Die Proliferation der Trophoblasten und Endothelzellen unter verschiedenen Bedingungen wurde mit Hilfe der Neubauer-Zählkammer bestimmt. Dafür wurden 3 x 104 Zellen in 24-Well Zellkulturplatten ausgesät und mit dem A2BAR Agonisten (NECA, 10 µM und 1 U/ml Adenosin-Desaminase (ADA)), dem A2BAR Antagonisten (MRS 1754, 1 µM + 1 U/ml ADA), oder dem Agonisten-Antagonisten-Gemisch (NECA, 10 µM + 1 µM MRS 1754 + 1 U/ml ADA) bei 2% O2, 8% O2 und Standardkulturbedingungen (21% O2) inkubiert. Als Kontrolle dienten unbehandelte Zellen. Die Zellen wurden 24 h, 48 h und 72 h nach der Behandlung mit einer Neubauer-Zählkammer in Trypanblau bei einer 1:2 Verdünnung ausgezählt. Die Zellvitalität wurde mittels Lichtmikroskop überprüft. Die Gesamtanzahl der Zellen berechnete sich nach folgender Formel:
4.2.2 Migrations-Assay
Der Migrations-Assay oder „Scratch–wound healing assay“ ist ein in vitro Experiment, das die Untersuchung des Migrationsverhaltens verschiedener Zellen und Kulturbedingungen nach dem Setzen einer artifiziellen Wunde ermöglicht [169]. Dafür wurden 3 x 104 – 6 x 104 Zellen in rückseitig markierten 12-Well Platten (s.h. Abbildung. 9) ausgesät und bis zur Konfluenz kultiviert. Am Versuchstag wurden die Zellen 4 h mit serumreduziertem Medium (0,2% FKS, 1U/ml ADA) vorbehandelt. Danach wurde mit einer sterilen 1000 µl Pipettenspitze entlang der vertikalen Linien im Zellrasen jedes Wells eine „Wunde“ gesetzt (Abbildung 9). Die Zellen wurden anschließend mit 1 ml PBS gewaschen und mit den entsprechenden Versuchslösungen (Tabelle. 3) behandelt. Für die Bestimmung einer dosisabhängigen Wirkung von Adenosin erfolgte die Behandlung zunächst mit 1; 10 bzw. 100 µM Adenosin. Im Weiteren wurden Versuche mit dem A2BAR Agonisten (NECA, 10 µM + 1 U/ml ADA), dem Antagonisten (MRS 1754, 1 µM + 1 U/ml ADA) und dem
Agonisten-Antagonisten-Gemisch (10 µM NECA + 1 µM MRS 1754 + 1 U/ml ADA) durchgeführt. Als Kontrolle dienten unbehandelte Zellen. Nach dem „Scratch“ wurde jedes Well im Phasenkontrastmikroskop bei einer 2,5 facher Vergrößerung fotografiert (T0) und für 22 h bei 2% O2, 8% O2 und 21% O2 inkubiert. Nach der Inkubation wurde der Überstand abgenommen und bei -80°C eingefroren (für β-HCG und Lactatdehydrogenase Konzentrationsbestimmung). Jedes Well wurde mit PBS gewaschen und mit 1 ml 4% PFA für 1 h bei Raumtemperatur (RT) inkubiert. Danach wurden die Zellen erneut mit 1 ml PBS gewaschen und mit 2 ml Mounting Medium fixiert. Anschließend wurden die Wells erneut fotografiert (T22). Zur Bestimmung der Migrationsfähigkeit wurden zunächst die zellfreien Flächen zu Beginn (T0) und am Ende des Experimentes (T22) mit der Bildbearbeitungssoftware ImageJ Software nachgezeichnet und die Flächenwerte berechnet.
Die quantitative Auswertung erfolgte dann mit Hilfe der folgenden Formel:
Abbildung 9: Well mit Markierung und „Wunde“
4.2.3 Invasions-Assay (Monokultur)
Matrigel ist ein löslicher Extrakt, das aus dem Tumor des Engelbreth-Holm-Swarm-Maussarkoms hergestellt wird. Matrigel besteht aus Proteinen, die in der Basalmembran vorkommen. Die wichtigsten Bestandteile sind Kollagen IV, Laminin, Heparansulfatproteoglykan, Entaktin und Nidogen. Matrigel enthält auch wichtige Wachstumsfaktoren wie Fibroblasten-Wachstumsfaktor, TGF-beta, Insulin like Growth Factor (IGF) und Gewebe-Plasminogenaktivator [170].
