Luziferase-Messungen nach Stimulation mit Interleukin-1

2 MATERIAL UND METHODEN 16

2.2 Methoden

3.7.1 Luziferase-Messungen nach Stimulation mit Interleukin-1

Durch dieses Experiment sollte untersucht werden, ob die Stimulation mit Interleukin-1 (IL-Interleukin-1) die mIRES-Funktion beeinflusst. Um außerdem den Einfluss der 3’gelegenen Haarnadelstruktur unter IL-1-Induktion beurteilen zu können, wurde zusätzlich zu p0RLNI0FL auch der Vektor p0RLNI0FL Pst mituntersucht. Dazu wurden 8 µg beider Vektoren in HeLa B.-Zellen transfiziert (2.2.7.3). Die Induktion mit IL-1 erfolgte je nach Versuchsaufbau nach zwei, vier und acht Stunden (2.2.7.4 b). Die Zellen wurden anschließend im Abstand von 15, 21 bzw. 24 h lysiert (2.2.7.5) und deren Luziferase-Expression bestimmt (2.2.8). Veränderungen der Expressionshöhe der beiden Luziferasen unter Induktion wurden als Hinweis auf eine Veränderung im Translationsablauf gedeutet. Die RLuc- und FLuc-Expression nicht induzierter Zellen dienten als Vergleichswerte. Die gemessenen Luziferasewerte für p0RLNI0FL und p0RLNI0FL Pst sowie die berechneten Quotienten beider Luziferasen wurden in den Diagrammen A - D der Abb. 3.21 dargestellt. Zur besseren Übersicht wurden für diesen Versuchsaufbau auch die unter IL-1-Induktion gemessenen Luziferasewerte sowie deren Quotienten in das Diagramm mitaufgenommen (grau dargestellt).

Für beide Vektoren ist die RLuc-Expression verleichbar hoch (s. Abb. 3.21 A). Auch nach der Induktion mit IL-1 zeigen die RLuc-Werte keine signifikante Veränderung der Expressionshöhe (ohne Induktion: p0RLNI0FL: 0,43 x 10⁶ Lichteinheiten, p0RLNI0FL Pst: 0,39 x 10⁶ Lichteinheiten. Mit Induktion: p0RLNI0FL: 0,49 x 10⁶ Lichteinheiten, p0RLNI0FL Pst: 0,39 x 10⁶Lichteinheiten). Auffällig ist jedoch, dass die gemessene RLuc-Expression für dieses Experiment nur knapp halb so hoch ist wie in vorhergehenden Experimenten (s. Abb. 3.14, S. 64 und Abb. 3.16, S. 68). Bei der FLuc-Expression zeigt sich ein deutlicher Unterschied zwischen dem Wildtyp-mIRES-Konstrukt und dem Vektor p0RLNI0FL Pst (s. Abb. 3.21 B). Die Expression beträgt hier für p0RLNI0FL das 7-fache der Expression für p0RLNI0FL Pst (9,98 x 10⁶ zu 1,39 x 10⁶ Lichteinheiten) und entspricht somit den Ergebnissen aus dem Experiment 3.5.2. Durch IL-1 Stimulation erhöht sich dieser Wert für den Vektor p0RLNI0FL auf 12,65 x 10⁶ gemessene Lichteinheiten. Eine Induktion von p0RLNI0FL Pst bewirkt hingegen keine Änderung der FLuc-Expression. Die Luziferase-Expressionen unabhängiger Versuche zeigen natürlicherweise Schwankungen der Proteinexpression. Dies äußert sich in relativ großen Fehlerbalken. Durch die Bildung der Quotienten beider Luziferasen (FLuc/RLuc) werden die unterschiedlichen Translationseffizienzen der einzelnen Experimente

aufgehoben. Die Quotienten liegen für dieses Experiment höher als in den anderen Versuchsdurchführungen (s. Abb. 3.21 C). Ohne IL-1-Induktion wurde für p0RLNI0FL ein Quotient von 23,4, für p0RLNI0FL Pst ein Quotient von 3,55 bestimmt. Nach Induktion betrugen die Quotienten jeweils 26,2 (p0RLNI0FL) und 3,6 (p0RLNI0FL Pst). Die Ursache könnte in den zuvor angesprochenen niedrigen Messwerten der Renilla-Luziferase liegen. Die Renilla-Luziferaselösung ist im Vergleich zur Firefly-Luziferinlösung instabiler. Die IL-1 Stimulation setzt die Zelle einem zusätzlichen Stress aus, welcher sich negativ auf den zellulären RLuc-Spiegel auswirken könnte.

