b Induktion von HeLa B.-Zellen mit Interleukin-1

2 MATERIAL UND METHODEN 16

2.2 Methoden

2.2.7 Arbeiten mit eukaryontischen Zellen

2.2.7.4 b Induktion von HeLa B.-Zellen mit Interleukin-1

Bei den durchgeführten Induktionsversuchen mit Interleukin-1 (IL-1) wurden 4 x 10⁵ Zellen in Zellkulturmedium mit 5% FCS in 3,5 cm ∅ Kulturschalen ausgesät. Nach 16 h wurde das Zellkulturmedium durch frisches Medium mit 10% FCS ersetzt. Je nach Versuch wurde im Abstand von zwei, vier oder acht Stunden induziert. Dafür wurde das Medium der Zellen verworfen und durch 2 ml Medium mit 10 ng/ml IL-1 ersetzt.

Das Zellkulturmedium wurde bis zur Zelllyse (2.2.7.5) je nach Versuchsaufbau 15, 21 bzw. 24 h auf den Zellen belassen.

2.2.7.5 Zelllyse zur Vorbereitung von Luziferase-Aktivitätsmessungen

Die kultivierten Zellen wurden am zweiten Tag nach der Transfektion (2.2.7.3) lysiert.

Alle Arbeitsschritte wurden auf Eis durchgeführt. Die 6-Well-Platten wurden pro Well zweimal mit je 1 ml eiskaltem PBS gewaschen. Anschließend wurden die Zellen entweder in 500 µl Renilla Luciferase-Lysepuffer (2.1.10) vom Boden der Kulturplatte gelöst oder in 1 ml PBS aufgenommen, zehn Minuten bei 2.000 x g zentrifugiert und

das Pellet anschließend in 300 µl Lysepuffer aufgenommen. Die Zellsuspension wurde dann für 15 min bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden die Zelltrümmer bei 4°C und 13.000 x g abzentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen und bei -80°C gelagert.

Bei der Isolierung von RNA aus HeLa B.-Zellen (2.2.2.5) wurde lediglich ein Aliquot der Zellsuspension für Luziferase-Aktivitätsmessungen lysiert. Hierzu wurde 1 ml der 10 ml Zellsuspension bei 2.000 x g fünf Minuten abzentrifugiert, der Überstand abgenommen und in 400 µl Lysepuffer für 15 min inkubiert. Im Anschluss erfolgte eine Zentrifugation bei 13.000 x g für zehn Minuten. Der Überstand wurde abgenommen und bei -80°C gelagert.

2.2.8 Proteinanalytik

Die Messung erfolgte am Lumat LB 9507 und mit dem Renilla Luciferase Assay System der Firma Promega. 16 µl des hergestellten Zelllysats (2.2.7.5.) wurden in einem Kunststoffklarsichtröhrchen in das Lumineszenzgerät gebracht. Zur Bestimmung der Renilla-Luziferase Lumineszenz wurden 100 µl des Renilla Luciferase Assay Buffer (Luciferase Assay Substrat 1:100 mit Luciferase Assay Buffer verdünnt) zum Zelllysat gegeben (2.1.10). Anschließend wurde für zehn Sekunden die Lumineszenz der Probe bestimmt. Jeder Wert wurde doppelt bestimmt und dann gemittelt. Für die Messung der Firefly-Luziferase Lumineszenz wurden 100 µl Luziferase-Messpuffer (2.1.2) eingesetzt. Aufgrund der geringeren Stabilität des Renilla Luciferase Assay Systems gegenüber dem Messpuffer der Firefly-Luziferase wurde darauf geachtet, dass die Renilla-Luziferase Aktivitätsbestimmung stets vor der Firefly-Luziferase Aktivitätsbestimmung ermittelt wurde.

Abb. 3.1: Schematische Darstellung des Aufbaus der verwendeten Reporter-genvektoren.

