Translationsregulation des
Transkriptionsfaktors NRF: Strukturelle und funktionelle Charakterisierung von NRF-IRES
Dissertation
zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin in der Medizinischen Hochschule Hannover
vorgelegt von
Isabelle Renger aus Wolfsburg
Hannover, 2008
Angenommen vom Senat
der Medizinischen Hochschule Hannover am: 26.08.08
Gedruckt mit der Genehmigung der Medizinischen Hochschule Hannover
Präsident : Prof. Dr. Dieter Bitter-Suermann Betreuerin der Arbeit : PD Dr. rer. nat. Mahtab Nourbakhsh Referent/Referentin : PD Dr. rer. nat. Fred Hofmann Koreferent(en)/Koreferentin(nen) : PD Dr. rer. nat. Detlef Neumann
Tag der mündlichen Prüfung : 26.08.08
Promotionsausschussmitglieder : Prof. Dr. med. Johannes Wilhelm Bigalke Prof. Dr. rer. nat. Gerhard Schumann Prof. Dr. med. Michael Gebel
Meinen Eltern
Doris und Wolfgang Renger
in Dankbarkeit gewidmet
Inhaltsverzeichnis Seite
1 EINLEITUNG 1
1.1 Translation bei Eukaryonten………..1
1.1.1 Mechanismus der Cap-abhängigen Translationsinitiation...1
1.1.2 Regulation der Translationsinitiation... 3
1.2 Cap-unabhängige Translationsinitiation: IRES-Elemente………..4
1.2.1 Virale IRES-Elemente...4
1.2.2 Zelluläre IRES-Elemente... 5
1.2.3 Translationsinitiation an IRES-Elementen... 6
1.2.4 IRES-Trans-Acting Factors (ITAFs)...9
1.3 Sekundärstruktur der IRES-Elemente……… 10
1.4 NRF-IRES………….……….. 11
1.4.1 NF-κB Repressing Factor (NRF)... 12
1.4.2 Das NRF-IRES-Element... 13
1.5 Aufgabenstellung……… 15
2 MATERIAL UND METHODEN 16 2.1 Material……….. 16
2.1.1 Chemikalien... 16
2.1.2 Puffer und Lösungen... 18
2.1.3 Antikörper und Enzyme... 19
2.1.4 DNA-, RNA- und Proteinstandards... 20
2.1.5 Nukleinsäuren...21
2.1.6 Zelllinien und Bakterienstämme... 22
2.1.7 Kulturmedien und Kulturagar... 22
2.1.8 Verbrauchsmaterialien...22
2.1.9 Geräte...23
2.1.10 Sonstiges...24
2.2 Methoden………... 26
2.2.1 Arbeiten mit Escherichia coli... 26
2.2.1.1 Kultivierung und Lagerung... 26
2.2.1.2 Herstellung hitzekompetenter E. coli... 26
2.2.1.3 Transformation nach Hitzeschockmethode... 26
2.2.2 Herstellung und Reinigung von Nukleinsäuren... 27
2.2.2.1 Präparation von Plasmid-DNA aus E.coli... 27
2.2.2.1 a Maxi-Präparation... 27
2.2.2.1 b Mini-Präparation... 28
2.2.2.2 Extraktion von DNA aus Agarosegelen... 28
2.2.2.2 a GFXTM DNA and Gel Band Purification Kit von Amersham Biosciences.... 28
2.2.2.2 b QIAquick Gel Extraction Kit von Qiagen... 29
2.2.2.3 Phenolextraktion und Ethanolpräzipitation... 29
2.2.2.4 DNA-Isolierung aus Restriktionslösungen... 30
2.2.2.5 Isolierung von RNA aus Säugerzellen... 30
2.2.2.6 Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren... 31
2.2.3 Modifikation von Nukleinsäuren...31
2.2.3.1 Restriktionsschnitte...31
2.2.3.1 a Analytische Restriktionsschnitte... 31
2.2.3.1 b Präparative Restriktionsschnitte...31
2.2.3.2 Ligation... 31
2.2.3.3 Polymerasekettenreaktion... 32
2.2.3.4 Mutagenese... 33
2.2.3.5 Radioaktive Markierung von DNA...33
2.2.4 Gelelektrophorese... 34
2.2.4.1 DNA-Gelelektrophorese...34
2.2.4.2 RNA-Gelelektrophorese...34
2.2.4.3 SDS-Gelelektrophorese... 34
2.2.5 Elektrophoretischer Transfer von Proteinen auf PVDF-Membran (Western Blot) und Detektion durch Antikörper... 35
2.2.6 Elektrophoretischer Transfer von Ribonukleinsäuren auf Nylonmembran (Northern Blot)... 36
2.2.6.1 Transfer... 36
2.2.6.2 Hybridisierung... 36
2.2.6.3 Stringenzwäsche... 37
2.2.7 Arbeiten mit eukaryontischen Zellen... 37
2.2.7.1 Kultivierung von HeLa B.-Zellen... 37
2.2.7.2 Langzeitlagerung von HeLa B.-Zellen... 38
2.2.7.3 Transfektion von HeLa B.-Zellen mittels Calciumphosphat-DNA- Kopräzipitation... 38
2.2.7.4 Induktion von HeLa B.-Zellen... 39
2.2.7.4 a Induktion von HeLa B.-Zellen mit dem Newcastle Desease-Virus... 39
2.2.7.4 b Induktion von HeLa B.-Zellen mit Interleukin-1... 39
2.2.7.5 Zelllyse zur Vorbereitung von Luziferase-Aktivitätsmessungen... 39
2.2.8 Proteinanalytik... 40
3 ERGEBNISSE 41
3.1 Bicistronisches Reportersystem zur Untersuchung von IRES-Sequenzen……… 41
3.2 Luziferase-Messungen zur Untersuchung der Aktivität desNRF-IRES- Elementes…...……….……….. 43
3.2.1 Konstruktion des Ausgangsvektors pRLNI0FL... 43
3.2.2 Luziferase-Messungen der Reportergenvektoren pRLNI0FL und pRLFL... 44
3.2.3 Nachweis der bicistronischen mRNA der Reportergenvektoren pRLNI0FL und pRLFL... 46
3.2.4 Konstruktion der Reportergenvektoren p0RLNI0FL und p0RLFL... 49
3.2.5 Luziferase-Messung der Reportergenvektoren p0RLNI0FL und p0RLFL... 52
3.2.6 Nachweis der bicistronischen mRNA der Reportergenvektoren p0RLNI0FL und p0RLFL... 53 3.3 Vergleich der Aktivität des NRF-IRES- mit dem Polio-IRES-Element…………....… 55
3.3.1 Konstruktion des Reportergenvektors p0RLPFL... 55
3.3.2 Luziferase-Messung der Reportergenvektoren p0RLNI0FL und p0RLPFL...56 3.4 Strukturanalyse des NRF-IRES………58 3.5 Mutationsanalyse zur Untersuchung der Struktur-Funktions-Beziehung im minimalen IRES-Element………. 60
3.5.1 Konstruktion der Reportergenvektoren p0RLNI0FL Pst, p0RLNI0FL CG und p0RLNI0FL D1... 60
3.5.2 Luziferase-Messung der Reportergenvektoren p0RLNI0FL Pst, p0RLNI0FL CG und p0RLNI0FL D1... 63
3.5.3 Konstruktion der Reportergenvektoren p0RL555NI0FL und p0RL585NI0FL... 66
3.5.4 Luziferase-Messung der Reportergenvektoren p0RL555NI0FL und
p0RL585NI0FL... 68
3.5.5 Nachweis der bicistronischen mRNA der Reportergenkonstukte aus den
Mutations- und Deletionsexperimenten... 70 3.6 Untersuchung der Wirkung von JKTBP1 auf die NRF-IRES-Funktion mit
Reportergenexperimenten...…..….... 72
3.6.1 Verwendete Vektoren... 73
3.6.2 Luziferase-Messungen nach Überexpression von JKTBP1... 74 3.7 Untersuchung der Wirkung von Stimulation auf die NRF-IRES-Funktion mit
Reportergenexperimenten………... 77
3.7.1 Luziferase-Messungen nach Stimulation mit Interleukin-1... 78
3.7.2 Luziferase-Messungen nach Stimulation mit dem Newcastle-Desease Virus...81
4 DISKUSSION 85 4.1 Einsatz eines bicistronischen Reportergenexperiments zur Charakterisierung von IRES-Elementen……….. 86
4.2 Nachweis der Integrität der bicistronischen Reportergenkonstrukte……….. 87
4.3 Detektion einer stabilen Sekundärstruktur des NRF-IRES-Elementes in silico…. 88 4.4 Relevanz der 3’Haarnadelstruktur für die in vivo Funktion des NRF-IRES-Elementes………. 91
4.5 Interaktion von RNA-bindenden Protein (JKTBP1) mit unterschiedlichen NRF-IRES-Konstrukten……….. 94
4.6 Auswirkungen der Stimulation mit Interleukin-1 und dem Newcastle Desease- Virus auf die Funktion des minimalen NRF-IRES-Elementes..………... 95
4.7 Medizinische Relevanz zellulärer IRES-Elemente……….. 97
4.8 Ausblick………. 99
5 ZUSAMMENFASSUNG 101 6 ANHANG 103
6.1 Literaturverzeichnis………..103
6.2 Abbildungsverzeichnis………113
6.3 Abkürzungsverzeichnis………...115
6.4 DNA Sequenzen………. 119
6.4.1 Sequenz des humanen NRF-IRES...119
6.4.2 Sequenz des minimalen NRF-IRES... 119
6.5 Daten der Reportergenexperimente………. 120
6.6 Plasmidkarten……… 129
6.6.1 Bicistronische Reportergenvektoren...129
6.6.2 Expressionsvektoren... 136
Lebenslauf……….137
Erklärung..………….………138
Danksagung.………..………..…139
1 Einleitung
Proteine sind die strukturell komplexesten und funktionell am feinsten abgestimmten Bausteine der Zelle. Nahezu alle Zellfunktionen werden durch sie ausgeführt. Für die Entwicklung und Aufrechterhaltung der Homöostase in Eukaryonten ist die zeit- gerechte und fehlerfreie Herstellung von Proteinen daher von entscheidender Bedeutung. Aus diesem Grund ist eine strenge Regulierung der mRNA-Expression sowie der Translation unbedingt erforderlich. Dies kann auf der Ebene der Transkription oder Translation erfolgen. Der Schwerpunkt dieser Arbeit liegt auf der Translation.
