Aus der Klinik für Frauenheilkunde und Geburtshilfe
Die Rolle des Adenosinrezeptors A
2Bin plazentaren Entwicklungsprozessen
INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer Doktorin
der Naturwissenschaften - Doctor rerum naturalium -
(Dr. rer. nat)
vorgelegt von
Natallia Darashchonak
geboren am 6. Mai 1981 in Witebsk (Weißrussland)
Hannover 2013
Angenommen vom Senat der Medizinischen Hochschule Hannover am 16.7.2013 Gedruckt mit Genehmigung der Medizinischen Hochschule Hannover
Präsident: Prof. Dr. med. Christopher Baum
Betreuer: PD. Dr. med. Frauke von Versen-Höynck Kobetreuer: Prof. Dr. rer. nat. Jürgen Alves
1. Gutachter: PD. Dr. med. Frauke von Versen-Höynck 2. Gutachter: Prof. Dr. rer. nat. Jürgen Alves
3. Gutachter: Prof. Dr. rer. nat. Matthias Gaestel
Tag der mündlichen Prüfung vor der Prüfungskommision: 16.07.2013 Prof. Dr. rer. nat. Matthias Gaestel
PD Dr. med. Frauke von Versen-Höynck Prof. Dr. rer. nat. Jürgen Alves
Prof. Dr. rer. nat. Matthias Gaestel
Zusammenfassung
Natallia Darashchonak
Thema der Dissertationsarbeit: „Die Rolle des Adenosinrezeptors A2B in plazentaren Entwicklungsprozessen“
Eine gestörte Trophoblastenmigration und –invasion in die maternalen Spiralarterien mit plazentarer Hypoxie und Dysfunktion spielen in der Pathophysiologie des Schwangerschaftssyndroms Präeklampsie eine entscheidende Rolle. Unter hypoxischen Bedingungen wird die Adenosinfreisetzung stimuliert. Die Wirkung von Adenosin wird durch an der Zelloberfläche lokalisierte Rezeptoren vermittelt. Adenosinrezeptoren gehören zu den G-Protein-gekoppelten Rezeptoren und werden anhand ihrer pharmakologischen Eigenschaften in vier Subtypen (A1, A2A, A2B und A3) unterteilt. Frauen mit Präeklampsie zeigen erhöhte Serumkonzentrationen von Adenosin und eine erhöhte Expression von Adenosinrezeptoren in der Plazenta. Die Bedeutung dieser Rezeptoren und insbesondere des durch Hypoxie regulierbaren Subtyps A2B für funktionelle Trophoblasteneigenschaften ist bisher unklar. Unter der Hypothese, dass der Adenosinrezeptor A2B eine Rolle in der plazentaren Entwicklung spielt, war das Hauptziel dieser Arbeit zum Einen, für die Plazentaentwicklung wichtige funktionelle Vorgänge wie Proliferations-, Migrations- und Invasionsverhalten von Trophoblasten nach Adenosinrezeptor A2B Aktivierung und Hemmung unter hypoxischen und normoxischen Bedingungen zu untersuchen. Zum Anderen sollten die dabei involvierten Signalkaskaden weitergehend erforscht werden.
In dieser Dissertation wurde erstmals mit Hilfe von real-time RT-PCR und Western Blot die Gen- und Proteinexpression des A2B Adenosinrezeptors in Trophoblasten und Endothelzellen in Abhängigkeit von Sauerstoff untersucht. Die Expression des Adenosinrezeptors A2B war unter hypoxischen Bedingungen (2% O2) höher als unter normoxischen Bedingungen. Es konnte gezeigt werden, dass die A2B Adenosinrezeptor Aktivierung zu einer verminderten Migration von Trophoblasten bei 2% O2, 8% O2 und 21% O2 führt. Die A2B Adenosinrezeptor Stimulation kann verschiedene Signalwege in Trophoblastenzellen aktivieren. Mit Hilfe proteinbiochemischer Methoden konnte eine verminderte Phosphorylierung der Mitogen- aktivierten Proteinkinasen (MAPK) ERK1/2, SAPK/JNK und p38 nachgewiesen werden, die möglicherweise für die Hemmung der Trophoblastenmigration verantwortlich sind. Es wurde außerdem gezeigt, dass eine Aktivierung des Adenosinrezeptors A2B mit einer verminderten Expression der Matrixmetalloproteinasen MMP-2 und MMP-9 auf mRNA Ebene sowie einer
bei Hypoxie assoziiert ist.
Eine Stimulation des Adenosinrezeptors A2B erhöhte andererseits neben der cAMP- Konzentration die Proliferation als auch die Invasion von Trophoblasten in einen Endothelzellmonolayer. Bei Betrachtung der Proteine in cAMP-induzierten Signalwegen konnte eine aktivierende Phosphorylierung des "cAMP response binding" Proteins (CREB) beobachtet werden.
Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit deuten auf eine Rolle des Adenosinrezeptors A2B für plazentare Entwicklungsvorgänge sowie für die plazentare Angiogenese hin und können möglicherweise in die Pathophysiologie der Präeklampsie involviert sein. Funktionell relevante Trophoblasteneigenschaften würden demzufolge je nach Aktivierungszustand des Adenosinrezeptors A2B durch verschiedene parallele Signalwege über Proteine wie MAPK und CREB reguliert. Weiterführende Untersuchungen zur Spezifizierung der beobachteten Effekte und zur Bedeutung der anderen Adenosinrezeptor-Subtypen erscheinen nun vielversprechend, um ein vollständiges Bild der Regulation von Plazentaentwicklungsprozessen durch Adenosin und seiner Rezeptoren zu erhalten.
Summary
Natallia Darashchonak
Title of dissertation: “The role of the adenosine receptor A2B in placental development”.
Abnormal trophoblast migration and invasion into the maternal spiral arteries with the placental hypoxia and dysfunction play a crucial role in the pathophysiology of preeclampsia (PE). Hypoxia, one of the pathological hallmarks of PE, can be a potent activator of adenosine release. Its action is mediated by G-protein coupled receptors (GPCRs). These receptors can be divided based on their pharmacological properties into four subtypes: A1, A2A, A2B and A3. The role of these receptors and particular the hypoxia-regulated A2B subtype in trophoblast function is poorly understood. Under the hypothesis that the adenosine receptor A2B plays a role in placental development, the main objective of this thesis was to analyse its importance for the placental development and processes like proliferation, migration and invasion behavior of trophoblasts under hypoxic and normoxic conditions. In addition, the downstream signalling cascades that might be involved in these processes were analysed. In this thesis, with the help of real-time RT-PCR and Western blot, I have demonstrated the expression of the A2B adenosine receptor in trophoblast and endothelial cells in response to oxygen. The expression of the adenosine A2B receptors increases markedly under hypoxic conditions in trophoblast and endothelial cells compared to normoxic conditions. Further experiments show that activation of the A2B adenosine receptor reduced trophoblast migration at 2% O2, 8% O2 and 21% O2. While activation of A2B adenosine receptor can activate different signalling pathways in trophoblast cells, I observed a decreased phosphorylation of mitogen-activated protein kinase (MAPK) ERK1/2, SAPK/JNK and p38 that may be responsible for the inhibition of trophoblast migration. Further experiments revealed that stimulation of the A2B receptor was associated with reduced expression of matrix metalloproteinases MMP-2 and MMP-9 at the mRNA level, as well as with reduced proMMP-2 enzyme activity and with decreased VEGF mRNA expression during hypoxia. Stimulation of the adenosine A2B receptors increased cAMP concentration, proliferation and trophoblast invasion into an endothelial monolayer. Analysis of the downstream proteins revealed activation through phosphorylation of the cAMP response binding protein (CREB).
Altogether, these results suggest a role of the adenosine A2B receptor in placental development and placental angiogenesis, supporting its potential involvement in the pathophysiology of preeclampsia. Functional trophoblast characteristics appear to be
2B
Further studies on the cell type specificity of the observed effects and the importance of other adenosine receptor subtypes will be promising to obtain a complete picture of the regulation of placental development processes by adenosine and its receptors.
Inhaltsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis ... 1 3 3 3 5 5 6 7 8 10 10 11 13 13 14 15 17 18 18 21 22 23 23 25 25 27 27 27 28 28 28 28 28 29 29 29 30 31 31 32 32 32 33 33 35 35 35 35 1 Einleitung ...
1.1 Allgemeine Einführung ...
1.2 Entwicklung und Aufbau der Plazenta ...
1.3 Präeklampsie...
1.3.1 Definition und klinische Charakteristika...
1.3.2 Pathophysiologie der Präeklampsie...
1.3.3 Abnormale Trophoblasteninvasion bei Präeklampsie ...
1.3.4 Molekulare Faktoren der Präeklampsie...
1.4 Adenosin und Adenosin-vermittelte Signalwege ...
1.4.1 Adenosin...
1.4.2 Purin-Rezeptoren ...
1.4.3 Adenosin-Rezeptoren ...
1.4.3.1 Klassifizierung von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren...
1.4.3.2 Signaltransduktion durch den A2BAR...
1.4.3.3 Physiologische Funktionen des A2BAR...
2 Fragestellung ...
3 Material...
3.1 Chemikalien...
3.1.1 Spezielle Chemikalien ...
3.1.2 Oligonukleotidprimer ...
3.2 Zellkulturmedien ...
3.3 Lösungen und Puffer ...
3.4 Verbrauchsmaterialien...
3.5 Geräte ...
3.6 Zelllinien...
3.7 Kits und Assays ...
3.8 Software...
4 Methoden ...
4.1 Zellkultur ...
4.1.1 Kultivierung von Zelllinien ...
4.1.2 Passagieren von Zellen ...
4.1.3 Einfrieren und Auftauen von Zellen...
4.2 Methoden zur Untersuchung funktioneller Eigenschaften der Zellen...
4.2.1 Proliferations-Assay ...
4.2.2 Migrations-Assay ...
4.2.3 Invasions-Assay (Monokultur) ...
4.2.4 In vitro Angiogenese Assay...
4.2.5 Invasions-Assay (Ko-Kultur) ...
4.3 Molekularbiologische Methoden...
4.3.1 Bestimmung der mRNA Expression ...
4.3.1.1 RNA Isolierung...
4.3.1.2 Komplementäre DNA-Synthese...
4.3.1.3 Quantitative Real-Time PCR...
4.4 Bestimmung der Proteinexpression ...
4.4.1 Proteinisolierung...
4.4.2 Bestimmung der Proteinkonzentration nach Bradford ...
4.4.3 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese ...
