1.4.3 Adenosin-Rezeptoren
1.4.3.3 Physiologische Funktionen des A 2B AR
Der A2BAR ist an der Regulation immunologischer, inflammatorischer und angiogenetischer Vorgänge beteiligt [74, 77-78]. Die Expression des Rezeptors wird durch diverse Ereignisse gesteuert und u.a. durch immunologische Mediatoren reguliert. Das proinflammatorische Zytokin TNF- α erhöht die A2BAR-Transkription in zahlreichen Zelltypen sowohl in vitro als auch in vivo [144-145]. Ebenfalls steigern Lipopolysaccharide (LPS) die A2BAR mRNA Expression in Makrophagen [146] und IL-1 in Endothelzellen [147].
Eine Aktivierung von A2BAR auf Mastzellen führt zur Freisetzung von proinflammatorischen Zytokinen, wie z.B. IL-4, IL-6, IL-8 und IL-13, und spielt damit eine zentrale Rolle bei asthmatischen Prozessen [110, 148-149]. Auch in humanen Lungenfibroblasten führt eine A2BAR-Aktivierung zu einer gesteigerten Freisetzung von IL-6 und fördert die Differenzierung von Fibroblasten zu Myofibroblasten [150]. Bei zerebraler Ischämie löst die A2BAR Aktivierung die Freisetzung von IL-6 durch Astrozyten aus [82, 151-152].
Die Expression von A2BAR spielt eine wichtige Rolle in der Regulation der Angiogenese [124]. Es konnte auch gezeigt werden, dass der A2BAR die VEGF-Produktion in humanen Retina- [153] und humanen mikrovaskulären Endothelzellen (HMEC) [124], humanen
Mastzellen [154], bronchialen glatten Muskelzellen (BSMC) und humanen Endothelzellen der Nabelschnurvenen (HUVEC) stimuliert [155]. Außerdem konnte eine vasodilatatorische Wirkung des A2BAR nachgewiesen werden [74].
Obwohl die Rolle von Adenosin und der Adenosinrezeptoren in zahlreichen Organen und Geweben bekannt ist, gibt es nur wenige Studien, die die Funktion und Rolle von Adenosin und seinen Rezeptoren in der Schwangerschaft und bei PE untersuchten. Bisher wurde beschrieben, dass Adenosinkonzentration in fetalem und mütterlichem Plasma bei PE im Vergleich zu normalen Schwangerschaften höher ist [156-158]. Yoneyama et.al. zeigte, dass die mütterliche Adenosinkonzentration bei gesunden Nicht-Schwangeren 0,18 µmol/L, bei gesunden Schwangeren 0,41 µmol/L, bei leichter PE 0,60 µmol/L und bei schwerer PE 0,72 µmol/L beträgt [156, 159]. Die Adenosinkonzentration im Nabelschnurblut von PE Schwangerschaften ohne fetale Hypoxie lag bei etwa 600 nM [160] und durch fetale Hypoxie stieg die Adenosin-Konzentration 3-fach an (~ 1800 nM). Auch andere Studien zeigen, dass die Adenosin-Konzentration im mütterlichen Blut bei PE (~ 680 nM) im Vergleich zur normalen Schwangerschaften (~ 390 nM) erhöht ist [158-163]. Eine Studie hat die Adenosin-Konzentration in der Plazenta bei Kaiserschnitt und Vaginalgeburt untersucht [164]. Hiernach ist bei Neugeborenen nach Vaginalgeburt das Adenosin im Nabelschnurblut deutlich höher konzentriert (0,46 µM arteriell und 0,48 µM venös) als nach primärem (geplantem) Kaiserschnitt (0,16 µM arteriell und 0,17 µM venös), [165].
In der humanen Plazenta wurden die Lokalisation und die Expression aller vier Adenosinrezeptoren (A1, A2A, A2B und A3) nachgewiesen. Die Expressionslevel von Rezeptoren waren in präeklamptischen Schwangerschaften höher als in normalen Schwangerschaften. Außerdem waren unter hypoxischen Bedingungen (2% O2) A2A -Adenosinrezeptors- Protein- und mRNA-Expression in plazentaren villösen Explantaten erhöht [109].