1.1 Translation bei Eukaryonten
Die Translation wird in Initiation, Elongation und Termination unterteilt. In allen drei Phasen spielen regulatorische Mechanismen eine wesentliche Rolle. Dabei ermöglicht die Initiation die effektivste Kontrolle der Translation und unterliegt daher einer komplexen Regulation. Es werden zwei Arten von Translationsinitiation unterschieden: Die 5’Cap-abhängige Initiation und die Initiation über sogenannte IRES (Internal ribosome entry segment)-Elemente, die Cap-unabhängig erfolgt.
1.1.1 Mechanismus der Cap-abhängigen Translationsinitiation
Eukaryontische mRNA verfügen neben der kodierenden Sequenz über eine Cap- Struktur (7-Methylguanosin-Cap, m7GpppN) am 5’Ende und eine PolyA-Sequenz am 3’Ende. Zwischen der Cap-Struktur und dem Translationsstart befinden sich kurze untranslatierte Regionen (UTRs). Nach Transkription, Verarbeitung der mRNA und deren Ausschleusung aus dem Zellkern wird die RNA translatiert. Eukaryontische mRNAs werden generell durch den komplexen Cap-abhängigen Translations- mechanismus translatiert. Neben dem Ribosom sind elf eukaryontische Initiations- faktoren (eIFs) an der Cap-abhängigen Initiation beteiligt (Hershey & Merrick, 1996).
Während der Translationsinitiation wird mit Hilfe dieser Faktoren das 80S-Ribosom gebildet und zum Translationsstart dirigiert. Der Ablauf der Initiation ist folgender (s.
Abb. 1.1 A): Unabhängig von der mRNA bildet sich im Zytoplasma ein Primärkomplex aus der 40S-Ribosomenuntereinheit und den Initiationsfaktoren eIF1A, eIF3 und eIF5. Der Initiationsfaktor eIF3 verhindert die vorzeitige Bindung der
60S-Untereinheit an die 40S-Untereinheit der Ribosomen. Zusammen mit dem Initiationsfaktor eIF1 bindet weiterhin ein ternärer Komplex, bestehend aus dem GTP-tragenden Faktor eIF2 und der Initiatior-Met-tRNA, an den 40S-Komplex. Die Bildung des ternären Komplexes wird zuvor durch eIF2B reguliert. Der Zusammenschluss der o. a. Initiationsfaktoren, des ternären Komplexes sowie der 40S-Ribosomeneinheit wird als 43S-Prä-Initiationskomplex bezeichnet. Dieser Komplex bindet die Cap-Struktur am 5’Terminus der mRNA.
Neben dem 43S-Prä-Initiationskomplex interagiert die Cap-Struktur mit drei weiteren Initiationsfaktoren (eIF4A, eIF4E, eIF4G), die zusammen den eIF4F-Komplex bilden.
Der Faktor eIF4E (cap binding protein, CBP) erkennt und bindet die 5’Cap-Struktur der mRNA. Das eIF4G kann mit mehreren Faktoren interagieren. Die Interaktion der eIF4G-Untereinheit mit dem Initiationsfaktor eIF3 des 43S-Prä-Initiationskomplexes ist von besonderer Bedeutung: Sie ermöglicht die Verbindung zwischen dem
Abb. 1.1: Cap-abhängige Translationsinitiation in Eukaryonten.
A: Die Translation der mRNA in Protein beginnt, wenn sich die Initiator-Met-tRNA zusammen mit der mRNA und den beiden Ribosomen-Untereinheiten am Startkodon (AUG) zum 48S- Komplex zusammenfügt. Hierfür sind mehrere Teilschritte notwendig, die von elf Initiationsfaktoren (eIFs) gesteuert werden. Einzelheiten sind dem Text (1.1.1) zu entnehmen. Die Steuerung der 40S-Ribosomen-
B.
A.
Untereinheit an die mRNA wird durch Protein-RNA und RNA-RNA-Interaktionen gewährleistet. Der Prä-Initiationskomplex bindet unter Mitwirkung des eIF4F-Komplexes das 5’Cap der mRNA. Dieser
„scannt“ die mRNA in 5’3’Richtung bis zum Startkodon. Dort verbinden sich die beiden Ribosomen- Untereinheiten zum 80S-Ribosomen. Die beteiligten eIFs stehen anschließend für die nächste Translationsinitiation bereit. B: Durch Interaktion von PABP und eIF4G kommen die Cap-Struktur und die 3’PolyA-Sequenz in räumliche Nähe. Durch Zirkularisierung der mRNA wird ein effizienteres Ablesen der mRNA ermöglicht. Die Abbildungen stammen aus: Lopez-Lastra et al., 2005.
Ribosom und der mRNA. Die RNA-Helicase eIF4A löst unter ATP-Spaltung Sekundärstrukturen der mRNA (Rogers, 2002). Zusammen ermöglichen diese drei Faktoren dem 43S-Prä-Initiationskomplex unter ATP-Verbrauch das „Scannen“ der mRNA in 5’3’Richtung bis zum Startkodon, das von sogenannten Kozak-Sequenzen (Kozak, 1986) eingerahmt wird. Am Startkodon formiert sich aus den drei Komponenten – der 40S-Ribosomenuntereinheit, dem ternären Komplex (Met- tRNAi/eIF2/GTP) und der vorbereiteten mRNA – ein stabiler Komplex, der als 48S- Prä-Initiationskomplex bezeichnet wird. Nach der Erkennung des Initiationskodons durch den 48S-Prä-Initiationskomplex wird eIF2 von der mRNA gelöst. Dies erfolgt mit Hilfe des Faktors eIF5B. Dieser spaltet das GTP am Faktor eIF2, was zu einem Entlassen von eIF2-GDP führt. Der Faktor eIF1 beugt als negativer Regulator des Faktors eIF5B einer vorzeitigen GTP-Hydrolyse vor. eIF5B ermöglicht außerdem die Bindung der 60S- an die 40S-Ribosomenuntereinheit und damit die Bildung des 80S- Initiationskomplexes.
Während der Translationsinitiation interagieren weiterhin PolyA-bindende Proteine (PABP) mit dem Cap-assoziierten Faktor eIF4G (Kahvejian et al., 2005; Borman et al., 2000) (s. Abb. 1.1 B). Die mRNA bildet dadurch eine Ringstruktur aus, die ein effizienteres Ablesen durch die Ribosomen ermöglicht (Wells et al., 1998; Gallie, 1991). Neben der beschriebenen Cap-abhängigen Translationsinitiation sind noch drei weitere, nicht-klassische Mechanismen der Cap-abhängigen Initiation beschrieben worden: Leaky scanning, ribosomales shunting und termination- reinitiation. An dieser Stelle soll jedoch nicht näher darauf eingegangen werden.
1.1.2 Regulation der Translationsinitiation
Die Cap-abhängige Translationsinitiation kann in mehreren Stadien reguliert werden.
Eine Feinregulierung der Proteintranslation geschieht dabei hauptsächlich über die Bereitstellung der Cap-bindenden Proteine. So können Veränderungen in der Proteinsyntheseaktivität überwiegend über Phosphorylierung und De- phosphorylierung von Initiationsfaktoren erreicht werden (Gingras et al., 2001). Der limitierende Schritt der Translationsinitiation ist hierbei die Bereitstellung des Cap- bindenden Faktors eIF4E. Dieser Faktor liegt von allen Initiationsfaktoren in der geringsten Menge in der Zelle vor (Duncan et al., 1987). Die Menge an eIF4E wird durch die Phosphorylierung von eIF4E-Bindungsproteinen (4E-BPs) reguliert (Gingras et al., 1999). In dephosphorylierter Form konkurrieren 4E-BPs mit eIF4G um
eine gemeinsame Bindungsstelle am Initiationsfaktor eIF4E und verhindern die Bildung des Proteinkomplexes eIF4F. Als Folge wird die Cap-abhängige Translation in höheren Eukaryonten inhibiert. Dies kann z. B. bei der Mitose beobachtet werden (Sharff & Robbins, 1966). Ein weiterer Regulationsmechanismus betrifft den aus drei Untereinheiten (α, β, γ) bestehenden eukaryontischen Initiationsfaktor eIF2. Durch das Enzym eIF2B wird – nach Verbrauch des GTP – der ternäre Komplex wieder regeneriert (Nika et al., 2001). Durch Phosphorylierung der α-Untereinheit des eIF2 wird dessen Dissoziation von eIF2B erschwert, woraus eine allgemeine Abnahme der Proteintranslation resultiert. Weiterhin können auch Proteasen die Cap- abhängige Translationsinitiation beeinflussen, indem sie Initiationsfaktoren abbauen.