4.4.4 Western Blot Analyse...36 38 38 39 39 40 41 42 42 42 43 44 44 45 45 45 47 48 48 48 49 50 51 51 51 52 53 53 54 55 56 56 56 58 58 59 60 60 61 62 63 66 66 67 68 70 70 4.4.5 „Stripping“ von Membranen ...
4.5 cAMP Assay ...
4.6 ß-hCG Assay ...
4.7 Laktat-Dehydrogenase (LDH) Assay ...
4.8 Gelatin-Zymographie...
4.9 Statistische Auswertung ...
5 Ergebnisse...
5.1 Gen- und Proteinexpression des A2B AR ...
5.1.1 Trophoblastenzellen als Test-System ...
5.1.2 Endothelzellen als Test-System...
5.2 Wirkung von Adenosin und A2BAR auf die cAMP–Produktion...
5.2.1 cAMP Produktion in Trophoblasten...
5.2.2 cAMP Produktion in Endothelzellen...
5.3 Wirkung des A2BAR auf das Proliferationsverhalten ...
5.3.1 Proliferationsverhalten von Trophoblasten ...
5.3.2 Proliferationsverhalten von Endothelzellen...
5.4 Einfluss von Adenosin und des A2BAR auf die Migration...
5.4.1 Migrationsverhalten von Trophoblasten...
5.4.1.1 Einfluss von Adenosin auf die Migration von Trophoblasten...
5.4.1.2 Einfluss des A2BAR auf die Migration von Trophoblasten...
5.4.2 Migrationsverhalten von Endothelzellen...
5.5 Bestimmung der β-hCG Sekretion durch Trophoblasten ...
5.5.1 Allgemeines ...
5.5.2 Effekt von Adenosin auf die β-hCG-Sekretion in Trophoblasten ...
5.5.3 Effekt des A2BAR auf die β-hCG-Sekretion von Trophoblasten...
5.6 Einfluss des A2BAR auf das Invasionsverhalten von Trophoblasten ...
5.6.1 Invasion von Trophoblasten im Ko-Kulturmodell mit Endothelzellen ...
5.6.2 Invasion von Trophoblasten in der Monokultur ...
5.7 Einfluss des A2BAR auf das Angiogeneseverhalten von Endothelzellen ...
5.8 Untersuchung von Adenosin-induzierten Signalwegen ...
5.8.1 Rationale...
5.8.2 Effekt des A2BAR auf den Hypoxie-induzierten Faktor 1α (HIF-1α) ...
5.8.3 MAPK Signalweg...
5.8.3.1 Effekt des A2BAR auf die ERK1/2–Phosphorylierung in Trophoblastenzellen ………...
5.8.3.2 Effekt des A2BAR auf die ERK1/2-Phosphorylierung in Endothelzellen...
5.8.4 SAPK/JNK Signalweg...
5.8.4.1 Effekt des A2BAR auf die p38-Phosphorylierung in Trophoblasten...
5.8.4.2 Effekt des A2BAR auf die SAPK/JNK-Phosphorylierung in Trophoblasten..
5.8.5 Einfluss des A2BAR auf die CREB Phosphorylierung in Trophoblasten ...
5.9 Einfluss des A2BAR auf Expression und Aktivität der Matrixmetalloproteinasen MMP-2 und MMP-9 in Trophoblasten...
5.10 Die Wirkung des A2BAR auf die VEGF mRNA Expression ...
5.10.1 Effekt des A2BAR auf die VEGF mRNA Expression in Trophoblastenzellen.
5.10.2 Effekt des A2BAR auf die VEGF mRNA Expression von Endothelzellen...
5.11 Effekt des A2BAR auf die Laktatdehydrogenase (LDH)- Konzentration in
Trophoblasten und Endothelzellen ...
6 Diskussion ...
6.1 Verwendete Modellsysteme ...
6.2 A2BAR Expression in Trophoblasten und Endothelzellen...71 72 73 75 75 76 78 80 80 81 82 86 87 99 99 101 102 107 108 109 110 6.3 Wirkung des A2BAR auf das Proliferationsverhalten ...
6.4 Effekt von Adenosin und des A2BAR auf die Migration von Trophoblasten...
6.5 Effekt des A2BAR auf die β-hCG-Sekretion von Trophoblasten...
6.6 Einfluss des A2BAR auf die Trophoblasteninvasion...
6.7 Die Wirkung des A2BAR auf die Expression und die Aktivität der
Matrixmetalloproteinasen MMP-2 und -9...
6.8 Die Wirkung des A2BAR auf die VEGF mRNA Expression und die Angiogenese.
6.9 Molekulare Mechanismen als Folge einer A2BAR Aktivierung in Trophoblasten und Endothelzellen ...
6.9.1 Die sauerstoffabhängige Aktivierung von HIF-1α in Trophoblasten...
6.9.2 Aktivierung des cAMP/CREB Signalweges durch A2BAR Stimulation in Trophoblasten ...
6.9.3 Die Beteilung des MAPK-Signalweges an A2BAR-vermittelten Zellprozessen ………...
7 Ausblick...
8 Literaturverzeichnis ...
9 Anhang ...
9.1 Abbildungsverzeichnis ...
9.2 Tabellenverzeichnis ...
9.3 Übersichtstabelle der Ergebnisse...
9.4 Lebenslauf ...
9.5 Publikationen ...
Danksagung ...
Erklärung ...
Abkürzungsverzeichnis
A2BAR A2B-Adenosinrezeptor
Abb Abbildung
ADA Adenosin- Desaminase
ADO Adenosin
ADP Adenosindiphosphat APS Ammoniumpersulfat ATP Adenosin-5’-triphosphat bzw beziehungsweise
cAMP cyclisches-Adenosin-3’, 5’-monophosphat
CREB cAMP response element-binding protein DAG Diacylglycerol DEPC Diethylpyrocarbonat DMSO Dimethylsulfoxid DTT 1,4-Dithiothreitol EBM Endothelial cell basal medium
ECL Elektrochemilumineszenz EDTA Ethylendiamintetraessigsäure
EGF Epidermal growth factor
EGM Endothelial cell growth factor
EGTA Ethylenglycol bis(2-aminoethylether)-N,N,N´,N´-tetraessigsäure
EM extrazelluläre Matrix
EPAC Exchange Protein Activated by cAMP ERK1/2 extrazellulär regulierte Kinase 1und 2 et al. und andere („et alii“)
FKS fetales Kälberserum
GPCR G-Protein-gekoppelter Rezeptor
GTS Glycin-Tris-SDS Puffer
h Stunde („hour“)
hCG Humanes Choriongonadotropin
HCl Salzsäure
HELLP Hemolysis, elevated liver enzymes, low platelet count
HIF Hypoxie-induzierbarer Faktor
HPLC High-performance liquid chromatography
HRP Horseradisch peroxidase
IL Interleukin
IP3 Inositol-1,4,5-triphosphat
IUGR Intrauterine growth restriction
JNK c-Jun N-terminale Kinase
KCl Kaliumchlorid kDa kilodalton
KH2PO4 Kaliumdihydrogenphosphat
LIF Leukemia inhibitory factor
LDH Laktatdehydrogenase MAPK Mitogen-aktivierte Proteinkinase
MeOH Methanol min Minuten
MMP Matrix-Metalloproteinase
mmHg Millimeter Quecksilbersäule
mRNA Messenger RNA
Na2CO3 Natriumcarbonat
Na2HPO4 Dinatriumhydrogenphosphat
NaHCO3 Natriumhydrogencarbonat
MRS N-(4-cyanophenol)-2-[4-(2,3,6,7-tetrahydro-2,6-dioxo-1,3- dipropyl-1H-purin-8-yl)-phenoxyl]acetamide
MW Molecular weight
NECA 5’-(N-ethylcarboxamido)adenosin NODAL nodal growth differentiation factor
NP-40 Tergitol NP-40
P/S Penicillin/Streptomycin PBS Phosphate buffered saline
PBS-T Phosphate buffered saline-Tween PE Präeklampsie PFA Paraformaldehyd
PI3K Phosphatidylinositol-3-Kinase PIGF Placental growth factor
PKA Proteinkinase A
PKC Proteinkinase C
PLC Phospholipase C
PMSF Phenylmethylsulfonylfluorid qRT-PCR Quantitative real time polymerase chain reaction Rap1/2 Ras-related Protein 1 and 2
rcf relative centrifugal force (relative Zentrifugalbeschleunigung) rhFGF-B Recombinant human fibroblast growth factor b
R3-IGF-1 Recombinant insulin like growth factor-1
SAPK Stress-aktivierte Proteinkinase
SDS Natrium (Sodium)-Dodecylsulfat
sFlt soluble fms-like tyrosine kinase sEng Endoglin
SEM Standard error of mean
SSW Schwangerschaftswoche
TBS Tris buffered saline
TBS-T Tris buffered saline- Tween
TBE Tris-Borat-EDTA TEMED Tetramethylethylendiamin TGF-β Transforming growth factor beta
TNF-α Tumornekrosefaktor-alpha
Tris Tris-(hydroxymethyl-aminomethan)
Tween20 Poloxyethen-sorbitan-monolaurat
U Enzymeinheit („unit“)
u.a. unter anderen
VEGF Vascular endothelial growth factor
z.B. zum Beispiel
1 Einleitung
1.1 Allgemeine Einführung
Eine gestörte plazentare Entwicklung kann zu schwangerschaftsassoziierten Erkrankungen, wie der fetalen intrauterinen Wachstumsretardierung aber auch der Präeklampsie (PE), beitragen. Trotz neuerlicher wissenschaftlicher Erfolge ist die Pathophysiologie der PE immer noch kaum verstanden und außer der Beendigung der Schwangerschaft existierten bisher weder eine effektive prädiktive Vefahren noch eine kausale Therapie. Daher gilt die Erkrankung seit Jahrtausenden als „Krankheit der Theorien“ [1]. Ihre klinischen Merkmale sind ein neu auftretender erhöhter Blutdruck (Hypertonie) sowie eine vermehrte Eiweißausscheidung im Urin (Proteinurie) [2]. Der Rückgang der klinischen Symptome mit der Geburt der Plazenta impliziert eine zentrale Rolle der Plazenta in der Pathophysiologie der Erkrankung [3]. Es wird angenommen, dass zu den pathophysiologischen Veränderungen eine unzureichende oder fehlende Trophoblasteninvasion in die mütterlichen Spiralarterien führt, wodurch es zu plazentarer Hypoxie kommen kann [4-5]. Die Plazenta reagiert mit der Freisetzung von Substanzen, wie z.B. anti-angiogene Faktoren (lösliche fms-like Tyrosinkinase, sFlt-1) [6], Auto-Antikörpern gegen den Angiotensin-II-Rezeptor (AT1- Rezeptor) [7] sowie Syncytiotrophoblastenfragmenten [8]. Diese tragen zum klinischen Erscheinungsbild durch die Begünstigung einer endothelialen Dysfunktion am mütterlichen Gefäßsystem bei [9]. In der vorliegenden Arbeit wird die Rolle des Hypoxie-induzierbaren Moleküls Adenosin und seines Rezeptors vom Subtyp A2B mit Hilfe von in vitro Modellen in Entwicklungsprozessen der humanen Plazenta untersucht.
