Analysen zur Rolle der Ubiquitin-spezifischen Protease 7 im Verlauf der produktiven Infektion mit dem Adenovirus Typ 5

Tag der Disputation:

17.11.2017

Gutachter:

Prof. Dr. Thomas Dobner

Prof. Dr. Nicole Fischer

Prüfungsvorsitzende:

Prof. Dr. Julia Kehr

Analysen zur Rolle der Ubiquitin-spezifischen

Protease 7 im Verlauf der produktiven Infektion mit

dem Adenovirus Typ 5

Dissertation

zur Erlangung des akademischen Grades

eines Doktors der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.)

an der Fakultät für Mathematik, Informatik und Naturwissenschaften

Fachbereich Biologie

der Universität Hamburg

vorgelegt von

Jana Kondrajew

1

Inhaltsverzeichnis

2.1.2 Pathogenität und Behandlung ... 10

2.1.3 Struktur und Genomorganisation ... 12

2.1.4 Infektionszyklus ... 15

2.2 Adenovirales DNA-Bindeprotein (DBP) ... 18

2.3 Funktionen posttranslationaler Modifikationen und zellulärer Proteine während des adenoviralen Infektionsverlaufs ... 22

2.3.1 Ubiquitinierung von Proteinen ... 22

2.3.2 Ubiquitin-spezifische Protease 7 (USP7) ... 25

3 Material ... 30 3.1 Zellen ... 30 3.1.1 Bakterienstämme ... 30 3.1.2 Säugerzelllinien ... 30 3.2 Adenoviren ... 31 3.3 Nukleinsäuren ... 31 3.3.1 Oligonukleotide ... 32 3.3.2 Expressionsvektoren ... 34

3.3.3 Rekombinante Plasmide & Bacmide ... 35

3.4 Antikörper ... 37

3.4.1 Primärantikörper ... 37

2

3.5 Größen- und Molekulargewichtstandards ... 39

3.6 Kommerzielle Systeme ... 39

3.7 Chemikalien, Enzyme, Reagenzien und Zubehör ... 39

3.8 Software, Datenbanken ... 40

4 Methoden ... 41

4.1 Bakterien ... 41

4.1.1 Kultivierung und Lagerung von E. coli-Bakterien ... 41

4.1.2 Transformation von E. coli-Bakterien ... 42

4.2 Säugerzellen ... 42

4.2.1 Kultivieren und Passagieren von Säugerzellen ... 42

4.2.2 Lagerung von Säugerzellen ... 43

4.2.3 Bestimmung der Zellzahl ... 43

4.2.4 Transfektion von Säugerzellen ... 44

4.2.5 Ernte von Säugerzellen ... 45

4.3 Adenoviren ... 45

4.3.1 Herstellung von Viruspartikeln aus DNA ... 45

4.3.2 Herstellung und Lagerung hochtitriger Virusbestände ... 46

4.3.3 Titerbestimmung von Virusbeständen ... 46

4.3.4 Infektion von Säugerzellen mit Adenoviren ... 47

4.3.5 Bestimmung von Virusnachkommen ... 48

4.4 DNA-Techniken ... 48

4.4.1 Präparation von Plasmid-DNA aus E. coli ... 48

4.4.2 Isolierung viraler DNA aus Virusbeständen und Zellpellets ... 49

4.4.3 Konzentrationsbestimmung von DNA ... 49

4.4.4 Agarose-Gelelektrophorese ... 50

4.4.5 Extraktion von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen ... 51

4.4.6 Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) ... 51

3

4.5 Protein-Techniken ... 55

4.5.1 Herstellung von Zelllysaten aus Säugerzellen ... 55

4.5.2 Quantitative Bestimmung der Proteinkonzentration ... 56

4.5.3 Nachweis von Protein-Protein Interaktionen mittels Immunpräzipitation ... 56

4.5.4 In-situ Ubiquitinierungs-Assay ... 57

4.5.5 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)... 59

4.5.6 Immundetektion mittels Western Blot ... 60

4.5.7 Nachweis von ProteinProtein Interaktionen mittels GSTTagKopplung und -Anreicherung ... 61

4.5.8 Immunfluoreszenz-Analyse... 62

5 Ergebnisse ... 64

5.1 Interaktions- und Lokalisationsanalysen zu DBP und USP7 ... 64

5.1.1 DBP und USP7 kolokalisieren in adenoviralen Replikationszentren ... 65

5.1.2 DBP interagiert mit der Deubiquitinase USP7 ... 66

5.1.3 DBP-S76A ist eine USP7-Bindemutante ... 73

5.1.4 Untersuchungen zur Ubiquitinierung von DBP ... 80

5.2 Herstellung von HAdV5-DBP-Mutanten ... 89

5.3 Charakterisierung der Virusmutanten H5pm4250 (UBM2) und H5pm4251 (UBM5) ………. 91

5.3.1 Untersuchung der Interaktion und Lokalisation von USP7 und DBP ... 91

5.3.2 H5pm4250 (UBM2) zeigt eine verstärkte und H5pm4251 (UBM5) eine defekte virale DNA-Replikation ... 102

5.3.3 H5pm4251 (UBM5) zeigt starke Defekte in der Expression später viraler Proteine ……… 106

5.3.4 H5pm4250 (UBM2) zeigt eine verstärkte und H5pm4251 (UBM5) eine defekte Virusnachkommen-Produktion ... 112

5.3.5 Ubiquitinierung von DBP-S354A während der Infektion mit H5pm4251 (UBM5) ……… 113

4

6.1 Identifikation von DBP als Interaktionspartner von USP7 ... 116

6.2 Charakterisierung der DBP-Virusmutanten ... 122

6.2.1 Virusmutante H5pm4250 (UBM2) ... 122

6.2.2 Virusmutante H5pm4251 (UBM5) ... 126

7 Literaturverzeichnis ... 136

8 Veröffentlichungen ... 158

9 Eidesstattliche Erklärung ... 159

10 Erläuterung zur Übersetzung ... 159

5

Abkürzungsverzeichnis

BSA Rinderserumalbumin (bovine serum albumin) C-Terminus Carboxy-Terminus

CMV Cytomegalovirus

Ct Cycle threshold

DABCO 1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octan

DAPI 4´, 6´-Diamidin-2-phenylindol Dihydrochlorid Daxx death domain-associated protein

DBP DNA-Bindeprotein (DNA binding protein) DMEM Dulbecco’s modified Eagle medium

DMSO Dimethylsulfoxid

DNA Desoxyribonukleinsäure (desoxyribonucleic acid) dNTP Desoxyribonukleosid-5-Triphosphate

ds doppelsträngig (double-stranded)

DUB Deubiquitinasen

DTT Dithiothreithol

E1, E2, E3, E4 frühe Region 1, 2, 3, 4 vom Adenovirus (early region) EBNA1 Epstein-Barr nuclear antigen 1

EBV Epstein-Barr-Virus

E. coli Escherichia coli

EDTA Ethylendiamintetraazetat

et al. et alii/aliae/alia

EtOH Ethanol

FITC Fluorescein-isothiocyanat

FFU Fluoreszenz-bildende Einheiten (fluorescence forming units)

FKS fötales Kälberserum

fwd forward

g gravitational force

GSH Glutathion

GST Glutathion-S-Transferase HAdV5 Humanes Adenovirus Typ 5

HEK human embryonic kidney

HIV Humanes Immundefizienz-Virus

h p.i. Stunden nach Infektion (hours post infection) h p.t. Stunden nach Transfektion (hours post transfection) HRP Meerrettich-Peroxidase (horseradish peroxidase)

HSV Herpes Simplex Virus

6

Ig Immunglobulin

IgH schwere Antikörperkette IgL leichte Antikörperkette

kb Kilobase

kDa Kilodalton

L1, 2, 3, 4 Späte Region 1, 2, 3, 4 (late region) LANA latency-associated nuclear antigen

LB Luria Bertani

MDM2 mouse double minute 2

MOI Multiplizität der Infektion (multiplicity of infection) Mre11 meiotic recombination 11

mRNA messenger RNA

nt Nukleotid

N-Terminus Amino-Terminus

OD optische Dichte

orf offener Leserahmen (open reading frame) PAGE Polyacrylamid-Gelelektrophorese

PBS Phosphat-gepufferte Salzlösung (phosphate buffered saline) PCR Polymerase-Ketten-Reaktion

PEI Polyethylenimin

PFA Paraformaldehyd

PML Protein der promyelozytischen Leukämie PML-NB PML nuclear body

PMSF Phenylmethylsulfonylfluorid

Pol Polymerase

pTP terminales Vorläuferprotein (precursor terminal protein) qPCR quantitative Polymerase-Ketten-Reaktion

Rad DNA repair protein

rev reverse

RIPA Radio-Immunpräzipitations-Puffer RNA Ribonukleinsäure (ribonucleic acid)

rpm Umdrehungen pro Minute (rotations per minute)

RT Raumtemperatur

ss einzelsträngig (single-stranded)

SDS Natriumdodecylsulfat (sodium dodecyl sulfate) SUMO small ubiquitin-related modifier

Taq Thermus aquaticus

TBS Tris-gepufferte Saline (tris buffered saline) TEMED N, N, N`, N`-Tetramethylethylendiamin

TRAF tumor necrosis factor receptor (TNFR)-associated factor

Tris Tris(hydroxymethyl)-aminomethan

U unit (Aktivitätseinheit von Enzymen)

Ub Ubiquitin

UBD Ubiquitin-Bindedomäne

USP7 Ubiquitin-spezifische Protease 7

v/v Volumenanteil pro Gesamtvolumen (volume per volume)

Vol. Volumeneinheit

w/v Gewichtsanteil pro Gesamtvolumen (weight per volume)

7

1 Zusammenfassung

Die Ubiquitin-spezifische Protease 7 (USP7) gehört zu der großen Gruppe der Deubiquitinasen (DUB), die Ubiquitin von ihren Substraten abspalten. USP7 spielt eine wichtige Rolle in vielen zellulären Prozessen wie der Zellteilung, Apoptose, Tumorgenese und epigenetischen Regulation. Außerdem ist bekannt, dass USP7 eine wichtige provirale Rolle im Infektionsverlauf des humanen Immundefizienz-Virus (HIV-1) sowie der Herpesviren Epstein-Barr-Virus (EBV), Kaposi-Sarkom-Herpesvirus (KSHV), Herpes Simplex-Virus Typ 1 (HSV-1) und Cytomegalovirus (CMV) einnimmt.