Die Initiationsfaktoren eIF4G und PABP werden auf diese Weise bei der apoptotischen Signalkaskade durch die Caspase-3 abgebaut (Marissen et al., 2004;
Clemens et al., 2000). Virale Infektionen können dagegen einen Aktivitätsverlust des eIF4G (Gradi et al., 1998), 4E-BP (Gingras et al., 1996) oder PABP (Kuyumeu- Martinez et al., 2004) bedingen und so den zellulären Translationsapparat inaktivieren.
1.2 Cap-unabhängige Translationsinitiation: IRES-Elemente
In Streßsituationen wie bei Apoptose oder Virusinfektion gibt es neben der bereits beschriebenen Cap-abhängigen Translation eine Translationsinitiation bei der die Ribosomen unabhängig von einer Cap-Struktur direkt an RNA-Sequenzelemente binden. Diese RNA-Elemente werden als interne Ribosomeneintrittsstellen, kurz IRES, bezeichnet.
1.2.1 Virale IRES-Elemente
Das Prinzip der Cap-unabhängigen Translation wurde zunächst bei mRNAs der Picornaviren beobachtet (Hellen & Sarnow, 2001). Nach der Entdeckung des Poliovirus-IRES (Pelletier & Sonenberg, 1988) wurden viele weitere virale IRES- Elemente beschrieben. Die Strategie der Viren liegt in der proteolytischen Spaltung zellulärer eIFs, woraus eine Einschränkung der Cap-abhängigen Proteintranslation resultiert. Der zelluläre Translationsapparat wird dann – über die Verwendung viraler IRES-Elemente – zur Herstellung eigener Proteine genutzt (Komar & Hatzoglou, 2005). Mit Ausnahme der Polypyrimidinsequenz, die in mehreren IRES-Elementen
viralen Ursprungs nachgewiesen werden konnte, wurden keine relevanten Sequenzhomologien gefunden (Pestova et al., 1991). Auch in der Länge der IRES- Elemente, die von einer Länge von 200 Nukleotiden bis zu 450 Nukleotiden variieren kann, existieren große Unterschiede. Als gemeinsames Merkmal konnten für virale IRES-Elemente mehrere Proteine und Translationsinitiationsfaktoren, sogenannte ITAFs (IRES Trans-Acting Factors), nachgewiesen werden, die an diese Bereiche binden und die Effezienz der Translation erhöhen (Martinez-Salas et al., 2001) (s.
Kapitel 1.2.4). Eine große Zahl viraler IRES-Elemente weisen außerdem ähnliche Sekundärstrukturen auf (Baird et al., 2007) (s. Kapitel 1.3).
IRES-Elemente werden in drei Gruppen unterteilt (Sachs et al., 1997;Jackson et al., 1990). Die Klassifizierung bezieht sich vor allem auf die Lage des IRES-Elementes in Bezug auf das Startkodon: Typ I IRES-Elemente (z. B. das poliovirale IRES-Element) liegen bis zu 100 Nukleotide strangaufwärts vor dem Translationsstart. Bei Typ II IRES-Elementen (z. B. EMCV (Encephalomyocarditis Virus)-IRES) befindet sich das Startkodon am 3’Ende des IRES-Elementes. Die 40S-Untereinheit erkennt in diesem Fall direkt das Initiationskodon (Pestova et al., 1996). Beim Typ III ist das Initiationskodon innerhalb des IRES-Elementes lokalisiert (z. B. HAV (Hepatitis A Virus)-IRES) (Reynolds et al.,1995). Inzwischen sind zelluläre IRES-Elemente beschrieben worden, die den Typ I Elementen zugeordnet werden.
1.2.2 Zelluläre IRES-Elemente
Auch in Eukaryonten konnte die Beteiligung von IRES-Elementen an der Translation nachgewiesen werden. Hier befinden sich die IRES-Elemente oft in ungewöhnlich langen 5’UTRs. Diese UTRs sind häufig GC-reich, verfügen über mehrere offene Leseraster (ORFs) und bilden ausgeprägte Sekundärstrukturen aus (Stoneley &
Willis, 2004) (s. Kapitel 1.3). Das erste zelluläre IRES-Element wurde in der mRNA des BiP (immunglobulin heavy chain binding protein) entdeckt (Macejak & Sarnow, 1991). Inzwischen wurden weitere IRES-Elemente in mRNAs einiger wichtiger regulatorischer Proteine, wie Wachstumsfaktoren und Zytokinen, nachgewiesen (Hellen & Sarnow, 2001). Die Mehrzahl der zellulären IRES-Elemente ist in der 5’UTR in direkter Nähe zum Startkodon lokalisiert. Sie zeigen, verglichen mit viralen IRES-Elementen, eine geringere Aktivität (Stoneley et al., 1998; Yang & Sarnow, 1997). Ihre Bedeutung für die eukaryontische Zelle scheint in der Sicherung der Translation wichtiger Proteine zu liegen. Dies ist u. a. während Stress, Mitose,
Apoptose oder in der G2/M-Phase des Zellzyklus von Bedeutung, bei der die Cap- abhängige Translation kompromittiert ist (Lopez-Lastra et al., 2005). Einige Beispiele zellulärer IRES-Elemente sind der Tabelle 1 zu entnehmen. Eine besondere Bedeutung kommt ihnen während der Apoptose zu. Bei transientem Stress (Hitzeschock, UV-Strahlung) sichert die IRES-abhängige Translation von Proteinen, wie XIAP (X-chromosome linked Inhibitor of Apoptosis) und Cat1 (Cationic amino acid transporter-1), das Überleben der Zelle (Komar & Hatzoglou, 2005).
Tabelle 1: Beispiele eukaryontischer Proteine, deren mRNAs als IRES fungieren.
mRNA Translationsinitiation über IRES-Elemente Literatur
Apaf-1 Apoptose Coldwell et al., 2000
cat-1 Zellulärer Stress Fernandez et al., 2001 c-myc Apoptose, gewebeabhängige Translation Nanbru et al., 1997 ;
Stoneley at al., 1998
DAP5 Apoptose Henis-Korenblit et al.,
2000
FGF-2 Wachstumskontrolle Vagner et al,. 1995
NRF Entzündungsantwort Oumard et al., 2000
ODC G2/M Phase des Zellzyklus Pyronnet et al., 2000
p58PITSLRE G2/M Phase des Zellzyklus Cornelis et al., 2000
PDGF2/C-SIS Wachstumskontrolle Bernstein et al., 1997
VEGF Hypoxie Akiri et al., 1998
XIAP Apoptose Holcik et al., 1999
Bei ständigem Stress werden dagegen pro-apoptotische Proteine, wie APAF1 (Apoptotic Protease Activating Factor 1) und DAP5 (Death Associated Protein 5), über IRES-Elemente exprimiert (Henis-Korenblit et al., 2002; Coldwell et al., 2000).
1.2.3 Translationsinitiation an IRES-Elementen
Die Initiation der Translation an IRES-Elementen unterscheidet sich wesentlich von der Cap-abhängigen Translationsinitiation. Bei der Cap-unabhängigen Initiation wird das 40S-Ribosom direkt an ein IRES-Element rekrutiert, das sich in der Nähe eines authentischen Startkodons (AUG) befindet. Die interne Initiation geschieht un-
Die Aufzählung erfolgt in alphabetischer Reihenfolge. Die Literaturangaben beziehen sich auf Erstbeschreibungen. Eine vollständige Auflistung beschriebener IRES-Elemente findet sich in der IRES database: http://ifr31w3.toulouse.inserm.fr/IRESdatabase/ oder unter http://www.IRESite.org.
abhängig von dem 5’Cap (Jackson et al., 1995). Das Vorhandensein von strangaufwärts liegenden AUG-Kodonen und stabilen Sekundärstrukturen im IRES interferiert dabei mit dem „Scanning“-Mechanismus der Ribosomen und inhibiert die Translationsinitiation am authentischen AUG-Startkodon (Sonenberg & Gingras, 1998). Je nach IRES-Element gibt es verschiedene Abläufe der Translationsinitiation:
Bei den Typ I IRES-Elementen besteht die Initiation aus 2 Schritten: Die 40S- Untereinheit wird direkt an das IRES-Element rekrutiert, das sich in der Nähe des authentischen Startkodons (AUG) befindet. In einem zweiten Schritt wandert das Ribosom zum Translationsstart. Falls das Initiationkodon direkt am 3’Ende des IRES lokalisiert ist (Typ II), verläuft die Translationsinitiation in einem Schritt (s. Abb. 1.2 A). Der Initiationskomplex entsteht in diesem Fall direkt am Startkodon.