Die Reportergene der Renilla-Luziferase (RLuc) und der Firefly-Luziferase (FLuc) sind grün markiert.

Das IRES Element ist gelb unterlegt. Alle verwendeten bicistronischen Vektoren besitzen einen SV40 Promotor, eine Ampicillin-Resistenz (rot dargestellt) sowie eine Spleißstelle (schwarz dargestellt).

3 Ergebnisse

Ein Ziel dieser Arbeit war es, die Funktion und Eigenschaften des NRF-IRES-Elementes zu untersuchen. Dies erfolgte in zwei Schritten: Der erste Schritt bestand in der Eingrenzung eines minimalen IRES-Elementes (mIRES) durch Punkt- und Deletionsmutagenese in einem bicistronischen Reportersystem. In einem zweiten Schritt erfolgte die Überprüfung der Integrität aller bicistronischen mRNAs mittels Northern Blot-Analyse.

3.1 Bicistronisches Reportersystem zur Untersuchung von IRES-Sequenzen Zur Charakterisierung von IRES-Elementen hat sich die Nutzung der bicistronischen Vektoren etabliert (Pelletier & Sonenberg, 1988). Unter der Kontrolle eines gemeinsamen Promotors entstehen bei der Transkription der Reportergenvektoren bicistronische mRNAs. Sie bestehen aus der kodierenden Sequenz der Renilla-Luziferase (Renilla reniformis, Seegurke) im ersten Cistron und der kodierenden Sequenz der Firefly-Luziferase (Photinus pyralis, Leuchtkäfer) im zweiten Cistron. Das IRES-Element befindet sich zwischen den beiden Luziferasegenen. Die Renilla-Luziferase (RLuc) wird über den gewöhnlichen Cap-abhängigen „Scanning“-Mechanismus translatiert.

Die Translation der Firefly-Luziferase (FLuc) wird durch interne Initiation ermöglicht. Ein „Scanning“ der Ribosomen durch den intercistronischen Bereich ist nicht möglich, da in allen Leserastern Stop-Kodone vorhanden sind. Dies bedeutet, dass die Aktivität des IRES-Elementes direkt an der Firefly-Luziferaseaktivität ablesbar ist.

Im Rahmen dieser Arbeit wurde auf die Verwendung dieser bicistronischen Plasmide zurückgegriffen. Hierfür wurden zur näheren Untersuchung des NRF-IRES-Elementes verschiedene Expressionsvektoren hergestellt, die sich von dem Vektor pBSLucNFLuc (Hennecke et al., 2001) ableiten. Die Expression dieses bicistronischen Reportersystems wird durch den Simian-Virus-40-Promotor (SV40) gewährleistet. Als prokaryontischer

Selektionsmarker dient ein Ampicillin-Resistenzgen, das für eine β-Lactamase kodiert und eine spezifische Amplifikation in Bakterien erlaubt. Dabei ist es durch Verwendung des dualen Reportersystems möglich, die simultane Expression der beiden Luziferasen in einem einzigen Reporter-Assay sequentiell zu messen. Die Wirtszellen exprimieren keine homologen endogenen Enzyme und weisen damit keine eigene Luziferaseaktivität auf. Renilla- und Firefly-Luziferase haben aufgrund ihres unterschiedlichen evolutionären Ursprungs verschiedene Enzymstrukturen und Substratanforderungen, wodurch es ermöglicht wird zwischen ihren Biolumineszenz-Reaktionen zu unterscheiden. Dies resultiert in einer Lichtdetektion bei unterschiedlicher Wellenlänge. Die Firefly-Luziferase katalysiert die Reaktion von D-Luziferin, Mg²⁺, ATP und O₂ zu Oxyluziferin und CO₂. Während dieser Reaktion wird Licht einer Wellenlänge von 562 nm emittiert. Die Lichtintensität ist proportional zur Enzymaktivität und somit auch zur Enzymmenge. Diese ist das Ergebnis der Translationsaktivität des NRF-IRES-Elementes. Die Renilla-Luziferase ermöglicht die Umsetzung von Coelentarazin und O₂ zu Coelenteramid und CO₂. Die gemessene Lumineszenz und damit die Aktivität der Renilla-Luziferase zeigt den Grundlevel der Cap-abhängigen Translation in den Zellen an.

