6.2 Charakterisierung der DBP-Virusmutanten
6.2.2 Virusmutante H5pm4251 (UBM5)
126
127 könnte (Higginbotham & O’Shea, 2015). Die fehlende Ausbildung der Replikationszentren würde somit bei H5pm4251 (UBM5) zu einer gleichbleibenden Ubiquitinierung führen.
Übereinstimmend mit den Immunfluoreszenz-Analysen, wurde bei der Virusmutante H5pm4251 (UBM5) ein gravierender Defekt hinsichtlich der DNA-Synthese nachgewiesen (Abbildung 29, Abbildung 30). Lecona et al. konnten zeigen, dass USP7 SUMOylierte Proteine in den Replisom-Regionen deubiquitiniert, sodass diese ihre Funktion während der Replikation ausführen können (Abbildung 35) (Lecona et al., 2016). Bezüglich der defekten DNA-Replikation während einer H5pm4251 (UBM5) Infektion, könnte dies einerseits bedeuten, dass USP7 DBP-S354 nicht deubiquitiniert. Aufgrund der fehlenden Replisom-ähnlichen Komplexe gäbe es nämlich kein ausschlaggebendes Signal für diese USP7-Funktion. Andererseits könnte der AS-Austausch S354A im DBP die Deubiquitinierung durch USP7 verhindern, sodass das ubiquitinierte Protein die Replikation nicht initiieren kann.
Abbildung 35: Posttranslationale Modifikationen von Proteinen im DNA-Replikationsbereich.
Schematisch dargestellt sind die posttranslationalen Modifikationen von Proteinen, die sich im Bereich des reifen Chromatins oder der Replikationsgabel befinden. USP7 deubiquitiniert SUMOylierte DNA-Replikationsfaktoren, sodass eine Ubiquitin-arme und SUMO-reiche Umgebung nahe der Replikationsgabel aufrechterhalten wird (übersetzt aus Lecona et al., 2016).
Es wurden Virusmutanten (Ad2+ND1ts23, Ad2ts111A, Ad2ts400, Ad5ts36, Ad5ts107, Ad5ts125) beschrieben, die bei einer nicht-permissiven Temperatur (39-40 °C) eine defekte DNA-Replikation zeigen (Kruijer et al., 1983; Rice & Klessig, 1984; Tsuji et al., 1991; van der Vliet & Sussenbach, 1975; Stillman et al., 1984; Prelich & Stillman, 1986). Diese besitzen wie H5pm4251 (UBM5) einen AS-Austausch in der C-terminalen Domäne von DBP
Reifes Chromatin Replisom Reifes Chromatin
SUMO-arm SUMO-reich SUMO-arm
Ubiquitin-reich Ubiquitin-arm Ubiquitin-reich
128 (Ad2+ND1ts23: AS 282; Ad2ts111A: AS 280; Ad5ts107: AS 413; Ad5ts125: AS 413).
Geringe Veränderungen der Aminosäuren in dieser Domäne scheinen daher direkt die virale DNA-Synthese negativ zu beeinflussen. Im Gegensatz zu den beschriebenen Studien hat das UBM5-Virus den Replikations-Defekt bei einer Temperatur von 37 °C, die der normalen Körpertemperatur des Menschen entspricht. Dennoch wäre es in diesem Zusammenhang interessant zu untersuchen, ob das UBM5-Virus bei einer anderen Temperatur (z.B. 40 °C) eine intakte DNA-Synthese zeigt.