2 Fragestellung
Eine gestörte Umwandlung maternaler Spiralarterien durch eine unzureichende Trophoblasteninvasion mit nachfolgend verminderter utero-plazentarer Perfusion und plazentarer Hypoxie wird derzeit als primärer Schritt angesehen, der zu Schwangerschaftskomplikationen, wie fetaler intrauteriner Wachstumsretardierung und der PE, führen kann.
Adenosin, ein durch Hypoxie induzierbares Molekül, ist an der Regulation von Zellfunktionen beteiligt und bei Schwangeren mit PE vermehrt nachzuweisen. Welche Rolle Adenosin und der durch Hypoxie regulierbare A2BAR inder Plazentaentwicklung spielt, ist bisher unbekannt.
Das Ziel dieser Arbeit war es daher, den Einfluss von Hypoxie und des A2BAR auf plazentare Entwicklungsvorgänge an in vitro Modellen mit humanen Ersttrimestertrophoblasten (HTR8/SVneo) und humanen uterinen Endothelzellen (HUtMVEC) zu untersuchen.
Insbesondere sollten folgende Fragestellungen bearbeitet werden:
1) Ist die Expression des A2BAR sauerstoffabhängig?
2) Beeinflusst die Sauerstoffkonzentration (2% O2, 8% O2, 21% O2) sowie die A2B AR-Aktivierung/Hemmung funktionelle Eigenschaften wie Proliferation, Migration, Invasion und Angiogenesekapazität, sowie die Interaktion von Trophoblasten und Endothelzellen?
3) Welche molekularen Mechanismen steuern diese zellulären Prozesse?
Um diese Fragen addressieren zu können, sollten Untersuchungen auf mRNA- und Proteinebene vorgenommen und unter Einsatz von Agonisten und Antagonisten des A2BAR funktionelle Tests an Trophoblasten und Endothelzellen in Zellkultur durchgeführt werden.
3 Material
3.1 Chemikalien
Tabelle 2: Chemikalien.
Chemikalie Bezugsquelle
Acrylamid Lösung, 40% Bio-Rad Laboratories, Inc., USA
Adenosin Sigma-Aldrich, Steinheim
Adenosindeaminase, Bovine Intestine Calbiochem, Darmstadt Agarose, UltraPure Invitrogen GmbH, Deutschland
Aprotinin Sigma-Aldrich, Steinheim
Ammoniumpersulfat (APS; (NH4)2S2O8 )) SERVA, Heidelberg
Bis-Acrylamid, 2% Bio-Rad Laboratories, Inc., USA
Borsäure Gibco, Eggenstein
Bromphenolblau Roth, Karlsruhe
CaCl2 (Calciumchlorid) Sigma-Aldrich, Steinheim
CellTracker Green CMFDA, Gibco® Invitrogen GmbH, Oregon, USA CellTracker Red CMTPX, Gibco® Invitrogen GmbH, Oregon, USA
Chloroform J.T.Baker, Deventer, Niederlande
Coomassie Brilliant Blue G250 SERVA, Heidelberg DMSO (Dimethylsulfoxid) Sigma-Aldrich, Steinheim DTT (1,4-Dithiothreitol) Roth, Karlsruhe
DEPC (Diethylpyrocarbonat) AppliChem, Darmstadt EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure,
Dinatriumsalz)
Sigma-Aldrich, Steinheim EGTA (Ethylen
Glycol-bis(ß-Aminoethylether-N,N`,N`-Tetraessigsäure)
Sigma-Aldrich, Steinheim
Essigsäure, 100% Roth, Karlsruhe
