, Zhang Y, Yang X, Zhang Z, Meng Q, Zhou J, Li D, Zhang J, Ni P, Li S, Ran L, Li H, Zhang J, Li R, Li S, Zheng H, Lin W, Li G, Wang X, Zhao W, Li J, Ye C, Dai M, Ruan J, Zhou Y, Li Y, He X, Zhang Y, Wang J, Huang X, Tong W, Chen J, Ye J, Chen C, Wei N, Li G, Dong L, Lan F, Sun Y, Zhang Z, Yang Z, Yu Y, Huang Y, He D, Xi Y, Wei D, Qi Q, Li W, Shi J, Wang M, Xie F, Wang J, Zhang X, Wang P, Zhao Y, Li N, Yang N, Dong W, Hu S, Zeng C, Zheng W, Hao B, Hillier LW, Yang SP, Warren WC, Wilson RK, Brandstrom M, Ellegren H, Crooijmans RP, van der Poel JJ, Bovenhuis H, Groenen MA, Ovcharenko I, Gordon L, Stubbs L, Lucas S, Glavina T, Aerts A, Kaiser P, Rothwell L, Young JR, Rogers S, Walker BA, van Hateren A, Kaufman J, Bumstead N, Lamont SJ, Zhou H, Hocking PM, Morrice D, de Koning DJ, Law A, Bartley N, Burt DW, Hunt H, Cheng HH, Gunnarsson U, Wahlberg P, Andersson L, Kindlund E, Tammi MT, Andersson B, Webber C, Ponting CP, Overton IM, Boardman PE, Tang H, Hubbard SJ, Wilson SA, Yu J, Wang J,Yang H: A genetic variation map for chicken with 2.8 million single-nucleotide
polymorphisms. Nature, 2004. 432(7018): p. 717-22.
14. Pal P, Xi H, Sun G, Kaushal R, Meeks JJ, Thaxton CS, Guha S, Jin CH, Suarez BK, Catalona WJ,Deka R: Tagging SNPs in the kallikrein genes 3 and 2 on 19q13 and their associations with prostate cancer in men of European origin. Hum Genet, 2007.
15. Oh JJ, Koegel AK, Phan DT, Razfar A,Slamon DJ: The two single nucleotide polymorphisms in the H37/RBM5 tumour suppressor gene at 3p21.3 correlated with different subtypes of non-small cell lung cancers. Lung Cancer, 2007 ; 58(1):7-14.
16. Chen K, Hu Z, Wang LE, Sturgis EM, El-Naggar AK, Zhang W,Wei Q: Single nucleotide polymorphisms at the TP53-binding or responsive promoter regions of BAX and BCL2 genes and risk of squamous cell carcinoma of the head and neck.
Carcinogenesis, 2007 Sep;28(9):2008-12. Epub 2007 Aug 11.
17. Aguillon JC, Cruzat A, Aravena O, Salazar L, Llanos C,Cuchacovich M: Could single-nucleotide polymorphisms (SNPs) affecting the tumour necrosis factor promoter be considered as part of rheumatoid arthritis evolution? Immunobiology, 2006. 211(1-2): p. 75-84.
18. Khurana VG, Fox DJ, Meissner I, Meyer FB,Spetzler RF: Update on evidence for a genetic predisposition to cerebral vasospasm. Neurosurg Focus, 2006. 21(3): p. E3.
19. Peeters RP, van der Deure WM,Visser TJ: Genetic variation in thyroid hormone pathway genes; polymorphisms in the TSH receptor and the iodothyronine deiodinases. Eur J Endocrinol, 2006. 155(5): p. 655-62.
20. Sunthornthepvarakul T, Hayashi Y,Refetoff S: Polymorphism of a variant human thyrotropin receptor (hTSHR) gene. Thyroid, 1994. 4(2): p. 147-9.
21. Gustavsson B, Eklof C, Westermark K, Westermark B,Heldin NE: Functional
analysis of a variant of the thyrotropin receptor gene in a family with Graves' disease.
Mol Cell Endocrinol, 1995. 111(2): p. 167-73.