Die Transfektion der Plasmide erfolgte transient in die humane Zelllinie HeLa B.

Sämtliche Transfektionen wurden mittels drei Parallelen durchgeführt und wenigstens dreimal wiederholt. Dies entspricht neun unabhängigen Transfektionen.

Anschließend wurden die Aktivitäten der Renilla- und der Firefly-Luziferase getrennt voneinander in relativen Lichteinheiten (RLuc) pro µg Gesamtprotein bestimmt. Zur Darstellung der Aktivität der beiden Luziferasen wurden verschiedene Säulendiagramme verwendet. Um die Stärke des IRES-Elementes der verschiedenen Vektoren untereinander vergleichen zu können, wurde der Quotient aus dem Firefly- (zweites Cistron) und dem Renilla-Luziferasewert (erstes Cistron) gebildet. Durch diese Darstellungsweise konnten Schwankungen der Transfektionseffizienz der einzelnen Plasmide aufgehoben werden. Da sich die in dieser Arbeit eingesetzten transfizierten Reportergenvektoren lediglich in der IRES-Sequenz vor dem zweiten Cistron unterscheiden, wird angenommen, dass die Translation des ersten Cistrons nur in geringem Maße variiert, während die Translation des zweiten Cistrons, durch eingeführte Mutationen am IRES stärkere Veränderungen der Proteinexpression aufweist. Demzufolge kann bei Veränderungen des errechneten Quotienten (FLuc/RLuc) von einer ausschließlichen

Abhängigkeit der Firefly-Expression ausgegangen werden. Um dies zu veranschaulichen, wurden die relativen Renilla- und Firefly-Messwerte in zwei weiteren Diagrammen berücksichtigt. Die zugehörigen Einzelmesswerte der jeweiligen Versuche sind im Anhang einsehbar.

Für die Darstellung der Ergebnisse dieser Arbeit wurde eine einheitliche Form gewählt. Für jedes durchgeführte Experiment wird zunächst der Aufbau der verwendeten Vektoren und deren Klonierung vorgestellt. Anschließend werden die Ergebnisse der Reportergenexperimente besprochen. Zuletzt wird anhand von Northern Blots gezeigt, dass sowohl die eingesetzte RNA-Menge als auch die Expression der verschiedenen Konstrukte vergleichbar sind. Die Plasmidkarten aller verwendeten Reportergenvektoren sind, sofern vorhanden, im Anhang aufgeführt.

Für alle Abbildungen in dieser Arbeit ist zum besseren Verständnis eine einheitliche Farbgebung eingehalten worden. Die Renilla-Luziferase wird hellgrün, die Firefly-Luziferase dunkelgrün, das Ampicillin-Resistenzgen rot und das IRES-Element gelb dargestellt. Die Nomenklatur der für in dieser Arbeit verwendeten Reportergen-vektoren richtet sich im Allgemeinen nach deren Aufbau: p = Plasmid, RL = Renilla-Luziferase, NI = NRF-IRES, FL = Firefly-Luziferase.

3.2 Luziferase-Messungen zur Untersuchung der Aktivität des NRF-IRES-Elementes

3.2.1 Konstruktion des Ausgangsvektors pRLNI0FL

Als Ausgangsvektor für die in dieser Arbeit durchgeführten Experimente sollte der Vektor pRLNI0FL dienen. Dieser Vektor entstand über mehrere Zwischenschritte aus dem Ursprungsvektor pBSRLucNFLuc, der das vollständige NRF-IRES mit 653 bp enthält (Hennecke et al., 2001). Die zur Herstellung des Vektors pRLNI0FL notwendigen Zwischenprodukte sind in der Abb. 3.2 vereinfacht dargestellt.

