Translation bei Eukaryonten

Die Translation wird in Initiation, Elongation und Termination unterteilt. In allen drei Phasen spielen regulatorische Mechanismen eine wesentliche Rolle. Dabei ermöglicht die Initiation die effektivste Kontrolle der Translation und unterliegt daher einer komplexen Regulation. Es werden zwei Arten von Translationsinitiation unterschieden: Die 5’Cap-abhängige Initiation und die Initiation über sogenannte IRES (Internal ribosome entry segment)-Elemente, die Cap-unabhängig erfolgt.

1.1.1 Mechanismus der Cap-abhängigen Translationsinitiation

Eukaryontische mRNA verfügen neben der kodierenden Sequenz über eine Cap-Struktur (7-Methylguanosin-Cap, m⁷GpppN) am 5’Ende und eine PolyA-Sequenz am 3’Ende. Zwischen der Cap-Struktur und dem Translationsstart befinden sich kurze untranslatierte Regionen (UTRs). Nach Transkription, Verarbeitung der mRNA und deren Ausschleusung aus dem Zellkern wird die RNA translatiert. Eukaryontische mRNAs werden generell durch den komplexen Cap-abhängigen Translations-mechanismus translatiert. Neben dem Ribosom sind elf eukaryontische Initiations-faktoren (eIFs) an der Cap-abhängigen Initiation beteiligt (Hershey & Merrick, 1996).

Während der Translationsinitiation wird mit Hilfe dieser Faktoren das 80S-Ribosom gebildet und zum Translationsstart dirigiert. Der Ablauf der Initiation ist folgender (s.

Abb. 1.1 A): Unabhängig von der mRNA bildet sich im Zytoplasma ein Primärkomplex aus der 40S-Ribosomenuntereinheit und den Initiationsfaktoren eIF1A, eIF3 und eIF5. Der Initiationsfaktor eIF3 verhindert die vorzeitige Bindung der

60S-Untereinheit an die 40S-Untereinheit der Ribosomen. Zusammen mit dem Initiationsfaktor eIF1 bindet weiterhin ein ternärer Komplex, bestehend aus dem GTP-tragenden Faktor eIF2 und der Initiatior-Met-tRNA, an den 40S-Komplex. Die Bildung des ternären Komplexes wird zuvor durch eIF2B reguliert. Der Zusammenschluss der o. a. Initiationsfaktoren, des ternären Komplexes sowie der 40S-Ribosomeneinheit wird als 43S-Prä-Initiationskomplex bezeichnet. Dieser Komplex bindet die Cap-Struktur am 5’Terminus der mRNA.

Neben dem 43S-Prä-Initiationskomplex interagiert die Cap-Struktur mit drei weiteren Initiationsfaktoren (eIF4A, eIF4E, eIF4G), die zusammen den eIF4F-Komplex bilden.

Der Faktor eIF4E (cap binding protein, CBP) erkennt und bindet die 5’Cap-Struktur der mRNA. Das eIF4G kann mit mehreren Faktoren interagieren. Die Interaktion der eIF4G-Untereinheit mit dem Initiationsfaktor eIF3 des 43S-Prä-Initiationskomplexes ist von besonderer Bedeutung: Sie ermöglicht die Verbindung zwischen dem

Abb. 1.1: Cap-abhängige Translationsinitiation in Eukaryonten.

A: Die Translation der mRNA in Protein beginnt, wenn sich die Initiator-Met-tRNA zusammen mit der mRNA und den beiden Ribosomen-Untereinheiten am Startkodon (AUG) zum 48S-Komplex zusammenfügt. Hierfür sind mehrere Teilschritte notwendig, die von elf Initiationsfaktoren (eIFs) gesteuert werden. Einzelheiten sind dem Text (1.1.1) zu entnehmen. Die Steuerung der 40S-Ribosomen-

B.

A.

Untereinheit an die mRNA wird durch Protein-RNA und RNA-RNA-Interaktionen gewährleistet. Der Prä-Initiationskomplex bindet unter Mitwirkung des eIF4F-Komplexes das 5’Cap der mRNA. Dieser

„scannt“ die mRNA in 5’3’Richtung bis zum Startkodon. Dort verbinden sich die beiden Ribosomen-Untereinheiten zum 80S-Ribosomen. Die beteiligten eIFs stehen anschließend für die nächste Translationsinitiation bereit. B: Durch Interaktion von PABP und eIF4G kommen die Cap-Struktur und die 3’PolyA-Sequenz in räumliche Nähe. Durch Zirkularisierung der mRNA wird ein effizienteres Ablesen der mRNA ermöglicht. Die Abbildungen stammen aus: Lopez-Lastra et al., 2005.