Ein Wirkungsverlust und daraus resultierend, fälschlicherweise zu niedrig gemessene Proteinexpressionen könnten die Folge sein. Dies betrifft alle in diesem Experiment verwendeten Konstrukte gleichermaßen.

0,39

3,55

Somit werden die IRES-Aktivitäten der unterschiedlichen Konstrukte im Verhältnis zueinander als konstant zu hoch ermittelt (s. dazu auch Kapitel 3.6.2). Bei einer Normierung der berechneten Quotienten auf das Wildtyp-mIRES (p0RLNI0FL) bleiben die Versuchsergebnisse hiervon unbeeinflusst und erlauben somit weiterhin

Abb 3.21: Interne Translationsinitiation des minimalen NRF-IRES nach Induktion mit Interleukin 1 (IL-1).

8 µg der angegebenen Vektoren wurden in HeLa B.-Zellen transfiziert (2.2.7.3). Nach 24 h erfolgte die Induktion mit IL-1 (2.2.7.4 b). Die Zellen wurden je nach Versuchsaufbau nach 15, 21 oder 24 h Expression lysiert (2.2.7.5) und deren Renilla- und Firefly-Luziferasewerte pro µg Gesamtprotein bestimmt (2.2.8). Alle Werte, die nach der Induktion mit IL-1 erhoben oder berechnet wurden, sind als graue Balken dargestellt. A: Relative Expression der Renilla-Luziferase (RLuc). B: Relative Expression der Firefly-Luziferase (Fluc). C: Quotient der Luziferasewerte aus dem zweiten Cistron geteilt durch das erste Cistron (FLuc/RLuc). D: Die berechneten Quotienten wurden auf die Wildtyp-mIRES-Aktvität (p0RLNI0FL) abgeglichen. Dazu wurde der Quotient des Vektors p0RLNI0FL gleich eins gesetzt. Die Standardabweichung wurde jeweils aus drei Parallelen mit vier Wiederholungen errechnet. Legendenbeschriftung: Ohne: Ohne Induktion; IL-1: Nach IL-1-Induktion.

zuverlässige Rückschlüsse auf die mIRES-Aktivität unter IL-1 Stimulation. Die ermittelte IRES-Aktivität von p0RLNI0FL wird hierzu im nicht-induzierten Zustand gleich eins gesetzt. Nach der Induktion mit IL-1 erhöht sich die IRES-Aktivität von p0RLNI0FL auf den Wert 1,12 und liegt somit leicht über dem ursprünglich ermittelten Wert. Diese Erhöhung der IRES-Aktivität konnte in 14 von 15 durchgeführten Versuchen nachgewiesen werden. Für den Reportergenvektor p0RLNI0FL Pst wird ohne Induktion ein Wert von 0,16 bestimmt. Nach IL-1 Stimulation beträgt er 0,17. Hier ergibt sich keine signifikante Erhöhung der IRES-Aktivität durch die IL-1 Stimulation. Auch bei einem Abgleich der Quotienten auf diejenigen des Wildtyp-mIRES (p0RLNI0FL) sind die berechneten Werte mit und ohne Induktion im Rahmen der Fehlertoleranz identisch. Der Beginn der Induktion (Induktion nach zwei, vier oder acht Stunden) sowie die Dauer der Induktion mit IL-1 (Zelllyse nach 15, 21 und 24 h) zeigte keine Auswirkung auf die Höhe der gemessenen Luziferase-Expression. Diese Daten wurden daher nicht separat aufgeführt, sondern in der Abb. 3.21 zusammengefasst.

3.7.2 Luziferase-Messung nach Stimulation mit dem Newcastle Desease-Virus Im Folgenden sollte nun der Einfluss einer Virusinfektion auf die NRF-mIRES-Funktion untersucht werden. Als Stimulanz wurde das Newcastle Desease-Virus (NDV) verwendet. Der Einfluss des Virus auf den Translationsablauf am IRES-Element wurde anhand der veränderten Proteinexpression der beiden Luziferasen abgelesen. HeLa B.-Zellen wurden mit 8 µg der Reportergenvektoren p0RLNI0FL und p0RLNI0FL Pst transfiziert (2.2.7.3). Die Zellen wurden nach 24 h für eine Stunde mit NDV induziert (2.2.7.4 a). Je nach Versuchsaufbau wurden die Zellen 15, 21 bzw. 24 h später lysiert (2.2.7.5) und die Luziferase-Expression bestimmt (2.2.8).

