6.9 Molekulare Mechanismen als Folge einer A 2B AR Aktivierung in Trophoblasten und Endothelzellen
6.9.3 Die Beteilung des MAPK-Signalweges an A 2B AR-vermittelten Zellprozessen
Es ist bekannt, dass G-Protein-gekoppelte-Rezeptoren die Mitogen-aktivierten – Proteinkinasen (MAPK), wie Extrazellulär-Signal-regulierte Kinasen (ERK), c-Jun N-terminale Kinasen (JNK)/ Stress-aktivierte Proteinkinasen (SAPK) und p38 aktivieren [78].
Die MAPK sind an der Regulation zellulärer Prozesse, wie dem Zellwachstum, der -differenzierung und dem Überleben von Zellen beteiligt [225].
In der vorliegenden Arbeit wurde die Aktivierung dieser Signalkaskaden nach der Stimulation oder Hemmung des A2BAR untersucht. Die Inkubation mit NECA führte zu einer verminderten ERK1/2-Phosphorylierung in Trophoblasten bei allen drei O2-Konzentrationen.
Diese Ergebnisse waren zunächst unerwartet, da wir eine positive Wirkung der A2BAR Aktivierung auf die ERK1/2-Phosphorylierung vermuteten. In den Untersuchungen der Endothelzellen zeigte sich, dass der A2BAR Agonist keinen Effekt auf die Phophorylierung von ERK1/2 bei allen drei Sauerstoffkonzentrationen hatte. Im Gegensatz dazu berichten andere Studien, dass die A2BAR Aktivierung die Phosphorylierung von ERK1/2 in Ovarialzellen des Chinesischen Hamsters [136], humanen Mastzellen (HMC-1) [149], humanen embryonalen Nierenzellen (HEK-293) [137], cornealen Zellen und HUVEC [225]
stimuliert. In einer weiteren Untersuchung konnte gezeigt werden, dass invasive
Trophoblasten von Patientinnen mit Präeklampsie im Vergleich zu gesunden Schwangeren eine verminderte ERK1/2–Phosphorylierung zeigen [226].
Die Untersuchung des SAPK/JNK Signalweges zeigte, dass die Behandlung mit NECA auch hier zu einer verminderten Phosphorylierung von SAPK/JNK in Trophoblasten bei allen drei Sauerstoffbedingungen führte. Die Antagonisierung hatte keinen Effekt auf die Phosphorylierung von SAPK/JNK. Der A2BAR Antagonist hob den Effekt des Agonisten auf, so dass eine spezifische Rolle des A2B Rezeptors angenommen werden kann. Ebenfalls konnten wir bei der Aktivierung des Rezeptors eine verringerte Phosphorylierung von p38 bei 2% O2 beobachten. Im Gegensatz zu den in dieser Arbeit gefundenen Ergebnissen haben Feokistov et.al. gezeigt, dass der A2BAR Agonist (NECA) die Phosphorylierung bzw.
Aktivierung von p38 und JNK in humanen Mastzellen (HMC-1) induziert [149]. In Skelettmuskelzellen von Ratten hingegen regulierte eine A2BAR Aktivierung die cAMP–
Produktion und führte zur Aktivierung von CREB, hatte aber keinen Effekt auf die ERK1/2 und p38–Phosphorylierung [224].
Unsere Ergebnisse stehen zum Teil im Widerspruch zu anderen Studien. Da es aber bisher keine Erkenntnisse zur Rolle des A2BAR in humanen Trophoblasten gibt, können wir unsere Ergebnisse lediglich mit den Untersuchungen, die an anderen Zelltypen durchgeführt wurden, vergleichen. Möglicherweise sind die Effekte, die wir sehen, lediglich für Trophoblasten spezifisch. Weitere Untersuchungen werden helfen, die molekularen Mechanismen, die durch den A2BAR in Trophoblasten vermittelt werden, besser zu verstehen.
Vor 10 Jahren wurden mit den Epac-Proteinen (Epac1 und Epac2, Exchange Protein Activated by cAMP) neue Rap-spezifische Guaninnukleotid-Austauschfaktoren identifiziert.
Epac1/2 werden direkt durch cAMP, unabhängig von der Proteinkinase A (PKA) aktiviert [227]. Epac-Proteine sind weitere wichtige Regulatoren zellulärer Prozesse, wie der Proliferation, der Differenzierung, der Migration, und der Apoptose [227]. Rap1 und Rap2 (Ras-related protein 1 and 2) gehören zu der Ras-Superfamilie und können durch Epac1/2 aktiviert werden. Durch Rap1/2 kommt es zu einer Phospholipase C (PLC)-Aktivierung und dies führt wiederum zur Inositol-1,4,5-triphosphat (IP3)-Bildung. Anschließend kommt es zum Anstieg der intrazellulären Ca2+-Konzentration und zur ERK1/2-Aktivierung [227]. In Abbildung 36 sind zusammenfassend mögliche Signalwege die durch eine A2BAR Aktivierung in Trophoblasten stimuliert werden, beispielhaft dargestellt.