1.2 Entwicklung und Aufbau der Plazenta
Die Befruchtung findet ca. 12-24 Stunden nach der Ovulation im Eileiter statt. Die entstehende Zygote (12-16-Zellen Stadium) tritt nach 4 Furchungsteilungen als Morula in den Uterus ein und entwickelt sich zu einer Blastozyste. Die Blastozyste besteht aus einer inneren Zellmasse, dem späteren Embryo und der äußeren Zellschicht, den Trophoblasten, aus der schließlich die Plazenta entsteht. Während der Implantation wird das Trophoblastenepithel (extra-embryonales Trophektoderm) ausgebildet, das differenzierte Trophoblastenzelltypen des Chorions und der Plazenta enthält. Am 5. bis 6. Tag post conceptionem (p.c.) „schlüpft“
(„hatching“ Prozess) der Embryo aus der Zona pellucida und startet die Implantation mit der Positionierung der Blastozyste an der Uteruswand. Dabei kommt es zum Kontakt zwischen Dezidua und Trophoblastenepithel [10]. Am 7.-12. Tag p.c. folgt die Differenzierung der
Trophoblasten in zwei Zellschichten: in den äußeren Synzytiotrophoblasten und in den inneren Zytotrophoblasten. Der Zytotrophoblast besteht aus einkernigen Zellen, die massiv proliferieren. Durch die Fusion der äußeren Zytotrophoblasten bildet der Synzytiotrophoblast ein Synzytium (mehrkernige Schicht ohne Zellgrenzen). Während der Einwanderung in das maternale Stroma umgibt der Synzytiotrophoblast den Embryo und steht in Kontakt mit den uterinen Blutgefäßen. Der Synzytiotrophoblast sezeniert Hormone, wie z.B. humanes Choriongonadotropin (hCG) oder humanes Plazentalaktogen (hPL) [11]. Die Zytotrophoblasten invadieren in den endometrialen und myometrialen Abschnitt der Spiralarterien, wo sie die Endothelzellschicht weitgehend ersetzen [12-13]. Der Invasionprozess muss streng reguliert ablaufen und wird von verschiedenen Wachstumsfaktoren, Adhäsionsmolekülen und Integrinen, wie VE (vascular endothelial)- cadherin, VCAM-1 (vascular cell adhesion protein 1) und PECAM-1 (platelet endothelial cell adhesion molecule) kontrolliert [14]. Matrixmetalloproteinasen (MMP), inbesondere MMP-2 und MMP-9 sowie ihre endogenen Inhibitoren (Tissue inhibitors, TIMPs) sind an der Regulation der Invasion beteiligt. Diese sind für den Abbau extrazellulärer Matrix verantwortlich [15-16]. Es kommt zur Dilatation der Gefäße und zur Umwandlung der Spiralarterien [5]. In der 20. Schwangerschaftswoche (SSW) ist die Adaptation der Gefäße mehr oder weniger abgeschlossen, so dass die Zirkulation von mütterlichem Blut die Versorgung der fetoplazentaren Einheit gewährleisten kann [17].
Mit der 14. SSW besitzt die Plazenta ihre Struktur (Abbildung. 1). Die reife Plazenta hat einen Durchmesser von ca. 20 cm, wiegt 500-600 g und besteht aus mütterlichen und fetalen Anteilen. Die fetale Seite der Plazenta besteht aus der Chorionplatte und den Chorionzotten.
Die mütterliche Seite besteht aus der Dezidua der Basalplatte und den Deziduasepten, die in 15-20 Felder (Kotyledonen) unterteilt werden. Zwischen der Chorionplatte und der Basalplatte befindet sich der intervillöse Raum, der mit mütterlichem Blut gefüllt ist. Aus jedem Kotyledon tritt eine Spiralarterie, durch die das sauerstoffreiche, arterielle Blut in den intervillösen Raum strömt. Von der Chorionplatte gehen die Zottenbäume aus, welche in den intravillösen Raum hineinragen, wo der fetomaternale Stoffaustausch stattfindet [18]. Die Plazenta erfüllt vielfältige Funktionen, z.B. die Versorgung des Embryos mit Sauerstoff und Nährstoffen, den Rücktransport von Abfallprodukten in die mütterliche Zirkulation sowie die Wärmeregulation [19].
Im ersten Trimenon entwickelt sich die Plazenta in einer sauerstoffarmen Umgebung, wobei die Sauerstoffkonzentration bis zur 8. SSW etwa 2,5% O2 beträgt [20]. Schon am Ende des ersten Trimenons liegt die O2-Konzentration bei 8,5% [20-22].
Abbildung 1: Schematischer Aufbau der humanen Plazenta(modifiziert nach [23]).
1.3 Präeklampsie
1.3.1 Definition und klinische Charakteristika
Die Präeklampsie ist eine schwere schwangerschaftsspezifische Erkrankung, an der 3 bis 8%
der Schwangeren erkranken [3, 24]. Sie stellt heute nach wie vor eine Hauptursache für mütterliche und fetale Morbidität und Mortalität dar [25-26]. Weltweit sterben schätzungsweise mehr als 60.000 Frauen jährlich daran [27]. Die Erkrankung wird klinisch durch eine neu aufgetretene Hypertonie (systolische Blutdruckwerte ≥ 140 mmHg und diastolische Werte ≥ 90 mmHg) und eine Proteinurie (≥ 300 mg/24h) nach der 20. SSW charakterisiert [2]. Die PE ist mit einer erhöhten Rate an vermindertem kindlichem Wachstum (intrauterine growth restriciton, IUGR), vorzeitiger Plazentalösung und intrauterinem Fruchttod assoziiert [26, 28-29]. In 15-20% der Krankheitsfälle kann es zu weiteren Komplikationen, wie Eklampsie oder HELLP-Syndrom (Hämolysie, Elevated Liver enzymes, Low Platelet count) kommen [28]. Das HELLP-Syndrom gilt als schwere Form der PE [25, 28, 30]. Dieses ist durch das Vorliegen einer Hämolyse, einer Erhöhung der Leberenzyme und einer erniedrigten Thrombozytenzahl (≤100.000/µl) definiert. Begleitend können rechtsseitige Oberbauchschmerzen, Kopfschmerzen, Sehstörungen, starke Übelkeit und Erbrechen auftreten. In ca. 2% der Fälle mit schwerer PE entwickelt sich eine Eklampsie [25-26, 28].
Dabei treten tonisch-klonische Krämpfe mit oder ohne Bewusstseinsverlust, Kopfschmerzen und Sehstörungen auf. Häufig müssen Patientinnen mit schwerer PE intensivmedizinisch
überwacht werden, da es zu Komplikationen wie Nierenversagen, Hirnödem, Thrombosen, zerebralen Blutungen und Netzhautschäden kommen kann.
Trotz zahlreicher Fortschritte in der Erforschung der Ätiologie der Präeklampsie existiert bisher keine ursächliche Therapie. Die einzige kausale Therapie besteht nach wie vor in der Entbindung und Entfernung der Plazenta aus dem mütterlichen Körper. Das kann zu iatrogener Frühgeburtlichkeit führen und trägt zu 15% der Frühgeburten bei [31]. Durch eine medikamentöse Therapie kann lediglich die symptomatische Behandlung erfolgen, um die maternalen zerebro- und kardiovaskulären Komplikationen zu vermeiden. Allerdings zeigen aktuelle Studien, dass die medikamentöse Blutdrucksenkung bei schwerer Präeklampsie (>170/110 mmHg) eine erhöhe Rate an wachstumsretadierten Neugeborenen und ein vermindertes Geburtsgewicht hervorruft [32].
Je nach zeitlichem Auftreten der klinischen Symptome unterscheidet man eine frühe Form („early-onset“, <34. + 0 SSW) und eine späte Form („late-onset“, >34. + 0 SSW) der Präeklampsie [33]. Die frühere Form macht bis zu 20% alle Präeklampsie-Fälle aus, ist häufig klinisch schwerwiegender und trägt zu einer hohen Rate an Frühgeburten bei [34].
Als Risikofaktoren für die Entstehung einer Präeklampsie gelten u.a. Erstgebärende, Mehrlingsschwangerschaften, mütterliche chronische Erkrankungen, wie Bluthochdruck, Diabetes mellitus, Nierenerkrankungen, aber auch mütterliches Übergewicht [28].
Frauen, die an einer Präeklampsie erkrankt waren, haben im späteren Leben ein deutlich erhöhtes Risiko für kardiovaskuläre Erkrankungen (Schlaganfall, Herzinfarkt), Typ-II- Diabetes oder dem metabolischen Syndrom [29, 35-36]. Das Risiko eine chronische Hypertonie nach 20-25 Jahren zu entwickeln, liegt bei 90% [37].