In den Diagrammen A - D (s. Abb. 3.22) sind die gemessenen Expressionen beider Luziferasen sowie deren Quotienten abgebildet. Die Luziferasewerte der induzierten Zellen sowie deren Quotienten werden grau dargestellt. Im nicht-stimulierten Zustand werden für p0RLNI0FL und p0RLNI0FL Pst ähnlich hohe RLuc-Expressionen gemessen (0,42x 10⁶ und 0,31 x 10⁶Lichteinheiten) (s. Abb. 3.22 A). Die Stimulation mit NDV hat auf die Höhe der RLuc-Expression keinen wesentlichen Einfluss. Sie liegt für beide Konstrukte nach der NDV-Induktion auch weiterhin im Bereich von 0,4 x 10⁶ Lichteinheiten. Auch in diesem Experiment liegen die ermittelten RLuc-Werte niedriger als in den vorangegangenen Experimenten. Der zusätzliche Stress durch

die NDV-Induktion wäre dafür ein möglicher Erklärungsansatz (s. auch Kapitel 3.7.1).

Die FLuc-Expression liegt für den Vektor p0RLNI0FL mit 8,39 x 10⁶Lichteinheiten etwa 8-fach über den gemessenen Werten für den Vektor p0RLNI0FL Pst (0,95 x 10⁶ Lichteinheiten) (s. Abb. 3.22 B). Durch die Stimulation mit dem ND-Virus kommt es zu einer starken Abnahme der FLuc-Expression. Für den Vektor p0RLNI0FL wird mit einer gemessenen Expression von 3,5 x 10⁶ Lichteinheiten nur etwa 42% des Ausgangswertes erreicht. Für p0RLNI0FL Pst sinkt die FLuc-Expression auf 0,67 x 10⁶ gemessene Lichteinheiten weniger stark auf 70% des Ausgangswertes. Werden die Quotienten aus beiden Luziferasen berechnet, ergeben sich ähnlich hohe Werte wie im vorangegangenen Experiment (s. Abb. 3.21 C, S. 79).

0,31

Abb. 3.22: Interne Translationsinitiation des NRF-mIRES nach Induktion mit dem Newcastle Desease-Virus (NDV).

8 µg der angegebenen Vektoren wurden in HeLa B.-Zellen transfiziert (2.2.7.3). Nach 24 h erfolgte die einstündige Induktion mit NDV (2.2.7.4 a). Die Zellen wurden je nach Versuchsaufbau nach 15, 21 oder 24 h Expression lysiert (2.2.7.5) und deren Renilla- und Firefly-Luziferasewerte pro µg Gesamtprotein gemessen (2.2.8). Alle Werte, die nach der Induktion mit NDV erhoben oder berechnet wurden, sind als graue Balken dargestellt. A: Relative Expression der Renilla-Luziferase (RLuc). B:

Relative Expression der Firefly-Luziferase (Fluc). C: Quotient der Luziferasewerte aus dem zweiten Cistron geteilt durch das erste Cistron (FLuc/RLuc). D: Die berechneten Quotienten wurden auf diejenigen des Wildtyp-mIRES (p0RLNI0FL) abgeglichen. Dazu wurde der Quotient des Vektors p0RLNI0FL gleich eins gesetzt. Die Standardabweichung wurde jeweils aus drei Parallelen mit vier Wiederholungen errechnet. Die aufgeführten Veruschsergebnisse entsprechen den Messwerten nach einer maximalen Induktionsdauer von 24 h. Legendenbeschriftung: Ohne: Ohne Induktion; NDV: Nach NDV-Induktion.