Ribosom und der mRNA. Die RNA-Helicase eIF4A löst unter ATP-Spaltung Sekundärstrukturen der mRNA (Rogers, 2002). Zusammen ermöglichen diese drei Faktoren dem 43S-Prä-Initiationskomplex unter ATP-Verbrauch das „Scannen“ der mRNA in 5’3’Richtung bis zum Startkodon, das von sogenannten Kozak-Sequenzen (Kozak, 1986) eingerahmt wird. Am Startkodon formiert sich aus den drei Komponenten – der 40S-Ribosomenuntereinheit, dem ternären Komplex (Met-tRNA_i/eIF2/GTP) und der vorbereiteten mRNA – ein stabiler Komplex, der als 48S-Prä-Initiationskomplex bezeichnet wird. Nach der Erkennung des Initiationskodons durch den 48S-Prä-Initiationskomplex wird eIF2 von der mRNA gelöst. Dies erfolgt mit Hilfe des Faktors eIF5B. Dieser spaltet das GTP am Faktor eIF2, was zu einem Entlassen von eIF2-GDP führt. Der Faktor eIF1 beugt als negativer Regulator des Faktors eIF5B einer vorzeitigen GTP-Hydrolyse vor. eIF5B ermöglicht außerdem die Bindung der 60S- an die 40S-Ribosomenuntereinheit und damit die Bildung des 80S-Initiationskomplexes.

Während der Translationsinitiation interagieren weiterhin PolyA-bindende Proteine (PABP) mit dem Cap-assoziierten Faktor eIF4G (Kahvejian et al., 2005; Borman et al., 2000) (s. Abb. 1.1 B). Die mRNA bildet dadurch eine Ringstruktur aus, die ein effizienteres Ablesen durch die Ribosomen ermöglicht (Wells et al., 1998; Gallie, 1991). Neben der beschriebenen Cap-abhängigen Translationsinitiation sind noch drei weitere, nicht-klassische Mechanismen der Cap-abhängigen Initiation beschrieben worden: Leaky scanning, ribosomales shunting und termination-reinitiation. An dieser Stelle soll jedoch nicht näher darauf eingegangen werden.

1.1.2 Regulation der Translationsinitiation

Die Cap-abhängige Translationsinitiation kann in mehreren Stadien reguliert werden.

Eine Feinregulierung der Proteintranslation geschieht dabei hauptsächlich über die Bereitstellung der Cap-bindenden Proteine. So können Veränderungen in der Proteinsyntheseaktivität überwiegend über Phosphorylierung und De-phosphorylierung von Initiationsfaktoren erreicht werden (Gingras et al., 2001). Der limitierende Schritt der Translationsinitiation ist hierbei die Bereitstellung des Cap-bindenden Faktors eIF4E. Dieser Faktor liegt von allen Initiationsfaktoren in der geringsten Menge in der Zelle vor (Duncan et al., 1987). Die Menge an eIF4E wird durch die Phosphorylierung von eIF4E-Bindungsproteinen (4E-BPs) reguliert (Gingras et al., 1999). In dephosphorylierter Form konkurrieren 4E-BPs mit eIF4G um

eine gemeinsame Bindungsstelle am Initiationsfaktor eIF4E und verhindern die Bildung des Proteinkomplexes eIF4F. Als Folge wird die Cap-abhängige Translation in höheren Eukaryonten inhibiert. Dies kann z. B. bei der Mitose beobachtet werden (Sharff & Robbins, 1966). Ein weiterer Regulationsmechanismus betrifft den aus drei Untereinheiten (α, β, γ) bestehenden eukaryontischen Initiationsfaktor eIF2. Durch das Enzym eIF2B wird – nach Verbrauch des GTP – der ternäre Komplex wieder regeneriert (Nika et al., 2001). Durch Phosphorylierung der α-Untereinheit des eIF2 wird dessen Dissoziation von eIF2B erschwert, woraus eine allgemeine Abnahme der Proteintranslation resultiert. Weiterhin können auch Proteasen die Cap-abhängige Translationsinitiation beeinflussen, indem sie Initiationsfaktoren abbauen.

Die Initiationsfaktoren eIF4G und PABP werden auf diese Weise bei der apoptotischen Signalkaskade durch die Caspase-3 abgebaut (Marissen et al., 2004;

Clemens et al., 2000). Virale Infektionen können dagegen einen Aktivitätsverlust des eIF4G (Gradi et al., 1998), 4E-BP (Gingras et al., 1996) oder PABP (Kuyumeu-Martinez et al., 2004) bedingen und so den zellulären Translationsapparat inaktivieren.