Zunächst wurden 511 bp aus dem 5’Bereich des NRF-IRES im Vektor pBSRLucNFLuc deletiert. Dieses Expressionsplasmid wurde als pRLNIFL bezeichnet und enthält die durch Oumard (2000) beschriebene minimale funktionelle IRES-Sequenz (mIRES) mit 148 bp. Das so entstandene Plasmid pRLNIFL enthält zwischen dem IRES-Element und der kodierenden Sequenz der Firefly-Luziferase eine 94 Basen lange Linkersequenz. Um eventuelle unspezifische Wirkungen der Linkersequenz auszuschließen, wurde diese aus dem Vektor pRLNIFL entfernt.

Abb. 3.2: Schematische Darstellung der Reportergenvektoren pBSRLucNFLuc, pRLNIFL, pRLNI0FL und pRLFL.

Die Herstellung der Reportergenvektoren pRLNI0FL und pRLFL erfolgte aus dem Ursprungsvektor pBSRLucNFLuc (Einzelheiten im Text 3.2.1). Die Renilla-Luziferase (RLuc) im ersten Cistron ist hellgrün hinterlegt. Die Firefly-Luziferase (FLuc) im zweiten Cistron ist dunkelgrün dargestellt. RLuc steht unter der Kontrolle des Simian-Virus40 (SV40)-Promotor. Der Vektor pBSRLucNFLuc enthält im intercistronischen Bereich das vollständige NRF-IRES-Element mit 653 bp. In dem Vektor pRLNIFL ist hingegen nur noch das minimale NRF-IRES-Element (148 bp) enthalten. Das Plasmid pRLNI0FL entstand durch Deletion einer 3’ des mIRES gelgenen Linkersequenz (94 bp). Im Falle des pRLFL-Vektors folgen die beiden Cistrone ohne eingefügte Sequenzen direkt aufeinander. Sie wurde als Kontrolle verwendet. Alle Vektoren enthalten 5’ des Renilla-Reportergens eine Spleißstelle mit Spleißakzeptor und Spleißdonor (schwarz dargestellt).

Dafür wurde mittels Mutagenese (2.2.3.4) eine zusätzliche SacI-Restriktionsstelle in pRLNIFL eingeführt. Die hierfür verwendete Primer waren: SacI5 und SacI3 (2.1.5).

Durch anschließenden SacI-Verdau (2.2.3.1 a) wurde die Linkersequenz herausgeschnitten. Der Vektor pRLNI0FL entstand durch anschließende Ligation der DNA (2.2.3.2). In nachfolgenden Experimenten sollte dieser Vektor, zwecks Analyse der Struktur-Funktions-Beziehung seines IRES-Elementes, weiter verändert werden.

Als Negativkontrolle diente das Plasmid pRLFL in dem die beiden Reportergene – ohne das NRF-IRES – direkt aufeinander folgen.

3.2.2 Luziferase-Messungen der Reportergenvektoren pRLNI0FL und pRLFL Zur Etablierung des bicistronischen Reportersystems wurden HeLa B.-Zellen mit 8 µg der Reportergenvektoren pRLNI0FL, mit Element, und pRLFL, ohne IRES-Element, transient transfiziert (2.2.7.3). Im Anschluss an die Zelllyse (2.2.7.5) wurde die Renilla (RLuc)- und Firefly (FLuc)-Luziferase-Expression für beide Vektoren bestimmt (2.2.8). Anhand der gemessenen FLuc-Expression sollte die Funktion der IRES-Sequenz im Vektor pRLNI0FL nachgewiesen werden. Als Kontrolle darüber, dass die Zellen selbst keine messbaren Mengen an RLuc- bzw. FLuc-Proteinen

pBSRLucNFLuc

pRLNIFL

pRLNI0FL

pRLFL

B: Relative Expression der Firefly-Luziferase (Fluc) pro µg Gesamtprotein. C: Quotient der Luziferasewerte aus dem zweiten Cistron und dem ersten Cistron (FLuc/RLuc). Der Quotient der Kontrolle (untransfizierte Zellen) wurde nicht aufgeführt. Die Standardabweichung wurde aus jeweils drei Parallelen mit vier Wiederholungen errechnet.