1.3.2 Pathophysiologie der Präeklampsie
Die Pathogenese der Präeklampsie ist noch nicht vollständig geklärt. Der Plazenta wird eine zentrale Rolle in der Entstehung des Schwangerschaftssyndroms zugeteilt [3]. Die Erkrankung kann u.a. bei Blasenmolen auftreten, wo nur plazentares Gewebe und kein embryonales Gewebe vorhanden ist [3, 38]. Die klinischen Symptome gehen nach der Entfernung der Plazenta aus dem mütterlichen Körper zurück [38]. Die PE stellt ein multifaktorielles Syndrom dar [39] mit plazentaren und mütterlichen Interaktionen [3]. Die derzeit akzeptierteste Hypothese zur Entstehung der Erkrankung ist ein Zwei-Stadien-Modell [40].
Im ersten Stadium, wie in Abbildung 2 gezeigt, können verschiedene Faktoren zu einer gestörten Plazentaentwicklung mit plazentarer Hypoxie, oxidativem Stress und mütterlicher
systemischer Inflammation beitragen. Zu diesen Faktoren gehören u.a. genetische Faktoren, Umweltfaktoren sowie mütterliche Vorerkrankungen (Diabetes mellitus, chronische Hypertonie, Thrombophilie) aber auch mütterliches Übergewicht [28, 41]. Die dysfunktionelle Plazenta schüttet Substanzen aus, die das mütterliche Gefäßsystem schädigen.
Dort wiederum verursachen diese Substanzen im Stadium 2 der Erkrankung eine milde bis schwere Mikroangiopathie der Zielorgane, wie Niere, Gehirn, Leber und Plazenta, mit den entsprechenden klinischen Symptomen [25, 40, 42].
Abbildung 2: Zwei-Stadienmodell der Präklampsieentstehung (modifiziert nach [25, 40, 43]).
1.3.3 Abnormale Trophoblasteninvasion bei Präeklampsie
Wie in Abschnitt 1.2 beschrieben, bauen die invasiven Zytotrophoblasten die mütterlichen Spiralarterien um, so dass diese Gefäße mit zuvor hohem Widerstand und einer gut ausgebildeten Muscularis, in dilatierte vaskuläre Kanäle mit hoher Kapazität transfomiert werden. So kann die Versorgung der fetoplazentaren Einheit gewährleistet werden [17]
(Abbildung 3A).
Im Gegensatz dazu invadieren die Trophoblasten bei PE nur in die dezidualen Anteile der maternalen Arterien, jedoch nicht in den myometrialen Teil. Als Folge kommt es zu einer
verminderten Dilatation der Spiralarterien [5] mit einem Gefäßdurchmesser, der nur ca 40%
dessen beträgt, was man bei einer normalen Schwangerschaft erwartet [44]. Dies führt wiederum zu einer Minderperfusion der uteroplazentaren Gefäße mit resultierender plazentarer Hypoxie und Ischämie [4, 9, 30] während der Schwangerschaft und Folgen für die wachsende Plazenta sowie die Sauerstoff- und Nährstoffversorgung des Fetus [45], (Abbildung 3B). Die initialen Ereignisse und die komplexen molekularen Vorgänge, die für die gestörte Trophoblasteninvasion Bedeutung haben, sind bislang nur teilweise bekannt.
A .Normal B. Präeklampsie
Abbildung 3: Abnormale Trophoblasteninvasion bei der Präeklampsie Bei einer normalen Schwangerschaft invadieren Zytotrophoblasten in die mütterlichen Spiralarterien (A). Bei der PE erfolgt eine verminderte Invasion und eine unzureichende Umwandlung der Spiralarterien (B), (modifiziert nach [25, 30]).
1.3.4 Molekulare Faktoren der Präeklampsie
Es existieren zunehmend mehr Erkenntnisse, dass die Plazenta von Frauen, die im Verlauf ihrer Schwangerschaft eine PE entwickeln, Faktoren in die mütterliche Zirkulation freisetzt, die das Gefäßsystem dazu veranlassen einen arteriellen Hypertonus und andere klinische Manifestationen zu verursachen. Bisher konnte kein einzelner Faktor ausgemacht werden, der alleinig für die Entwicklung einer PE prädisponiert.
Der derzeit bekannteste Kandidat ist der lösliche Rezeptor des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktors (VEGF)-1, auch bekannt als sFlt1 (soluble fms-like tyrosine kinase 1).
Dieser antiangiogene Faktor bindet den vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF, vascular endothelial growth factor), sowie den plazentaren Wachstumsfaktor (PIGF, placental growth factor) und entzieht den Endothelzellen somit wichtige Überlebensfaktoren [46-47].
Es ist bekannt, dass eine plazentare Ischämie zu einem Ungleichgewicht zwischen angiogenen (VEGF, PIGF) und antiangiogenen (sFlt-1, soluble Endoglin: sEng) Faktoren führt. Ein Überschuss an antiangiogenen Faktoren scheint eine zentrale Rolle in der Pathophysiologie der Erkrankung zu spielen [6, 30, 35]. VEGF sowie PlGF, das in der Plazenta gebildet wird, sind wichtige angiogenetische und mitogene Faktoren und essentielle Zytokine für die
endotheliale Integrität [25]. Sie induzieren eine Vasodilatation durch die Induktion der Stickstoffmonoxid- und Prostacyclinsynthese in Endothelzellen. Auch sFlt-1 wird in der Plazenta von Synzytiotrophoblasten produziert und ist bei Patientinnen mit PE schon 5-6 Wochen vor dem Auftreten klinischer Symptome erhöht. Im Gegensatz dazu ist die Konzentration von VEGF und PlGF bei diesen Frauen auf Grund der Antagonisierung durch sFlt-1 erniedrigt [48].
Zu den weiteren Faktoren, die zur Pathogenese der PE beitragen, zählt sEng [48]. sEng ist ein Co-Rezeptor für TGF-β1 und TGF-β3 und wird von Endothelzellen und Synzytiotrophoblasten gebildet. Bei Schwangeren ist sEng 2-3 Monate vor der klinischen Manifestation v.a. der schweren PE hochreguliert [48]. sEng ist ebenfalls an der Regulation des Gefäßtonus durch Interaktionen mit der endothelialen Stickstoffmonoxidsynthase beteiligt. Sowohl Hypoxie als auch inflammatorische Mechanismen werden als Stimuli für die Freisetzung von sFlt-1 und sEng diskutiert.
Verschiedene Anteile des inflammatorischen Netzwerkes werden bei PE aktiviert (Leukozyten, Endothelzellen, Gerinnungssystem, Thrombozyten, Akute-Phase Marker), spielen aber auch in normalen Schwangerschaften eine Rolle und werden als physiologische Reaktion in der Schwangerschaft verstanden. Diese Veränderungen treten verstärkt im dritten Trimenon und bei PE auf. Zu den verstärkt aktivierten Zytokinen gehören u.a.
Tumornekrosefaktor-alpha (TNF-α), Interleukin (IL)-6, IL-1α, IL-1β, und Fas-Ligand [49- 50].
Folgen der generalisierten Entzündungsvorgänge beinhalten u.a. die Freisetzung von freien Fettsäuren [51], Lipoproteinen, Lipidperoxiden [52], TNF-α [53] und Fibronektin [54] in die maternale Zirkulation [55]. Sowohl Granulozyten [56-58] als auch Monozyten [59-60]
werden aktiviert und setzen proinflammatorische Zytokine, wie TNFα und dessen löslichen Rezeptor, IL-6 [53] und lösliche Phospholipase A2, frei.[61].
Die Aktivierung des Renin-Angiotensin-Systems wurde ebenfalls mit der Pathogenese der PE in Zusammenhang gebracht, insbesondere da es funktionell in der Plazenta vorhanden ist und die Level des Angiotensin 1 Rezeptors (AT1-R) in Trophoblasten bei PE erhöht sind.
Außerdem wurden im Serum von Frauen mit PE Auto-Antikörper (AT1-AA) gefunden, die den AT1-R stimulieren [7, 62]. Diese AT1-AA können direkt eine Blutdruckerhöhung und Proteinurie induzieren [7]. Hypoxie, die durch eine plazentare Minderperfusion verursacht wurde, kann zu einer inflammatorischen Antwort führen, die zur Freisetzung das AT1-AA beiträgt [63].
Die von Syncytiotrophoblasten freigesetzten anti-endothelialen und anderen Proteine sind wahrscheinlich die Hauptursache für die endotheliale Dysfunktion. Von besonderem Interesse ist jedoch, dass in den letzten Jahren gezeigt wurde, dass eine gesteigerte Rate an trophoblastärem Material der Plazenta in der maternalen Zirkulation bei PE zu finden ist [8, 64-65]. Dieses besteht aus Syncytiotrophoblastenmembranmikropartikeln, Zytokeratinfragmenten, löslicher RNA und DNA fetalen Ursprungs und ebenso Zytotrophoblastenzellen. Das Material ist pro-inflammatorisch und verursacht eine systemische maternale inflammatorische Antwort [8].
Verschiedene Charakteristika der PE lassen auch vermuten, dass immunologische Faktoren eine Rolle in der Pathogenese der Erkrankung spielen. Sie führen zur Schädigung des Gefäßendothels, was durch erhöhte Level von Fibronektin, Faktor-VIII-Antigen und Thrombomodulin im Serum von PE Patientinnen nachzuweisen ist [66-67]. Eine erhöhte Empfindlichkeit auf Angiotensin II, sowie eine erhöhte Sekretion von Endothelin und eine verminderte Produktion von Prostacyclin wurde ebenfalls bei PE beschrieben, was zur Vasokonstruktion und somit zur Blutdruckerhöhung führt [68-69]. Im Übrigen befinden sich natürliche Killerzellen (NK-Zellen) in der mütterlichen Dezidua und stehen in direktem Kontakt mit den fetalen Trophoblasten [70-71] und können in Prozesse involviert sein, die für die PE von Bedeutung sind. Es gibt Hinweise darauf, dass die Empfänglichkeit für eine PE durch das humane Leukozytenantigen C (HLA-C) und KIR-Rezeptoren (killer cell immunoglobulin-like receptors), die in der Plasmamebran von NK-Zellen vorkommen, beeinflusst werden kann [72]. Darüber hinaus ähneln die histologischen Veränderungen der Niere (so genannte Endotheliose der Niere) und der Plazenta bei der PE den histologischen Befunden bei der Vaskulitis [73], die zu den Autoimmunerkrankungen zählt.