22. Gabriel EM, Bergert ER, Grant CS, van Heerden JA, Thompson GB,Morris JC:
Germline polymorphism of codon 727 of human thyroid-stimulating hormone receptor is associated with toxic multinodular goiter. J Clin Endocrinol Metab, 1999. 84(9): p.
3328-35.
23. Dykxhoorn DM, Schlehuber LD, London IM,Lieberman J: Determinants of specific RNA interference-mediated silencing of human beta-globin alleles differing by a single nucleotide polymorphism. Proc Natl Acad Sci U S A, 2006. 103(15): p. 5953-8.
24. A.C. M, S. B,B. K: Phenylketonurie und Hyperphenylalaninämie. Monatsschr Kinderheilkd 2000. 148: p. 179-193.
25. Burger J, Kirchner M, Bramanti B, Haak W,Thomas MG: Absence of the lactase- persistence-associated allele in early Neolithic Europeans. Proc Natl Acad Sci U S A, 2007. 104(10): p. 3736-41.
26. Murua Escobar H, Gunther K, Richter A, Soller JT, Winkler S, Nolte I,Bullerdiek J:
Absence of ras-gene hot-spot mutations in canine fibrosarcomas and melanomas.
Anticancer Res, 2004. 24(5A): p. 3027-8.
27. Richter A, Murua Escobar H, Gunther K, Meyer B, Winkler S, Dolf G, Schelling C, Nolte I,Bullerdiek J: The canine NRAS gene maps to CFA 17. Anim Genet, 2004.
35(4): p. 355-6.
28. Schwanbeck R, Gerharz M, Drung A, Rogalla P, Piekielko A, Blank C, Bullerdiek J,Wisniewski JR: Point mutations within AT-hook domains of the HMGI homologue HMGIYL1 affect binding to gene promoter but not to four-way junction DNA.
Biochemistry, 2000. 39(47): p. 14419-25.
29. Bustin M: Revised nomenclature for high mobility group (HMG) chromosomal proteins. Trends Biochem Sci, 2001. 26(3): p. 152-3.
30. Bustin M,Reeves R: High-mobility-group chromosomal proteins: architectural
components that facilitate chromatin function. Prog Nucleic Acid Res Mol Biol, 1996.
54: p. 35-100.
31. Chau KY, Patel UA, Lee KL, Lam HY,Crane-Robinson C: The gene for the human architectural transcription factor HMGI-C consists of five exons each coding for a distinct functional element. Nucleic Acids Res, 1995. 23(21): p. 4262-6.
32. Friedmann M, Holth LT, Zoghbi HY,Reeves R: Organization, inducible-expression and chromosome localization of the human HMG-I(Y) nonhistone protein gene.
Nucleic Acids Res, 1993. 21(18): p. 4259-67.
33. Murua Escobar H, Soller JT, Richter A, Meyer B, Winkler S, Bullerdiek J,Nolte I:
"Best friends" sharing the HMGA1 gene: comparison of the human and canine HMGA1 to orthologous other species. J Hered, 2005. 96(7): p. 777-81.
34. Chiappetta G, Avantaggiato V, Visconti R, Fedele M, Battista S, Trapasso F, Merciai BM, Fidanza V, Giancotti V, Santoro M, Simeone A,Fusco A: High level expression of the HMGI (Y) gene during embryonic development. Oncogene, 1996. 13(11): p.
2439-46.
35. Pellacani A, Chin MT, Wiesel P, Ibanez M, Patel A, Yet SF, Hsieh CM, Paulauskis JD, Reeves R, Lee ME,Perrella MA: Induction of high mobility group-I(Y) protein by endotoxin and interleukin-1beta in vascular smooth muscle cells. Role in activation of inducible nitric oxide synthase. J Biol Chem, 1999. 274(3): p. 1525-32.
36. Diana F, Sgarra R, Manfioletti G, Rustighi A, Poletto D, Sciortino MT, Mastino A,Giancotti V: A link between apoptosis and degree of phosphorylation of high mobility group A1a protein in leukemic cells. J Biol Chem, 2001. 276(14): p. 11354- 61.