exprimieren, wurde parallel dazu die Expression beider Proteine in untransfizierten Zellen gemessen. Die Expression der beiden Luziferasen sowie deren errechnete Quotienten sind in Abb. 3.3 dargestellt. Die relative RLuc-Expression zeigt für die beiden Vektoren pRLNI0FL (RLuc-Expression: 1 x 10⁶ Lichteinheiten) und pRLFL (RLuc Expression: 1,6 x 10 ⁶ Lichteinheiten) wie erwartet relativ geringe Schwankungen (s. Abb. 3.3 A). Im Gegensatz dazu ist bei der relativen FLuc-Expression des Vektors pRLNI0FL, der das minimal funktionelle IRES-Element enthält, eine deutlich höhere Expression (29,5 x 10⁶Lichteinheiten zu 0,95 x 10⁶ Lichteinheiten für pRLFL) festzustellen. Die interne Translation des zweiten Cistrons liegt damit für den Vektor pRLNI0FL deutlich über der Cap-abhängigen Translation.

Im Vergleich zur Kontrolle pRLFL -ohne IRES- ist die FLuc Expression 31-fach höher (29,5 x 10⁶ zu 0,95 x 10⁶ Lichteinheiten) (s. Abb. 3.3 B).

Dieser signifikante Unterschied, der sich aus der Expression der Firefly-Luziferase zwischen den beiden Vektoren ergibt, ist allein auf die Funktion des NRF-IRES-Elementes vor dem Firefly-Reportergen zurückzuführen. Um Schwankungen der Translationseffizienz aufzuheben, die an den leicht unterschiedlichen RLuc- und

Abb. 3.3: Vergleichende Darstellung der Renilla- und Firefly-Proteinexpression der Reportergenvektoren pRLNI0FL, pRLFL und untransfizierter Zellen (Kontrolle).

8 µg der angegebenen Expressionsplasmide wurden in HeLa B.-Zellen transfiziert (2.2.7.3), nach 48 h lysiert (2.2.7.5) und die Firefly- und Renilla-Expression gemessen (2.2.8). Es wurden vier unabhängige Transfektionen mit jeweils drei Parallelversuchen zusammen-gefasst. A: Relative Expression der Renilla- Luziferase. (Rluc) pro µg Gesamtprotein.

A. B.

FLuc-Expressionen abzulesen sind, wurde zusätzlich der Quotient der beiden Cistrone eines jeweiligen Experiments gebildet. Für pRLNI0FL beträgt dieser 30,1, für pRLFL 0,5. Durch die Bildung des Quotienten aus dem zweiten Cistron (FLuc) und dem ersten Cistron (RLuc) zeigt eine 37-fach höhere Firefly-Expression für pRLNI0FL gegenüber dem Vektor pRLFL (s. Abb. 3.3 C). Diese Darstellung berücksichtigt die Schwankungen der Transfektionseffizienz und erlaubt genauere Aussagen über die IRES-Aktivität als sie allein durch Rückschlüsse auf die Firefly-Expression möglich wären. Die messbare Aktivität des IRES-Elementes im intercistronischen Bereich wird demnach durch diese Korrektur von dem Faktor 31 (bei alleiniger Berücksichtigung der FLuc) auf den Faktor 37 (bei Quotientenbildung) erhöht. Dies verdeutlicht die Notwendigkeit, die Firefly-Werte jeder Transfektion auf die zugehörigen Renilla-Werte zu beziehen. Die gemessenen Luziferasewerte für untransfizierte Zellen liegen für beide Luziferasen drei Zehnerpotenzen unter denen, die für pRLNI0FL gemessen wurden (untransfizierte Zellen: FLuc 2 x 10³; RLuc 7 x 10³) und sind daher im Diagramm nicht darstellbar. Sie wurden infolgedessen bei der Auswertung nachfolgender Versuche nicht weiter berücksichtigt (s. Diskussion).