Ethanol, 99% Th. Geyer GmbH &CoKG, Renningen
Ethidiumbromid Sigma-Aldrich, Steinheim
Fetales Kälberserum (FKS, hitzeinaktiviert) Invitrogen/Gibco, Eggenstein
Formamid Merck, Darmstadt
Forskolin AppliChem, Darmstadt
FastStartUniversal SYBR Green Master (Rox) Roche Diagnostics, Mannheim
Gelatine Sigma-Aldrich, Steinheim
Giemsas Azur-Eosin-Methylenblaulösung Merck, Darmstadt
Glycerol Merck, Darmstadt
Glycin Roth, Karlsruhe
Guanidiniumisothiocyanatlösung mit Phenol ABgene, Cambridge, England ß-Glycerolphosphat Sigma-Aldrich, Steinheim
HPLC- Wasser J.T. Baker, Deventer, Niederlande
Isopropanol Merck, Darmstadt
Kaliumhydrogenphosphat (KH2PO4) Merck, Darmstadt
Kaliumchlorid (KCl) Roth, Karlsruhe
Leupeptin SERVA, Heidelberg
Lipofectamine 2000 Invitrogen GmbH, Deutschland
Luminol Sigma-Aldrich, Steinheim
Matrigel, Phenolrot- frei BD Biosciences, Bedford, MA, USA
Milchpulver, fettfrei Marvel, UK
ß-Mercaptoethanol, Calbiochem® Merck, Darmstadt
Methanol J.T. Baker, Deventer, Niederlande
Natriumhydrogencarbonat (NaHCO3) Merck, Darmstadt
Natriumchlorid (NaCl) J.T. Baker, Deventer, Niederlande
Natriumcarbonat (Na2CO3) Merck, Darmstadt
Dinatriumhydrogenphosphat (Na2HPO4) Merck, Darmstadt Natriumfluorid (NaF) Sigma-Aldrich, Steinheim Natriumvanadat (NaV) Sigma-Aldrich, Steinheim
Nonidet P-40 Sigma-Aldrich, Steinheim
p-Cumarsäure Sigma-Aldrich, Steinheim
Penicillin/Streptomycin (10.000 U/ml / 10.000 µg/ml)
Biochrom, Berlin
Ponceau S Sigma-Aldrich, Steinheim
Phenylmethansulphanylfluorid (PMSF) SERVA, Heidelberg
„PIERCE” –Super Signal West Dura Extended Pierce/ Perbio Sciences, USA Precision Plus ProteinTM Standards, All Blue Bio-Rad, München
Protein Assay Dye Reagent Concentrate Bio-Rad, München Rekombinantes humanes MMP-2, Western
Blotting Standard
R&D Systems, Wiesbaden Rekombinantes humanes MMP-9, Western
Blotting Standard
R&D Systems, Wiesbaden
Rotiphorese Gel 40 (37, 5:1) Roth, Karlsruhe
RPMI (Roswell Park Memorial Institute medium) 1640 1x (+) L-Glutamin
Invitrogen/Gibco, Eggenstein Salzsäure (HCl) J.T. Baker, Deventer, Niederlande SDS (Sodium Dodecyl Sulphate) Roth, Karlsruhe
Single Quot Kit CC-4176, EGM-2 Lonza, USA TEMED
(N,N,N´,N´-Tetramethylethylendiamin)
Roth, Karlsruhe
Total RNA Isolation Reagent (TRIR) Thermo Fisher Scientific, UK
Tris(hydroxymethyl)aminomethan Merck, Darmstadt
Tris-HCl Merck, Darmstadt
Triton X-100 Sigma-Aldrich, Steinheim
Trypan blue Solution 0,4% Sigma-Aldrich, Steinheim Trypsin-EDTA 0,5% Invitrogen/Gibco, Eggenstein
Tween 20 (for electrophoresis) Sigma-Aldrich, Steinheim
Uvasol Merck, Darmstadt
Wasserstoffperoxid, 30% reinst Omnilab-Laborzentrum GmbH & Co.
KG, Gehrden, Hannover
Xylencyanol FF Sigma-Aldrich, Steinheim