Kürzlich wurde gezeigt, dass USP7 auch eine provirale Funktion im Infektionsverlauf von Adenoviren hat und mit dem viralen Protein E1B-55K interagiert. Eine Inhibition oder ein

knock-down von USP7 führt zu verringerten E1B-55K Protein-Gleichgewichtsmengen und

einer stark reduzierten adenoviralen Replikation. Weiterhin wurde beobachtet, dass USP7 während der Infektion in nukleäre, adenovirale Replikationszentren relokalisiert wird. Die Umverteilung von USP7 erfolgte allerdings unabhängig von E1B-55K, da diese auch nach Infektion mit E1B-55K-defizienten Viren beobachtet wurde. Ob diese Umverteilung von der Zelle als antivirale Abwehr initiiert oder vom Virus zum Nutzen oder zur Inhibition der USP7-Funktionen eingeleitet wird, wurde bisher nicht geklärt. Das adenovirale DNA-Bindeprotein (DBP) ist ein wesentlicher Bestandteil der genannten viralen Replikationszentren, da es eine wichtige Rolle bei der viralen DNA-Replikation spielt. Daher stellte sich die Frage, ob USP7 seine provirale Funktion im adenoviralen Infektionszyklus durch eine Interaktion mit DBP ausübt. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob die Kolokalisation von DBP und USP7 eine Interaktion der beiden Proteine voraussetzt und welche Auswirkungen diese Interaktion und virusinduzierte Umverteilung von USP7 auf den Infektionszyklus hat.

Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass USP7 ein Interaktionspartner von DBP ist. Weiterhin wurde zur näheren Charakterisierung der Interaktion gezeigt, dass die TRAF-like Domäne von USP7 die Binderegion für DBP enthält und die Aminosäuresequenz „PSTS“ in der N-terminalen Domäne von DBP das Bindemotiv für USP7 ist. Um die Fragestellung bezüglich der USP7-Umverteilung weiter zu untersuchen, wurden die Virusmutanten H5pm4250 (UBM2) und H5pm4251 (UBM5) mit jeweils einem AS-Austausch in einem putativen USP7-Bindemotiv von DBP (DBP-S76A; DBP-S354A) generiert. Neben einer

8 fehlenden Bindung von USP7 durch DBP-S76A konnte bei der Virusmutante H5pm4250 (UBM2) keine Umverteilung von USP7 in frühe Replikationszentren beobachtet werden.

Diese Virusmutante zeigte eine leicht verstärkte virale DNA-Synthese und Virusnachkommen-Produktion im Vergleich zum WT-Virus. Jedoch waren die Gleichgewichtsmengen viraler und zellulärer Proteine nach Infektion mit H5pm4250 (UBM2) vergleichbar zu denen des WT-Virus.

Das DBP-S354A der Virusmutante H5pm4251 (UBM5) bindet USP7 weiterhin, zeigte jedoch verringerte Gleichgewichtsmengen des viralen Proteins. Daher wurden Analysen zur Ubiquitinierung der DBP-Varianten durchgeführt, die zeigten, dass DBP-S354A in Transfektionsexperimenten stärker ubiquitiniert wird als DBP-WT und DBP-S76A. In Infektionsexperimenten konnte sogar lediglich bei DBP-S354A der Virusmutante H5pm4251 (UBM5) eine Ubiquitinierung detektiert werden. In Immunfluoreszenz-Analysen wurde weiterhin beobachtet, dass diese Virusmutante keine Replikationszentren mehr ausbildet und sowohl DBP-S354A als auch USP7 im gesamten Infektionsverlauf diffus im Nukleus lokalisieren. Übereinstimmend dazu wurde ein Defekt in der Synthese viraler DNA und später viraler Proteine bei dieser Virusmutante detektiert. Aufgrund dessen ist bei der Virusmutante H5pm4251 (UBM5) auch keine Produktion von Virusnachkommen nachweisbar.

Zusammengefasst zeigt diese Arbeit, dass USP7 nach einer adenoviralen Infektion durch Bindung an das AS-Motiv „PSTS“ von DBP in die Replikationszentren rekrutiert wird. Weiterhin hat der AS-Austausch im DBP-S354A der Virusmutante H5pm4251 (UBM5) gravierende Auswirkungen auf mehrere Prozesse des Infektionszyklus. Diese Beobachtungen sind für die Herstellung potentieller Medikamente in Form von Inhibitoren interessant. Da es bisher keine Adenovirus-spezifischen Therapeutika gibt, würde ein passender DBP-Inhibitor erstmalig die Möglichkeit bieten therapeutisch gegen eine adenovirale Infektion zu intervenieren.

9

2 Einleitung

2.1 Adenoviren

2.1.1 Klassifizierung

Adenoviren (Ad) wurden 1953 von Wallace Rowe in adenoidem Gewebe, welches einen zytopathischen Effekt zeigte, entdeckt und erstmals isoliert (Rowe et al., 1953). 1954 entdeckte Maurice Hilleman, dass Adenoviren eine akute, respiratorische Erkrankung (acute

respiratory disease; ARD) hervorrufen können (Hilleman & Werner, 1954). Die vielfältigen

Bezeichnungen für diese neuen Viren wurden 1956 zu dem Namen „Adenoviren“ zusammengefasst (Enders et al., 1956).

Die Familie der Adenoviridae wird, abhängig von der Wirtsspezifität, in 5 Gattungen unterteilt (Abbildung 1). Es wird zwischen Adenoviren der Säugetiere (Mastadenoviridae), der Vögel (Aviadenoviridae), der Reptilien (Atadenoviridae), der Amphibien (Siadenoviridae) und der Fische (Ichtadenoviridae) unterschieden (Benkö & Harrach, 1998; Benkó et al., 2002; Davison et al., 2003). Kürzlich wurde eine sechste Gattung, Testadenovirus, für Adenoviren der Schildkröten (Ordnung: Testudines) vorgeschlagen (Doszpoly et al., 2013).

Zu den Mastadenoviridae gehören die humanen Adenoviren (HAdV), die derzeit in 7 Spezies (A-G) und in mehr als 80 Typen unterteilt werden (Abbildung 1) (Yoshitomi et al., 2016; Lion, 2014; Buckwalter et al., 2012). Die Unterscheidung der Typen erfolgte anhand ihrer Genomsequenz, Onkogenität in immunsupprimierten Nagetieren und Eigenschaften zur Hämagglutination (Wadell, 1984; Bailey & Mautner, 1994; de Jong et al., 1999; Buckwalter

et al., 2012; Lion, 2014; Hage et al., 2015; Berk et al., 2007).

Die humanen Adenoviren sind die am weitesten erforschte Spezies der Adenoviridae, wobei vor allem die Typen 2 und 5 (HAdV2 und HAdV5) der Spezies C aufgrund ihrer nicht-onkogenen Eigenschaften zu Forschungszwecken herangezogen werden (Cook & Lewis Jr., 1984; Jochemsen et al., 1986). 1962 wurde das humane Adenovirus Typ 12 (Spezies A) als erstes Adenovirus, das bösartige Tumore in Nagetieren hervorruft, beschrieben (Trentin et al., 1962). Bisher wurden 5 stark onkogene (9, 10, 12, 18, 31) und 9 schwach onkogene (3, 7, 11, 14, 16, 21, 34, 35, 50) Adenovirus-Typen beschrieben (Berk et al., 2007; Jonsson & Ankerst, 1977). Trotz intensiver Forschung hinsichtlich Adenovirus-vermittelter Transformation,

10 konnte bisher kein Beweis für den Zusammenhang zwischen einer Infektion mit Adenoviren und der Entstehung von Tumoren im Menschen erbracht werden.

Abbildung 1: Klassifikation der Familie Adenoviridae.

Dargestellt ist eine vereinfachte Klassifikation der Familie Adenoviridae mit den 5 Gattungen und den 7 Spezies (A-G) der humanen Adenoviren (International Committee of the Taxonomy of

Viruses/ICTV; Davison et al., 2003; Lion, 2014; Hage et al., 2015; Buckwalter et al., 2012). Das

onkogene Potential der Adenoviren in Nagetieren ist durch unterschiedliche Farben gekennzeichnet (rot: stark onkogen; blau: schwach onkogen; grün: nicht-onkogen; schwarz: bisher nicht beschrieben) (Berk et al., 2007).

2.1.2 Pathogenität und Behandlung

Adenoviren sind weltweit mit hoher Prävalenz verbreitet und treten üblicherweise bereits im Kindesalter auf, so sind ca. 80% aller Kinder im Alter von 5 Jahren mit Adenoviren infiziert (Mitchell et al., 2000; Ampuero et al., 2012; Lin et al., 2004; Mahy & van Regenmortel, 2010). Die Infektion kann einen asymptomatischen Verlauf nehmen, aber auch ernsthafte Erkrankungen der oberen und unteren Atemwege, des Gastrointestinaltraktes und der Augen hervorrufen (Ison, 2006). Dazu gehören Erkrankungen wie Gastroenteritis, epidemische Keratokonjunktivitis, Pharyngitis, Pneumonie und in seltenen Fällen auch hämorrhagische Zystitis, Meningoenzephalitis sowie Hepatitis (Celik et al., 2015; Yolken et al., 1982; Zhou et

al., 2012; Windheim et al., 2016; Esposito et al., 2013; Hofland et al., 2004; de Ory et al.,

11 eine milde, selbstlimitierende Infektion (Mahy & van Regenmortel, 2010; Berk et al., 2007). Immungeschwächte Patienten wie Empfänger eines Stammzell- oder Organtransplantats, HIV(human immunodeficiency virus)-infizierte Menschen, die AIDS (acquired immune

deficiency syndrome) entwickeln, und Krebspatienten, die sich einer Bestrahlung oder

Chemotherapie unterziehen, gehören zu der Gruppe, die meist einen schwerwiegenden, oftmals tödlichen Infektionsverlauf entwickeln (Lion et al., 2010; Abe et al., 2003; Kolawole

et al., 2014; Carrigan, 1997).

Adenoviren verursachen sowohl lytische als auch persistierende Infektionen, dabei sind Lymphozyten oder auch adenoides Gewebe (z.B. Mandeln) häufig Orte der Persistenz (Garnett et al., 2002, 2009; Roy et al., 2011). Es wird vermutet, dass persistierende Adenoviren in immungeschwächten Patienten wieder aktiv werden können. Daher ist noch nicht geklärt, ob es zu einer Reaktivierung von persistierenden Adenoviren nach einer Transplantation kommt oder das transplantierte Organ die Quelle der eindringenden Adenoviren ist (Mahy & van Regenmortel, 2010).