3.2.3 Nachweis der bicistronischen mRNA der Reportergenvektoren pRLNI0FL und pRLFL

Um anhand der gemessenen Proteinexpression Aussagen über den Einfluss eingeführter Mutationen auf die IRES-Aktivität treffen zu können, muss sichergestellt werden, dass die RNA der bicistronischen Reportergenvervektoren vollständig und in vergleichbaren Mengen vorliegt. Für den Vergleich der Menge der bicistronischen Transkripte wurden Northern Blot-Hybridisierungen durchgeführt. Hiermit konnte gezeigt werden, dass die Expression der Firefly-Luziferase im zweiten Cistron durch eine interne, Cap-unabhängige Translation vonstatten geht. Hierfür wurde die humane Zelllinie HeLa B. mit den genannten Reportergenvektoren transient transfiziert (2.2.7.3). Ein Aliquot der Zellen (2.2.7.5) wurde zur Bestimmung der relativen Luziferase-Expression (2.2.8) und deren Quotienten berechnet. Diese Daten dienten als Transfektionskontrolle. Für Experimente dieser Arbeit bei denen RNA-Proben eine unterschiedliche Intensität der Banden auf den Northern Blots zeigten, wurden diese Werte zusätzlich aufgeführt.

Nach Gewinnung der RNA (2.2.2.5) wurden RNA-Blot-Hybridisierungen (2.2.6.2) mit verschiedenen radioaktiv markierten Proben durchgeführt (2.2.3.5). Die Herstellung

Abb. 3.4: Herstellung der Renilla-Luziferase (RLuc)- und Firefly-Luziferase (FLuc)-Sonden aus dem Reportergenvektor pRLNI0FL.

Die für den Northern Blot verwendeten Sonden wurden ausgehend vom Reportergenvektor pRLNI0FL hergestellt. Die Schnittstellen der jeweiligen Restriktionsenzyme zur Herstellung der RLuc-und FLuc-Sonden sind als solche gekennzeichnet. Die angegebene Basenzahl bezieht sich auf die vollständige Plasmidsequenz des Vektors pRLNI0FL. Im unteren Abbildungsbereich sind die Größen der erwarteten mRNAs einzusehen.Die mRNA mit dem integrierten NRF-IRES hat eine theoretische Länge von 2845 Basen (b) ohne PolyA-Ende. Im ersten Cistron befindet sich die Renilla Luziferase, gefolgt von dem minimalen NRF-IRES (mIRES) und dem zweiten Cistron, der Firefly-Luziferase.

der hierfür verwendeten Proben ist in Abb. 3.4 dargestellt. Zur Hybridisierung wurden mit α[³²P]CTP radioaktiv markierte Sonden des Renilla-Luziferasegens (1028 Basen, s. Abb. 3.4 XhoI/SalI) und des Firefly-Luziferasegens (1289 Basen, s. Abb. 3.4 XbaI/

EcoRV) eingesetzt. Als Negativkontrolle diente Gesamt-RNA aus untransfizierten Zellen. Die Länge der bicistronischen mRNA beträgt rechnerisch 2845 Basen (b).