Die PE ist eine komplexe Erkrankung mit einer Vielzahl klinischer Erscheinungsbilder. Diese Heterogenität legt die Möglichkeit verschiedener pathogenetischer Mechanismen nahe. Weder die initialen ätiologischen Faktoren noch die Interaktionen zwischen der ischämischen Plazenta, anti-angiogenen Faktoren, inflammatorischen Zytokinen, Angiotensin II und dem AT1-R, die mit der Präeklampsie in Verbindung gebracht werden, sind bisher gut verstanden.
1.4 Adenosin und Adenosin-vermittelte Signalwege
1.4.1 Adenosin
Adenosin ist ein endogenes Purin-Nukleosid [74-75], welches aus der Nukleinbase Adenin und dem Zucker β-D-Ribose besteht (Abbildung 4). Adenosin ist ein biologisch aktives Signalmolekül, welches ubiquitär im Körper vorhanden ist und viele physiologische Prozesse moduliert [74]. Es ist ein Bestandteil der energiereichen Verbindungen Adenosintriphosphat
(ATP), Adenosindiphosphat (ADP), Adenosinmonophosphat (AMP), sowie der Ribonukleinsäuren (RNA). Adenosin kommt intra- und extrazellulär vor [76-77]. Intrazellulär wird Adenosin aus der Hydrolyse von S-Adenosylhomocystein (SAH) durch SAH- Hydrolasen, oder durch AMP- Dephosphorylierung mittels cytosolischer 5´-Nukleotidasen gebildet [76, 78-80]. Es kann aus extrazellulär liegenden Nukleotiden (ATP, ADP, cAMP, Di- Adenosin-Polyphosphate) über membranständige Ektoenzyme (Ekto-Phosphodiesterasen, Ekto-Nukleotidasen) gebildet werden [81]. Intrazellulär wird Adenosin durch Adenosin- Desaminase zu Inosin umgesetzt [76, 78, 82]. Der Adenosin-Transport aus dem intra- in den extrazellulären Raum erfolgt hauptsächlich mittels erleichterter Diffusion [78]. Hypoxie, Ischämie und Entzündungen führen zu einer raschen 30-300 fachen Erhöhung der extrazellulären Adenosinkonzentration [82-83]. Endothelzellen und neutrophile Granulozyten können vor allem durch metabolischen Stress, Entzündungen und Infektionen extrazelluläres Adenosin akkumulieren [84]. Es ist bekannt, dass die Konzentration von extrazellulärem Adenosin unter 1 µM in gesundem Gewebe beträgt, während in entzündetem oder ischämischem Gewebe, mit vorliegender Sepsis, die Konzentration bis auf 100 µM ansteigen kann. Beispielweise wurden bei Patienten mit rheumatoider Arthritis Adenosin- Konzentrationen von 10 bis 100 µM in der Synovialflüssigkeit nachgewiesen [75, 85].
Adenosin hat vielfältige Wirkungen auf das Herz und die Blutgefäße, das zentrale Nervensystem, die Skelettmuskulatur und das Immunsystem [75, 82, 86-89].
Abbildung 4: Strukturformel von Adenosin.
1.4.2 Purin-Rezeptoren
Adenosin vermittelt seine vielfältigen Effekte über die Bindung an spezifische membranständige Rezeptoren [75, 78, 90]. Diese Rezeptoren gehören zu der Familie der Purin-Rezeptoren (Abbildung 5). Im Jahre 1972 wurde erstmals von Burnstock die Bezeichnung „purinerge Rezeptoren“ eingeführt [91]. Diese Rezeptoren werden in zwei Klassen: P1 und P2 unterteilt [92]. Zur Klasse P1 gehören die Adenosin- Rezeptoren, die
anhand ihrer pharmakologischen Eigenschaften in vier Subtypen (A1, A2A, A2B und A3) eingeteilt und als Nukleosid-Rezeptoren bezeichnet werden [90, 92]. Die P2 –Rezeptoren (Nukleotid-Rezeptoren) unterteilen sich in P2X-Rezeptoren (Ligandengesteuerte Ionenkanäle) und P2Y-Rezeptoren (G-Protein-gekoppelte Rezeptoren) mit ihren entsprechenden Subtypen [78, 93-95]. Die P2–Rezeptoren können durch die Nukleotide ATP, ADP und Adenindinukleotid aktiviert werden [90, 92, 94-95]. Vor kurzem wurden als P0-Rezeptoren bezeichnete Adenin-Rezeptoren identifiziert und in die Gruppe der Purin-Rezeptoren eingeordnet. Diese werden dagegen durch Adenin aktiviert [96-98].
Abbildung 5: Klassifizierung der purinergen Rezeptoren[92-95].
Adenosin-Rezeptoren sind G-Protein-gekoppelte Rezeptoren. Diese bestehen aus sieben Transmembrandomänen, die durch drei extrazelluläre und drei intrazelluläre Schleifen miteinander verbunden sind und in einem extrazellulären Aminoterminus sowie einem intrazellulären Carboxyterminus enden [78, 99]. Hauptfunktion der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren ist die Signaltransduktion in das Zellinnere über Aktivierung von Guanosintriphosphat (GTP)-bindende Proteine (G-Proteine) [99].
Die Aktivierung eines G-Protein–gekoppelten Rezeptors ist ein mehrstufiger Prozess (Abbildung 6). Im inaktiven Zustand besteht dieser aus einem Heterotrimer, der sich aus drei Untereinheiten (α, β, γ) zusammensetzt. Die α-Untereinheit ist im inaktiven Zustand an das Guanosindiphosphat (GDP) Molekül gebunden (1). Nach der Bindung eines Liganden (Agonist) (2) kommt es zur Konformationsänderung des Rezeptors (3). Dies führt zu einem Austausch von GDP gegen GTP (4). Durch die Bindung von GTP dissoziiert die α- Untereinheit von der β und γ- Untereinheiten ab (5). Die aktivierte α- Untereinheit sowie die β, γ- Untereinheiten können weitere Signalkaskaden auslösen und interagieren mit der Adenylatcyclase (AC) oder Phospholipase C. Die α-Untereinheit hydrolysiert nach einer
bestimmten Zeit GTP zu GDP (6), ändert ihre Konformation, assoziiert wieder mit den β, γ- Untereinheiten (1) und ist bereit, wieder mit einem Rezeptor zu interagieren [92, 100].
Abbildung 6: Signaltransduktion G-Protein-gekoppelter-Rezeptoren (Quelle: http://commons.wikimedia.org/wiki/File:GPCR-Zyklus.png)
1.4.3 Adenosin-Rezeptoren
1.4.3.1 Klassifizierung von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren
Anhand der α-Untereinheit-Homologie werden G-Protein-gekoppelte Rezeptoren in drei Gruppen (Gs, Gi und Gq) eingeteilt (Tabelle.1). Die A1 und A3- Adenosinrezeptoren sind mit Gi-Proteinen gekoppelt. Die Aktivierung dieser Rezeptoren führt zur Hemmung des Enzyms Adenylatcyclase (AC) und zur Verringerung der intrazellulären cAMP- Konzentration [101].
A2A und A2B- Adenosinrezeptoren sind Gs- Protein- gekoppelte-Rezeptoren. Deren Aktivierung stimuliert AC, führt zu einer Erhöhung des intrazellulären cAMP und zur einer Aktivierung der Proteinkinase A (PKA). Dadurch können weitere Proteine aktiviert und phosphoryliert werden [74, 78, 90]. A2B und A3- Rezeptoren können außerdem noch an Gq- Protein gekoppelt sein und Phospholipase C aktivieren. Es kommt zum Anstieg von Inositol- 1,4,5-triphosphat (IP3) und Diacylglycerol (DAG). IP3 stimuliert die Freisetzung von Calcium aus den intrazellulären Speichern [74, 78].Der A1-Rezeptor kann mit G0-Proteinen gekoppelt sein [102]. G0-Proteine werden auch als olfaktorische Proteine bezeichnet und stimulieren die AC des Riechepithels [103].
Tabelle 1. Effektorsystem der Adenosinrezeptoren[78].
Adenosinrezeptor
Subtyp A1 A2A A2B A3
G-Protein Gi, G0 Gs Gs, Gq Gi, Gq
Effekt
cAMP ↓
K+↑, Ca2+↓ cAMP ↑ cAMP↑ IP3 ↑ DAG ↑
cAMP ↓ IP3 ↑ DAG ↑
1.4.3.2 Signaltransduktion durch den A2BAR
Der Adenosin-Rezeptor vom Subtyp 2B war von besonderem Interesse in der vorliegenden Arbeit. A2BAR kommen ubiquitär im Körper vor und wurden in zahlreichen Organen und Geweben, nachgewiesen. Hierzu gehören u.a. der Gastrointestinaltrakt [92, 104], die Lunge, die Harnblase, der Dickdarm, der Blinddarm [74], das Gehirn (Neuronen) [105-106] und die Gliazellen [101, 107-108] sowie die Plazenta [109]. Die A2BAR Expression wurde dabei in Mastzellen [110-111], Makrophagen [112], Lymphozyten [113], dendritischen Zellen [114- 115], Neutrophilen [116], Astrozyten [82], Herzmuskelzellen [117-119], Netzhautpigmentepithel [120-121], Endothelzellen [122-124], Darmepithel [104, 125], Muskelzellen [126-127] und Fibroblasten [128] nachgewiesen. Der A2BAR spricht auf viele biologische Prozesse an, die seine Expression induzieren. Es wurde gezeigt, dass die Transkription des A2BAR durch HIF [129], NFκB (nuclear factor „kappa-light-chain- enhancer“ of activated B-cells) [130] und durch cAMP reguliert werden kann [74].
Nach der Ligandenbindung kann der A2BAR mehrere Signaltransduktionswege aktivieren, um seine Effekte zu vermitteln. Nach Aktivierung des A2BAR wird eine Stimulation der AC über das Gs-Protein mit einem Anstieg der intrazellulären cAMP–Konzentration bewirkt [74].