Interessanterweise konnten durch eine zweite Mutation (AS 347, 352 oder 508) Temperatur-unabhängige Revertanten der Virusmutanten Ad5ts107 und Ad5ts125 hergestellt werden (Kruijer et al., 1983). In der vorliegenden Arbeit konnte bei der UBM5-Virusmutante nach Transfektion von H1299-Zellen mit einem DBP-WT-Plasmidkonstrukt ebenfalls virale DNA detektiert werden (Abbildung 29). Damit wurde nachgewiesen, dass nur der AS-Austausch S354A im DBP für den Defekt in der DNA-Synthese verantwortlich ist und dieser nicht durch andere Faktoren, die in der Virusmutante H5pm4251 (UBM5) womöglich verändert sind, hervorgerufen wird. Der AS-Austausch S354A im DBP scheint daher Funktionen von DBP, die für die virale Replikation essenziell sind, zu hemmen. DBP fördert die virale DNA-Synthese, indem es u.a. die Konformation der DNA durch Bindung verändert und ssDNA vor einem Abbau durch Nukleasen schützt (Monaghan et al., 1994; van Amerongen et al., 1987;
Tucker et al., 1994; Stuiver et al., 1992). Für die Konformationsänderung und Entwindung doppelsträngiger DNA bildet DBP Multimere, indem ein C-terminaler Arm an die hydrophobe Tasche eines anderen DBPs bindet (Tucker et al., 1994). DBP-Mutanten ohne C-terminalen Arm verlieren die Fähigkeit zur Multimerisierung, haben eine reduzierte Affinität für DNA und unterstützen die Elongation von doppelsträngiger DNA nicht mehr (Dekker et al., 1997). Eine mögliche Erklärung für die defekte virale DNA-Synthese und die fehlende Ausbildung von Replikationszentren, könnte daher eine beeinträchtigte Multimerisierung von DBP-S354A sein. Jedoch befindet sich der AS-Austausch S354A nicht im Bereich des C-terminalen Arms, der die Aminosäuren 512-529 umfasst (Abbildung 36A und B) (Tucker et al., 1994). Außerdem scheint auch die hydrophobe Tasche, an die der C-terminale Arm eines anderen DBPs bindet, nicht von der Mutation beeinflusst zu werden (Abbildung 6, Abbildung 36A). Daher wurde vermutet, dass die Multimerisierung von DBP-S354A intakt ist und nicht die Ursache für die defekte DNA-Synthese der Virusmutante H5pm4251 (UBM5) ist. Jedoch müssten künftig beispielweise Saccharose-Dichtegradienten-Zentrifugationen oder Immunpräzipitations-Analysen mit DBP durchgeführt werden, um einen Defekt bei der Multimerisierung sicher auszuschließen.
129 Der AS-Austausch S354A könnte auch zu einer veränderten Konformation des Proteins führen und dadurch die Funktion von DBP bei der viralen DNA-Replikation beeinflussen. Für die Ausbildung der nativen Konformation von DBP und die Stabilität der Proteinfaltung sind zwei Zink-Atome notwendig (Tucker et al., 1994). Sie werden von je vier konservierten Aminosäure-Resten (Zinkatom 1: AS C284, H286, C339, C355; Zink-Atom 2: AS C396, C398, C450, C467) koordiniert (Tucker et al., 1994). Es wurde festgestellt, dass sich der AS-Austausch S354A in der Nähe eines der zwei Zink-Atome (Zinkatom 1) von DBP befindet (Abbildung 5, Abbildung 36B).
A
B
130 Abbildung 36: Kristallstruktur der C-Domäne von DBP.
(A-B) Die Kristallstruktur der C-Domänen (AS 176-529) eines DBP-Dimers (A) oder eines DBP-Moleküls (B) inklusive der Position der Zink-Atome (graue Pfeile) ist unter Verwendung von CLC Main Workbench 7 dargestellt. Der C-terminale Arm (roter Pfeil) eines DBP-Moleküls bindet an die hydrophobe Tasche des zweiten DBP-Moleküls. Die Position des AS-Austausches S354A ist mit einem weißen Pfeil gekennzeichnet (Kanellopoulos et al., 1995; Tucker et al., 1994).