Ohne NDV-Induktion ergibt sich für den Vektor p0RLNI0FL ein Quotient von 20,25, für p0RLNI0FL Pst 3,06. Nach NDV-Induktion sinken die Quotienten auf Werte von

8,62 (p0RLNI0FL) und 2,40 (p0RLNI0FL Pst). Die Punktmutation im Vektor p0RLNI0FL führt auch hier unabhängig von der Induktion zu einem starken Einbruch der mIRES-Aktivität (Faktor 7). Werden die Quotienten auf denjenigen des Vektors p0RLNI0FL abgeglichen, ergeben sich folgende Werte (s. Abb. 3.22 D): Der Quotient für p0RLNI0FL fällt bei der Induktion mit NDV von dem Wert 1 auf 0,43. Da die RLuc-Expression vor und nach der Induktion konstant bleibt, bedeutet dies einen Rückgang der IRES-Aktivität um fast 60%.

Die NRF-mIRES-Aktivität im Vektor p0RLNI0FL Pst sinkt ebenfalls von 0,15 auf 0,12 nach Stimulation mit NDV. Diese Veränderungen der Expression liegen allerdings im Bereich der Fehlergrenzen, so dass eine Aussage über die Signifikanz dieses Ergebnisses erschwert wird. Die aufgeführten Veruschsergebnisse entsprechen den Messwerten nach einer maximalen Induktionsdauer von 24 h.

4 Diskussion

Die zeitlich abgestimmte und fehlerfreie Expression der Gene ist von herausragender Bedeutung für die Aufrechterhaltung der Homöostase innerhalb einer Zelle. Die Aktivität eines Genes kann dabei auf der Ebene der Transkription und Translation reguliert werden. Dabei stellt die Translationsinitiation bei der Herstellung von Protein eine der am stärksten kontrollierten Teilschritte dar. Neben der üblichen Cap-abhänigen Initiation kann die Translationsinitiation auch Cap-unabhängig an einem Element beginnen. Durch diese interne Translationsinitiation über IRES-Elemente kann die Genexpression essentieller Proteine u. a. auch unter Bedingungen aufrechterhalten werden unter denen die Cap-abhängige Translations-initiation nicht möglich ist. Diese Bedingungen liegen vor allem bei viralen Infekten oder Apoptose vor. Nach heutigen Vorstellungen trifft dies auf etwa 3 - 5% aller zellulären mRNAs zu (Johannes et al., 1999).

Der Transkriptionsfaktor NRF (NF-κB Repressing Factor) ist ein konstitutiv exprimiertes Protein. Die Bedeutung des Proteins NRF liegt in seiner Rolle als zentraler Mediator des Transktiptionsfaktors NF-kB. Diesen reguliert NRF im basalen Zustand über Protein-Protein-Interaktion negativ. NRF verfügt dabei über eine ungewöhnlich lange 5’UTR, die sich in eine komplexe Sekundärstruktur faltet. Hierfür konnte eine starke IRES-Aktivität nachgewiesen werden (Oumard et al., 2000).

Durch vorausgegangene Experimente konnte die NRF-IRES-Aktivität auf ein minimales IRES-Element (mIRES) von ca. 100 Basen eingegrenzt werden, das proximal zum authentischen Stratkodon liegt.

Ziel dieser Arbeit war es, den Mechanismus der Translationsinitiation am NRF-IRES-Element näher aufzuklären. Ein besonderes Augenmerk wurde dabei auf die Bedeutung der Sekundärstrukturen für die Funktion des minimalen IRES-Elementes (mIRES) gelegt. Um den Einfluss der Sekundärstrukturen genauer zu untersuchen, wurde die mIRES-Sequenz durch gezielte Punktmutationen und Deletionen verändert. Der Einsatz bicistronischer Reportergenexperimente ließ – durch Änderung der messbaren Proteinexpression – Rückschlüsse auf die IRES-Aktivität zu. Zusätzlich sollte der Einfluss des IRES-bindenden Proteins JKTBP1 auf die IRES-Funktion aufgeklärt werden. In Hinblick auf die duale Funktion des NRF Proteins in Bezug auf einige Promotoren (s. 1.4.2) wurde die IRES-Aktivität weiterhin unter Stimulation mit IL-1 und NDV untersucht (Nourbakhsh et al., 2001).