Durch eine Kopplung über Gq-Proteine wird die Phospholipase C aktiviert, wodurch die DAG Konzentration erhöht und damit die Proteinkinase C aktiviert wird [74]. Andererseits kommt es zu einer Erhöhung von IP3 und zu einem Anstieg von intrazellulärem Calcium. Dies wurde in mehreren Zellen nachgewiesen. Beispiele sind dafür murine [131], und auch humane Mastzellen (HMC-1 Zellen), [110]. In HMC-1 Zellen kommt es nachfolgend zur Synthese von IL-8, einem Entzündungsmediator, der in die Pathogenese chronische entzündlicher Lungenerkrankungen, wie z.B. Asthma, involviert ist [110]. Andererseits führte eine A2BAR Aktivierung in humanen Erythroleukämie Zellen (HEL-Zellen) zwar zu einem Anstieg intrazellulären Calciums, aber ohne Phopsholipase C Aktivierung [132].
Signaltransduktionskaskaden, die durch Stimulierung des A2BAR aktiviert werden, beinhalten die Mitogen-aktivierte Proteinkinase Familie (MAP-Kinasen, MAPK) [78, 110, 133]. MAPK
gehören zur Gruppe der Serin/Threonin-Kinasen, die an verschiedenen zellulären Prozessen wie Zellwachstum, Differenzierung, Inflammation und Apoptose beteiligt sind [134]. MAPK werden in drei Hauptgruppen eingeteilt: ERK (englisch: extracellular signal-regulated protein kinases) mit den Isoformen ERK-1 und ERK-2, stressaktivierte Proteinkinasen p38 und c-Jun N-terminale Proteinkinasen (JNK) [78, 133]. p38 und JNK sind Stress-aktivierte Proteinkinasen (SAPK), da sie vor allem durch Stressoren, wie dem osmotischen Schock, oxidativen Stress oder UV-Strahlung aktiviert werden [135]. MAPK werden im Zytoplasma aktiviert und translozieren danach in den Zellkern. Dort werden verschiedene Transkriptionsfaktoren aktiviert, die die Expression verschiedener Gene kontrollieren. Die Phosphorylierung von ERK1/2 nach A2BAR Aktivierung wurde in Ovarialzellen des Chinesischen Hamsters [136], in humanen embryonalen Nieren-293-Zellen [137] und in menschlichen Mastzellen (HMC-1 Zellen) gezeigt. Proinflammatorische Zytokine, wie zum Beispiel IL-1, können zu einer p38 und JNK- Phosphorylierung führen und eine inflammatorische Antwort auslösen [138]. Nach Anstieg des intrazellulären cAMP wird die PKA stimuliert. Das führt u.a. zur Aktivierung des cAMP Response Element Binding Proteins (CREB) [139]. CREB ist vielfach in Proliferations-, Differenzierungs- und Überlebensprozesse von Zellen involviert [140-143].
1.4.3.3 Physiologische Funktionen des A2BAR
Der A2BAR ist an der Regulation immunologischer, inflammatorischer und angiogenetischer Vorgänge beteiligt [74, 77-78]. Die Expression des Rezeptors wird durch diverse Ereignisse gesteuert und u.a. durch immunologische Mediatoren reguliert. Das proinflammatorische Zytokin TNF- α erhöht die A2BAR-Transkription in zahlreichen Zelltypen sowohl in vitro als auch in vivo [144-145]. Ebenfalls steigern Lipopolysaccharide (LPS) die A2BAR mRNA Expression in Makrophagen [146] und IL-1 in Endothelzellen [147].
Eine Aktivierung von A2BAR auf Mastzellen führt zur Freisetzung von proinflammatorischen Zytokinen, wie z.B. IL-4, IL-6, IL-8 und IL-13, und spielt damit eine zentrale Rolle bei asthmatischen Prozessen [110, 148-149]. Auch in humanen Lungenfibroblasten führt eine A2BAR-Aktivierung zu einer gesteigerten Freisetzung von IL-6 und fördert die Differenzierung von Fibroblasten zu Myofibroblasten [150]. Bei zerebraler Ischämie löst die A2BAR Aktivierung die Freisetzung von IL-6 durch Astrozyten aus [82, 151-152].
Die Expression von A2BAR spielt eine wichtige Rolle in der Regulation der Angiogenese [124]. Es konnte auch gezeigt werden, dass der A2BAR die VEGF-Produktion in humanen Retina- [153] und humanen mikrovaskulären Endothelzellen (HMEC) [124], humanen
Mastzellen [154], bronchialen glatten Muskelzellen (BSMC) und humanen Endothelzellen der Nabelschnurvenen (HUVEC) stimuliert [155]. Außerdem konnte eine vasodilatatorische Wirkung des A2BAR nachgewiesen werden [74].
Obwohl die Rolle von Adenosin und der Adenosinrezeptoren in zahlreichen Organen und Geweben bekannt ist, gibt es nur wenige Studien, die die Funktion und Rolle von Adenosin und seinen Rezeptoren in der Schwangerschaft und bei PE untersuchten. Bisher wurde beschrieben, dass Adenosinkonzentration in fetalem und mütterlichem Plasma bei PE im Vergleich zu normalen Schwangerschaften höher ist [156-158]. Yoneyama et.al. zeigte, dass die mütterliche Adenosinkonzentration bei gesunden Nicht-Schwangeren 0,18 µmol/L, bei gesunden Schwangeren 0,41 µmol/L, bei leichter PE 0,60 µmol/L und bei schwerer PE 0,72 µmol/L beträgt [156, 159]. Die Adenosinkonzentration im Nabelschnurblut von PE Schwangerschaften ohne fetale Hypoxie lag bei etwa 600 nM [160] und durch fetale Hypoxie stieg die Adenosin-Konzentration 3-fach an (~ 1800 nM). Auch andere Studien zeigen, dass die Adenosin-Konzentration im mütterlichen Blut bei PE (~ 680 nM) im Vergleich zur normalen Schwangerschaften (~ 390 nM) erhöht ist [158-163]. Eine Studie hat die Adenosin- Konzentration in der Plazenta bei Kaiserschnitt und Vaginalgeburt untersucht [164]. Hiernach ist bei Neugeborenen nach Vaginalgeburt das Adenosin im Nabelschnurblut deutlich höher konzentriert (0,46 µM arteriell und 0,48 µM venös) als nach primärem (geplantem) Kaiserschnitt (0,16 µM arteriell und 0,17 µM venös), [165].
In der humanen Plazenta wurden die Lokalisation und die Expression aller vier Adenosinrezeptoren (A1, A2A, A2B und A3) nachgewiesen. Die Expressionslevel von Rezeptoren waren in präeklamptischen Schwangerschaften höher als in normalen Schwangerschaften. Außerdem waren unter hypoxischen Bedingungen (2% O2) A2A- Adenosinrezeptors- Protein- und mRNA-Expression in plazentaren villösen Explantaten erhöht [109].
2 Fragestellung
Eine gestörte Umwandlung maternaler Spiralarterien durch eine unzureichende Trophoblasteninvasion mit nachfolgend verminderter utero-plazentarer Perfusion und plazentarer Hypoxie wird derzeit als primärer Schritt angesehen, der zu Schwangerschaftskomplikationen, wie fetaler intrauteriner Wachstumsretardierung und der PE, führen kann.
Adenosin, ein durch Hypoxie induzierbares Molekül, ist an der Regulation von Zellfunktionen beteiligt und bei Schwangeren mit PE vermehrt nachzuweisen. Welche Rolle Adenosin und der durch Hypoxie regulierbare A2BAR inder Plazentaentwicklung spielt, ist bisher unbekannt.
Das Ziel dieser Arbeit war es daher, den Einfluss von Hypoxie und des A2BAR auf plazentare Entwicklungsvorgänge an in vitro Modellen mit humanen Ersttrimestertrophoblasten (HTR8/SVneo) und humanen uterinen Endothelzellen (HUtMVEC) zu untersuchen.
Insbesondere sollten folgende Fragestellungen bearbeitet werden:
1) Ist die Expression des A2BAR sauerstoffabhängig?
2) Beeinflusst die Sauerstoffkonzentration (2% O2, 8% O2, 21% O2) sowie die A2BAR- Aktivierung/Hemmung funktionelle Eigenschaften wie Proliferation, Migration, Invasion und Angiogenesekapazität, sowie die Interaktion von Trophoblasten und Endothelzellen?
3) Welche molekularen Mechanismen steuern diese zellulären Prozesse?
Um diese Fragen addressieren zu können, sollten Untersuchungen auf mRNA- und Proteinebene vorgenommen und unter Einsatz von Agonisten und Antagonisten des A2BAR funktionelle Tests an Trophoblasten und Endothelzellen in Zellkultur durchgeführt werden.
3 Material
3.1 Chemikalien
Tabelle 2: Chemikalien.