Die Übertragung erfolgt durch Inhalation aerosolierter Tröpfchen, direkter konjunktivaler Inokulation, fäkal-oraler Ausbreitung oder Exposition von infiziertem Gewebe oder Blut (Ruuskanen et al., 2002). Vor allem Einrichtungen wie militärische Kasernen, Kindertagesstätten und Pflegeheime haben ein erhöhtes Risiko für eine Exposition mit Adenoviren und einen Ausbruch Adenovirus-bedingter Erkrankungen (Sendra-Gutiérrez et

al., 2004; Kajon et al., 2007; van Der Veen & Dijkman, 1962).

Es wurde beschrieben, dass auch Koinfektionen mit Adenoviren gleicher oder unterschiedlicher Spezies häufig vorkommen (Lion, 2014). Diese könnten eine Rolle bei der Entstehung von rekombinanten Adenovirus-Typen spielen (Lion, 2014).

Derzeit gibt es noch keine spezifische, effektive Behandlung gegen Adenoviren. Bei schwerwiegenden Infektionsverläufen kommen antivirale Medikamente, die gegen ein breites Spektrum von Viren wirksam sind, zum Einsatz. Diese sind jedoch oft ineffektiv und sehr toxisch (Ison, 2006). Zu den eingesetzten Medikamenten zählt z.B. Cidofovir, ein Monophosphat-Nukleotidanalogon, das den Einbau von dCTP in die virale DNA durch die virale DNA-Polymerase und somit die Elongation inhibiert (Bronson et al., 1989; Xiong et

al., 1996; Ljungman et al., 2003). Nachteilige Nebenwirkungen von Cidofovir umfassen die

Nephrotoxizität und okulare Toxizität sowie Iritis, hämatologische Abnormitäten, Übelkeit und Fieber (Plosker & Noble, 1999). Kürzlich wurde ein Lipid-konjugiertes Prodrug von Cidofovir, das Brincidofovir, als effektives Medikament zur Behandlung der Adeno-Virämie nach einer hämatopoetischen Zelltransplantation beschrieben (Hiwarkar et al., 2017).

12

A B

2.1.3 Struktur und Genomorganisation

Adenoviren bestehen aus einem ikosaedrischen Kapsid ohne Membranhülle und weisen einen Durchmesser von 914 Å sowie ein molekulares Gewicht von ca. 150x106 Da (HAdV2) auf (Horne et al., 1959; Stewart et al., 1991; van Oostrum & Burnett, 1985). Das Kapsid besteht aus 7 Strukturproteinen und beinhaltet das adenovirale Genom sowie weitere Proteine (DNA-Kernprotein-Komplex) in seinem Inneren (Abbildung 2). Das Genom besteht aus einer linearen, doppelsträngigen DNA (26163-45063 bp), die an ihren Termini invertierte Wiederholungen (inverted terminal repeats; ITR) mit einer Größe von 36-368 bp enthält (Mahy & van Regenmortel, 2010). An den 5´ Enden des Genoms ist ein terminales Protein (TP) kovalent gebunden, welches zur Initiierung der viralen DNA-Synthese beiträgt (Rekosh

et al., 1977).

Abbildung 2: Schematisches Diagramm und elektronmikroskopische Aufnahmen des HAdV. (A) Schematische Struktur des humanen Adenovirus mit den sieben Strukturproteinen des Kapsids,

den sechs Kernproteinen und der doppelsträngigen DNA (übersetzt aus Reddy & Nemerow, 2014).

(B) Elektronenmikroskopische Aufnahmen von HAdV5-Partikeln mit erkennbarem ikosaedrischen

Kapsid und Hexonproteinen (Abteilung für Elektronenmikroskopie, Heinrich-Pette-Institut, Hamburg).

Zu den Strukturproteinen des Kapsids gehören Hexone (Polypeptid II; 109 kDa), Pentonbasen (Polypeptid III; 63,3 kDa), Fiber (Polypeptid IV; 61,9 kDa) und die Proteine IIIa (63,5 kDa),

dsDNA

Kapsidproteine (major)

Hexon Peripentonales Hexon Pentonbase Fiber Kapsidproteine (minor/cement) Protein VI Protein IIIa Protein VIII Protein IX Kernproteine (core) Terminales Protein (TP) Protein Mu (µ) Protein VII Protein V IVa2 Protease (AVP)

13 VI (23 kDa), VIII (15,4 kDa) sowie IX (14,4 kDa) (Abbildung 2) (van Oostrum & Burnett, 1985; Ahi & Mittal, 2016). Dabei bilden 12 Kopien der Hexon-Trimere eine der 20 dreieckigen Strukturen des Kapsids, während die Pentonbase-Pentamere und die Fiber-Trimere einen Komplex (Penton) an den 12 Eckpunkten bilden (Stewart et al., 1993; Rux & Burnett, 2004). Die antennenartigen Fortsätze des Pentons ermöglichen die Adsorption des Virus an Rezeptoren der Wirtszelle (Louis et al., 1994). Zu den wichtigsten Rezeptoren gehört CD46 (cluster of differentiation 46) und der Coxsackie-Adenovirus-Rezeptor (CAR), der sowohl von humanen Adenoviren (Spezies A, C, D, E, F) als auch von Coxsackie B-Viren gebunden wird (Bergelson et al., 1997; Gaggar et al., 2003; Roelvink et al., 1998). Zusätzlich erleichtern die Pentonbasen-Proteine die effiziente Aufnahme der Viren durch eine Interaktion mit Integrinen der Wirtszelloberfläche (Mathias et al., 1994; Wickham et al., 1994).

Die kleineren Kapsidproteine IIIa, VI, VIII und IX haben neben der Stabilisierung des Kapsids noch weitere Funktionen während des Infektionsverlaufs (Vellinga et al., 2005). So trägt das Protein VI beispielsweise zum Abbau der endosomalen Membran nach dem Eindringen des Virus bei (Wiethoff et al., 2005).

Die, zu den Kernproteinen gehörenden, Proteine µ (Mu; 11 kDa), IVa2 (50 kDa), V (41 kDa), VII (19 kDa), die terminalen Proteine (TP; 55 kDa) sowie die virale Protease (AVP; 23 kDa) assoziieren und interagieren auf unterschiedliche Weise mit dem adenoviralen Genom (Abbildung 2) (Tyler et al., 2007; Anderson et al., 1989; van Oostrum & Burnett, 1985; Everitt et al., 1973; Rekosh et al., 1977; Mangel et al., 2003).

Das Strukturprotein IVa2 spielt in einem Komplex mit dem viralen Protein L1-52/55K und VII eine wichtige Rolle in der Verpackung der DNA durch Bindung der viralen DNA (Ostapchuk et al., 2005; Zhang & Arcos, 2005; Tyler et al., 2007). Zusätzlich reguliert das Protein VII nach der Endozytose den Eintritt des Virusgenoms in den Nukleus der Wirtszelle (Wodrich et al., 2006; Lee et al., 2003). Das Protein V verbindet das virale Genom inklusive der viralen Kernproteine mit dem Kapsid, indem es mit der DNA, dem Protein VI und den Pentonbase-Proteinen interagiert (Everitt et al., 1975; Matthews & Russell, 1998). Die Funktion des kleinen Proteins µ (Mu) ist weitestgehend unbekannt, es wird jedoch vermutet, dass es ähnliche Funktionen wie das Protein VII hat (Anderson et al., 1989).Die adenovirale Protease (AVP) wird in einer inaktiven Form synthetisiert und durch eine nicht-spezifische Bindung an die virale DNA sowie Bindung durch den C-terminalen Teil des Vorläuferproteins VI (pVI) aktiviert (Gupta et al., 2004; Mangel et al., 1993; Webster et al., 1993). Die aktive Protease verändert durch die Spaltung von Vorläuferproteinen (pVI, pVII,

14 pVIII, IIIa, X, pTP) deren Funktion und trägt dadurch zum Zusammenbau des reifen, infektiösen Virus bei (Webster et al., 1989; Diouri et al., 1996; Mangel et al., 2003; Anderson

et al., 1973; Boudin et al., 1980; Tremblay et al., 1983).

Sequenzanalysen konnten zeigen, dass der zentrale Teil des Genoms innerhalb der Familie

Adenoviridae konserviert ist, während die terminalen Teile große Unterschiede hinsichtlich

der Länge und der kodierten Gene zeigen (Mahy & van Regenmortel, 2010). Der zentrale, konservierte Teil kodiert für die meisten Strukturproteine (Ausnahme: pV, pIX) und Proteine, die an der viralen DNA-Replikation sowie dem Virus-Zusammenbau beteiligt sind (Berk et

al., 2007; Mahy & van Regenmortel, 2010).

Die humanen Adenoviren haben eine sehr ähnliche Genomorganisation, dabei sind die nah verwandten Typen 2 und 5 der Spezies C die am weitesten erforschten humanen Adenoviren (Chroboczek et al., 1992). Deren Genom (36 kb) kodiert für über 40 Proteine und zwei nicht-kodierende Virus-assoziierte RNAs (VA-RNAs) (Abbildung 3) (Chroboczek et al., 1992; Berk et al., 2007; Vachon & Conn, 2016; Mei et al., 2003). Das Genom beinhaltet fünf frühe (E1A, E1B, E2, E3, E4), drei intermediäre (IX, IVa2, spätes E2) und eine späte Transkriptionseinheit (major late transcription unit; MLTU), die in fünf Familien später mRNAs prozessiert wird (L1 bis L5) (Abbildung 3) (Berk et al., 2007; Flint, 1982). Jede Transkriptionseinheit verfügt über einen eigenen Promotor und wird von der RNA-Polymerase II transkribiert (Weinmann et al., 1974). Eine Ausnahme stellen die VA-RNAs dar, die von der RNA-Polymerase III transkribiert werden (Weinmann et al., 1974).

Abbildung 3: Genomorganisation von HAdV5.

Dargestellt ist das lineare, doppelsträngige Genom (Linie in der Mitte) mit den invertierten Wiederholungen (inverted terminal repeats; ITR) an den Enden (Längen sind in kb gekennzeichnet). Die Position und Orientierung der frühen (schwarze Pfeile), intermediären (graue Pfeile mit schwarzer Umrandung) sowie späten (graue Pfeile) Transkriptionseinheiten innerhalb des Genoms ist abgebildet. Die weißen Rechtecke in der E2A- und E2B-Region kennzeichnen Introns. Die kleinen Pfeile zeigen die Position der Virus-assoziierten RNAs (VA-RNAs). E: early (früh); ITR: inverted terminal repeat

15 (invertierte terminale Wiederholung); L: late (spät); MLP: major late promoter (später Promotor); TPL: tripartite leader; VA-RNA: Virus-assoziierte RNA (Täuber & Dobner, 2001).