Um einen Eindruck zu bekommen, ob der AS-Austausch S354A die Struktur von DBP verändert, wurde eine Tertiärstruktur des mutierten DBPs mit SWISS-Model generiert (Abbildung 37A und B) (Schwede et al., 2003; Biasini et al., 2014). Die prognostizierte Tertiärstruktur von DBP-S354A weist nur geringe Unterschiede zu der Struktur von DBP-WT auf (Abbildung 37B). Eine detaillierte Darstellung zeigt, dass die Aminosäure 354 in der Nähe des Zink-Atoms liegt (Abbildung 37A). Allerdings ist der Abstand zwischen dem AS-Rest und dem Zink-Atom mit 5,4 Å zu groß, um einen Einfluss auf die Bindung zu haben.
Dies lässt vermuten, dass der AS-Austausch S354A die Bindung der Zink-Atome und die Konformation von DBP nicht verändert und den Defekt in der DNA-Synthese nicht verursacht. Da es sich beim SWISS-Model um eine in silico Analyse handelt, müssten künftig Untersuchungen zur Struktur (z.B. Kristallstrukturanalyse) und Zink-Bindung von DBP-S354A durchgeführt werden, um diesen Sachverhalt eindeutig zu klären.
Die AS-Sequenzen der Bereiche, die für die Bindung der Zink-Atome notwendig sind, zeigen keine Ähnlichkeit zu bekannten Zink-Bindemotiven anderer DNA-Bindeproteine, sodass dieser Bereich vermutlich auch nicht in die DNA-Interaktion involviert ist (Berg, 1990;
Tucker et al., 1994). Für die bereits erwähnten Temperatur-sensitiven Virusmutanten (Ad2+ND1ts23, Ad2ts111A, Ad5ts125) wurde neben einer defekten DNA-Replikation auch eine reduzierte Affinität für DNA gezeigt (Prelich & Stillman, 1986; Tsuji et al., 1991).
Weiterhin resultieren Punktmutationen, die zu einem Austausch der AS 322, 323 oder 470 führen, ebenfalls in einer verringerten Affinität von DBP für ssDNA (Neale & Kitchingman, 1989). Daher scheint ein AS-Bereich von mindestens 190 AS (AS 280 - 470) die DNA-Bindefähigkeit zu beeinflussen, obwohl die DNA-Bindestelle von DBP auf 11-15 Nukleotide eingegrenzt wurde (Kuil et al., 1989). Der Grund hierfür ist vermutlich eine Strukturänderung des Proteins, welche zu einer verringerten Affinität für DNA führt. Aufgrund der beschriebenen Studien kann für die UBM5-Mutante ein nachteiliger Effekt auf die DNA-Bindung nicht ausgeschlossen werden, weshalb Untersuchungen zur DNA-Protein-Wechselwirkung notwendig sind. Eine defekte DNA-Bindung würde dazu führen, dass DBP die DNA nicht entwindet und die Replikation nicht initiiert. Dies würde mit dem
131 beobachteten Defekt in der viralen DNA-Synthese und der Ausbildung von Replikationszentren übereinstimmen.
A
132 Abbildung 37: Vergleich der Tertiärstruktur von DBP-WT mit der prognostizierten Tertiärstruktur von DBP-S354
In silico Analyse der Tertiärstruktur von DBP-S354A mit SWISS-Model (Schwede et al., 2003; Biasini et al., 2014). (A) Detaillierte Darstellung der Position des Zink-Atoms (lila Kreis) und der benachbarten Aminosäure mit der Position 354 (weißer Pfeil) im DBP-WT (hellblau) und DBP-S354A (hellbraun). Gestrichelte Linien (lila) zeigen die Entfernung des Zink-Atoms zu den vier koordinierenden Aminosäuren (AS C284, H286, C339, C355). Die gestrichelte, gelbe Linie zeigt die Entfernung (5,4 Å) der Aminosäure 354 zum Zink-Atom. (B) Überlagerung der Tertiärstrukturen von DBP-WT (hellblau) und DBP-S354A (hellbraun).