Abbildung 36: Mögliche Signalkaskaden der A2BAR Aktivierung in Trophoblastenzellen 1. Der cAMP/CREB–Signalweg, der durch den A2BAR möglicherweise aktiviert wird, führt zur Steigerung der Proliferation von Trophoblasten. In dieser Arbeit wurden eine cAMP-Erhöhung und eine spezifische CREB-Phosphorylierung nach A2BAR Stimulation belegt, dies ging einher mit einer Erhöhung der Zellzahl. 2. A2BAR Aktivierung verringert die Migration wahrscheinlich über einen bisher unbekannten Zwischenschritt durch verminderte ERK1/2, SAPK/JNK und p38 Aktivierung. Die Phosphorylierungen von ERK1/2, SAPK/JNK und p38 waren in dieser Arbeit bei Trophoblasten reduziert, ebenso die Aktivität von MMP-2, die Menge von VEGFA und die Menge sezernierten β-hCG. 3,4. Mögliche weitere Signalwege zur Induktion der MAP-Kinasen über cAMP/ EPAC 1/2 (3) oder über PLC/IP3 oder PLC/DAG (4).
Zusammengefasst konnten in dieser Arbeit die folgenden neuen Erkenntnisse über die Regulation von HTR-8/SVneo (als Modell für Trophoblasten) und von HUtMVEC (als Modell für uterine Endothelzellen des Myometriums) durch Adenosin und/oder NECA, einen weiteren Agonisten des A2B Rezeptors, gewonnen werden. Adenosin (100 µM) und NECA reduzierten die Migration und β-hCG Sekretion von Trophoblasten bei 2% O2, 8% O2 und 21% O2. Der A2BAR Agonist verminderte die Phosphorylierung der Mitogen-aktivierten Proteinkinasen ERK1/2, SAPK/JNK und p38. Außerdem reduzierte NECA die MMP-2 und MMP-9 mRNA Level sowie die proMMP-2 Enzymaktivität in Trophoblasten. Der A2BAR ist möglicherweise in Prozesse der Angiogenese involviert, da NECA die VEGF Transkriptmenge bei Hypoxie verminderte. Andererseits erhöhte der A2BAR Agonist neben der cAMP-Konzentration, die Proliferation als auch die Invasion von Trophoblasten in einen Endothelzellmonolayer. Es wurde ebenfalls gezeigt, dass NECA die Phosphorylierung des
„cAMP response binding protein“ (CREB) aktiviert. Effekte von Hypoxie wurden nur bei bei dem Invasions Assay nachgewiesen.
In HUtMVEC Endothelzellen zeigten sich deutlich weniger Effekte des A2BAR auf funktionelle Zelleigenschaften. Im Gegensatz zu Trophoblasten kam es zwar zu einer Steigerung der Zellzahl nach A2BAR Aktivierung, jedoch fand sich kein Einfluss auf die Migration und Phosphorylierung von ERK1/2.
7 Ausblick
Die im Rahmen dieser Arbeit gewonnenen Erkenntnisse sollen einen ersten Einblick in die Rolle des A2BAR in der plazentaren Entwicklung geben. Vielfache experimentelle Evidenz spricht nun dafür, dass der A2BAR in die Proliferation, Migration und Invasion von Trophoblasten involviert sein kann. Die Spezifität der in diesen Untersuchungen gezeigten Aktivierung der CREB und MAPK (ERK 1/2, SAPK/JNK und p38) Signalwege in Abhängigkeit vom A2BAR und die Involvierung dieser Signalwege in die erwähnten funktionellen Prozesse müssen in Zukunft durch selektive Inhibitoren oder Knockdown mittels siRNA weiter analysiert werden. Im Falle der verringerten Migration durch verminderte Phosphorylierung der MAP-Kinasen würde die Aktivierung von EPAC1/2 und Rap1/2 Proteinen weitere Einblicke in A2BAR vemittelte Signalkaskaden in Trophoblasten geben.
Es ist ebenfalls denkbar, dass neben dem A2BAR noch andere Adenosinrezeptoren, wie der A1-, A2A- und A3- AR Rezeptor an den plazentaren Entwicklungsprozessen beteiligt sind.
Diese Rezeptoren werden ebenfalls in der humanen Plazenta von verschiedenen Zellen exprimiert, wobei eine höhere Expression von Adenosinrezeptoren in Plazenten präeklamptischer Schwangerschaften im Vergleich zu normalen Schwangerschaften nachgewiesen wurde [109]. Die Untersuchungen in Zellkulturmodellen können zunächst weitere Erkenntnisse bei plazentaren Prozessen verschaffen, wobei die gewonnenen Erkenntnisse durch den Einsatz von primären Zytotrophoblasten und mit Hilfe von in vivo Modellen bestätigt werden sollten.
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