4.1 Einsatz eines bicistronischen Reportergenexperiments zur Charakterisierung von IRES-Elementen

Zur Untersuchung von Sequenzen auf IRES-Funktion und zur näheren Charakterisierung derselben hat sich der Rückgriff auf bicistronische Vektoren etabliert (Pelletier & Sonenberg, 1988). Die Methode wurde bereits im Kapitel 3.1 detailliert beschrieben. Die Vor- und Nachteile dieser Anwendung in Hinblick auf die Fragestellung werden hier erläutert. Die für diese Arbeit verwendeten bicistronischen Reportergenvektoren enthalten zwischen dem ersten Cistron (Renilla-Luziferase) und dem zweiten Cistron (Firefly-Luziferase) das NRF-IRES-Element in ihrem intercistronischen Bereich. Durch die Verwendung zweier unabhängig voneinander exprimierter Cistrone kann bei jedem Konstrukt die Cap-abhängige (erstes Cistron) sowie die interne Translationsinitiation (zweites Cistron) beurteilt werden. Die Lichtintensität der Firefly-Luziferase ist dabei direkt proportional zur Enzymaktivität und somit auch zur Enzymmenge. Das Ergebnis entspricht demnach der Translationsaktivität des NRF-IRES-Elementes. Die gemessene Lumineszenz der Renilla-Luziferase wird durch den Grundlevel der Cap-abhängigen Translation in den Zellen angezeigt. Da die Proteinexpression beider Luziferasen durch unter-schiedliche Transfektionseffizienzen variieren kann, erfolgte eine Beurteilung der Aktivität des IRES-Elementes über die Berechnung eines Quotienten (zweites Cistron durch erstes Cistron). Dies ermöglicht die Berücksichtigung unterschiedlicher Transfektionseffizienzen und eine bessere Beurteilung der tatsächlichen IRES-Aktivität. Als Kontrolle für die in dieser Arbeit durchgeführten Experimente diente der Reportergenvektor p0RLFL. Dieser Vektor enthält kein IRES-Element im intercistronischen Bereich. Ursprünglich sollte hiermit eine IRES-unabhängige Expression des zweiten Cistrons (Firefly-Luziferase) ausgeschlossen werden.

Dennoch konnte in den durchgeführten Experimenten eine basale Expression des zweiten Gens gemessen werden (s. Kapitel 3.2.2, 3.2.5, 3.3.2 und 3.5.2). Dieser Vorgang wurde in früheren Studien auf eine Reinitiation der Ribosomen nach der Translation des ersten Cistrons zurückgeführt (Yang & Sarnow, 1997). Yang &

Sarnow berichteten, dass die Reinitiation progressiv erhöht wird, wenn die intercistronische Distanz zunimmt. Befindet sich das strangaufwärts liegende Cistron 79 oder mehr Nukleotide vor dem zweiten AUG, erfolgt die Reinitiation der Ribosomen mit sehr hoher Effizienz (Kozak, 1986). Da im Vektor p0RLFL der intercistronische Bereich aus 92 bp besteht (s. hierzu die Plasmidkarte im Anhang),

wäre diese Erklärung denkbar. Die gemessenen FLuc-Expressionen für den Vektor p0RLFL liegen in allen durchgeführten Experimenten mindestens drei Zehnerpotenzen unterhalb derjenigen der IRES-enthaltenden Vektoren. Eine Beeinflussung der Ergebnisse durch die Verwendung dieses Vektors als Kontrolle ist dadurch nahezu ausgeschlossen und seine Verwendung daher zulässig.

4.2 Nachweis der Integrität der bicistronischen Reportergenkonstrukte

Bei bicistronischen Reportergenkonstrukten ist es essentiell die Integrität der mRNA nachzuweisen. Nur der Nachweis einer vollständigen, für alle Konstrukte in vergleichbaren Mengen vorliegende RNA, erlaubt verlässliche Aussagen über den Einfluss eingeführter Mutationen in das IRES-Element. Die sicherste Methode, die Integrität der mRNA nachzuweisen, ist die Northern Blot-Analyse. Die Transkription der bicistronischen Reportergenvektoren lässt eine mRNA erwarten, die sowohl das Gen der Renilla-Luziferase im ersten Cistron als auch das Gen für die Firefly-Luziferase im zweiten Cistron enthält und damit eine errechnete Größe von 2845 Basen aufweist. Dennoch konnte bei der Hybridisierung des Vektors pRLNI0FL mit der FLuc-Sonde eine von dem errechneten Bandenmuster abweichende zusätzliche Bande detektiert werden (s. Abb. 3.5 B, S. 48). Eine mögliche Erklärung der Entstehung des kurzen Transkripts wäre das Spleißen oder der Abbruch der Transkription an definierten Stellen. Um die Entstehung der zweiten Bande durch einen Spleißvorgang der mRNA auszuschließen, wurde bei den eingesetzten Konstrukten die Spleißstelle (Donor-Akzeptor-Stelle) entfernt (s. Kapitel 3.2.4). Für alle Konstrukte – ohne Donor-Akzeptor-Stelle – wurde in den folgenden Northern Blot-Analysen ausschließlich die Bande der erwarteten Größe nachgewiesen (s. Abb.