Chemikalie Bezugsquelle
Acrylamid Lösung, 40% Bio-Rad Laboratories, Inc., USA
Adenosin Sigma-Aldrich, Steinheim
Adenosindeaminase, Bovine Intestine Calbiochem, Darmstadt Agarose, UltraPure Invitrogen GmbH, Deutschland
Aprotinin Sigma-Aldrich, Steinheim
Ammoniumpersulfat (APS; (NH4)2S2O8 )) SERVA, Heidelberg
Bis-Acrylamid, 2% Bio-Rad Laboratories, Inc., USA
Borsäure Gibco, Eggenstein
Bromphenolblau Roth, Karlsruhe
CaCl2 (Calciumchlorid) Sigma-Aldrich, Steinheim
CellTracker Green CMFDA, Gibco® Invitrogen GmbH, Oregon, USA CellTracker Red CMTPX, Gibco® Invitrogen GmbH, Oregon, USA
Chloroform J.T.Baker, Deventer, Niederlande
Coomassie Brilliant Blue G250 SERVA, Heidelberg DMSO (Dimethylsulfoxid) Sigma-Aldrich, Steinheim DTT (1,4-Dithiothreitol) Roth, Karlsruhe
DEPC (Diethylpyrocarbonat) AppliChem, Darmstadt EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure,
Dinatriumsalz)
Sigma-Aldrich, Steinheim EGTA (Ethylen Glycol-bis(ß-
Aminoethylether-N,N`,N`-Tetraessigsäure)
Sigma-Aldrich, Steinheim
Essigsäure, 100% Roth, Karlsruhe
Ethanol, 99% Th. Geyer GmbH &CoKG, Renningen
Ethidiumbromid Sigma-Aldrich, Steinheim
Fetales Kälberserum (FKS, hitzeinaktiviert) Invitrogen/Gibco, Eggenstein
Formamid Merck, Darmstadt
Forskolin AppliChem, Darmstadt
FastStartUniversal SYBR Green Master (Rox) Roche Diagnostics, Mannheim
Gelatine Sigma-Aldrich, Steinheim
Giemsas Azur-Eosin-Methylenblaulösung Merck, Darmstadt
Glycerol Merck, Darmstadt
Glycin Roth, Karlsruhe
Guanidiniumisothiocyanatlösung mit Phenol ABgene, Cambridge, England ß-Glycerolphosphat Sigma-Aldrich, Steinheim
HPLC- Wasser J.T. Baker, Deventer, Niederlande
Isopropanol Merck, Darmstadt
Kaliumhydrogenphosphat (KH2PO4) Merck, Darmstadt
Kaliumchlorid (KCl) Roth, Karlsruhe
Leupeptin SERVA, Heidelberg
Lipofectamine 2000 Invitrogen GmbH, Deutschland
Luminol Sigma-Aldrich, Steinheim
Matrigel, Phenolrot- frei BD Biosciences, Bedford, MA, USA
Milchpulver, fettfrei Marvel, UK
ß-Mercaptoethanol, Calbiochem® Merck, Darmstadt
Methanol J.T. Baker, Deventer, Niederlande
Natriumhydrogencarbonat (NaHCO3) Merck, Darmstadt
Natriumchlorid (NaCl) J.T. Baker, Deventer, Niederlande
Natriumcarbonat (Na2CO3) Merck, Darmstadt
Dinatriumhydrogenphosphat (Na2HPO4) Merck, Darmstadt Natriumfluorid (NaF) Sigma-Aldrich, Steinheim Natriumvanadat (NaV) Sigma-Aldrich, Steinheim
Nonidet P-40 Sigma-Aldrich, Steinheim
p-Cumarsäure Sigma-Aldrich, Steinheim
Penicillin/Streptomycin (10.000 U/ml / 10.000 µg/ml)
Biochrom, Berlin
Ponceau S Sigma-Aldrich, Steinheim
Phenylmethansulphanylfluorid (PMSF) SERVA, Heidelberg
„PIERCE” –Super Signal West Dura Extended Pierce/ Perbio Sciences, USA Precision Plus ProteinTM Standards, All Blue Bio-Rad, München
Protein Assay Dye Reagent Concentrate Bio-Rad, München Rekombinantes humanes MMP-2, Western
Blotting Standard
R&D Systems, Wiesbaden Rekombinantes humanes MMP-9, Western
Blotting Standard
R&D Systems, Wiesbaden
Rotiphorese Gel 40 (37, 5:1) Roth, Karlsruhe
RPMI (Roswell Park Memorial Institute medium) 1640 1x (+) L-Glutamin
Invitrogen/Gibco, Eggenstein Salzsäure (HCl) J.T. Baker, Deventer, Niederlande SDS (Sodium Dodecyl Sulphate) Roth, Karlsruhe
Single Quot Kit CC-4176, EGM-2 Lonza, USA TEMED
(N,N,N´,N´-Tetramethylethylendiamin)
Roth, Karlsruhe
Total RNA Isolation Reagent (TRIR) Thermo Fisher Scientific, UK
Tris(hydroxymethyl)aminomethan Merck, Darmstadt
Tris-HCl Merck, Darmstadt
Triton X-100 Sigma-Aldrich, Steinheim
Trypan blue Solution 0,4% Sigma-Aldrich, Steinheim Trypsin-EDTA 0,5% Invitrogen/Gibco, Eggenstein
Tween 20 (for electrophoresis) Sigma-Aldrich, Steinheim
Uvasol Merck, Darmstadt
Wasserstoffperoxid, 30% reinst Omnilab-Laborzentrum GmbH & Co.
KG, Gehrden, Hannover
Xylencyanol FF Sigma-Aldrich, Steinheim
3.1.1 Spezielle Chemikalien
A2B-Adenosinrezeptoragonist und – antagonist:
In den vergangenen Jahren wurden neuartige Subtyp-spezifische Adenosinrezeptorliganden entwickelt. Diese pharmakologischen Werkzeuge helfen, typische Rezeptor-vermittelte Effekte zu untersuchen.
In dieser Arbeit wurde 5′-(N-Ethylcarboxamido)adenosin (NECA, Sigma-Aldrich, Steinheim), der am häufigsten verwendete A2BAR Agonist, mit einer mittleren effektiven Konzentration (EC50) von etwa 2 µM verwendet [166], [77], Abbildung 7
Abbildung 7: Strukturformel des A2BAR Agonisten 5′-(N-Ethylcarboxamido)adenosine (NECA).
Als selektiver Antagonist des A2BAR kam N-(4-Cyanophenyl)-2
-[4-(2,3,6,7-tetrahydro-2,6-dioxo-1,3-dipropyl-1H-purin-8-yl)phenoxy]-acetamid (MRS 1754, Sigma-Aldrich, Steinheim) zum Einsatz [167],[78], Abbildung 8
Abbildung 8: Strukturformel des A2BAR Antagonisten MRS 1754: N-(4-Cyanophenyl)-2-[4-(2,3,6,7- tetrahydro-2,6-dioxo-1,3-dipropyl-1H-purin-8-yl)phenoxy]-acetamid
Tabelle 3: Behandlungslösungen.
Produkt finale Konzentration
Adenosin 1 µM, 10µM , 100µM und 500 µM
A2BAR Agonist (NECA) 10µM + 1 U/ml Adenosin-Desaminase (ADA) A2BAR Antagonist (MRS 1754) 1µM+ 1 U/ml ADA
3.1.2 Oligonukleotidprimer
Tabelle 4: Übersicht über die verwendeten Primersequenzen.
Zielgen 5’→3’ Primer Sequenz ADORA2B forward
reverse
5′-GTGTCCCGCTCAGGTATAAAAG-3′ 5′-GGGACCACATTCTCAAAGAGAC-3′ MMP-2 forward
reverse
5´-GAAGAGCGTGAAGTTTGG-3′ 5´-TCTGAGGGTTGGTGGG-3′ MMP-9 forward
reverse
5´-GGGACGGCAATGCTGATG-3′ 5´-CCACTTCTTGTCGCTGTC-3′ TIMP-1 forward
reverse
5′-CGCTGACATCCGGTTCGTCTAC-3′ 5′-GTGGACACTGTGCAGGCTTCAG-3′ VEGF forward
reverse
5′-CTGGAGTGTGTGCCCACTGA-3´
5´-TCCTATGTGCTGGCCTTGGT-3´
RNA18S5 forward reverse
5´-GAGCGAAAGCATTTGCCAAG-3′ 5′-GGCATCGTTTATGGTCGGAA-3′ GAPDH forward
reverse
5′-AGCCACATCGCTCAGACAC-3′ 5′-TGGACTCCACGACGTACTC-3′
ACTB forward
reverse
5´-CCCTAAGGCCAACCGTGAAAAGATG-3´
5´-GAACCGCTCATTGCCGATGTGATG-3´
Alle verwendeten Oligodesoxyribonukleotide wurden von Eurogentec (Belgien) bezogen.
3.2 Zellkulturmedien
Tabelle 5: Zellkulturmedien.
Medium Zusammensetzung Trophoblastenkulturmedium RPMI 1640 1x (+) L-Glutamin
5% FKS
100 U/ml Penicillin/Streptomycin Endothelzellkulturmedium (Endothelial Cell
Growth Medium, EGM)
Endothelial Cell Basal Medium (EBM)
Wachstumsfaktoren (EGM-2, SingleQuots Kit (rhEGF) 0,5 ml
Hydrocortison 0,2 ml
GA-1000 Gentamicin Sulfat 0,5 ml Amphotericin-B 0,5 ml,
VEGF 0,5 ml, rhFGF-B 2,0 ml, R3-IGF-1 0,5 ml, Ascorbinsäure 0,5 ml 5% FKS
100 U/ml Penicillin/Streptomycin
Happy Medium 50% Trophoblastenkulturmedium
50% EGM 3.3 Lösungen und Puffer
Tabelle 6: Lösungen und Puffer.
10 x PBS Stammlösung 1,37 M NaCl
81 mM Na2HPO4
27 mM KCl 14 mM KH2PO4 in dH2O
10 x TBS 50 mM Tris
150 mM NaCl pH 7,5
10 x Carbonat- Puffer (Transfer-Puffer)
0,1 M NaHCO3 30 mM Na2CO3
10 x GTS 1,9 M Glycin
0,25 mM Tris 1% SDS
10 x TBE 0,9 M Tris/HCl
0,9 M Borsäure 0,02 M EDTA pH 8,3
PBS/Tween PBS (1x) + 0,05% Tween 20
TBS/Tween TBS (1x) + 0,05% Tween 20
Blocklösung PBS (1x)
5% Magermilchpulver 0,05% Tween
Stripping Puffer 62,5 mM Tris/HCl (pH 6,8)
2% SDS 100 mM DTT
SDS-Laufpuffer (5x) 1 M Tris/HCl (pH 6,8) 50% Glycerin
15% SDS
15% β-Mercaptoethanol 1,5% Bromphenolblau Aktivierungspuffer
(für Zymographie)
50 mM Tris/HCl (pH 7,0) 5 mM CaCl2
2 x Ladepuffer (für Zymographie)
10 % Glycerol 10 mM Tris (pH 6,8) 1 % SDS
0,04 % Bromphenolblau dH2O
Coomassie- Färbelösung (1x) 0,4% Coomassie Blue 40% Methanol
10% Essigsäure 50% dH2O
Entfärbelösung 30% Methanol
10% Essigsäure 60% H2O Ladepuffer (6x)
(für Agarose-Gelelektrophorese)
0,25% Bromphenolblau 0,25% Xylencyanol FF 100% Formamid
Einfriermedium 92% FKS
8% DMSO
Mounting Medium 20% Glycerol
80% PBS
Lysispuffer Stock-Lösung 50 mM Tris (pH 7,4)
150 mM NaCl 2 mM EGTA 2 mM EDTA
25 mM Natriumfluorid (NaF) 25 mM ß-Glycerolphosphat 0,1 mM Natriumvanadat (NaV) dH2O
Frisch dazugeben:
0,1 mM PMSF
Leupeptin (10 mg/ ml) Aprotinin (10 mg/ml) 0,2 % Triton
0,3 % NP-40 Luminol Enhancing Solution Lösung 1:
2,5 mM Luminol 400 µM p-Cumarsäure 100 mM Tris/HCl (pH 8,5) Lösung 2:
100 mM Tris/HCl (pH 8,5) 30 % H2O2
3.4 Verbrauchsmaterialien
Tabelle 7: Verbrauchsmaterialien.