B.
A.
Abb. 1.2: Schematische Übersicht der Translationsinitiation an IRES-Elementen.
A:. Bei der Cap-unahängigen Translations- initiation über Typ II IRES-Elemente wird das 40S-Ribosom, anders als bei der Cap- abhängigen Translation, über das IRES-Element direkt an das Initiationskodon rekrutiert (Jackson et al., 1995). Das 40S-Ribosom kann hier das Startkodon unmittelbar erkennen und die Translation starten. In einigen Fällen wurden IRES-Elemente beschrieben, die dem Ribosomen auch bei größeren Entfernungen ein Scannen der mRNA bis zum Initiationskodon ermöglicht (Typ-I IRES-Elemente) (Stonely &
Willis, 2004). Die IRES-Element enthaltende mRNA bildet eine komplexe Sekundärstruktur aus, die als Bindungsstelle für spezifische RNA-Bindungsproteine (ITAFs) dient. Die zur Initiation der Translation notwendigen ITAFs sowie die Verwendung eukaryontische Initiationsfaktoren (eIFs) variieren je nach IRES-Element (Stoneley & Willis, 2004). Nach der GTP-Hydrolyse am Faktor eIF2 und anschließender Abspaltung der Initiationsfaktoren folgt die Bildung des 80S-Komplexes sowie das „Scannen“ der mRNA durch das Ribosom. B: Darstellung der Zirkularisierung der mRNA. Diese ermöglicht, wie auch bei der Cap-abhängigen Initiation, ein effizienteres Ablesen der mRNA. Eine Interaktion der 3’ und 5’Termini wird u.a. durch PABP und DAP5 ermöglicht. Die Abbildung A stammt aus: Komar & Hatzoglou, 2005; Abbildung B aus: M. Holcik et al., 2000.
Die Erkennung des IRES-Elementes und des Startkodons wird von spezifischen Proteinen, den ITAFs (IRES-Trans-Acting Factors), übernommen (s. Kapitel 1.2.4).
Ein weiterer Unterschied der Cap-abhängigen im Vergleich zur IRES-vermittelten Initiation betrifft deren Notwendigkeit für eukayontische Initiationsfaktoren (eIFs). Bei der konventionellen Cap-abhängigen Translationsinitiation werden alle eIFs benötigt (Hershey & Merrick, 1996) (s. Kapitel 1.1.1). Die IRES-abhängige Translationsinitiation läuft dagegen unter Verwendung weit geringerer Mengen von eIFs ab. Wird die Cap-abhängige Translationsinitiation durch fehlende eIFs verhindert, kann so bei bestimmten Proteinen die Synthese durch das IRES-Element gewährleistet werden. Dabei variiert die Verwendung von eukaryontischen Initiationsfaktoren für die interne Initiation je nach IRES-Element erheblich (Komar &
Hatzoglou, 2005). Das Hepatitis C Virus (HCV) benötigt zur Translationsinitiation keinerlei eIFs (Ji, 2004; Otto, 2004; Kolupaeva, 2000). Das Cricket Paralysis Virus (CrPV) benötigt zur Formierung des 80S/IRES-Komplexes weder eIFs noch Initiator- tRNA (Pestova & Hellen, 2003; Jan & Sarnow, 2002). Gemeinsam ist dabei allen IRES-Elementen eine Unabhängigkeit vom Cap-bindenden Initiationsfaktor eIF4E und PABP (Pestova et al., 1996). Es konnte gezeigt werden, dass das C-terminale Fragment des eIF4G mit der Bindungsstelle für das eIF3 und eIF4A ausreicht, um das 40S-Ribosom an das IRES-Element zu rekrutieren (Lomakin et al., 2000;
Ohlmann et al., 1996). Eine proteolytische Spaltung des eIF4G kann u. a. durch virale Proteasen oder bei zellulärem Stress auftreten (Haghighat et al., 1996). Am Beispiel des Cat1 (Cationic Amino Acid Transporter 1)-IRES wurde gezeigt, dass die in zellulären IRES-Elementen strangaufwärts liegenden offenen Leserahmen (ORFs) ebenfalls aktivierend auf die Translationsinitiation wirken (Yaman et al., 2003). Durch die Translation des ORFs wird die Sekundärstruktur der 5’UTR verändert, woraus die Aktivierung des IRES-Elementes resultiert. Wie bei der Cap-abhängigen wird auch bei der internen Initiation die Translation durch Interaktion mit der PolyA-Sequenz stimuliert (Paulous et al., 2003). Wie am Beispiel des c-myc und BiP IRES-Elementes nachgewiesen wurde, tritt die Stimulation auch bei gespaltenem eIF4G auf (Thoma et al., 2004). Vieles spricht dafür, dass in diesen Fällen die Interaktion des 3’ und 5’UTRs vom Faktor PABP unabhängig ist. Eine mögliche Erklärung wären spezifische RNA-RNA oder RNA-Protein-Interaktionen zwischen Sequenzen oder Faktoren, die sowohl mit dem 3’UTR als auch dem IRES-Element interagieren können. Dies könnte über Spaltprodukte der PABPs, dem Faktor eIF4GI oder die
Proteine DAP5, NAT1 oder p97 vermittelt werden (Holcik & Sonenberg, 2005) (s.
Abb. 1.2 B).
1.2.4 IRES-Trans-Acting Factors (ITAFs)
Zur effizienten Translationsinitiation an IRES-Elementen werden im Unterschied zur Cap-abhängigen Translationsinitiation neben den eIFs noch zusätzliche Proteine, die IRES-Trans-Acting Factors (ITAFs) erforderlich, welche die Erkennung des IRES- Elementes ermöglichen (s. Abb 1.2, S. 7) (Cornelis et al., 2000; Roberts et al., 1998).
Für mehrere zelluläre IRES-Elemente konnte nachgewiesen werden, dass deren Aktivität, je nach Gewebetyp bzw. Zellzyklusphase in der sie exprimiert werden, unterschiedlich ist (Creancier et al., 2000; Stoneley et al., 2000). Dies wird durch den Einfluss positiver und negativer regulatorischer Proteine erklärt, die in verschiedenen Zellgeweben in unterschiedlichen Konzentrationen vorliegen (Stoneley & Willis, 2004). Diese stammen überwiegend aus der Familie der heteronukleären Proteine (hnRNPs). Die hnRNPs können sich frei zwischen dem nukleären und dem zytoplasmatischen Kompartiment bewegen (Kawamura et al., 2002, Shyu et al., 2000). Ein Mitglied dieser Proteinfamilie ist das heterogene nukleäre Ribonukleoprotein D-ähnliche Protein (JKTBP), das als erstes NRF-IRES-bindendes Protein nachgewiesen werden konnte (Reboll et al., 2007). Das Protein JKTBP existiert in zwei Isoformen: JKTBP1 (38 kDa) und JKTBP2 (53 kDa), beide unterscheiden sich nur in der Länge des N-Terminus (Kamei et al.,1999). Dabei ist JKTBP1 die dominantere der beiden Isoformen und bindet sequenzspezifisch sowohl RNA (Kamei & Yamada, 2002) als auch DNA (Boopathi et al., 2004).
Es wird angenommen, dass die im Zytoplasma vorliegende Menge an ITAFs in Stresssituationen variiert und auf diese Weise die Aktivität der IRES-Elemente beeinflusst. In manchen Fällen benötigen IRES-Elemente eine Kombination aus mehreren ITAFs zur effizienten Translationsinitiation. So auch im Fall des APAF1 (Apoptotic Protease Activating Factor 1)-IRES-Element (Mitchell et al., 2001). Durch Bindung eines RNA-Proteinkomplexes aus dem Unr (Upstream of N-ras)-Protein und dem PTB (polypyrimidine tract binding protein)-Protein am APAF1-IRES wird die IRES-abhängige Translationsinitiation aktiviert. Dabei scheint die Bindung von Unr eine Bindungsstelle für PTB zu exponieren, wodurch eine Interaktion zwischen PTB und dem IRES-Element ermöglicht wird. Es ist denkbar, dass ITAFs die RNA- Struktur in eine günstige Konformation bringen, die eine Bindung der Ribosomen an
das IRES-Element ermöglicht (Hellen & Sarnow, 2001). Für diese Hypothese spricht, dass alle ITAFs eine multiple RNA-Bindungsdomäne besitzen (Hunt et al., 1999;
Jacquemin-Sablon et al., 1994) sowie teilweise RNA-Erkennungsmotive enthalten (Walter et al., 2002; Ohndorf et al., 2001).