3.9, S. 54; Abb. 3.17, S. 71). Somit konnte die Entstehung der zweiten Bande auf einen Spleißvorgang in der mRNA zurückgeführt werden. Dabei scheint das entstandene FLuc-Spleißprodukt funktionell aktiv zu sein. Nach Entfernung der Donor-Akzeptor-Stelle aus den Reportergenvektoren halbiert sich die Firefly-Exression, während die RLuc-Expression konstant bleibt (s. Kapitel 3.2.5). Die Folge ist eine Halbierung der funktionellen IRES-Aktivität. Für das minimale IRES-Element beträgt der berechnete Quotient beider Luziferasen noch 14,2 (s. Abb. 3.8, S. 52), statt der ehemals 30 (s. Abb. 3.3, S. 45). Dennoch zeigt die interne Initiation über das NRF-mIRES-Element auch weiterhin eine 14-fach höhere IRES-Aktivität im Vergleich zur Cap-abhängigen Translationsinitiation und zeugt somit von einem starken

zellulären IRES-Element. Aufgrund dieser Ergebnisse wurde in den folgenden Experimenten bei allen verwendeten Reportergenvektoren die Donor-Akzeptor-Stelle entfernt.

Kritiker der IRES-Elemente argumentieren, dass die interne Translationsinitiation allein auf Vorliegen von kryptischen Promotoren sowie auf Spleißstellen zurückzuführen sei (Kozak, 2005). Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen jedoch, dass die gemessene FLuc-Expression allein auf die interne Initiation durch das NRF-IRES-Element zurückzuführen ist. Auch nach der Entfernung der Spleißstelle kann eine interne Translationsinitiation über das IRES-Element nachgewiesen werden, die 14-fach über der Cap-abhängigen liegt. Somit gehört das NRF-IRES-Element auch weiterhin zu den stärksten bisher nachgewiesenen zellulären IRES-Elementen.

4.3 Detektion einer stabilen Sekundärstruktur des NRF-IRES-Elementes in silico Seit der Entdeckung des ersten zellulären IRES-Elementes in der BiP-mRNA (Macejak & Sarnow 1991) sind eine Vielzahl weiterer zellulärer IRES-Elemente beschrieben worden. Während für virale IRES-Elemente bereits einige Kenntnisse über den Ablauf des Translationbegins gewonnen werden konnten (s. 1.2.1), ist über die Funktionsmechanismen zellulärer IRES-Elemente bis heute nur wenig bekannt.

Eine besondere Rolle scheint die komplexe Sekundärstruktur der IRES-Elemente zu spielen (Stoneley & Willis, 2001). Diese wird für die Rekrutierung der Ribosomen an das IRES-Element verantwortlich gemacht.

Um Aussagen über die IRES-Struktur und deren funktionelle Relevanz treffen zu können, ist eine Vorstellung über die vorliegenden Strukturen der mRNA notwendig.

Zur Vorhersage der Sekundärstrukturen aus der RNA-Primäsequenz können Computerprogramme eingesetzt werden (s. Kapitel 1.3). Dabei ergaben die bisherigen Sekundärstrukturanalysen einiger zellulärer IRES-Elemente in silico ein gemeinsames Motiv zellulärer IRES-Elemente. Dieses entspricht einer Y-Ringstammstruktur, gefolgt von einer Haarnadelstruktur (Le & Maizel, 1997). Diese Struktur konnte in vorangegangenen Arbeiten auch für das NRF-IRES-Element nachgewiesen werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde, mit Hilfe des Programms

‚mfold 3.2’ (Zuker, 2003), für das vollständige NRF-IRES- und auch für das minimale IRES-Element die wahrscheinlichste Sekundärstruktur berechnet (s. Abb. 3.12, S.