Verbrauchsmaterial Bezugsquelle
Kryoröhrchen Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen
Deckgläser (24 x 24 mm) Thermo Scientific, Braunschweig
Falcon-Tubes Sarstedt, Nümbrecht
Faltenfilter Schleicher & Schüll GmbH, Dassel Filme: Amersham Hyperfilm ECL GE Healthcare, UK
Hybond-C extra Nitrocellulosemembran GE Healthcare, UK
Labortücher Kimberly Clark, Ansell GmbH, München
Zählkammer nach Neubauer Omnilab- Laborzentrum, Bremen
Parafilm American National CanTM,USA
Reagiergefäße (0,5 ml; 1,5 ml und 2,0 ml) Eppendorf, Hamburg
Pipetten Eppendorf, Hamburg
Pipettenspitzen Sarstedt, Nümbrecht
Pipette, serologisch, bis 10 ml Sarstedt, Nümbrecht Polycarbonate Membrane (8,0µm pore size) Corning Inc., USA Sterling Nitril- Untersuchungshandschuhe Kimberly Clark, UK
Strip tubes 0,1 ml (VE 1000) für Rotor Gene LTF Labortechnik, Wasseburg
Zellkulturflaschen Nunclon, Thermo Fisher Scientific,
Dänemark
Zellkulturplatten NunclonTM Delta Surface, Thermo Fisher Scientific, Dänemark
Zellkulturschalen Sarstedt, Nümbrecht
Zellschaber 25 cm Sarstedt, Nümbrecht Whatman Papier, 3mm GE Healthcare, UK
3.5 Geräte
Tabelle 8: Geräte.
Gerät Bezugsquelle
Absaugpumpe Gast® MFG. Corp., USA
Abzug: mc 6 Waldner Laboreinrichtungen, Wangen
accu-jet pro (Pipettierhilfe) Brand GmbH+CoKG, Wertheim Autoklaviergeräte:
HST 6-6-6 LVSA 50/70
Zirbus Technology, Bad Grund Zirbus Technology, Bad Grund Biospherix XVIVO System
(Inkubationssystem)
Biospherix, Ltd. Cell Culture Incubator, Hypoxia Chamber & Animal Modeling Systems, USA
Eismaschine Ziegra-Eismaschinen, Isernhagen
Elektronische Analysen- und Präzisionswaagen
Sartorius AG, Göttingen
Hoefer TE 62 standard tank blotter Amersham Biosciences Europe GmbH, Freiburg
Heizblock: ThermoStat plus Eppendorf, Hamburg
CO2 Inkubator Sanyo Electric Biomedical Co. Ltd., Japan Geldokumentationssystem Biostep GmbH, Jahnsdorf
Gelelektrophorese System:
Horizontal: Horizon 58
Vertikal:PerfectBlue Doppelgelsystem Twin ExW S
Gibco BRL, Eggenstein
PEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen Gefrier- und Kühlschränke:
- 20 °C - 80°C
Liebherr, Ochsenhausen
Sanyo Electric Biomedical Co. Ltd., Japan Immulite/ Immulite 1000 HCG Siemens, Eschborn, Deutschland
Leica CTR 6000 (Fluoreszenzmikroskop) Leica Microsystems CMS GmbH, Wetzlar Lichtmikroskop (Olympus IX 51) Olympus, Hamburg
Magnetrührer: IKA® RH basic 2 IKAMAG®
IKA® Werke GmbH & Co. KG, Staufen Mastercycler (PCT-200, Peltier Thermal
Cycler
Biozym Diagnostik GmbH, Oldendorf
Mikrowellengerät Panasonic, Japan
SDS-PAGE Elektrophoresekammer Bio-Rad, München
pH-Einstabmesselektrode SE100 Knick Elektronische Messgeräte GmbH &
CoKG, Berlin
pH-Meter 766 Calimetrie Knick Elektronische Messgeräte GmbH &
CoKG, Berlin PCR-Maschine: MJ Research PTC-200
Peltier Thermal Cycler
Biozym, Hessisch-Oldendorf
Photometer Multiskan EX Thermo Fisher Scientific Inc., Dänemark Rotor-GeneTM 6000 Corbett Research, Qiagen, Hilden
ScanMaker i900 Microtek, China
Tecan Sunrise™ (Photometer) Tecan Group Ltd., Schweiz
Sterilbank HeraSafe 300 Kendro Laboratory Products, Hanau
Schüttler Mini Rocker Shaker PEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen Vortex Heidolph Reax Control Heidolph Instruments GmbH & Co. KG,
Schwabach
Wärmeschrank: Memmert Modell 400 Memmert, Schwachbach
Wasserbad GFL 1083 Gesellschaft für Labortechnik mbH, Burgwedel
Whatman Biometra PS 304 Biometra GmbH, Göttingen Zentrifugen:
Centrifuge 5415C Centrifuge 5415D
Zentrifuge Hettich "Rotina 35R"
Eppendorf, Hamburg Eppendorf, Hamburg
Andreas Hettich GmbH, Tuttlingen
3.6 Zelllinien
HTR8/ SVneo (humane Ersttrimestertrophoblasten) sind mittels Simian Virus Transfektion immortalisierte humane Trophoblasten, welche aus plazentarem Gewebe der 8.-10. SSW gewonnen wurden [168]. Diese Standardzelllinie wurde uns von Dr. C. Graham (Queens University Kingston, Ontario, Kanada) zur Verfügung gestellt.
HUtMVEC (human uterine microvascular endothelial cells) - sind humane, uterine Endothelzellen. Bezugsquelle : Lonza, USA. Die Zellen wurden aus dem Myometrium von Patientinnen gewonnen und in den Passagen 5 bis 11 für die Versuche verwendet.
3.7 Kits und Assays
Tabelle 9: Kits und Assays
Kit Bezugsquelle Amersham cAMP Biotrak
Enzymeimmunoassay (EIA) System
GE Healthcare, UK cDNA Reverse Transkription Kit Applied Biosystems, USA LDH-Kit (Tox-7-1 Kit) Sigma-Aldrich, Steinheim
HCG Immulite Kit Siemens Healthcare Diagnostics GmbH
3.8 Software
Tabelle 10: Software
Ascent software 2.6 Thermo Fisher Scientific Inc., Dänemark Adobe Photoshop 5.0 Adobe Systems GmbH, Deutschland GraphPad (InStat3.06; Prism4.03) GraphPad Software Inc., USA
ImageJ Software 1.4.10 ImageJ Conference Organisation, Luxemburg
Leica Software 3.5.0 Leica Microsystems CMS GmbH, Wetzlar Magellan™ Data analysis software V.3.1 Tecan Group Ltd., Schweiz
4 Methoden
4.1 Zellkultur
4.1.1 Kultivierung von Zelllinien
Die Kultivierung der HTR-8/SVneo (Trophoblasten) Zellen erfolgte unter Standardzellkulturbedingungen bei 37°C und 5% CO2 in T-75 Zellkulturflaschen bei einer Konzentration von etwa 6.000 – 12.000 Zellen/cm². Der Mediumwechsel erfolgte alle 3-4 Tage mit Trophoblastenzellkulturmedium (10 ml RPMI 1640, 5% FKS, 100 U/ml Penicillin/Streptomycin). Bei einer Zellkonfluenz von 80-90% wurden die Zellen passagiert.
HUtMVEC (human uterine microvascular endothelial cells) wurden in gelatinierten Kulturflaschen mit Endothelzellkulturmedium (EGM) bei Standardkulturbedingungen (37°C, 5% CO2) kultiviert. Alle drei Tage wurde das Medium gewechselt und bei 80% Konfluenz wurden die Zellen passagiert.
4.1.2 Passagieren von Zellen
Bei dem Passagieren wurde das alte Medium abgesaugt und die Zellen mit 10 ml PBS gewaschen. Die vollständige Ablösung der Zellen vom Boden erfolgte durch Inkubation mit 5 ml Trypsin/EDTA für ca. 5 min unter mikroskopischer Kontrolle. Danach wurden 5 ml frisches Wachstumsmedium hinzugegeben und die Zellsuspension in 50 ml Röhrchen überführt. Anschließend wurden die Zellen 5 min bei 210 rcf zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, und das Zellpellet wurde in frischem Medium resuspendiert und in der gewünschten Verdünnung auf neue Zellkulturflaschen verteilt.
4.1.3 Einfrieren und Auftauen von Zellen
Beim Einfrieren können sich Eiskristalle bilden, die zu einer irreversiblen Schädigung der Zellen führen können. Um dies zu verhindern, wurde ein spezielles Einfriermedium verwendet. Die Zellen wurden von der Zellkulturschale abgelöst. Die Zellsuspension wurde in ein 50 ml Röhrchen überführt und für 5 min bei 210 rcf zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Zellpellet in Einfriermedium (92% FKS + 8% DMSO) resuspendiert.
Diese Mischung wurde sofort in ein 1ml Kryoröhrchen übertragen, bei -80°C für 24 h aufbewahrt und anschließend langfristig in flüssigem Stickstoff (-196 °C) gelagert.