1.3 Sekundärstruktur der IRES-Elemente
Trotz zahlreicher neuer Erkenntnisse auf dem Gebiet der zellulären IRES-Elemente konnte bis heute noch nicht endgültig geklärt werden wie zelluläre IRES-Elemente die 40S-Ribosomen an den Ort der Translationsinitiation rekrutieren. Es wird vermutet, dass die komplexe Sekundär- und Tertiärstruktur der IRES-Elemente Interaktionen mit eukaryontischen Initiationsfaktoren, IRES-bindenden Proteinen (ITAFs) und der 40S-Ribosomenuntereinheit ermöglicht (Stoneley & Willis, 2004;
Hellen & Sarnow, 2001). Die Vorhersage eines IRES-Elementes anhand bestimmter Sequenzen oder Strukturmotiven konnte bisher noch nicht getroffen werden (Komar
& Hatzoglou, 2005). In einigen zellulären IRES-Elementen wurde aber eine gemeinsame Y-Ringstammstruktur mit nachfolgender Haarnadelstruktur beschrieben (s. Abb. 1.3), die einen Einfluss auf die Bindung von Translationskomplexen ausüben könnte (Bonnal et al., 2003; Le & Maizel, 1997). Untersuchungen mit viralen IRES- Elementen zeigen, dass selbst minimale Veränderungen der Sekundärstruktur durch Punktmutationen bereits Einschränkungen der IRES-Aktivität bewirken können (Fernandez-Miragall, 2003; Martinez-Salas, 2002). An der Ausbildung solcher Sekundärstrukturen sind sowohl RNA-Protein- als auch RNA-RNA-Interaktionen funktionell aktiver Domänen beteiligt (Martinez-Salas & Fernandez-Miragall, 2004;
Lafuente et al., 2002).
Letztere werden durch spezifische Umweltfaktoren, wie der RNA-Konzentration, der Temperatur und der Ionenverteilung, stark beeinflusst. Die daraus resultierende strukturelle Dynamik der IRES-Elemente scheint für ihre biologische Funktion bedeutsam zu sein. So werden abhängig von spezifischen Umweltfaktoren
Abb.1.3: Darstellung der Y-Ringstammstruktur mit Haarnadel- struktur zellulärer IRES-Elemente.
Die Ringstammstruktur ist ein verbreitetes Strukturmotiv bei zellulären IRES-Elementen. Die Stämme a - c bilden eine Y-förmige Struktur, der stromabwärts eine Haarnadelstruktur (d) folgt. Die Strukturen wurden unter Berücksichtigung der thermodynamisch stabilsten Struktur sowie unter phylogenetischen und statistischen Gesichtspunkten berechnet (Le
& Maizel, 1997). Die Abbildung stammt aus Oumard, 2002.
unterschiedliche Sekundärstrukturen ausgebildet, die in der Folge eine veränderte Translationsaktivität bedingen könnten (Martinez-Salas et al., 2002; Martinez-Salas et al., 2001).
RNA-Strukturvorhersage
Wie durch Le & Maizel gezeigt werden konnte, spielen Strukturen, welche die RNA ausbildet, eine wesentliche Rolle für die Funktion von zellulären IRES-Elementen (1997). Diese werden in Sekundär- und Tertiärstrukturen unterteilt. Die RNA- Primärstruktur ist im Gegensatz zur Sekundär- und Tertiärstruktur mittels Sequenzierung leicht zu erhalten. Ein Ziel der Forschung ist daher, die Sekundär- oder sogar Tertiärstruktur aus dieser zu ermitteln (Pandey et al., 2004; Higgs, 2000).
Die Stabilität einer ausgebildeten RNA-Struktur wird hauptsächlich durch die Energie der Basenpaarungen, die Länge des gepaarten Bereiches und dem Stapeleffekt bestimmt. Da die Synthese der RNA bei der Transkription sequentiell erfolgt, spielt auch die Kinetik der Ausbildung der Konformation eine Rolle. Die zuerst synthetisierten Bereiche der mRNA bilden bereits während der Synthese erste Sekundärstrukturen aus. Diese können so stabil sein, dass sie nachfolgend nicht aufgelöst werden (Pandey et al., 2004; Higgs, 2000). Idealerweise sollten alle genannten Aspekte bei der Strukturvorhersage von RNA berücksichtigt werden. Die in dieser Arbeit verwendeten Sekundärstrukturvorhersagen basieren auf dem Programm ‚mfold 3.2’ von M. Zuker (2003). Das angewandte Prinzip ist dabei die Vorhersage der RNA-Struktur anhand des berechneten energetischen Minimums.
Die Temperatur ist mit 37°C fest eingestellt. Die i onische Zusammensetzung für die RNA-Faltung ist frei wählbar. Einstellbar sind außerdem die Größe der RNA- Schleifenbildung, der Abstand möglicher Basenpaarungen und die prozentuale Abweichung vom berechneten energetischen Optimum einer Faltung.
1.4 NRF-IRES
Der NF-κB Repressing Faktor (NRF) ist das während dieser Arbeit untersuchte Protein. Es kann sowohl Cap-abhängig als auch Cap-unabhängig über ein IRES- Element in seiner 5’UTR translatiert werden. In den folgenden zwei Unterpunkten wird auf dieses Protein sowie auf sein IRES-Element näher eingegangen.
1.4.1 NF-κB Repressing Factor (NRF)
Die Auslösung und Koordination der angeborenen und erworbenen Immunabwehr bedürfen der Aktivierung einer Vielzahl von konstitutiven sowie induzierbaren Transkriptionsfaktoren. Als zentraler Mediator der akuten Immunabwehr koordiniert der aktivierbare Transkriptionsfaktor NF-κB die Expression einer Vielzahl von Zytokinen, Chemokinen, Adhäsionsmolekülen und MHC Proteinen. Natur und Ausmaß dieser Genaktivierungen hängen jedoch sehr stark von weiteren Transkriptionsfaktoren ab, die mit NF-κB interagieren.
Der Transkriptionsfaktor NRF ist über die Regulation von NF-κB als Mediator an der akuten Immunabwehr beteiligt. NRF ist ein nukleäres, konstitutiv exprimiertes Protein (Nourbakhsh & Hauser, 1999). Das Protein wurde aufgrund seiner spezifischen Bindung an das NRE („Negative Regulatory Element“) des IFN-β Promotors identifiziert (Nourbakhsh & Hauser, 1997). NRF inhibiert die NF-κB-Aktivität durch eine direkte und starke Protein-Protein-Interaktion und unterbindet dadurch die basale Expression mehrerer pro-inflammatorischer Gene. Es konnte gezeigt werden, dass NRF nicht nur die IFN-β-Expression, sondern auch die Expression von induzierbarer NO-Synthase (iNOS) und Interleukin-8 (IL-8) reguliert (Feng et al., 2002; Nourbakhsh et al., 2001; Nourbakhsh at al., 2000; Noubakhsh & Hauser, 1999). NRF inhibiert konstitutiv die Transkription dieser Gene. Auf den IL-8 Promotor übt NRF eine duale Funktion aus: NRF reprimiert den IL-8 Promotor konstitutiv. Nach Stimulation durch Interleukin-1 wirkt NRF, zusammen mit NF-κB Proteinen, auf den IL-8 Promotor koaktivierend (Nourbakhsh et al., 2001).
Die erste identifizierte NRF-cDNA-Sequenz stammt aus einer humanen endometrialen Zelllinie und kodiert für ein 43,5 kD Protein. Die genomische Sequenz von humanem und murinem NRF liegt in Maus und Mensch in einem sehr konservierten Bereich auf dem X-Chromosom vor (Nourbakhsh et al., 2000). In allen bislang getesteten Zelltypen und Organen wird NRF konstitutiv transkribiert (Nourbakhsh & Hauser, 1999). Dabei treten jeweils eine kurze mRNA (2783 Nukleotide) und eine lange mRNA (3727 Nukleotide) auf, die sich allein durch die Länge ihrer 3’untranslatierten Region (UTRs) unterscheiden. Die Länge der 5’UTR beträgt in beiden mRNAs 653 Nukleotide. Das Protein verfügt über eine C-terminale DNA-Bindungsdomäne (AS 296 - 388) und eine N-terminalen Repressordomäne (AS 1 - 296) (Nourbakhsh & Hauser, 1999). In Letzterer befindet sich zusätzlich eine
Kernlokalisationssequenz (AS 31 - 46). Im C-terminalen Bereich werden weitere DNA/RNA-Bindungsdomänen vermutet (Niedick et al., 2004).
1.4.2 Das NRF-IRES-Element
Die NRF-5’UTR ist mit seinen 653 Basenpaaren ungewöhnlich lang und enthält 11 Start (AUG)-Kodons, von denen einige in einem die Translation begünstigendem Kontext stehen (Kozak et al., 1984; Kozak et al., 1981). Einige der AUG-Kodons werden von offenen Leserahmen von einer Länge bis zu 30 Aminosäuren gefolgt (Oumard et al., 2000). Durch Verwendung von bicistronischen Reportergen- konstrukten konnte gezeigt werden, dass das 5’UTR als Distanz-unabhängiges Typ I IRES-Element fungiert. Dies konnte durch die Einführung eines 110 bp langen Fragments vor dem Startkodon gezeigt werden (Oumard et al., 2000). Die relative Aktivität des NRF-IRES-Elementes ist 31-fach höher als die Cap-abhängige Initiation und bis zu 30-fach höher als die der viralen IRES-Elemente (Oumard et al., 2000).