Das Einsetzen der viralen DNA-Replikation ist für die Expression der späten viralen Gene notwendig und kennzeichnet somit den Übergang in die späte Phase der Infektion (Seth, 1999). Daher zeigten die Untersuchungen der Gleichgewichtsmengen viraler Proteine erwartungsgemäß große Unterschiede zwischen der Virusmutante H5pm4251 (UBM5) und dem WT-Virus H5pg4100 (Abbildung 31A und B). Zunächst wurden bei H5pm4251 (UBM5) infizierten H1299- und HCT116-Zellen gleichbleibende Gleichgewichtsmengen des frühen Proteins E1A und reduzierte Gleichgewichtsmengen des DBPs beobachtet. E1A ist das erste Protein, das während der Infektion exprimiert wird und die frühe Genexpression initiiert (Nevins et al., 1979). Zusätzlich zur bereits erwähnten Regulation der DBP-Transkription durch sich selbst, wird diese auch von E1A kontrolliert. Die E1A-Transkriptionseinheit produziert die E1A-12S und E1A-13S mRNAs während der frühen Infektionsphase (Perricaudet & Virtanen, 1979). So wurde gezeigt, dass der frühe DBP-Promotor in Anwesenheit von E1A-13S stimuliert wird, während der späte DBP-Promotor durch E1A-12S inhibiert wird (Guilfoyle et al., 1985; Rossini, 1983). Dabei beeinflusst E1A die Fähigkeit eines spezifischen Wirts-Transkriptionsfaktor (E2F) mit dem DBP-Promotor zu interagieren
B
133 (Kovesdi et al., 1987). Gleichbleibende Proteinmengen an E1A-12S würden folglich auch während der späten Infektionsphase zu einer Inhibition des späten DBP-Promotors und somit zu verringerten DBP-Gleichgewichtsmengen, wie sie für H5pm4251 (UBM5) beobachtet wurden, führen.
Ein funktionelles DBP ist wiederum notwendig, um den Abbau früher mRNAs zu kontrollieren (Babich & Nevins, 1981; Carter & Blanton, 1978b). Für die Temperatur-sensitive Mutante Ad5ts125, die analog zum UBM5-Virus eine defekte DNA-Replikation zeigt, wurde eine Anhäufung früher mRNAs bei der nicht-permissiven Temperatur (40 °C) beschrieben (Babich & Nevins, 1981; Carter & Blanton, 1978b). Verringerte DBP-Proteinmengen könnten daher bei H5pm4251 (UBM5) zum reduzierten Abbau früher mRNAs und daraus resultierenden erhöhten E1A-Proteinmengen während der späten Infektionsphase führen. Die Reduktion der Expression früher Gene geht mit einer Aktivierung der späten Gene einher (Fessler & Young, 1998), somit resultieren die gleichbleibenden E1A-Proteinmengen vermutlich auch durch den Defekt in der Expression später Proteine. So konnten weder in H1299- noch in HCT116-Zellen nach Infektion mit H5pm4251 (UBM5) späte virale Proteine wie L4-100K und Kapsidproteine detektiert werden (Abbildung 31A und B). Die späten Proteine werden erst nach Einsetzen der viralen DNA-Replikation exprimiert, sodass die Abwesenheit dieser Proteine aus der defekten DNA-Synthese von H5pm4251 (UBM5) resultiert (Chow et al., 1980; Seth, 1999).
