Herstellung und Reinigung von Nukleinsäuren

2.2.2.1 a Maxi-Präparation

Zunächst wurden 4 ml LB-Medium mit E. coli-Bakterien, die das zu präparierende Plasmid trugen, beimpft (2.2.1.1). Die Bakterien wurden durch Zugabe von 100 µg/ml Ampicillin selektiert und für fünf Stunden bei 37°C und 200 rpm inkubiert.

Die Vorkultur wurde in 250 ml LB-Medium (mit 100 µg/ml Ampicillin) überführt. Die Kultur wurde für 16 h bei 37°C schüttelnd inkubiert (160 rpm) und die DNA dann mit dem Nucleobond PC 500 Paket (Macherey & Nagel) präpariert. Im Einzelnen wurde wie folgt verfahren: Die Bakterien wurden zunächst in einem 500 ml Zentrifugenbecher bei 4°C und 2.500 x g abzentrifug iert und in 12 ml Puffer S1 (mit RNAse A) aufgenommen. Anschließend wurden die Bakterien durch Zugabe von 12 ml Puffer S2 lysiert. Die Lösung wurde sechsmal invertiert und für fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Zum Stoppen der Lyse wurden 12 ml Puffer S3 zugegeben und nach erneutem sechsmaligem Invertieren für fünf Minuten auf Eis inkubiert. Das Präzipitat wurde mit einem Faltenfilter abgetrennt und das klare Lysat auf eine mit 6 ml Puffer N2 äquilibrierte Säule gegeben. Das Eluat wurde verworfen und die Säule mit 32 ml Puffer N3 gewaschen. Die DNA wurde nun mit 15 ml Puffer N5 eluiert und durch Zugabe von 11 ml 2-Propanol gefällt. Die Lösung wurde für 30 min bei 10.000 x g und 4°C zentrifugiert und das DN A-Pellet mit 2 ml 70% Ethanol gewaschen. Nach erneuter Zentrifugation (zehn Minuten, 10.000 x g, 4°C) wurde die Ethanol-Lösung verworfen und die DNA durch Inkubation bei 37°C getrocknet. Die DNA wurde dann in 200 bis 300 µl 10 mM Tris-HCl pH 7,6 aufgenommen und die

Konzentration über eine Extinktionsmessung bei 260 nm bestimmt. Die Lösung wurde bei -20°C gelagert.

2.2.2.1 b Mini-Präparation

Für die Plasmidpräparation wurde das GFX^TM Micro Plasmid Prep Kit von Amersham Biosciences verwendet. Alle Zentrifugationsschritte wurden bei maximaler Geschwindigkeit der Tischzentrifuge durchgeführt.

Von einer 4 ml Flüssigkultur (2.2.1.1) wurden 1,5 ml in Eppendorfgefäße überführt.

Nach 30 s Zentrifugation wurde der Überstand verworfen und das Pellet in 150 µl Solution 1 resuspensiert. Die Suspension wurde mit 150 µl Solution 2 versetzt und durch mehrmaliges Invertieren des Röhrchens gemischt. Im Anschluss wurden 300 µl Solution 3 zugegeben. Nach erneuter mehrmaliger Inversion der Suspension wurden die Zelltrümmer bei maximaler Geschwindigkeit für fünf Minuten abzentrifugiert und das klare Lysat auf die mitgelieferte Säule gegeben. Nach einminütiger Zentrifugation wurde das Eluat verworfen und die Säule zunächst mit 300 µl Puffer III gewaschen. Nach einer weiteren Minute Zentrifugation wurde mit 400 µl des mitgelieferten Wasch-Puffers gewaschen. 40 µl 10 mM Tris-HCl pH 7,6 wurden im folgenden Schritt auf die Säule gegeben, für eine Minute bei Raumtemperatur inkubiert und durch einminütige Zentrifugation eluiert. Der Elutionsschritt wurde zur Erhöhung der Ausbeute mit dem Eluat wiederholt.