NRF stellt damit ein einmaliges Beispiel im Vergleich zu anderen zellulären IRES- Elementen dar, welche deutlich schwächer sind als die viralen IRES-Elemente.
Abb. 1.4: Sekundär- strukturvorhersage der NRF-5’UTR (A).
Die 5’UTR von NRF ist 653 Nukleotide lang und bildet nach Berechnungen mit dem Computerprogramm
‚mfold’ (Version 2.3) von Zuker (1989) eine komplexe Sekundärstruktur aus. Das minimale NRF-IRES- Element (mIRES) entspricht in etwa den letzten 148 Nukleotiden vor dem 3’
Ende der NRF- 5’UTR. Das mIRES faltet sich in die für zelluläre IRES-Elemente
beschrie-bene Y-
Ringstammstruktur mit nachfolgender Haar- nadelstruktur (durch roten Pfeil markiert) (Le & Maizel, 1997). Alle Experimente dieser Arbeit wurden mit diesem minimalen NRF- IRES-Element durch- geführt.
(B) Sequenz des mIRES- IRES (148 bp).
506 TCTTT GGTTTTATAG CCAAGATACC CTGTTGATAA 541 AGTCTTGTGG GAGCAATTAT AAGACTGGCT TATTTTGAAG 581 CTTTTTAAAA AAGACATCCT TACCTGTTTT AACTGTAGAT 621 TATATTAACT TAAATAGGTA CAGCCCACGC TTGATG
A.
B.
Durch sukzessive Deletionen am 3’Terminus konnte gezeigt werden, dass die 100 Nukleotide vor dem Initiationskodon ein minimales IRES-Element (mIRES) bilden (Nukleotide 551-653). Die Deletion der letzten 53 Nukleotide führt zum vollständigen Verlust der IRES-Aktivität (Oumard, 2002). Durch das NRF-IRES-Element wird die Expression von NRF auch bei einer geringen Cap-abhängigen Translationsaktivität (G2/M-Phase des Zellzykluses) gewährleistet. So wird als ein Beispiel die konstitutive Repression des IFN-β Promotors bzw. die nach IL-1 Stimulation erfolgte Koaktivierung des IL-8 Promotors gesichert. Hierdurch leistet die IRES-vermittelte Translation von NRF einen wesentlichen Beitrag zur Aufrechterhaltung der zellulären Homöostase. Die Sekundärstruktur des NRF-IRES-Elementes ist in Abb. 1.4 (s. o.) dargestellt. Interessanterweise zeigt sich in den bisherigen Sekundärstruktur- vorhersagen des NRF-IRES mit dem Programm ‚mfold 2.3’ (Zucker, 1989), dass sich dieses zu einer konservierten RNA-Struktur faltet. Diese Struktur konnte bei einer Vielzahl zellulärer IRES-Elemente nachgewiesen werden und entspricht der von Le &
Maizel beschriebenen Y-Ringstammstruktur, gefolgt von einer Haarnadelstruktur (1997). Ungeklärt bleibt, welche Bereiche genau für die IRES-Aktivität notwendig sind und ob und wie bestimmte Strukturmerkmale des NRF-IRES-Elementes daran beteiligt sind.
1.5 Aufgabenstellung
Der Transkriptionsfaktor NF-κB Repressing Faktor (NRF) reprimiert einige NF-κB- regulierte Promotoren, die bei der Inflammation, Apoptose und antiviralen Reaktion eine wichtige Rolle spielen. Vorangegangene Arbeiten haben gezeigt, dass die 5’UTR von NRF eine interne Translationsinitiation über ein IRES (Internal Ribosome Entry Segment)-Element ermöglicht. Es konnte gezeigt werden, dass sich die NRF- IRES-Aktivität auf etwa 100 Basen eingrenzen lässt, die proximal zum authentischen AUG Startkodon liegen.
Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, die für die IRES-Aktivität relevanten Bereiche der NRF-5’UTR zu definieren. Hierfür sollen bicistronische Reportergenvektoren hergestellt werden, welche die beschriebene minimale IRES-Sequenz im intercistronischen Bereich enthalten. Die Expression des ersten Reportergens erfolgt durch den konventionellen 5’Cap-abhängigen Translationsmechanismus, während die Expression des zweiten Reportergens ausschließlich durch interne Initiation ermöglicht wird. Durch Punkt- und Deletionsmutagenese sollen so die für die Aktivität des IRES-Elementes notwendigen Bereiche näher charakterisiert werden. Ein besonderes Augenmerk soll dabei auf die Bedeutung der Sekundärstrukturen für die Funktion des minimalen IRES-Elementes (mIRES) gelegt werden. Als Kontrolle dienen Northern Blot-Hybridisierungen, die eine einzige bicistronische mRNA zeigen von der zwei unterschiedliche Proteine translatiert werden.
Des Weiteren sollen neue Kenntnisse über das Verhalten der IRES-vermittelten Translationsinitiation gewonnen werden. Aus diesem Grund werden Induktions- versuche durchgeführt. Als Stimulanzien dienen Interleukin-1 und das Newcastle- Desease Virus. In weiteren Reportergenexperimenten soll anschließend der Einfluss des NRF-IRES-bindenden Proteins JKTBP1 auf die IRES-Aktivität näher untersucht werden.
2 Material und Methoden 2.1 Material
2.1.1 Chemikalien
Acrylamidlösung Rotiphorese Gel 30 (37, 6:1) Carl Roth GmbH & Co.
Adenosintriphosphat (ATP) Sigma
Agarose NEEO Ultra-Qualität Roti-Garose Carl Roth GmbH & Co.
2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propandiol (Tris) Sigma
2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propandiol-Puffer (Tris) Carl Roth GmbH & Co.
Ammoniumpersulfat (APS) Bio-Rad
Ampicillin Sigma
Aqua Spüllösung DeltaSelect (Wasser) DeltaSelect GmbH
Bromphenolblau Sigma
CaCl2 x 2 H2O Sigma
Chloroform J.T.Baker
Coenzym A Fluka
Cytosintriphosphat (CTP) Sigma
Dextransulfat Sigma
Dimethylsulfoxid (DMSO) Fluka
Dithiothreitol (DTT) Sigma
Essigsäure J.T.Baker
Ethanol J.T. Baker
Ethidiumbromid 10 mg/ml Invitrogen
Ethylendiaminotetraessigsäure (EDTA) Merck
Ficoll Biochrom AG
Formaldehyd Merck
Formamid Merck
Hefe-RNA Roche
Heringssperma-DNA Roche
Isobutanol Isopropanolol L-Glutamat
Merck J. T. Baker Gibco
Glycerin Serva
Glycerol-2-phosphat Sigma
Glycin Carl Roth GmbH & Co.
Guanosintriphosphat (GTP) Sigma
HCl, konzentriert (38%) J.T. Baker
Hefe-RNA
4-(2-Hydroxyethyl)-1-Piperazinethansulfonsäure (HEPES)
Roche Sigma
Imidazol Merck
KCl Sigma
KOH Merck
D-Luciferin Applichem
Magermilchpulver Sucofin
Magnesiumacetat Fluka
Β-Mercaptoethanol Sigma
Methanol J.T. Baker
2-Methylpropan-2-ol (Isobutylalkohol) Merck
MgCl2 Sigma
(MgCO3)Mg(OH)2 x 5 H2O Sigma
MgSO4 Applichem
Micro-O-Protect Roche
Mineral-Öl Sigma
4-Morpholinpropansulfonsäure (MOPS) Na2HPO4
Sigma
Riedel de Haen
Na3VO3 Sigma
Natriumacetat (NaAc) NaCl
Sigma J.T. Baker
NaOH Merck
Natriumdodecylsulfat (Sodiumdodecylsulfat, SDS) ICN Biomedicals Inc.
Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol 25:24:1 Roth
Polyethylenglykol 8000 Sigma
2-Propanol J.T. Baker
Roti®-Blot A Carl Roth GmbH & Co.
Roti®-Blot B Carl Roth GmbH & Co.
Roti®-Load1 4 x Konzentrat (Laemmli-Auftragspuffer) Carl Roth GmbH & Co.
Sodiumdodecylsulfat (SDS) ICN, Biomedicals, Inc.