37. Tamimi Y, van der Poel HG, Denyn MM, Umbas R, Karthaus HF, Debruyne FM,Schalken JA: Increased expression of high mobility group protein I(Y) in high grade prostatic cancer determined by in situ hybridization. Cancer Res, 1993. 53(22):
p. 5512-6.
38. Chiappetta G, Manfioletti G, Pentimalli F, Abe N, Di Bonito M, Vento MT, Giuliano A, Fedele M, Viglietto G, Santoro M, Watanabe T, Giancotti V,Fusco A: High mobility group HMGI(Y) protein expression in human colorectal hyperplastic and neoplastic diseases. Int J Cancer, 2001. 91(2): p. 147-51.
39. Williams AJ, Powell WL, Collins T,Morton CC: HMGI(Y) expression in human uterine leiomyomata. Involvement of another high-mobility group architectural factor in a benign neoplasm. Am J Pathol, 1997. 150(3): p. 911-8.
40. Kazmierczak B, Dal Cin P, Wanschura S, Borrmann L, Fusco A, Van den Berghe H,Bullerdiek J: HMGIY is the target of 6p21.3 rearrangements in various benign mesenchymal tumors. Genes Chromosomes Cancer, 1998. 23(4): p. 279-85.
41. Tallini G, Vanni R, Manfioletti G, Kazmierczak B, Faa G, Pauwels P, Bullerdiek J, Giancotti V, Van Den Berghe H,Dal Cin P: HMGI-C and HMGI(Y) immunoreactivity correlates with cytogenetic abnormalities in lipomas, pulmonary chondroid
hamartomas, endometrial polyps, and uterine leiomyomas and is compatible with rearrangement of the HMGI-C and HMGI(Y) genes. Lab Invest, 2000. 80(3): p. 359- 69.
42. Blank C, Rogalla P, Tran KH,Bullerdiek J: A novel high mobility group protein gene is a candidate for Xp22 abnormalities in uterine leiomyomas and other benign tumors.
Cancer Genet Cytogenet, 2000. 121(2): p. 172-80.
43. Pierantoni GM, Battista S, Pentimalli F, Fedele M, Visone R, Federico A, Santoro M, Viglietto G,Fusco A: A truncated HMGA1 gene induces proliferation of the 3T3-L1 pre-adipocytic cells: a model of human lipomas. Carcinogenesis, 2003. 24(12): p.
1861-9.
44. Chiappetta G, Bandiera A, Berlingieri MT, Visconti R, Manfioletti G, Battista S, Martinez-Tello FJ, Santoro M, Giancotti V,Fusco A: The expression of the high mobility group HMGI (Y) proteins correlates with the malignant phenotype of human thyroid neoplasias. Oncogene, 1995. 10(7): p. 1307-14.
45. Fedele M, Bandiera A, Chiappetta G, Battista S, Viglietto G, Manfioletti G, Casamassimi A, Santoro M, Giancotti V,Fusco A: Human colorectal carcinomas express high levels of high mobility group HMGI(Y) proteins. Cancer Res, 1996.
56(8): p. 1896-901.
46. Bandiera A, Bonifacio D, Manfioletti G, Mantovani F, Rustighi A, Zanconati F, Fusco A, Di Bonito L,Giancotti V: Expression of HMGI(Y) proteins in squamous
intraepithelial and invasive lesions of the uterine cervix. Cancer Res, 1998. 58(3): p.
426-31.
47. Abe N, Watanabe T, Sugiyama M, Uchimura H, Chiappetta G, Fusco A,Atomi Y:
Determination of high mobility group I(Y) expression level in colorectal neoplasias: a potential diagnostic marker. Cancer Res, 1999. 59(6): p. 1169-74.
48. Abe N, Watanabe T, Masaki T, Mori T, Sugiyama M, Uchimura H, Fujioka Y, Chiappetta G, Fusco A,Atomi Y: Pancreatic duct cell carcinomas express high levels of high mobility group I(Y) proteins. Cancer Res, 2000. 60(12): p. 3117-22.
49. Balcerczak M, Pasz-Walczak G, Balcerczak E, Wojtylak M, Kordek R,Mirowski M:
HMGI(Y) gene expression in colorectal cancer: comparison with some histological typing, grading, and clinical staging. Pathol Res Pract, 2003. 199(10): p. 641-6.