2.2.2.2 Extraktion von DNA aus Agarosegelen

Nach der Auftrennung der Fragmente im Agarosegel (2.2.4.1) wurde die mit Ethidiumbromid angefärbte DNA im UV-Licht detektiert und aus dem Gel ausgeschnitten. Das Gelstück wurde je nach mitgelieferter Anleitung weiter aufgearbeitet. Alle Zentrifugationsschritte wurden bei maximaler Geschwindigkeit der Tischzentrifuge durchgeführt.

2.2.2.2 a GFX^TM DNA and Gel Band Purification Kit von Amersham Biosciences

Zunächst wurde das Gelstück mit 10 µl Capture buffer pro 10 mg Gel versetzt. Der Ansatz wurde gut gemischt und solange bei 60°C inku biert bis die Agarose

vollständig gelöst war. Nach kurzem Abzentrifugieren wurde die Lösung auf eine GFX-Säule gegeben, eine Minute bei Raumtemperatur inkubiert und im Anschluss 30 s zentrifugiert. Auf die Säule wurden 500 µl Wash buffer gegeben, gefolgt von einem weiteren Zentrifugationsschritt (30 s). Das Eluat wurde verworfen. Die DNA wurde schließlich mit 40 µl 10 mM Tris-HCl pH 7,5 eine Minute bei Raumtemperatur inkubiert und abschließend für eine Minute zentrifugiert. Zur Erhöhung der Ausbeute wurde der Elutionsschritt ggf. wiederholt, die Nukleinsäure anschließend bei -20°C gelagert.

2.2.2.2 b QIAquick Gel Extraction Kit von Qiagen

Zu dem aus dem Agarosegel ausgeschnittenen Gelstück wurde das dreifache Volumen an Puffer QXI gegeben und das Gelstück bei 50°C gelöst. Die Lösung wurde anschließend auf eine Säule mit Silica-Gel-Membran gegeben und für eine Minute bei 13.000 x g zentrifugiert. Nach Zugabe von 750 µl ethanolhaltigem Puffer PE wurde zweimal für eine Minute bei 13.000 x g zentrifugiert. Zu der Elution der DNA aus der Säule wurden 30 µl Puffer Elution Buffer (10 mM Tris/HCl, pH 8,5) auf die Säule gegeben. Nach einminütiger Inkubation bei Raumtemperatur wurde anschließend wieder eine Minute bei 13.000 x g zentrifugiert.

2.2.2.3 Phenolextraktion und Ethanolpräzipitation

Die zu extrahierende DNA-Lösung (2.2.3.1 b) wurde auf ein Volumen von 200 µl mit destilliertem Wasser aufgefüllt. Das gleiche Volumen an Phenol/Chloroform/

Isoamylalkohol (25:24:1) wurde hinzugefügt, eine Minute geschüttelt und zwei Minuten bei 13.000 x g in der Tischzentrifuge zentrifugiert. Der wässrige Überstand wurde abgenommen und in ein neues Eppendorfgefäß überführt. Die Phenolphase wurde erneut mit 200 µl Wasser extrahiert, ebenfalls eine Minute geschüttelt und anschließend zwei Minuten zentrifugiert. Der gewonnene wässrige Überstand wurde zu dem klaren Überstand des ersten Schrittes gegeben. Das gleiche Volumen Chloroform wurde zugegeben. Erneut wurde eine Minute geschüttelt und zwei Minuten bei 13.000 x g zentrifugiert. Der Überstand wurde möglichst ohne Chloroform abgenommen und in ein neues Eppendorfgefäß überführt. Zu dieser Lösung wurden 1/10 des Volumens an 3 M Natrium-Acetat (pH 5,2) und das gleiche Volumen an kaltem Isopropanol zugegeben. Die Fällung erfolgte standardmäßig über

Nacht. Anschließend wurde für 30 min bei 4°C und mi ndestens 13.000 x g zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet mit 1 ml 70%igem Ethanol gewaschen und erneut für zehn Minuten bei 4°C und 13.000 x g zentrifugiert.