Stickstoff, flüssig Linde N’, N’, N’, N’-Tetra-methyl-ethylendiamin (Temed) Bio-Rad
Thymidintriphosphat (TTP) Sigma
Tricin Applichem
Tris (2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propandiol) Roth
Trizol-Lösung Invitrogen
Trypanblau-Lösung PAA-Laboratories
α-[32P]Uridintriphosphat (UTP) 10 Ci/ l Tween 20
Amersham Sigma
Xylencyanol FF Sigma
2.1.2 Puffer und Lösungen
Anodenpuffer 50 ml Roti®-Blot A, 350 ml H2O dest., 100 ml Methanol
DNA-Auftragspuffer (6x) 0,25% Bromphenolblau, 0,25% Xylencyanol FF, 15% Ficoll, 0,1 M EDTA
RNA-Auftragspuffer 40% (v/v) Formaldehyd, 40 g/ml Ethidiumbromid, 120 mM MOPS, 50 mM NaAc, 6 mM EDTA pH 8,0, 30% (v/v) Stop-Puffer RNA-Stop-Puffer 50 % Glycerol (w/v), 1 mM EDTA pH 8,0, 0,4%
Bromphenolblau (BPB) HEBS-Puffer (HEPES-gepufferte
Salzlösung), (2x)
0,28 M NaCl, 0,05 M HEPES, 1,5 mM Na2HPO4, pH 7,1
Hybridisierungslösung 0,9 M NaCl, 0,9 % Dextransulfat, 0,9 % SDS, 0,45 % Heringssperma-DNA, 0,045 %Hefe- RNA
Kathodenpuffer 50 ml Roti®-Blot K, 350 ml H2O dest., 100 ml Methanol
Ligationspuffer (10x)
Luziferase-Messpuffer für Phyti- nus Pyralis (Firefly)
Lysepuffer
Roche
200 mM Tricin, 10,7 mM (MgCO3)Mg(OH)2 x 5 H2O, 26,7 mM MgSO4, 333 mM DTT, 5,3 mM ATP, 0,2 mg/ml Coenzym A, 472 µM D- Luciferin, pH 7,8
10 mM Hepes pH 7,9, 1,5 mM MgCl , 1 g/ml
MOPS 10x
Leupeptin, 1 g/ml Approtinin, 1 g/ml Pepstatin, 0,5 mM PMSF, 5% NP-40
0,2 M MOPS, 10 mM EDTA, 80 mM Na-acetat, pH 7,0
Mutagenese Reaktionspuffer (10x) PBS (Phosphatgepufferte Salz- lösung), (10x)
Stratagene
PAA Laboratories GmbH
PCR-Puffer (10x) Invitrogen
Proteingel-Laufpuffer 250 mM Tris, 2 M Glycin, 1 % SDS
DNA-Stop-Puffer 50% (w/v) Glycerol, 1 mM EDTA, 0,4% (w/v) Bromphenolblau
SSC (10x) 1,5 N NaCl, 0,15 N Natrium-Citratdihydrat, pH 7,0
TAE (50x) 2 M Tris, 0,05 % Essigsäure, 0,05 M EDTA TBS (Tris buffered saline) 100 mM Tris, 1,5 M NaCl, mit HCl auf pH 7,5
TBS-Tween TBS, 5% Tween 20
TE-Puffer 10 mM Tris/HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0
TSS-Puffer 10% PEG, 50 mM MgCl2, 5 %DMSO in LB- Medium pH 6,6
2.1.3 Antikörper und Enzyme
Anti-JKTBP1 (rabbit) M. Yamada, Graduate School of Integrated Science, Yokohama City University
Goat anti-rabbit Immunglobulins/HRP Dako Cytomation
T4-DNA-Ligase Roche
Trypsin Gibco
Klenow Fermentas
Restriktionsenzyme:
Enzym Standard-Fermentas-
Puffer
Hersteller
Age I Puffer O Fermentas
Asc I NEBuffer 4 New England BioLabs
Cla I Puffer Tango Fermentas
EcoRI EcoRI-Puffer Fermentas
Eco RV Puffer R Fermentas
Hind III Puffer R Fermentas
Hpa II Puffer Tango Fermentas
Mlu I Puffer R Fermentas
Nco I Puffer Tango Fermentas
NheI Puffer Tango Fermentas
Not I Puffer O Fermentas
Pae I Puffer B Fermentas
PstI Puffer O Fermentas
PvuI Puffer R Fermentas
Sac I Puffer-SacI+ Fermentas
ScaI Puffer ScaI+ Fermentas
SphI Puffer B Fermentas
SspI Puffer G Fermentas
XbaI Puffer Tango Fermentas
XhoI Puffer R Fermentas
Weitere Puffer Klenow-Puffer Puffer Y/Tango
T4-DNA-Ligase-Puffer
Fermentas Fermentas Roche
2.1.4 DNA-, RNA- und Proteinstandards
Precision Plus ProteinTM Dual Color Standard [kDa]:
10, 15, 20, 25, 37, 50, 75, 100, 150, 250
Bio-Rad
Smart ladder [bp]:10000, 8000, 6000, 5000, 4000, 3000, 2500, 2000, 1500, 1000, 800, 600, 400, 200
Eurogentec
RNA-ladder high range [bp]:
0,24; 1,35; 2,37; 4,40; 7,45; 9,49
Fermentas
2.1.5 Nukleinsäuren
Definierte DNA-Oligonukleotide (Primer) MWG, Operon
Oligo (dT) Pharmacia Biotech
Plasmidkarten Siehe Anhang
Verwendete Primer:
Name 5’3’ Sequenz Hersteller__
CG5 5’ – CTT AAA TAG GTA CAC GCC ACC GCA GGG CGC GCC GAA TTC GAC C – 3’
MWG
CG3 5’ – GCT CGA ATT CGG CGC GCC CTG CGG TGG CGT GTA CCT ATT TAA G – 3’
MWG
Xsmu5 5’ – GTT TAG TCT TTT TGT CTT TTA TTC TCG AGC TCC CGG AAT TGG TTT AAA CG – 3’
MWG
Xsmu3 5’ – CGT TTA AAC CAA TTC CGG GAG CTC GAG AAT AAA AGA CAA AAA GAC TAA AC – 3’
MWG
PstI5 5’ – CTT AAA TAG GTA CAG CCC ACT GCA GGG CGC GCC GAA TC GAG C – 3’
MWG
PstI3 5’ – GCT CGA ATT CGG CGC GCC CTG CAG TGG GCT GTA CCT ATT TAA G – 3’
MWG
SacI5 5’ – GCA TTC CGG TAC TGT TGA GCT CAT GGA AGA CGC C – 3’ MWG
SacI3 5’ – GGC GTC TTC CAT GAG CTC AAC AGT ACC GGA ATG C – 3’ MWG
SalMlu555;5 5’ – GAT AAA GTC TTG TCG ACG CGT AAT TAT AAG ACT GG – 3’ MWG
SalMlu555;3 5’ – CCA GTC TTA TAA TTA CGC GTC GAC AAG ACT TTA TC – 3’ MWG
SalMlu585;5 5’ – GGC TTA TTT TGT CGA CGC GTA AAA AAG ACA TCC – 3’ MWG
SalMlu585;3 5’ – GGA TGT CTT TTT TAC GCG TCG ACA AAA TAA GCC – 3’ MWG
Sspmu5 5’ – GTA GAT TAT ATT AAC TTA AAT ATT GGG CGC GCC GAA TTC G – 3’
Operon
Sspmu3 5’ – CGA ATT CGG CGC GCC CAA TAT TTA AGT TAA TAT AAT CTA C – 3’
Operon
SalPolio 5’ – CAA TAA GTC GAC AAG CTT AAA ACA GCT CTG G – 3’ Operon
ASCPolio 5’ – CTC GAA TTC GGC GCG CCA TCC AAT TCG CTT TAT G – 3’ Operon
ScaI5 5’- CTT TGG TTT TAT AGC CAA GAA GTA CTG TTG ATA AAG TCT TGT GGG – 3’
MWG
ScaI3 5’- CCC ACA AGA CTT TAT CAA CAG TAC TTC TTG GCT ATA AAA CCA AAG – 3’
MWG
2.1.6 Zelllinien und Bakterienstämme
Escherichia coli XL1-blue (E. Coli) Stratagene
HeLa Bujard (HeLa B) H. Bujard, Universität Heidelberg
2.1.7 Kulturmedien und Kulturagar
Fetales Kälberserum (FCS) (PAA Laboratories GmbH) Luria-Bertani-Agar (LB-Agar) Standard I Nähragar (Merck)
Luria-Bertani-Medium (LB-Medium) DifcoTM Luria Bertani Broth (Miller Becton Dickinson & Company)
Penicillin/Streptamycin-Lösung (10.000 IU/ml Penicillin,
10.000 UG/ml Streptamycin)
(Gibco)
Trypsin/EDTA-Lösung
Zellkulturmedium
Gibco/Merck, 2.5% Trypsin, 0,01%
EDTA in PBS
DMEM High Glucose (PAA Laboratories GmbH) mit 100 IU/ml Penicillin, 100 UG/ml Streptamycin, 2 mM L-Glutamat
2.1.8 Verbrauchsmaterialien
Bakterienkulturschalen 92 mm Sarstedt
Einwegküvetten Sarstedt
Einwegpipetten 25, 10, 2 ml Sarstedt
Filme Kodak
Filterpapier 3MM-Chromatographiepapier Whatman
Kulturflaschen, 250 ml Greiner bio-one Cellstar
Kulturschalen 94 mm, 145 mm Greiner bio-one Cellstar
Kulturschalen 35 mm, 6-Well Nunc
Kunststoffklarsichtröhrchen 5 ml Sarstedt, Elkay Laboratories
Kunststoffröhrchen 10 ml Greiner
Kunststoffröhrchen 15 ml Nunc
Kunststoffröhrchen 50 ml Greiner
Nylonmembran, Hybond-N Amersham Biosciences
Pipettenspitzen 0,5 – 20 µl Eppendorf epTIPS standard Pipettenspitzen 10 – 200 µl, 100 – 1000 µl Sarstedt
Polyvinylidenfluorid (PVDF)-Membran Millipore Immobilon
Reaktionsgefäße 0,5 ml Landgraf
Reaktionsgefäße 2 ml, 1 ml Eppendorf
RNA-Säulen Skalpell
Stratagene Feather
UV-Küvetten Hellma
2.1.9 Geräte
Agarosegeldokumentation BioDoc Analyze + Software (Biometra) Gel Doc 1000 BioRad
Bakterien Inkubator B5050E (Heraeus)