50. Czyz W, Balcerczak E, Jakubiak M, Pasieka Z, Kuzdak K,Mirowski M: HMGI(Y) gene expression as a potential marker of thyroid follicular carcinoma. Langenbecks Arch Surg, 2004. 389(3): p. 193-7.
51. Takaha N, Resar LM, Vindivich D,Coffey DS: High mobility group protein HMGI(Y) enhances tumor cell growth, invasion, and matrix metalloproteinase-2 expression in prostate cancer cells. Prostate, 2004. 60(2): p. 160-7.
52. Diana F, Di Bernardo J, Sgarra R, Tessari MA, Rustighi A, Fusco A, Giancotti V,Manfioletti G: Differential HMGA expression and post-translational modifications in prostatic tumor cells. Int J Oncol, 2005. 26(2): p. 515-20.
53. Frasca F, Rustighi A, Malaguarnera R, Altamura S, Vigneri P, Del Sal G, Giancotti V, Pezzino V, Vigneri R,Manfioletti G: HMGA1 inhibits the function of p53 family members in thyroid cancer cells. Cancer Res, 2006. 66(6): p. 2980-9.
54. Jiang X,Wang Y: Acetylation and phosphorylation of high-mobility group A1 proteins in PC-3 human tumor cells. Biochemistry, 2006. 45(23): p. 7194-201.
55. Liau SS, Jazag A,Whang EE: HMGA1 is a determinant of cellular invasiveness and in vivo metastatic potential in pancreatic adenocarcinoma. Cancer Res, 2006. 66(24): p.
11613-22.
56. Sarhadi VK, Wikman H, Salmenkivi K, Kuosma E, Sioris T, Salo J, Karjalainen A, Knuutila S,Anttila S: Increased expression of high mobility group A proteins in lung cancer. J Pathol, 2006. 209(2): p. 206-12.
57. Grade M, Hormann P, Becker S, Hummon AB, Wangsa D, Varma S, Simon R, Liersch T, Becker H, Difilippantonio MJ, Ghadimi BM,Ried T: Gene expression profiling reveals a massive, aneuploidy-dependent transcriptional deregulation and distinct differences between lymph node-negative and lymph node-positive colon carcinomas. Cancer Res, 2007. 67(1): p. 41-56.
58. Liau SS, Jazag A, Ito K,Whang EE: Overexpression of HMGA1 promotes anoikis resistance and constitutive Akt activation in pancreatic adenocarcinoma cells. Br J Cancer, 2007. 96(6): p. 993-1000.
59. Breen M, Bullerdiek J,Langford CF: The DAPI banded karyotype of the domestic dog (Canis familiaris) generated using chromosome-specific paint probes. Chromosome Res, 1999b. 7(5): p. 401-6.
60. Reimann N, Bartnitzke S, Nolte I,Bullerdiek J: Working with canine chromosomes:
current recommendations for karyotype description. J Hered, 1999. 90(1): p. 31-4.
61. Graphodatsky AS, Beklemisheva VR,Dolf G: High-resolution GTG-banding patterns of dog and silver fox chromosomes: description and comparative analysis. Cytogenet Cell Genet, 1995. 69(3-4): p. 226-31.
62. Reimann N, Bartnitzke S, Bullerdiek J, Schmitz U, Rogalla P, Nolte I,Ronne M: An extended nomenclature of the canine karyotype. Cytogenet Cell Genet, 1996. 73(1-2):
p. 140-4.
63. Breen M, Thomas R, Binns MM, Carter NP,Langford CF: Reciprocal chromosome painting reveals detailed regions of conserved synteny between the karyotypes of the domestic dog (Canis familiaris) and human. Genomics, 1999a. 61(2): p. 145-55.
64. Selden JR, Moorhead PS, Oehlert ML,Patterson DF: The Giemsa banding pattern of the canine karyotype. Cytogenet Cell Genet, 1975. 15(6): p. 380-7.