2.1.4 Infektionszyklus

Humane Adenoviren infizieren vor allem postmitotisch ruhende, differenzierte Zellen wie die Epithelzellen des respiratorischen und gastrointestinalen Traktes (Radko et al., 2015). In Gewebekultur können Adenoviren in verschiedenen Tumorzelllinien und primären Zellen vermehrt werden. In humanen Epithelzellen durchlaufen sie normalerweise einen produktiven, lytischen Vermehrungszyklus (Tollefson et al., 1996). Nach einer akuten Primärinfektion können Adenoviren der Spezies C persistieren, wobei das infektiöse Virus zeitweise im Stuhl detektiert werden kann (Fox et al., 1969).

Wie bei den meisten DNA Viren wird der produktive, lytische Infektionszyklus von humanen Adenoviren zeitlich in eine frühe (1-8 h nach Infektion) und eine späte Phase (ab 8 h nach Infektion bis zur Zelllyse) unterteilt (Chow et al., 1980; Seth, 1999). Der Phasenübergang erfolgt durch das Einsetzen der viralen DNA-Replikation. Als intermediäre Phase wird oft noch der Zeitraum während der Expression der viralen Proteine IVa2 und IX bezeichnet (Bridge & Pettersson, 1995). Die frühe Phase beinhaltet die Adsorption an die Wirtszelle, die Penetration der Wirtszellmembran, das Zerlegen des Viruspartikels, den Transport des viralen Genoms in den Nukleus und die frühe Genexpression (Abbildung 4). Die späte Phase umfasst die späte Genexpression, die Produktion von Virusnachkommen und den Austritt aus der Wirtszelle.

Abbildung 4: Lebenszyklus des humanen Adenovirus Typ 5 (HAdV5).

Zytosol CAR Integrin αvβ3 Endosom Kapsid-Freisetzung Internalisierung Injektion des viralen Genoms Nukleus

16 Schematische Darstellung der Bindung der Fiberproteine des Adenovirus an den Coxsackie-Adenovirus-Rezeptor (CAR) und Integrine der Wirtszelle, die Endozytose des Viruspartikels, die Freisetzung des Kapsids und der Eintritt der DNA in den Nukleus der Wirtszelle (übersetzt aus Strauss & Costanzi-Strauss, 2013).

Die Viren gelangen durch Rezeptor-vermittelte Endozytose in die Wirtszelle und werden durch eine Veränderung des pH-Wertes im Endosom sowie durch eine Protein VI-vermittelte Permeabilisierung der endosomalen Membran ins Zytoplasma entlassen (Greber et al., 1993; Wiethoff et al., 2005). Bereits während der endozytotischen Aufnahme beginnt der Zerlegungsprozess des Viruspartikels, der z.B. den Verlust der Fiber und Pentonbasen-Proteine beinhaltet, und dauert bis zur Aufnahme des viralen Genoms in den Nukleus an (Greber et al., 1993). Der virale DNA-Kernprotein-Komplex gelangt mit Hilfe von Mikrotubuli zum Nukleus, assoziiert dort mit dem Kernporenkomplex (nuclear pore complex) und wird in den Nukleus importiert (Bremner et al., 2009; Leopold et al., 2000; Strunze et al., 2005; Greber et al., 1997). Daraufhin setzt die frühe Genexpression mit der Expression der ersten Transkriptionseinheit ein, deren Produkt E1A der wichtigste transkriptionelle Aktivator der frühen Transkriptionseinheiten E1-E4 ist (Nevins et al., 1979; Moran et al., 1986). Neben der Produktion der frühen viralen mRNAs, wird die späte Region L1 in geringen Mengen in der frühen Phase exprimiert (Nevins & Wilson, 1981; Shaw & Ziff, 1980). Die frühen mRNAs werden unterschiedlich gespleißt und polyadenyliert, sodass sie in mehr als 20 unterschiedliche Proteine translatiert werden können (Brady & Wold, 1987; Doerfler, 1986). Die frühen viralen Genprodukte regulieren die Produktion von viralen und zellulären RNAs transkriptionell und posttranskriptionell, induzieren die Zellzyklusprogression und inhibieren antivirale Abwehrmechanismen wie die Apoptose oder Immunantwort der Wirtszelle (Debbas & White, 1993; Ben-Israel & Kleinberger, 2002; Berk et al., 2007; Weitzman & Ornelles, 2005). Damit schaffen die frühen Proteine optimale Bedingungen für die virale DNA-Replikation, in die vor allem Proteine der E2-Region involviert sind (Chow et al., 1980). Dazu gehören das virale DNA-Bindeprotein (DBP), die virale DNA-Polymerase (Pol oder E2B) und das terminale Protein (TP) (Binger et al., 1982).

Das terminale Vorläuferprotein (pTP) bildet einen Komplex mit der viralen DNA-Polymerase und dient als Primer, an die das erste Nukleotid (dCTP) während der Initiierung der Replikation gekoppelt wird (Temperley & Hay, 1992; Lichy et al., 1982; Mysiak et al., 2004). Die Wirtszellproteine NFI (nuclear factor I) und NFIII/Oct-1 (nuclear factor III/octamer

transcription factor 1) stimulieren die Initiierung durch Rekrutierung des pTP-Pol Komplexes

17 1994). Katalysiert durch die virale Polymerase, bildet sich der pTP-Trinukleotid-Komplex (pTP-CAT) aus und springt 3 Basen zurück (King & van der Vliet, 1994). Die Polymerase dissoziiert von pTP, sodass die Elongation durch DNA-Strang-Verschiebung voranschreiten kann (King et al., 1997). Die Replikation findet in sogenannten Replikationszentren statt, die im Nukleus der Zelle verteilt sind (Pombo et al., 1994). Die Replikationszentren bestehen aus einem inneren Bereich, in dem sich die einzelsträngige DNA sammelt und aus der peripheren, replikativen Zone (PRZ), in der die doppelsträngige DNA akkumuliert (Hidalgo et al., 2016; Pombo et al., 1994; Condezo & San Martín, 2017). Nahe der Replikationszentren dient die neu synthetisierte, doppelsträngige DNA weiterhin als Matrize der Transkription viraler Gene (Pombo et al., 1994).

Das Einsetzen der viralen DNA-Replikation ist notwendig für die Expression der späten viralen Gene und kennzeichnet somit den Übergang in die späte Phase. In dieser Phase wird der späte Promotor (major late promoter; MLP) aktiviert und die späten viralen mRNAs der Familien L1, L2, L3, L4 und L5 durch alternatives Spleißen der Vorläufer-mRNA (29 kb) produziert (Farley et al., 2004; Nevins & Darnell, 1978; Kreivi & Akusjärvi, 1994; Shaw & Ziff, 1980). Diese kodieren vorwiegend für Strukturproteine (z.B. Hexon) und Proteine, die in die Verpackung des viralen Genoms involviert sind (Farley et al., 2004; Wu et al., 2013; Ahi & Mittal, 2016). Die späten viralen mRNAs werden für die Translation ins Zytoplasma transportiert, während die Translation und der Transport der mRNAs der Wirtszelle größtenteils unterbunden wird (Beltz & Flint, 1979; Dobner & Kzhyshkowska, 2001). Zuletzt regulieren sowohl frühe (DBP) als auch späte Proteine (L4-100K, L4-33K, L4-22K) die Verpackung des viralen Genoms und den Zusammenbau der Virusnachkommen (Ahi et al., 2013; Oosterom-Dragon & Ginsberg, 1981; Wu et al., 2013; Guimet & Hearing, 2013). Kürzlich wurde gezeigt, dass sich alle Faktoren, die für den Zusammenbau benötigt werden, in der peripheren, replikativen Zone (PRZ) von Replikationszentren befinden (Condezo & San Martín, 2017). Der Infektionszyklus ist, in Abhängigkeit von der Zelllinie, nach 24 bis 36 Stunden abgeschlossen und resultiert in 104 Virusnachkommen pro Zelle sowie überschüssige virale Proteine und DNA, die nicht zu Viruspartikeln zusammengebaut wurden (Green & Daesch, 1961; Berk et al., 2007). Die Zelllyse wird vom viralen Protein ADP (adenovirus

death protein), welches in der späten Phase exprimiert wird (E3-Region), induziert und führt

18

2.2 Adenovirales DNA-Bindeprotein (DBP)

Das frühe adenovirale DNA-Bindeprotein (DBP) ist ein Produkt des E2A-Gens (early region 2A), welches früh sowie spät im Infektionszyklus exprimiert wird und im Nukleus von infizierten Zellen lokalisiert (Chow et al., 1980; Flint & Sharp, 1976; Voelkerding & Klessig, 1986). Infizierte Zellen enthalten mit ca. 107 Kopien pro Zelle eine sehr große Anzahl an DBP (van der Vliet & Sussenbach, 1975). Das DBP ist in mehrere Prozesse des adenoviralen Infektionszyklus wie DNA-Replikation, transkriptionelle Kontrolle, mRNA Stabilität, Transformation und Virus-Zusammenbau involviert (Zijderveld et al., 1994; Cleghon et al., 1989; Ginsberg et al., 1975; Nicolas et al., 1983).

1973 wurde es als ein Protein, das bevorzugt einzelsträngige DNA (ssDNA) bindet, beschrieben (van der Vliet & Levine, 1973). Mittlerweile wurde gezeigt, dass DBP auch an doppelsträngige DNA (dsDNA) und RNA bindet (Fowlkes et al., 1979; Stuiver & van der Vliet, 1990; Cleghon, 1986; Adam & Dreyfuss, 1987). Während es an ssDNA und RNA sehr stabil und kooperativ bindet, ist die Bindung an dsDNA eher instabil (van Amerongen et al., 1987; Stuiver et al., 1992). Die Bindung von DBP an ssDNA erfolgt in einer Sequenz-unabhängigen Weise und mit einer 11-15 Nukleotide umfassenden Bindestelle (Kuil et al., 1989; van Amerongen et al., 1987). Dabei ist die ssDNA komplett mit dem DBP umhüllt und dadurch vor einem Abbau durch Nukleasen geschützt (Monaghan et al., 1994). Einzelsträngige DNA weist im Komplex mit DBP eine ausgedehnte Struktur und verstärkte Rigidität auf, bei der die Fähigkeit zur intramolekularen Renaturierung herabgesetzt ist (van Amerongen et al., 1987; Tucker et al., 1994). Doppelsträngige DNA bildet im Komplex mit DBP ebenfalls eine starre Nukleoprotein-Struktur ohne tertiäre Faltung aus (Stuiver et al., 1992). Die Veränderung der DNA-Konformation durch Bindung von DBP fördert so die Replikation der DNA.