Elektrophoresekammer semidry elektroblotter HEP-1/HEP-3 (Panther)
Eismaschine (Ziegra)
Filmentwickler Optimax (Protec)
Geltrockner Hand-β-Zähler
Pherotemp 40 LB 122 (Berthold)
Heizblock Test Tube Thermostat TCR100 (Roth)
Hybridisierungsofen Mini Oven (MWG Biotech) Hybridisierungsröhre GL 45 (Schott)
Kühlschrank 4°C (Liebherr)
Kühlschrank –80°C VIP Series (Sanyo)
Kühlzentrifugen J2-21 (Beckman)
6K10, 2K15 (Sigma) RT 6000B (Sorvall)
Lumineszenzmessgerät Lumat LB 9507 (Berthold)
Mikroskop 950405 (Olympus)
Netzgerät EPS 301 (Amersham pharmacia biotech)
Thermozykler Thermocycler (Landgraf)
Photometer UV160A (Shimadzu)
GeneQuant II (Pharmacia Biotech) Pipetten 0,5-10 µl, 10-100 µl, 100-
1000 µl
(Eppendorf Research)
Pipettierhilfe Pipetboy (Integra Biosciences)
RNA-Gelkammer (Biorad)
Schüttler The Belly Dancer (Stovall)
intelli mixer (Neolab) REAX top (Heildorph) Reax 2000 (Omnilab) Schüttel-Inkubator Certomat H + R (B. Braun)
Sterilwerkbank Hera Safe (Heraeus Instruments) Szintillationsmessgerät (Perkin)
Tischzentrifugen Biofuge pico (Heraeus) Biofuge 13 (Heraeus)
UV Tisch (Bachhofer)
Vakuumtrockner Speed Vac SVC 100 (Savant)
Wasserbäder 42°C (VWR), 37°C (Köttermann)
Wasserfiltrationsanlage Milli QUF Plus (Millipore) Zellinkubator CO2 Auto Zero (Heraeus)
2.1.10 Sonstiges Software
pDRAW32 AcaClone software
Windows2000 professional Microsoft Office XP Professional Microsoft
Mfold Rensselaer Polytechnic Institute
Websites
‚mfold’ 3.2 http://www.bioinfo.rpi.edu/application/mfold/rna/form1.cgi
IRES database http://ifr31w3.toulouse.inserm.fr/IRESdatabase/
IRESite http://www.IRESite.org
„Kits“
GFXTM DNA and Gel Band Purification Kit Amersham Biosciences GFXTM Micro Plasmid Prep Kit Amersham Biosciences MicroSpin Sephacryl S-200 HR-Säulen Amersham Biosciences
Nucleobond PC 500 Macherey Nagel
Super Signal® West Femto Maximum Sensitivity Substrate
Pierce
Super Signal® West Pico Chemiluminescent Substrate
Pierce
QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen
QuickChangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit Stratagene
Rediprime II Prime Labelling System Amersham Biosciences
Renilla Luciferase Assay System Promega
2.2 Methoden
2.2.1 Arbeiten mit Escherichia coli 2.2.1.1 Kultivierung und Lagerung
Die E.coli-Bakterien (XL1-Blue) wurden, sofern nicht anders angegeben, in LB- Medium bei 37°C schüttelnd (180 rpm) kultiviert. 4 ml der Flüssigkultur wurden mit einem Klon einer Agarplatte angeimpft; mit 50 l dieser Kultur wurde anschließend eine 200 ml Kultur angeimpft. Die Flüssigmedien und Agarplatten enthielten, wenn nicht anders angegeben, 100 µg/ml Ampicillin. Auf Agarplatten ausgestrichenen Bakterien wurden über Nacht bei 37°C und 5% CO2 inkubiert.
Eine kurzfristige Lagerung (bis zu 6 Wochen) von auf Agarplatten ausgestrichenen Bakterienkolonien erfolgte im Kühlraum bei 4°C. Ein e langfristige Lagerung erfolgte durch das Anlegen einer Stammkultur. Die Bakterien wurden in LB-Medium bis zu einer OD600 von 0,3 bis 0,4 kultiviert, mit 20% (v/v) Glycerol versetzt und in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Die Lagerung der Bakterien erfolgte bei -80°C.
2.2.1.2 Herstellung hitzekompetenter E. coli
Kompetente E. coli (XL1-Blue) Bakterien wurden mit der TSS-Methode hergestellt.
Dazu wurde eine 3 ml-Vorkultur von E. coli XL1-Blue angelegt und für 16 h bei 37°C schüttelnd (200 rpm) inkubiert. 100 ml LB-Medium wurden mit der Vorkultur beimpft und die Bakterien bis zu einer OD600 der Bakteriensuspension von 0,3 bis 0,4 herangezogen. Die Bakterien wurden dann für zehn Minuten bei 2.000 x g abzentrifugiert und in 10 ml TSS aufgenommen. Nach zweiminütiger Inkubation auf Eis wurden sie bei -80°C gelagert.
2.2.1.3 Transformation nach Hitzeschockmethode
Zu 200 µl hitzekompetenter Bakterien (XL1-Blue) wurden, wenn nicht anders angegeben, 10 ng präparierter DNA (2.2.3.1 a, 2.2.3.1 b) bzw. die Hälfte eines Ligationsansatzes (2.2.3.2) gegeben. Nach 30 min Inkubation auf Eis wurde das Röhrchen im Wasserbad für 45 s bei 42°C erwärmt. Na ch dem Hitzeschock wurde für zwei Minuten auf Eis inkubiert. Die Bakterien wurden dann in 800 µl LB-Medium ohne Antibiotikum aufgenommen und für eine Stunde bei 37°C und 200 rpm
inkubiert. Üblicherweise wurden 100 µl der erhaltenen Bakteriensuspension auf LB- Agarplatten mit 100 µg/ml Ampicillin gebracht. Diese wurde für etwa 16 h bei 37°C inkubiert. Um eine Konzentrierung der restlichen Bakteriensuspension zu erreichen, wurde die Bakteriensuspension zehn Minuten bei 2000 x g zentrifugiert. 750 l des Überstandes wurden abgenommen und das Pellet in der restlichen Flüssigkeit resuspendiert. Diese Suspension wurde wiederum auf einer Agarplatte ausgestrichen. Am nächsten Tag wurden einzelne Kolonien in 4 ml Flüssigmedium überführt (2.2.1.1).
2.2.2 Herstellung und Reinigung von Nukleinsäuren 2.2.2.1 Präparation von Plasmid-DNA aus E.coli 2.2.2.1 a Maxi-Präparation
Zunächst wurden 4 ml LB-Medium mit E. coli-Bakterien, die das zu präparierende Plasmid trugen, beimpft (2.2.1.1). Die Bakterien wurden durch Zugabe von 100 µg/ml Ampicillin selektiert und für fünf Stunden bei 37°C und 200 rpm inkubiert.
Die Vorkultur wurde in 250 ml LB-Medium (mit 100 µg/ml Ampicillin) überführt. Die Kultur wurde für 16 h bei 37°C schüttelnd inkubiert (160 rpm) und die DNA dann mit dem Nucleobond PC 500 Paket (Macherey & Nagel) präpariert. Im Einzelnen wurde wie folgt verfahren: Die Bakterien wurden zunächst in einem 500 ml Zentrifugenbecher bei 4°C und 2.500 x g abzentrifug iert und in 12 ml Puffer S1 (mit RNAse A) aufgenommen. Anschließend wurden die Bakterien durch Zugabe von 12 ml Puffer S2 lysiert. Die Lösung wurde sechsmal invertiert und für fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Zum Stoppen der Lyse wurden 12 ml Puffer S3 zugegeben und nach erneutem sechsmaligem Invertieren für fünf Minuten auf Eis inkubiert. Das Präzipitat wurde mit einem Faltenfilter abgetrennt und das klare Lysat auf eine mit 6 ml Puffer N2 äquilibrierte Säule gegeben. Das Eluat wurde verworfen und die Säule mit 32 ml Puffer N3 gewaschen. Die DNA wurde nun mit 15 ml Puffer N5 eluiert und durch Zugabe von 11 ml 2-Propanol gefällt. Die Lösung wurde für 30 min bei 10.000 x g und 4°C zentrifugiert und das DN A-Pellet mit 2 ml 70% Ethanol gewaschen. Nach erneuter Zentrifugation (zehn Minuten, 10.000 x g, 4°C) wurde die Ethanol-Lösung verworfen und die DNA durch Inkubation bei 37°C getrocknet. Die DNA wurde dann in 200 bis 300 µl 10 mM Tris-HCl pH 7,6 aufgenommen und die