Nach vollständiger Entfernung des Ethanols wurde das Pellet für ca. 15 min bei 37°C getrocknet. Das Pellet wurde in Tris- oder TE-Puffer gelöst. Die Menge richtete sich dabei nach der Größe des jeweiligen Pellets. Bei nicht sichtbarem Pellet wurden standardmäßig 10 µl eingesetzt.

2.2.2.4 DNA-Isolierung aus Restriktionslösungen

Zur Aufreinigung der Nukleinsäuren aus einer Restriktionslösung wurden zu der Restriktionslösung 1/10 des Volumens an 3 M Natrium-Acetat (pH 5,2) und das gleiche Volumen an -20°C-kaltem Isopropanol zugegeb en. Nach Fällung über Nacht wurden die Proben wie im Unterpunkt 2.2.2.3 weiter bearbeitet.

2.2.2.5 Isolierung von RNA aus Säugerzellen

Die Isolierung von RNA aus Säugerzellen erfolgte durch Trizol/Chloroform-Extraktion.

Die in 9 cm Kulturschalen ausgesäten Hela B.-Zellen (2.2.7.1) (3 x 10⁶ Zellen) wurden zunächst 2 x mit 10 ml kaltem PBS gewaschen. Nach Zugabe weiterer 10 ml PBS auf die Zellkulturschale wurden die Zellen mit einem sterilen Zellschaber vom Boden gelöst und abzüglich 1000 µl für die Proteinbestimmung (2.2.8) fünf Minuten bei 2.000 x g und 4°C abzentrifugiert. Der Überstand wurde abdekantiert, das Pellet in 1 ml Trizol-Lösung resuspendiert und fünf Minuten bei Raumtemperatur schüttelnd inkubiert. Nach Zugabe von 200 µl Chloroform wurde die Lösung 15 s mehrfach invertiert und anschließend wieder drei Minuten bei Raumtemperatur geschüttelt. Zur Phasentrennung folgte eine 15-minütige Zentrifugation bei 4°C und 13.000 x g. Nach Überführung von 600 µl des klaren Überstandes in ein neues 2 ml Eppendorfgefäß wurden, zur Fällung der Nukleinsäuren, 500 µl Isopropanol zugegeben und bei Raumtemperatur für zehn Minuten inkubiert. Anschließend wurde die Lösung für zehn Minuten bei 4°C und 13.000 x g abzentrifugiert . Der Überstand wurde verworfen, das Pellet mit 1 ml 75% (v/v) Ethanol gewaschen und für fünf Minuten bei 4°C und 7.500 x g zentrifugiert. Die isolierten Nuk leinsäuren wurden 15 min bei Raumtemperatur getrocknet. Die RNA wurde, je nach Größe des Pellets, in 30 - 50 µl H₂O aufgenommen. Zur Lösung der RNA folgte eine 10-minütige Inkubation bei

60°C. Die Konzentration der RNA wurde photometrisch bestimmt (2.2.2.6) und bei -80°C gelagert.

2.2.2.6 Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren

Die DNA Lösung (2.2.2.1, 2.2.2.3) wurde mit Wasser 1:200 verdünnt. Die Extinktion der Nukleinsäurelösung wurde photometrisch bei 260 nm bestimmt. Als mittlerer Extinktionskoeffizient wurde ε=50g/lcm verwendet (c=E/εd). Zur Überprüfung der Reinheit der isolierten Nukleinsäuren wurde der Quotient OD_260nm/OD_280nm bestimmt.

Als Voraussetzung für die Verwendung der Nukleinsäure musste die gemessene Extinktion bei 1,8 (DNA) und 2,0 (RNA) liegen.

2.2.3 Modifikation von Nukleinsäuren