Das Protein besteht beim HAdV5 aus 529 Aminosäuren und hat eine molekulare Masse von 59 kDa, wobei es in SDS-Gelen aufgrund seiner Mobilitätseigenschaften auf einer Höhe von 72 kDa zu detektieren ist (van der Vliet & Levine, 1973; Kruijer et al., 1981). Mit Hilfe einer Chymotrypsin-Behandlung lässt sich DBP in eine N- (AS 1-173; 26 kDa) und C-terminale Domäne (AS 174-529; 44 kDa) teilen, wobei letztere in verschiedenen Serotypen konserviert und in die meisten beschriebenen Funktionen von DBP involviert ist (Klein et al., 1979; Tsernoglou et al., 1985a). Jedoch führen auch Mutationen in der N-terminalen Domäne zu einer reduzierten viralen DNA-Synthese (Brough et al., 1993). Die N-terminale Domäne scheint weiterhin in die Bestimmung der Wirtsspezifität involviert zu sein (Anderson et al.,

19 1983; Brough et al., 1985; Harfst & Leppard, 1999). Sie enthält zwei NLS-Regionen (nuclear

localization signal; AS 42-46 & AS 84-89) und ist stark phosphoryliert, während die

C-terminale Domäne nicht phosphoryliert wird und zwei Zink-Atome enthält (Morin et al., 1989b; Vos et al., 1988; Linné et al., 1977).

Die Bindung der DNA durch die C-Domäne des DBPs erfolgt an einer β-Faltblatt-Struktur (sheet 3; Abbildung 5, Abbildung 6), die über konservierte, positiv geladene und aromatische Aminosäurereste verfügt (Dekker et al., 1998; Neale & Kitchingman, 1989). In der Nähe dieser β-Faltblatt-Struktur befinden sich die Zink-Atome (Abbildung 5, Abbildung 6), die für die Ausbildung der nativen Konformation von DBP und die Stabilität der Proteinfaltung wichtig sind (Tucker et al., 1994). Es wurde gezeigt, dass die Zugabe von Zink bei einer in

vitro Synthese von DBP notwendig ist, um ein funktionelles DBP zu erhalten, welches

einzelsträngige DNA binden kann (Vos et al., 1988). Bei der Bindung der DNA scheint DBP einen Proteinkern zu formen, um den sich die einzelsträngige DNA windet (Tucker et al., 1994).

Abbildung 5: Topologisches Diagramm der C-Domäne des DBPs.

Das Diagramm zeigt die Struktur der C-Domäne des DBPs inklusive der Sequenzpositionen der jeweiligen Sekundärstrukturen und der Aminosäurereste, die die Atome koordinieren. Zn: Zink-Atom; Sheet: β-Faltblatt (Tucker et al., 1994).

Die letzten 17 Aminosäuren der C-Domäne bilden einen hervorstehenden Arm, der an die hydrophobe Tasche eines anderen DBPs binden kann (Abbildung 6), sodass Multimere entstehen (Tucker et al., 1994). Durch eine sogenannte Gelenk-Region (AS 512-515) ist der

20 C-terminale Arm beweglich, wodurch verschiedene Konformationen der Proteinkette möglich sind, die eine Anpassung an verschiedene DNA-Konformationen sicherstellen (Kanellopoulos

et al., 1996; van Breukelen et al., 2000). Es wurde gezeigt, dass DBP durch Multimerisierung

doppelsträngige DNA ATP-unabhängig entwindet und dadurch essenziell für die Elongationsphase der adenoviralen DNA-Replikation ist (Zijderveld & van der Vliet, 1994; Monaghan et al., 1994; Dekker et al., 1997).

Abbildung 6: Kristallstruktur der C-Domäne des DBPs.

Die Kristallstruktur der C-Domäne des DBPs inklusive der Position der zwei Zink-Atome (graue Kreise) und des C-terminalen Arms ist dargestellt (Kanellopoulos et al., 1996; Tucker et al., 1994). Der C-terminale Arm eines Moleküls bindet in der hydrophoben Tasche eines anderen DBP-Moleküls, um eine Proteinkette zu bilden. Sheet: β-Faltblatt (übersetzt aus de Jong et al., 2003).

Die Fähigkeit von DBP, die Initiierung der DNA-Replikation zu verstärken, hängt von der Konzentration der viralen DNA-Polymerase (pol) und des terminalen Vorläuferproteins (pTP) ab, die am höchsten bei einer niedrigen pTP-pol Konzentration ist (Dekker et al., 1997). Dabei spielt DBP eine Rolle in der Rekrutierung des pTP-pol-Komplexes zu dem Replikationsursprung (van Breukelen et al., 2000). Es wurde gezeigt, dass DBP die DNA-Polymerase vor thermischer Inaktivierung schützt und deren Bindung an doppelsträngige DNA stimuliert (Lindenbaum et al., 1986; van Breukelen et al., 2003). Dabei verringert DBP den Km-Wert für die Kopplung der ersten Nukleotide an das terminale Vorläuferprotein (Bildung des pTP-CAT-Komplexes) durch die Polymerase (Mul & van der Vliet, 1993). Die

DBP Proteinkette flexibler Loop

21 Prozessivität der Polymerase wird durch Entfernen der Sekundärstrukturen der DNA durch DBP verstärkt (Lindenbaum et al., 1986). Weiterhin hängt die Stimulierung der Initiierung durch DBP von der DNA-Matrizen-Konformation ab, so wurde die maximale Stimulation (bis zu 15-fach) an doppelsträngiger DNA und TP-enthaltendem Replikationsursprung beobachtet (van Breukelen et al., 2003). Außerdem verstärkt DBP die Bindung von NFI (nuclear factor

I) an den Replikationsursprung, sodass NFI wiederum den Initiierungs-Prozess verstärkt

(Stuiver & van der Vliet, 1990; Cleat & Hay, 1989). Ist der Replikationsursprung komplett entwunden, verstärkt DBP die Initiierung nicht mehr (van Breukelen et al., 2003). Zuletzt vermittelt DBP auch die intermolekulare Renaturierung von komplementären einzelsträngigen DNAs (Zijderveld et al., 1993). Zusätzlich zum DBP, das diffus im Nukleus lokalisiert, akkumuliert eine große Menge an DBP mit dem Einsetzen der viralen DNA-Replikation in intranukleären, kreisförmigen Strukturen, den sogenannten Replikationszentren (Voelkerding & Klessig, 1986).

RNA wird wie auch DNA durch die C-terminale Domäne von DBP gebunden (Cleghon, 1986). Die Rolle von DBP in der Regulation der viralen Genexpression und der mRNA Stabilität ist noch nicht vollständig geklärt. Eine DBP-Mutante (Deletion von 242 bp), bei der kein DBP detektiert werden konnte, zeigte gleiche Mengen aller frühen, viralen mRNAs wie das Wildtyp-Virus (Rice & Klessig, 1985). Nur die DBP mRNA-Mengen waren bei dieser Mutante stark reduziert, weshalb DBP eine Rolle bei der Expression des eigenen Gens haben könnte (Rice & Klessig, 1985). Andererseits wurde mit Hilfe einer Temperatur-sensitiven DBP-Mutante (Ad5ts125) gezeigt, dass ein funktionelles DBP notwendig ist, um die Transkription und den Abbau früher viraler mRNAs zu späteren Zeitpunkten der Infektion zu kontrollieren (Carter & Blanton, 1978a,b; Babich & Nevins, 1981). Dabei scheint DBP die zytoplasmatische Stabilität von E1A- und E1B-mRNAs als auch die Transkriptionsrate der E4-Region zu beeinflussen (Babich & Nevins, 1981; Nevins & Winkler, 1980). Neben der Inhibition des E4-Promotors, wurde beobachtet, dass DBP auch die Transkriptionsrate des E1A-, E2A- und des späten Promotors (major late promoter; MLP) verstärken kann (Chang & Shenk, 1990; Handa et al., 1983). Zwei weitere DBP-Mutanten (HAdV2), die einen Defekt in der DNA-Bindung und Replikation aufweisen, zeigen erhöhte RNA-Mengen der E3-, L3- und L5-Region (Kitchingman, 1995). Weiterhin erhöhen sich in diesen Mutanten, im Gegensatz zum Wildtyp-Virus, die E1B- und E4-RNA-Mengen nicht, wenn es zur DNA-Replikation kommt (Kitchingman, 1995).

Des Weiteren ist DBP in der Transformation von Rattenzellen durch HAdV2 und HAdV5 involviert, da Mutationen in der C-Domäne von DBP zu einer verstärkten Transformation

22 führen (Rice et al., 1987; Ginsberg et al., 1975). Da DBP-Deletionsmutanten jedoch keinen Unterschied in der Transformationseffizienz im Vergleich zum Wildtyp-Virus zeigen, beruht dieser Verstärkungseffekt nicht auf der Inaktivierung der DBP-Funktion, sondern auf der Aktivität des veränderten DBPs (Rice et al., 1987; Rice & Klessig, 1985). Zuletzt wurde auch eine Interaktion von DBP mit dem adenoviralen Protein IVa2 beobachtet, was vermuten lässt, dass diese Proteine zusammen mit dem adenoviralen Protein L4-33K bei der Verpackung des Genoms in das virale Kapsid kooperieren (Ahi et al., 2013). Diese Beobachtung wurde durch eine Temperatur-sensitive Mutante (R(ts107)202) mit einem instabilen DBP, die kein infektiöses Virus produzieren und keine Viruspartikel zusammenbauen kann, bestätigt (Nicolas et al., 1983).

2.3 Funktionen posttranslationaler Modifikationen und zellulärer

Proteine während des adenoviralen Infektionsverlaufs

2.3.1 Ubiquitinierung von Proteinen

Nach der Translation unterliegen viele Proteine posttranslationalen Modifikationen (PTM) wie beispielsweise der Ubiquitinierung, SUMOylierung, Phosphorylierung, Acetylierung und Methylierung. Posttranslationale Modifikationen sind notwendig, um diverse Zellvorgänge zu regulieren und die zelluläre Homöostase aufrechtzuerhalten. Durch Ubiquitinierung werden u.a. die Signalübertragung, Transkription, Endozytose, Immunantwort und der Zellzyklusverlauf reguliert (Varshavsky, 1998). Eine Dysfunktion Ubiquitin-vermittelter Prozesse führt zu schwerwiegenden Erkrankungen, u.a. der Entstehung von Tumoren (Loda et

al., 1997; Scheffner et al., 1990).