59). Dabei stellt die aktuelle Version 3.2 des Programms ‚mfold’ eine überarbeitete Form der Version 2.3 dar, die in früheren Experimenten verwendet wurde. In der

neuen Version sind mit Ausnahme der Temperatur alle Bedingungen der Faltung frei wählbar (Einzelheiten s. Kapitel 3.4). Für diese Arbeit war der Einfluss der Temperatur auf die RNA-Faltung von untergeordneter Bedeutung, da alle in vivo Experimente konstant bei 37°C durchgeführt wurden. Als weitere Neuerung im Programm wird die mRNA ausschließlich in zirkulärer Form dargestellt. Die Ausbildung einer Y-Ringstammstruktur ist daher nicht mehr möglich. Dennoch bleiben einige besonders stabile Basenpaarungen weiterhin bestehen, die dem Bereich der ursprünglichen Y-Ringstammstruktur entsprechen. Besonders stabile Basenpaarungen findet man beim vollständigen NRF-IRES-Element für die letzten 50 Nukleotide am 3’Ende (s. Abb. 3.12 A, S. 59). Für das mIRES-Element weisen die letzten 30 Nukleotide vor dem 3’Ende des IRES eine stabile Konformation auf (s.

Abb. 3.12 B, S. 59). Besonders auffällig ist eine am 3’Ende gelegene stabile Haarnadelstruktur, die auch unter Veränderung von verschiedenen Parametern für beide Sequenzen konstant erhalten bleibt. Diese bildet sich aus den letzten 14 Basen vor dem in 3’Richtung lokalisierten Terminus der IRES-Sequenz aus. Aus diesem Grund wurden während der Arbeit zunächst durch gezielt eingeführte Punktmutationen sowie Deletionen, diese stabil gefalteten Sequenzbereiche verändert und deren Einfluss auf die IRES-Aktivität untersucht. Mit Hilfe des Programms ‚mfold 3.2’ wurden dazu die Auswirkungen einzelner Basenveränderungen auf die Sekundärstruktur ermittelt. Die erhaltenen Faltungsergebnisse für das mIRES (p0RLNI0FL) sowie der drei in ihrer mIRES- Sequenz veränderten Vektoren (p0RLNI0FL Pst, p0RLNI0FL CG, p0RLNI0FL D1) sind in der Abb. 4.1 abgebildet. Pfeile markieren das Auftreten der 3’Haarnadel-struktur in der mRNA der Reportergenvektoren p0RLNI0FL und p0RLNI0FL CG. Laut der Berechnungen konnte, infolge gezielter Veränderung von vier Nukleinsäuren (GCTT zu TGCA) in der mIRES-Sequenz des Vektors p0RLNI0FL (148 bp), die Haarnadelstruktur am 3’Ende des mIRES zerstört werden (p0RLNI0FL Pst, s. Abb.

4.1). Durch die Veränderung von drei Nukleinsäuren im Vektor p0RLNI0FL Pst (GCCCACT CGCCACC) wurde diese Struktur anhand computergestützter Berechnungen mit veränderter Sequenz, aber in gleicher Größe und in derselben Position, erneut hergestellt (p0RLNI0FL CG, s. Abb. 4.1). Ergänzend wurde eine VeränderungderSekundärstrukturauchnachDeletion der kompletten 14 bp, die an der Bildung der Haarnadelstruktur beteiligt sind, untersucht (p0RLNI0FL D1, s. Abb.

Abb. 4.1: Darstellung der in silico berechneten zweidimensionalen mRNA-Strukturen des minimalen NRF-IRES (p0RLNI0FL) und seiner Mutationskonstrukte.

Die berechneten Sekundärstrukturen wurden mit Hilfe des Programms mfold 3.2 (Zuker, 2003) unter http://www.bioinfo.rpi.edu/application/mfold/rna/form1.cgi erstellt. Die von ‚mfold’ vorgegebenen Parameter wurden für alle Sequenzen beibehalten und die Faltungen unter konstanten Bedingungen berechnet. Die eingesetzte Sequenz entspricht der des minimalen NRF-IRES-Elementes (p0RLNI0FL). Hier ergeben Berechnungen der eingesetzten Sequenz eine Haarnadelstruktur am

Im Dokument Translationsregulation des Transkriptionsfaktors NRF: Strukturelle und funktionelle Charaktersisierung von NRF-IRES (Seite 85-0)