RNA-Größen:

Renilla-Luziferase: 936 b NRF-mIRES-Element: 148 b Firefly-Luziferase: 1653 b Linkersequenz: 108 b berechnete Gesamt-RNA-Größe: 2845 b

Sowohl bei der Hybridisierung mit der Renilla-Sonde als auch bei der Hybridisierung durch die Firefly-Sonde konnten somit Banden von etwa 3 Kilobasen (kb) erwartet werden. Die Ergebnisse der Agarosegelelektrophorese und der Northern Blot-Analyse sind der Abb. 3.5 auf der nächsten Seite zu entnehmen. Bei der Hybridiesierung des Northern-Blots mit RNA-Proben für pRLFL, pRLNI0FL und untransfizierten Zellen (Kontrolle) ist ersichtlich, dass sowohl bei der Hybridisierung mit der Renilla- als auch mit der Firefly-Sonde, die erwartete Bande bei 3 kb detektiert werden kann (s. Abb. 3.5 B). Zusätzlich entsteht bei der Hybridisierung mit der Firefly-Sonde eine zweite, nicht erwartete Bande von ca. 2,2 kb Länge. Zur

RLuc IRES

XhoI (353 b)

SalI (1381 b) XbaI (1602 b)

EcoRV (2891 b)

FLuc pRLNI0FL 5674 Basen

Überprüfung der aufgetragenen RNA-Menge dienten die Agarose-Gele. Auf ihnen sind erwartungsgemäß die Banden der 18S- und 28S-RNA zu erkennen (s. Abb. 3.5 A). Durch den Vergleich der Intensität der Banden untereinander sind Rückschlüsse auf die aufgetragene Menge der RNA möglich. Die Intensität der erwarteten Banden ist sowohl auf den Agarosegelen als auch auf den Northern Blots für beide Konstrukte gleich stark, so dass von einer gleichen RNA-Menge und von einer gleich starken Expression der verschiedenen Konstrukte ausgegangen werden kann.

Das von den Berechnungen abweichende Bandenmuster nach Hybridisierung mit der FLuc-Sonde kann auf vielfältige Weise entstehen. Es besteht die Möglichkeit, dass ein weiterer Promotor innerhalb des bicistronischen Konstruktes vorliegt. Des Weiteren könnte eine RNA in Antisense-Richtung entstanden sein. Ebenfalls könnte durch Spleißstellen (Donor-Akzeptor-Stelle) innerhalb der RNA eine weitere Bande entstehen oder die Transkription an definierten Stellen abbrechen. Diese unter der Firefly-Hybridisierung zusätzlich aufgetretene 2,2 kb Bande müsste demnach das Gen oder zumindest Teile des Gens der Firefly-Luziferase enthalten, nicht aber das

Abb. 3.5: Agarose-Gelelektrophorese der Gesamt-RNA (A) und Northern Blot-Analyse (B) der bicistronischen Reporter mRNA.

A: Agarosegel der Gesamt-RNA. Links: Agarosegel, das für den Northern Blot mit der Renilla-Sonde hybridisiert wurde. Rechts: Agarosegel, das für den Northern Blot mit der Firefly-Sonde hybridisiert wurde. Die beiden dargestellten Banden entsprechen der ribosomalen 18S- und 28S-RNA. Auf der linken Seite sind die Bandengrößen des aufgetragenen Markers ersichtlich. B: Darstellung der Northern Blot-Analysen für die Reportergenvektoren pRLNI0FL und pRLFL. Als Kontrolle dienten untransfizierte Zellen. Links: Die Gesamt-RNA wurde mit der Renilla Luziferase-spezifischen mit α[³²P]dCTP radioaktiv markierten Sonde (XhoI/SalI) hybridisiert. Für beide Vektoren ist die errechnete 3 kb-Bande nachweisbar. Rechts: Die Gesamt-RNA wurde mit der Firefly Luziferase-spezifischen mit α[³²P]dCTP radioaktiv markierten Sonde (XbaI/EcoRV) hybridisiert. Neben der errechneten 3 kb-Bande ist hier eine zusätzliche etwa 2,2 kb große kb-Bande ungeklärten Ursprungs ersichtlich.

Abb. 3.6: Schematische Darstellung der Reportergenvektoren pRLNI0FL, pRLFL mit Spleißsstelle (schwarz dargestellt) und der Vektoren p0RLNI0FL und p0RLFL nach Deletion der Spleißsstelle.