Außerdem spielt die Ubiquitinierung wie auch andere posttranslationale Modifikationen eine Rolle bei der Interaktion von Wirtszellproteinen mit viralen Proteinen. Die Ubiquitinierung von Wirtszellproteinen oder viralen Proteinen hat außerdem einen Einfluss auf diverse Prozesse bei dem Viruseintritt sowie -austritt und bei der Replikation. Es wurde schon mehrfach eine Interaktion von adenoviralen Proteinen mit dem Ubiquitin-Proteasom-System (UPS) während des adenoviralen Infektionszyklus beschrieben (Blackford et al., 2010; Blanchette et al., 2004; Harada et al., 2002; Isobe et al., 2009; Schwartz et al., 2008; Woo & Berk, 2007).

23 Ubiquitin ist ein hochkonserviertes Polypeptid, welches aus 76 Aminosäuren besteht und eine Molekülmasse von 8,5 kDa hat (Schlesinger et al., 1975; Wilkinson & Audhya, 1981). Es besitzt sieben Lysinreste (K6, -11, -27, -29, -33, -48, -63), an denen eine Isopeptidbindung mit der Carboxygruppe des Glycins (G76) eines anderen Ubiquitins entstehen kann (Kee & Huang, 2016).

Bei der Ubiquitinierung werden mit Hilfe von E3-Ubiquitin-Ligasen ein oder mehrere Ubiquitinmoleküle kovalent an das Zielprotein gekoppelt (Abbildung 8) (Suryadinata et al., 2014). Die Ubiquitinierungsreaktion verläuft dabei in 3 Schritten unter Beteiligung von drei verschiedenen Enzymen (Abbildung 7) (Haas et al., 1982; Ciechanover et al., 2000). Im ersten Schritt bildet das E1-Enzym unter ATP-Verbrauch eine Thioesterbindung mit der Carboxygruppe des Ubiquitins aus. Nach der Bindung erfolgt in einem zweiten Schritt der Transfer des aktivierten Ubiquitins vom E1-Enzym zum E2-Enzym (Ubiquitin-Carrier-Protein). Im dritten und letzten Schritt überträgt die E3-Ligase das Ubiquitin vom E2-Enzym auf das Zielsubstrat. Eine E3-Ligase erkennt ihr Substrat an spezifischen Ubiquitinierungssignalen (z.B. Strukturmotive) und katalysiert die Ausbildung einer Isopeptidbindung zwischen einem Lysinrest des Substrats und dem C-Terminus des Ubiquitins (Pickart, 2001).

Abbildung 7: Mechanismus der Ubiquitinierung eines Zielproteins.

Dargestellt ist die Ubiquitinierungsreaktion, die in 3 Schritten unter Beteiligung von drei verschiedenen Enzymen verläuft. E1: Ubiquitin-aktivierendes Enzym; E2: Ubiquitin-übertragendes Enzym; E3: Ubiquitinligase; Ub: Ubiquitin.

E1 E1 E2

E1 Ub

Ub _Ub

ATP + AMP + PPi

E2 Ub E3 Substrat E2 E3 Substrat Ub Substrat Ub Ub Ub

24 Eines der wichtigsten Gründe für eine Ubiquitinierung ist die Markierung von Proteinen für den proteasomalen Abbau (Saeki, 2017). Dadurch können Protein-Gleichgewichtsmengen reguliert, aber auch Fremd-Proteine von Pathogenen schnell und effizient abgebaut werden (Wang et al., 2017; Oshiumi et al., 2013). Neben der Proteolyse reguliert Ubiquitinierung auch Prozesse wie z.B. die DNA-Reparatur, Initiierung von Entzündungsreaktionen und Funktionen von Transkriptionsfaktoren sowie Ribosomen (Pickart, 2001). Die verschiedenen Verknüpfungsmöglichkeiten der Ubiquitinmoleküle aneinander determinieren, ob ein Protein für den proteasomalen Abbau oder ein anderes Schicksal bestimmt ist (Abbildung 8). Zum Beispiel sind Substrate mit einer Polyubiquitinkette, die durch eine K48-G76 Isopeptidbindung verknüpft ist, für den Abbau bestimmt (Chau et al., 1989). Während Substrate mit einer Polyubiquitinkette, die durch eine K63-G76 Isopeptidbindung verknüpft ist, eine Rolle in der NF-κB Aktivierung oder DNA-Reparatur spielen (Spence et al., 1995; Deng et al., 2000; Hofmann & Pickart, 1999). Die Mono- oder Multi-Ubiquitinierung eines Proteins kann einen Einfluss auf dessen Lokalisation, Aktivität oder Interaktion mit anderen Proteinen haben und eine Rolle bei der Genexpression, Endozytose sowie DNA-Reparatur spielen (Ye & Rape, 2009; Suryadinata et al., 2014).

25 Dargestellt sind unterschiedliche Ubiquitinierungen (Mono-, Multi-, Polyubiquitinierung) sowie unterschiedliche Lysin-Verknüpfungen der Ubiquitine. Die Art der Ubiquitinierung entscheidet über das Schicksal des ubiquitinierten Substrats. Ub: Ubiquitin (übersetzt aus Suryadinata et al., 2014).

Ubiquitinierte Proteine werden von Ubiquitin-Bindeproteinen (Ubiquitin-Rezeptoren), die über eine Ubiquitin-Bindedomäne (UBD) verfügen, erkannt (Randles & Walters, 2012). UBDs sind sowohl in Enzymen, die eine Ubiquitinierung oder Deubiquitinierung katalysieren, als auch in Ubiquitin-Rezeptoren, die ubiquitinierte Substrate erkennen und deren Signale interpretieren, enthalten (Hicke et al., 2005). Strukturell gesehen sind UBDs sehr divers und haben zum Teil eine Präferenz für bestimmte Ubiquitinverknüpfungen (Hicke

et al., 2005; Elsasser & Finley, 2005). Die geringe Affinität zwischen UBDs und Ubiquitin

mit einer Dissoziationskonstante (Kd) von 10-500 µM ermöglicht ein dynamisches Netzwerk

mit einem schnellen Auf- und Abbau der Interaktionen (Hicke et al., 2005; Dikic et al., 2009).

2.3.2 Ubiquitin-spezifische Protease 7 (USP7)

Deubiquitinasen (DUBs) sind eine große Gruppe von Proteasen, die Ubiquitin von ihren Substraten abspalten und damit deren Ubiquitinierung rückgängig machen. Neben der gezielten Abspaltung des Ubiquitins von spezifischen Substraten, sind DUBs auch beim Recycling von Ubiquitin, welches beim proteasomalen oder endozytotischen, lysosomalen Abbau von Proteinen entsteht, beteiligt (Farshi et al., 2015). Weiterhin können sie die Isopeptidbindungen der Ubiquitinketten von Substraten verändern, sodass die Funktion des Substrates moduliert wird (Winborn et al., 2008; Newton et al., 2008). Dies ermöglicht schnell auf Veränderungen in der Zelle zu reagieren und entsprechende Vorgänge einzuleiten. DUBs weisen eine Spezifität gegenüber dem Substrat selbst oder der Ubiquitinverkettung des Substrats auf und regulieren daher nur eine begrenzte Anzahl von Proteinen (Nijman et al., 2005; Wilkinson et al., 1995; Kee & Huang, 2016). Da es viel weniger DUBs als Ubiquitin-Ligasen gibt, haben DUBs jedoch eine breitere Spezifität mit mehr Substraten pro Deubiquitinase als pro Ligase (Coyne & Wing, 2016). Um eine Spezifität und richtige Funktionsweise zu gewährleisten, wird deren Aktivität sowohl intramolekular (z.B. durch intramolekulare Interaktion zweier Domänen) als auch durch externe Faktoren reguliert (Sahtoe & Sixma, 2015). Die Enzymgleichgewichtsmengen werden sowohl auf den Ebenen der Transkription, Translation und posttranslationalen Modifikation als auch durch Spaltung oder Abbau reguliert (Hutti et al., 2007; Meulmeester et al., 2008; Todi et al., 2009; Coyne &

26 Wing, 2016; Huang et al., 2006). Weiterhin werden DUBs oft durch die Bindung des Substrats oder eines anderen Proteins aktiviert oder im letzteren Falle auch inhibiert (allosterische Regulation). Manche DUBs gehen einen Komplex mit E3-Ligasen ein, wonach die Stabilität der Deubiquitinase moduliert wird (Velasco et al., 2013). Jedoch kann durch einen solchen Komplex auch die Stabilität der E3-Ligase und deren Substrate moduliert werden (Lu et al., 2009; Wu et al., 2004; Mouchantaf et al., 2006). Zuletzt ist auch die Lokalisation der Deubiquitinasen ein regulatorischer Faktor, da die Enzyme in unterschiedlichen Organellen und intrazellulären Komplexen verschiedene Funktionen einnehmen können (Coyne & Wing, 2016; Urbé et al., 2012).

Zwei Klassen von Proteasen, die Cystein- und Metalloproteasen, enthalten DUBs, wobei die meisten DUBs Cystein-Proteasen sind (Shrestha et al., 2014; Nijman et al., 2005). Das humane Genom kodiert für ungefähr 95 DUBs, die in fünf Subklassen unterteilt werden: Ubiquitin C-terminale Hydrolasen (UCHs), Ubiquitin-spezifische Proteasen (USPs), Machado-Joseph Domäne-enthaltende Proteine (MJDs), Otubain Domäne-enthaltende Proteasen (OTU) und JAMM (JAB1/MPN/Mov34) Proteasen (Nijman et al., 2005). Die USPs sind mit einer Anzahl von 58 (USP1-8, USP9X, USP9Y, USP10-17, USP17L2-5, USP17L7-8, USP18-26, USP27X, USP28-54) die größte Gruppe der DUBs (Nijman et al., 2005; Quesada et al., 2004). Alle USPs haben eine konservierte katalytische Domäne, variieren jedoch in der Anzahl und Art der Domänen, die diese umgeben (Quesada et al., 2004). Es wird vermutet, dass die N- und C-terminalen Domänen dadurch eine Rolle bei der Bestimmung der zellulären Lokalisation und Substratspezifität spielen (Quesada et al., 2004). Die katalytische Domäne von USPs enthält zwei konservierte Regionen (Cys- und His-Box), die die notwendigen Aminosäure-Reste, bestehend aus der katalytischen Triade Cys-His-Asp/Asn, für die Katalyse enthalten (Hu et al., 2002; Tanno et al., 2014).