Zur Bestimmung der Invasivität von Trophoblasten wurden 100 µl einer Mixtur, die der komplexen Extrazellularmatrix ähnelt (Matrigel), nach einer 1:10 Verdünnung in serumfreiem Medium, in die Einsätze pipettiert und diese in die 24-Well Platten gesetzt. Diese Zellkulturplatten wurden dann bei 37°C über Nacht gelagert. Am nächsten Tag wurden 5 x 104 Trophoblasten (in serumfreiem Medium) in die Wells gegeben und mit 750 µl Behandlungsmedium (A2BAR Agonist [NECA, 10 µM + 1 U/ml ADA], Antagonist [MRS 1764, 1 µM + 1 U/ml ADA] und Agonist-Antagonist Gemisch [10 µM NECA + 1 µM MRS + 1 U/ml ADA] benetzt und für 48 h bei 2% O2, 8% O2 und 21% O2 inkubiert. Nach der Inkubation wurde das Medium mit einer Pipette abgesaugt und die Wells zwei Mal mit PBS
gewaschen. Die Zellen wurden mit Formaldehyd (3,7% in PBS) bei RT für 2 min fixiert, mit 100% Methanol permeabilisiert und 20 min bei RT inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Zellen erneut zwei Mal mit PBS gewaschen und mit Giemsa gefärbt. Die Platte wurde mit Aluminiumfolie abgedeckt und 20 min bei RT inkubiert. Danach wurden die Zellen nochmals mit PBS gewaschen und alle nicht invadierten Zellen von der Innenseite des Netwell-Einsatzes mit Wattestäbchen abgekratzt. Die invadierten Zellen wurden lichtmikroskopisch bei 100 facher Vergrößerung gezählt.
4.2.4 In vitro Angiogenese Assay
Für den Angiogenese Assay wurde Matrigel verwendet, da Zellen auf diesem Substrat kapillarähnliche, netzartige Strukturen bilden.
Nach Aussaat von 1 x 105 Endothelzellen in eine 12-Well Platte wurden diese bis zu 80%
Konfluenz kultiviert. Die Zellen wurden mit dem A2BAR Agonisten (NECA, 10 µM + 1 U/ml ADA), Antagonisten (MRS 1754, 1 µM + 1 U/ml ADA) oder dem Agonisten-Antagonisten Gemisch (10 µM NECA + 1 µM MRS 1754 + 1 U/ml ADA) in EBM Medium (ohne Wachstumsfaktoren, 100 U/ml P/S, 0,1% FKS) inkubiert. Matrigel wurde vor der Verwendung über Nacht bei 4 °C auf Eis aufgetaut. Am Versuchstag wurden 30 µl Matrigel pro Well in einer 96-Well Platte vorgelegt, 10 min unter der Sterilbank und 40 min im Inkubator bei 37 °C inkubiert. Nach 24 h Vorbehandlung wurden die Endothelzellen mit PBS gewaschen und trypsiniert. 8 x 103 Zellen wurden in 150 µl Behandlungsmedium aufgenommen und auf Matrigel beschichtete Wells gegeben und bei 2% O2, 8% O2 und 21%
O2 inkubiert. Die Bildung der kapillarähnlichen Strukturen wurde mikroskopisch beurteilt und nach 6 h fotografiert. Die Bestimmung der in vitro Angiogenesekapazität erfolgte durch Ausmessen der Gesamttubuli-Länge mittels Image J Software.
4.2.5 Invasions-Assay (Ko-Kultur)
Die Invasion von Trophoblasten wurde außerdem in einem Ko-Kultur-Assay mit humanen uterinen mikrovaskulären Endothelzellen (HUtMVEC) untersucht [171]. Dafür wurden 2 x 105 Endothelzellen in gelatinierte (0,2% Gelatine) rückseitig markierte und in vier Abschnitte geteilte 6-Well-Platten ausgesät. Am Versuchstag wurden die konfluenten Endothelzellen mit grünem Cell Tracker (CellTracker Green CMFDA) markiert. Dazu wurden 50 µg Cell Tracker in 10 µl DMSO gelöst und mit 30 ml EGM-Medium gemischt. Anschließend wurden 0,8 ml Cell Tracker-Medium Gemisch in jedes Well vorgelegt und 30 min bei 37°C inkubiert.
Danach wurden das Medium abgesaugt und 1 ml frisches EGM-Medium zugefügt, für 30 min
inkubiert, und nach dem Absaugen die Endothelzellen mit dem Versuchsmedium (A2BAR Agonist [NECA, 10 µM], - Antagonist [MRS 1754, 1 µM], Agonist-Antagonist Gemisch [10 µM NECA + 1 µM MRS + 1 U/ml ADA]) behandelt. Die Trophoblastenzellen wurden in der Zwischenzeit mit rotem Cell Tracker (CellTracker Red CMTPX) markiert. Hierfür wurden 50 µg Cell Tracker in 10 µl DMSO gelöst und mit 5 ml RPMI Medium gemischt. Nach 30 min Inkubation und Waschen mit 10 ml frischem Medium wurden die markierten Trophoblasten trypsiniert und das Zellpellet in 1 ml „Happy Medium“ resuspendiert. Pro Well wurden 4 x 105 Trophoblasten zu den Endothelzellen gegeben und für 48 h bei 2% O2, 8% O2 und 21%
O2 bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden die Zellen mit PBS gewaschen, mit 4% PFA fixiert und mit Mounting Medium bedeckt. Die Auswertung des Experimentes erfolgte nach Anfertigen von jeweils 4 Fotos pro Well bei 2,5 facher Vergrößerung am Fluoreszenzmikroskop, wobei nach Anfertigung von Phasenkontrastaufnahmen die grün markierten Endothelzellen im FITC 488 Kanal und die rot markierten Trophoblasten im Alexa 456 Kanal aufgenommen wurden. Mit Hilfe der Leica Application Suite V3 wurden die durch Trophoblasten bedeckten Flächen bestimmt und als Anteil der Gesamtfläche angegeben.
4.3 Molekularbiologische Methoden