65. Switonski M. (coordinator) FP, Reimann N., Bartnitzke S., Bullerdiek J., Ronne M., Pieńkowska A., Ładoń D., Graphodatskey A., Beklemisheva V., Long S., Bosma A., Moreno-Mil . .American Kennel Club. . International efforts for establishing
standard karyotype of the dog (Canis familiaris). in Molecular Genetics Canine Genetic Health Conference. 1994. Frederiksberg.
66. Switonski M, Reimann N, Bosma AA, Long S, Bartnitzke S, Pienkowska A, Moreno- Milan MM,Fischer P: Report on the progress of standardization of the G-banded canine (Canis familiaris) karyotype. Committee for the Standardized Karyotype of the Dog (Canis familiaris). Chromosome Res, 1996. 4(4): p. 306-9.
67. Shimomura O, Johnson FH,Saiga Y: Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, Aequorea. J Cell Comp Physiol, 1962. 59: p. 223-39.
68. Foti D, Chiefari E, Fedele M, Iuliano R, Brunetti L, Paonessa F, Manfioletti G, Barbetti F, Brunetti A, Croce CM, Fusco A,Brunetti A: Lack of the architectural factor HMGA1 causes insulin resistance and diabetes in humans and mice. Nat Med, 2005. 11(7): p. 765-73.
69. Kuska B: Sit, DNA, sit: cancer genetics going to the dogs. J Natl Cancer Inst, 1999.
91(3): p. 204-6.
70. Hahn KA, Bravo L, Adams WH,Frazier DL: Naturally occurring tumors in dogs as comparative models for cancer therapy research. In Vivo, 1994. 8(1): p. 133-43.
71. Becker K, Murua Escobar H, Richter A, Meyer B, Nolte I,Bullerdiek J: The canine HMGA1 gene maps to CFA 23. Anim Genet, 2003. 34(1): p. 68-9.
72. Sachs L, Hedderich, J. , Angewandte Statistik. 2006: Springer Verlag 978-3-540- 32160-6.
DANKSAGUNG
Ich danke Herrn Prof. Dr. I. Nolte und Prof. Dr. J. Bullerdiek für die Überlassung des interessanten Themas sowie die jederzeit gewährte fachliche Unterstützung bei der Erstellung der Arbeit.
Besonderer Dank gilt Herrn Dr. Hugo Murua Escobar für die großartige Hilfe und sehr starken Nerven bei Erklärungen und der Lösung von für mich scheinbar unüberwindbaren Problemen. Und natürlich für jede Menge Spaß!
Meiner Arbeitsgruppe danke ich für die vielen fachlichen Hilfestellungen und die lieb gemeinten Versuche, einer Tierärztin die Molekularbiologie nahe zu bringen.
Michaela Muth gab mir nicht nur fachliche Unterstützung, sondern war auch und im Besonderen in sehr schweren Zeiten mit viel Herz und Verständnis immer für mich da.
Meinem Schwesterherz Diana Brunnhuber, meinem Lieblingsschwager Martin K.S.
Brunnhuber, Lieblingstante Jutta Hüppop und Lieblingsonkel Dr. Egbert Casper danke ich für die vielen seelischen Aufbauarbeiten und technischen Hilfestellungen, die mir aus manchem Tief halfen.
Ein ganz besonderer Dank gilt meinen Eltern Wolfgang und Brigitte Oehm, die mich auf beispiellose Art jederzeit unterstützen und immer an mich glauben.
Ich danke „Mima“ für die täglichen Telefonate, die vielen „Noteinsätze“ bei der Betreuung von Niklas und Moritz und die liebevolle Fürsorge, mit der sie zu jeder Zeit für uns da ist.
„Pipa“ danke ich für die zahllosen Gespräche, sachlich fundierten und gleichzeitig liebevollen Ratschläge und das Gefühl jederzeit von einem guten Freund begleitet zu werden. Am allermeisten aber für die Einstellung, dass ein Glas höchstens halb voll, nie aber halb leer sein kann.
Last but not least danke ich meinen Söhnen Niklas und Moritz, die mir mit ihrer wundervollen Art jeden Tag neuen Mut gaben, an meinem Ziel festzuhalten.