Die Ubiquitin-spezifische Protease 7 (USP7), auch bekannt unter Herpes-Virus-assoziierte Ubiquitin-spezifische Protease (HAUSP), ist eine 135 kDa große Cystein-Isopeptidase (Meredith et al., 1994; Everett et al., 1997). USP7 besteht aus der N-terminalen TRAF (tumor

necrosis factor receptor (TNFR)-associated factor)-like Domäne, der katalytischen Domäne

und den C-terminalen Domänen UBL1-5 (ubiquitin-like) (Abbildung 9) (Holowaty et al., 2003a; Zapata et al., 2001; Faesen et al., 2011). Die TRAF-like Domäne ist für die Substraterkennung und -bindung zuständig (Holowaty et al., 2003a; Sheng et al., 2006), während die katalytische Domäne die Ubiquitin-Bindetasche enthält (Hu et al., 2002). Die Bindung eines Ubiquitins führt zu einer Konformationsänderung in der katalytischen Domäne und im Terminus der UBL-Domänen (Hu et al., 2002; Rougé et al., 2016). Die

C-27 terminalen Domänen UBL45 können dann, durch Interaktion mit einer Schleife der katalytischen Domäne, die Protease von einem nicht-aktiven in einen aktiven Zustand versetzen und diesen stabilisieren (Faesen et al., 2011; Rougé et al., 2016). Diese Interaktion wird zusätzlich durch Bindung einer GMP (Guanidin-Monophosphat)-Synthase an die Domänen UBL123 allosterisch stabilisiert (Faesen et al., 2011). Die C-terminalen Domänen UBL123 dienen jedoch auch zur Interaktion mit Substraten (Hong et al., 2002; Pozhidaeva et

al., 2015; Holowaty et al., 2003a; Cheng et al., 2015; Zhang et al., 2015b).

Einige Untersuchungen zeigten, dass USP7 dimerisieren kann und sowohl ubiquitiniert als auch phosphoryliert wird (Fernández-Montalván et al., 2007; Lee et al., 2005).

Abbildung 9: Struktur und Domänen der Deubiquitinase USP7.

(A) Dargestellt ist die Struktur eines USP7-Fragments (AS 53-560), das sowohl die TRAF-like

Domäne als auch die katalytische Domäne enthält. Die Bindestellen für die Bindung von Ubiquitin als auch des Substrats MDM2 sind gekennzeichnet (übersetzt aus Hu et al., 2006). (B) Dargestellt ist die Anordnung der Domänen des humanen USP7-Proteins. Catalytic Domain: Katalytische Domäne; UBL: Ubiquitin-like Domänen (Pozhidaeva et al., 2015).

USP7 spielt eine wichtige Rolle in vielen zellulären Prozessen wie der Zellteilung, Apoptose, Tumorgenese und epigenetischen Regulation, indem es mit Tumorsuppressoren (p53, PTEN,

Ubiquitin-Bindetasche KerndomäneUSP7

MDM2-Bindestelle Flexibles Gelenk USP7 TRAF-like Domäne USP7 Ubiquitinkette Ubiquitin MDM2

A

B

28 FOXO, Claspin), E3-Ligasen (MDM2, Mule) und epigenetischen Regulatoren (DNMT1, Tip60, UHRF1) interagiert (Li et al., 2002; Song et al., 2008; van derHorst et al., 2006; Faustrup et al., 2009; Li et al., 2004; Khoronenkova & Dianov, 2013; Qin et al., 2011; Dar et

al., 2013; Felle et al., 2011). Der Tumorsuppressor p53 wird bei Zellstress von USP7

deubiquitiniert und stabilisiert, sodass das Zellwachstum reprimiert und die Apoptose induziert wird (Li et al., 2002; Vogelstein et al., 2000). Unter normalen Bedingungen wird p53 von der E3-Ligase MDM2 (mouse double minute 2) ubiquitiniert und anschließend proteasomal abgebaut, wodurch die Protein-Gleichgewichtsmenge von p53 in der Zelle niedrig gehalten wird.

Die Ubiquitin-Ligase MDM2, welche sich selbst ubiquitinieren kann (Auto-Ubiquitinierung), wird ebenfalls von USP7 deubiquitiniert und stabilisiert (Li et al., 2004). Diese Feedback-Regulation ermöglicht durch Änderung der Protein-Gleichgewichtsmengen eine Reaktion auf veränderte Zellbedingungen. Eine Fehlfunktion von USP7 steht beim Menschen in Zusammenhang mit Erkrankungen wie beispielsweise der Entstehung von Prostata- oder Lungenkrebs (Masuya et al., 2006; Song et al., 2008).

Es wurde gezeigt, dass USP7 auch eine wichtige Rolle im Infektionsverlauf des humanen Immundefizienz-Virus (HIV-1) sowie der Herpesviren Epstein-Barr-Virus (EBV), Kaposi-Sarkom-Herpesvirus (KSHV), Herpes Simplex-Virus Typ 1 (HSV-1) und Cytomegalovirus (CMV) spielt (Holowaty et al., 2003b; Jäger et al., 2012; Canning et al., 2004; Salsman et al., 2012; Ali et al., 2017). Das HIV-1 Protein Tat, das die virale Produktion verstärkt, wird von USP7 durch Deubiquitinierung stabilisiert (Ali et al., 2017). Außerdem wurde gezeigt, dass die endogenen Proteinmengen von USP7 nach einer HIV-1 Infektion ansteigen (Ali et al., 2017). Das Protein EBNA1 (Epstein-Barr nuclear antigen-1) des EBV konkurriert mit p53 um die Bindung an USP7, wodurch p53 destabilisiert und die DNA-Reparatur-Antwort, die bei einer EBV-Infektion aktiviert wird, blockiert wird (Saridakis et al., 2005). Das HSV-1 Protein ICP0 (infected cell protein 0) ist eine E3-Ubiquitin-Ligase, die sich selbst ubiquitinieren kann und dadurch dem proteasomalen Abbau zugeführt wird (Canning et al., 2004). Um dem Abbau zu entgehen, bindet ICP0 die Deubiquitinase USP7 und wird von dieser deubiquitiniert und stabilisiert (Canning et al., 2004). ICP0 ist für das HSV-1 notwendig, um die lytische Infektion und Expression bestimmter viraler Gene zu stimulieren sowie den proteasomalen Abbau von zellulären Proteinen wie PML (Protein der promyelozytischen Leukämie) zu induzieren (Everett et al., 1998; Chelbi-Alix & de Thé, 1999; Boutell et al., 2011). Weiterhin interagiert USP7 mit dem Protein UL35 des Cytomegalovirus, welches wichtig für die virale Replikation ist (Salsman et al., 2012).

29 Kürzlich wurde gezeigt, dass USP7 auch eine Rolle während der Infektion mit Adenoviren spielt, indem es mit dem adenoviralen Protein E1B-55K interagiert (Ching et al., 2013). Das frühe Protein E1B-55K spielt eine wichtige Rolle bei der Zelltransformation, Transkription, Translation und wirkt der zellulären Abwehr sowie Apoptose entgegen (Debbas & White, 1993; White & Cipriani, 1990; Berk, 2005). Eine Inhibition oder ein knock-down von USP7 führte zu verringerten E1B-55K Protein-Gleichgewichtsmengen sowie zu einer reduzierten adenoviralen Replikation (Ching et al., 2013). Auch die zelluläre Transformationseffizienz war nach einer Inhibition von USP7 reduziert. Weiterhin wurde beobachtet, dass USP7 während der Infektion in kreisförmige Strukturen innerhalb des Nukleus relokalisiert wird. Mit einem Immunfluoreszenz-basierten Nachweis des DNA-Bindeproteins in diesen kreisförmigen Strukturen, wurden diese als adenovirale Replikationszentren definiert. Die Relokalisation von USP7 erfolgte unabhängig von E1B-55K, da diese auch nach Infektion mit E1B-55K-defizienten Viren beobachtet wurde.

30

3 Material

3.1 Zellen

3.1.1 Bakterienstämme

Für die Amplifizierung von rekombinanten Plasmiden und Transformation mit Plasmiden wurden E. coli DH5α verwendet. Die Transformation mit Bacmiden wurde mit E. coli XL2-Blue durchgeführt.

Bezeichnung Merkmal Referenz

E. coli DH5α supE44, ΔlacU169, (φ80dlacZΔM15), hsdR17, recA1, endA1, gyrA96, thi-1, relA1

Hanahan, 1983

E. coli XL2-Blue recA1, endA1, gyrA96, thi-1, hsdR17, supE44, relA1, lac,

[F’proAB, lacIqZΔM15, Tn10 (Tetr), Amy, Camr]

Agilent Technologies

3.1.2 Säugerzelllinien

Die Zelllinien 2E2, H1299 und HEK-293 wurden für die Herstellung und Vermehrung von Adenoviren benutzt. Die Titration von Adenoviren wurde in der Zelllinie H1299 durchgeführt. Für die Transfektion mit Plasmiden und Infektion mit Adenoviren wurden die Zelllinien H1299 und HCT116 verwendet.

Bezeichnung Merkmal Referenz

2E2

induzierbare Helferzelllinie; generiert aus HEK-293; Gene für die adenovirale E2-Region und E4orf6 sind unter der Kontrolle eines Doxycyclin-abhängigen Promotors

Catalucci et al., 2005

H1299 Humane Lungenkarzinomzelllinie; p53 negativ Mitsudomi et al., 1992

HCT116 Humane Darmkarzinomzelllinie Brattain et al.,

31 HEK-293 Humane, embryonale Nierenzellen, die die adenoviralen

Onkoproteine E1A und E1B stabil exprimieren

Graham et al.,

1977

3.2 Adenoviren

Für Infektionsstudien wurden Wildtyp Adenoviren sowie in dieser Arbeit generierte Adenovirusmutanten verwendet. Die Virusmutanten wurden im H5pg4100-Rückgrat hergestellt.

Bezeichnung Merkmal Referenz

H5pg4100 (WT)

Wildtyp HAdV5 mit einer 1863 bp Deletion (nt 28602-30465) im E3 Leserahmen

Kindsmüller et

al., 2007

H5pm4250 (UBM2)

HAdV5 DBP-Mutante mit einem AS-Austausch an der

Position 76 (S76A) diese Arbeit

H5pm4251 (UBM5)

HAdV5 DBP-Mutante mit einem AS-Austausch an der

Position 354 (S354A) diese Arbeit

3.3 Nukleinsäuren

Die Nummern und Bezeichnungen der Oligonukleotide, Expressionsvektoren und Plasmide ergeben sich durch die Nummerierung und Bezeichnung in der Filemaker Pro-Datenbank der Arbeitsgruppe.