Mittels Mutagenese (2.2.3.4) wurde die Spleißstelle (schwarz dargestellt) aus den beiden Reportergenvektoren pRLNI0FL und pRLFL entfernt. Die Anordnung der Strukturelemente innerhalb der Vektoren wurde dabei nicht verändert. Die Renilla-Luziferase (RLuc) ist hellgrün unterlegt. Die Firefly-Luziferase (FLuc) ist dunkelgrün markiert. Das IRES-Element ist gelb dargestellt. Die RLuc steht unter der Kontrolle des Simian-Virus 40 (SV40)-Promotors. In den Vektoren pRLNI0FL und p0RLNI0FL ist mit 148 bp das minimale NRF-IRES (NRF) eingefügt. Bei den Vektoren pRLFL und p0RLFL folgen die beiden Cistrone ohne Unterbrechung aufeinander.

Gen der Renilla-Luziferase. Eine Erklärungsmöglichkeit könnte in unterschiedlichen Spleißen der mRNA begründet sein. So enthält sowohl der Ausgangsvektor pRLNI0FL als auch der Vektor pRLFL eine Spleißstelle mit Spleißakzeptor und Spleißdonor (s. Abb. 3.2). Diese Spleißstelle ermöglicht den Reportergenvektoren eine effizientere Expression der kodierten Proteine. Um festzustellen, ob es sich bei der zweiten, kürzeren Bande um ein Spleißprodukt des Firefly-Gens handelt, wurde beiden Vektoren die Spleißstelle entfernt und der Einfluss der Spleißstelle auf die IRES-Aktivität und deren RNA-Integrität untersucht.

3.2.4 Konstruktion der Reportergenvektoren p0RLNI0FL und p0RLFL

Zur Klärung der Entstehung der zweiten Bande im Northern Blot, die bei der Hybridisierung mit der Firefly-Sonde entsteht, wurde den beiden Reportergenvektoren pRLNI0FL und pRLFL die Spleißstelle (Donor-Akzeptor-Stelle) im Bereich von 385 - 416 Basenpaaren entfernt. Eine schematische Darstellung des Aufbaus der Reportergenvektoren mit und ohne Spleißstelle ist der Abb. 3.6 zu entnehmen. Die zur Herstellung dieser Konstrukte notwendigen Klonierungsschritte sind in der Abb. 3.7 detailliert dargestellt.

pRLFL

p0RLFL

pRLNI0FL

p0RLNI0FL

pRLNI0FL 5674 bp

p_RLNI0FL 5676 bp

P0RLNI0FL 5617 bp

pRLFL 5592 bp

P_RLFL 5594 bp

P0RLFL 5535 bp 444 bp

387 bp 387 bp

1136 bp

996 bp

Abb. 3.7: Klonierungsschemata zur Entfernung der Spleißstelle aus den Reportergenvektoren pRLNI0FL und pRLFL.

1: Herstellung des Reportergenvektors p0RLNI0FL: Durch Mutagenese (2.2.3.4) wurde in den Vektor pRLNI0FL eine zweite XhoI- sowie eine SacI-Schnittstelle eingefügt. Durch Kontrollrestriktion des erhaltenen Vektors p_RLNI0FL mit dem Restriktionsenzym SacI wurden positive Klone selektiert (2.2.3.1 a). A: DNA von p_RLNI0FL nach SacI-Verdau. Das erwartete Fragment hat eine Größe von 1136 Bp. Durch anschließenden XhoI-Verdau wurde die Spleißstelle aus dem Vektor deletiert (2.2.3.1 b) und der Vektor erneut ligiert (2.2.3.2). Eine Kontrolle des enstandenen Klons p0RLNI0FL erfolgte

Im Dokument Translationsregulation des Transkriptionsfaktors NRF: Strukturelle und funktionelle Charaktersisierung von NRF-IRES (Seite 46-85)