32

3.3.1 Oligonukleotide

Die folgenden Oligonukleotide wurden für Sequenzierungen, PCR-Amplifikationen, real-time qPCR-Amplifikationen und Mutagenese-PCRs verwendet. Alle Oligonukleotide wurden bei der Firma Metabion (München) bestellt.

Nr. Bezeichnung Sequenz Anwendung

64 E1B bp2043 fwd 5´-CGC GGG ATC CAT GGA GCG AAG AAA _{CCC ATC TGA GC-3´} PCR (virale DNA-Replikation) 110 E1B 361-389 rev 5´-CGG TGT CTG GTC ATT AAG CTA AAA-_3´ PCR (virale

DNA-Replikation)

366 cmv 5´-CCC ACT GCT TAC TGG C-3´ Sequenzierung

527 USP7-620-fwd 5´-TAA ATT ACA GAG ATG A-3´ Sequenzierung 528 USP7-1320-fwd 5´-TGG GGA CAA TAA ATA C-3´ Sequenzierung 636 pcDNA3-rev 5´-GGC ACC TTC CAG GGT CAA G-3´ Sequenzierung 642 USP7-2000-fwd 5´-CGC TTG CTG AGT TTG T-3´ Sequenzierung 661 USP7-2700-fwd 5´-AAT GTT GCT GCA GTT T-3´ Sequenzierung 675 cmv-3` 5´-CCA ATT ATG TCA CAC CA-3´ Sequenzierung 746 pcDNA3seq5 5´-ATG GGC GGT AGG CGT GTA CG-3´ Sequenzierung 785 Seq E1-Box fwd 4799

bp 5´-CAC GCT TTG AGT TCA GAT GG-3´ Sequenzierung

786 Seq E1-Box fwd 5310

bp 5´-CAG GGT CAT GTC TTT CCA CG-3´ Sequenzierung

787 Seq E1-Box fwd 5737

bp 5´-CAT GAG CCG GTG TCC ACG C-3´ Sequenzierung

792 Abra. seq fwd 6320 bp 5´-CTT GGC GAT GGA GCG CAG G-3´ Sequenzierung 793 Abra. seq fwd 6889 bp 5´-GGG ACC GAG GTT GCT ACG G-3´ Sequenzierung 794 Abra. seq fwd 7400 bp 5´-CCA GAG CAA AAA GTC CGT GC-3´ Sequenzierung 795 Abra. seq fwd 8004 bp 5´-GGT GCG AGG ATG CGA GCC-3´ Sequenzierung

33 812 Abra. seq fwd 17701

bp 5´-GTG GTT CTT GCA GAT ATG GCC-3´ Sequenzierung

820 Abra. seq fwd 22332

bp 5´-CAG TGC GCA GAT TAG GAG C-3´ Sequenzierung

821 Abra. seq fwd 22903

bp 5´-GAC CGT GCC CGG TCT GGG-3´ Sequenzierung

822 Abra. seq fwd 23481

bp 5´-CGT GGT ACT TGT CCA TCA GC-3´ Sequenzierung

823 Abra. seq fwd 24100

bp 5´-GGA GTC AGT CGA GAA GAA GG-3´ Sequenzierung

824 Abra. seq fwd 24627

bp 5´-GCA AGA TAC CCC TAT CCT GC-3´ Sequenzierung

825 Abra. seq fwd 25186

bp 5´-GCA CTA CAC CTT TCG ACA GG-3´ Sequenzierung

826 Abra. seq fwd 25768

bp 5´-GCG GTG ACG GTC TAC TGG-3´ Sequenzierung

827 Abra. seq fwd 26330

bp 5´-GGA CAT GAT GGA AGA CTG GG-3´ Sequenzierung

839 Abra. seq fwd 33772

bp 5´-GGG CCA AGT GCA GAG CG-3´ Sequenzierung

841 Abra.sequ fwd 4019

bp 5´-GAA GGC TTC CTC CCC TCC C-3´ Sequenzierung

842 Abra.sequ fwd 4407

bp 5´-GGA TGG GTG CAT ACG TGG GG-3´ Sequenzierung

998 Penton[607-630]rev 5´-GTC GAA TAG GGG TGC CAA CTC AG-3´ Sequenzierung 1219 L4 100K early rev 5´-GAC TTG TTC CTC GTT TGC CTC-3´ Sequenzierung 1278 pSuper-Seq-fwd 5´-GGA AGC CTT GGC TTT TG-3´ Sequenzierung 1441 Hexon-qPCR-fw 5´-CGC TGG ACA TGA CTT TTG AG-3´ real-time qPCR

1442 Hexon-qPCR-rev 5´-GAA CGG TGT GCG CAG GTA-3´ real-time qPCR

1535 Vir7000fwd 5´-CGT ACA TGC CGC AAA TGT CG-3´ Sequenzierung 1572 DBP-qPCR-rev 5´-CAG CCT CCA TGC CCT TCT CC-3´ Sequenzierung 1688 DBP RT fwd 5´-GGT CTG GGC GTT AGG ATA CA-3´ Sequenzierung 1853 LeGO-SFFV-fwd 5´-CCT GCG CCT TAT TTG AAT TAA CC-3´ Sequenzierung 2073 pAdTrack-CMV 4923f 5´-GCA GTG CAG ACT TTT GAG G-3´ Sequenzierung

34 2720 Ad5 17977inv-rev 5´-TCT ACA AAA TAG TTA CAG GAC CAA _GC-3´ Sequenzierung 2775 β2 mikrogolublin fwd 5´-TGA GTA TGC CTG CCG TGT GA-3´ real-time qPCR

2776 β2-MG reverse DNA 5´-ACT CAT ACA CAA CTT TCA GCA GCT _TAC-3´ real-time qPCR

3149 E2A-UBM1fwd 5´-CGT GTC GTC CCC GTC CCC GGC GCC _{GCC GCC TCC CCG GGC-3´} Mutagenese 3150 E2A-UBM1rev 5´-GCC CGG GGA GGC GGC GGC GCC GGG _{GAC GGG GAC GAC ACG-3´} Mutagenese 3151 E2A-UBM2fwd 5´-CCA GCC CGC GGC CAT CGA CCG CGG _{CGG CGG ATT TGG CC-3´} Mutagenese 3152 E2A-UBM2rev 5´-GGC CAA ATC CGC CGC CGC GGT CGA _{TGG CCG CGG GCT GG-3´} Mutagenese 3153 E2A-UBM3fwd 5´-GCT ACA AAT GGT GGG TTT CGC CAA

CCC ACC GGT GCT AAT C-3´ Mutagenese

3154 E2A-UBM3rev 5´-GAT TAG CAC CGG TGG GTT GGC GAA _{ACC CAC CAT TTG TAG C-3´} Mutagenese 3155 E2A-UBM4fwd 5´-GCT GAG TGT GCC GAT CGT GGC TGC

GTG GGA GAA GGG CAT G-3´ Mutagenese

3156 E2A-UBM4rev 5´-CAT GCC CTT CTC CCA CGC AGC CAC _{GAT CGG CAC ACT CAG C-3´} Mutagenese 3157 E2A-UBM5fwd 5´-CCA ATC AGT TTT CCG GCA AGG CTT _{GCG GCA TGT TCT TCT C-3´} Mutagenese 3158 E2A-UBM5rev 5´-GAG AAG AAC ATG CCG CAA GCC TTG _{CCG GAA AAC TGA TTG G-3´} Mutagenese 3358 E1B_RTfwd 5´-GAC AGG GCC TCT CAG ATG CT-3´ real-time qPCR

3359 E1B_RTrev 5´-TGG CTA CGT GAA TGG TCT TCA G-3´ real-time qPCR

3.3.2 Expressionsvektoren

Die folgenden Expressionsvektoren wurden für Transfektionsexperimente verwendet.

Nr. Bezeichnung Merkmal Referenz

101 pGEX-4T1 Bakterieller Expressionsvektor; Expression eines

GST-Tags PL-Pharmacia

136 pcDNA3 Expressionsvektor für eukaryotische Zellen; CMV

Promotor Invitrogen

145 pGEX-4T2 Bakterieller Expressionsvektor; Expression eines

35 152 pCMX3b-Flag Expressionsvektor für eukaryotische Zellen; CMV

Promotor; Expression eines Flag-Tags

Stammsammlung der

Arbeitsgruppe 204 pPG-S4 Expressionsvektor für eukaryotische Zellen;

Expression der HAdV5 L4-Region

Stammsammlung der

Arbeitsgruppe 208 pSUPER.retro.puro Expressionsvektor für eukaryotische Zellen;

Expression einer kurzen interferierenden RNA OligoEngine

3.3.3 Rekombinante Plasmide & Bacmide

Die folgenden rekombinanten Plasmide und Bacmide wurden für Klonierungen und Transfektionsexperimente verwendet.

Nr. Bezeichnung Vektor Insert Referenz

2 pC53-SN3 pCMV/neo humane p53 cDNA Baker et al., 1990 1154 Ad5pPG-S2 (Noah) pPG-S2 HAdV5 Genom Stammsammlung der Arbeitsgruppe 1199 pGEX-USP7-TD pGEX GST-USP7 AS 1-215 Zapata et al., 2001b 1215

pcDNA3-myc-USP7-TD pcDNA3-myc

USP7 AS 1-215 mit

myc-Tag Zapata et al., 2001b 1217

pcDNA3-myc-USP7-deltaTD pcDNA3-myc

USP7 ohne AS 1-203

mit myc-Tag Zapata et al., 2001b 1319 pcDNA3-E1B-55K pcDNA3 HAdV5 E1B-55K Stammsammlung

der Arbeitsgruppe 1513 L4-Box pPG-S4 HAdV5 L4-Region (nt 21463-27103 von Ad5pPG-S3) Stammsammlung der Arbeitsgruppe 1642 pSuper-siRNA-Usp7 pSuper.retro.puro siRNA-USP7 Stammsammlung

der Arbeitsgruppe 1813 pGEX-USP7-2 pGEX-4T2 GST-USP7 AS 212-561 Stammsammlung

der Arbeitsgruppe 1814 pGEX-USP7-3 pGEX-4T2 GST-USP7 AS 561-916 Stammsammlung

der Arbeitsgruppe 1815 pGEX-USP7-4 pGEX-4T2 GST-USP7 AS

913-1102

Stammsammlung der Arbeitsgruppe 1858 Myc-USP7 C223S pcDNA3 USP7 C223S mit

myc-Tag

Stammsammlung der Arbeitsgruppe 1878 pcDNA-myc-USP7 pcDNA3 USP7 mit myc-Tag Stammsammlung