Neben den veränderten Gleichgewichtsmengen viraler Proteine, wurden nach Infektion mit H5pm4251 (UBM5) überraschenderweise auch gleichbleibende Gleichgewichtsmengen des zellulären Proteins Daxx (death domain associated protein) beobachtet (Abbildung 31A und B). Der Transkriptions-Repressor Daxx trägt zur antiviralen Abwehr bei, indem es die frühe virale Genexpression verschiedener Viren (Adenovirus, Cytomegalovirus, Hantavirus) reprimiert oder Apoptose induziert (Khaiboullina et al., 2013; Ullman & Hearing, 2008;
Woodhall et al., 2006). Es wurde beschrieben, dass das adenovirale Protein E1B-55K diese Funktion von Daxx durch Interaktion inhibiert und dem proteasomalen Abbau zuführt (Schreiner et al., 2010). Allerdings konnte dieser Abbau von Daxx in der Virusmutante H5pm4251 (UBM5) im Gegensatz zum Wildtyp trotz vergleichbarer E1B-55K-Gleichgewichtsmengen nicht beobachtet werden (Abbildung 31). Womöglich sind neben E1B-55K noch weitere Proteine für den Daxx-Abbau notwendig, die während der H5pm4251 (UBM5) Infektion nicht exprimiert oder destabilisiert werden. Gleichbleibende Gleichgewichtsmengen von Daxx könnten bei der UBM5-Virusmutante zur Repression der Protein-Expression und viralen DNA-Replikation führen.
134 Wurden H1299-Zellen vor der H5pm4251 (UBM5) Infektion zusätzlich mit einem DBP-WT-Plasmidkonstrukt transfiziert, reduzierte sich die Gleichgewichtsmenge von Daxx im Vergleich zu der vom WT-Virus nur gering (Abbildung 32), jedoch konnte die Expression später viraler Proteine wiederhergestellt werden (Abbildung 32). Der fehlende Abbau von Daxx in der H5pm4251 (UBM5) Infektion kann daher nicht der Hauptgrund für den Defekt in der Expression später viraler Proteine sein. Durch die Wiederherstellung der Expression später viraler Proteine nach Transfektion des DBP-WT-Plasmidkonstruktes konnten sowohl die verringerten Gleichgewichtsmengen des DBP-S354A als auch andere Faktoren, die in der UBM5-Virusmutante womöglich verändert sind, als Ursache für die Abwesenheit später viraler Proteine ausgeschlossen werden.
Es wurde bereits eine Virusmutante beschrieben, die einen H5pm4251 (UBM5) vergleichbaren Phänotyp zeigte. Bei dieser wurde das terminale Vorläuferprotein (pTP) deletiert, was ebenfalls zu einem Defekt in der viralen DNA-Replikation und Expression später mRNAs führte (Schaack et al., 1996). Diese Mutante konnte wie das UBM5-Virus nur mit Hilfe einer Helferzelllinie, die pTP-WT exprimiert, generiert und vermehrt werden. Wie DBP spielt das Protein pTP der E2-Region eine essenzielle Rolle bei der viralen DNA-Replikation, so werden die ersten Nukleotide durch die adenovirale Polymerase an das pTP (Bildung des pTP-CAT-Komplexes) gekoppelt (Mul & van der Vliet, 1993). Der pTP-pol-Komplex wird durch DBP zu dem Replikationsursprung rekrutiert (van Breukelen et al., 2000). Dabei schützt DBP die DNA-Polymerase vor thermischer Inaktivierung und stimuliert deren Bindung an doppelsträngige DNA (van Breukelen et al., 2003; Lindenbaum et al., 1986). In diesem Zusammenhang müsste künftig überprüft werden, ob das DBP der Virusmutante H5pm4251 (UBM5) noch mit dem pTP-pol-Komplex wechselwirkt, um die Ursache der defekten DNA-Synthese zu untersuchen.
Übereinstimmend mit den Defekten hinsichtlich der viralen DNA-Replikation und Expression später viraler Proteine, konnte bei der Virusmutante H5pm4251 (UBM5) auch keine Produktion von Virusnachkommen nachgewiesen werden (Abbildung 33). Eine reduzierte Virusnachkommen-Produktion durch eine beeinträchtigte DNA-Replikation und Expression später, viraler Gene inklusive des DBP-Gens selbst, wurde bereits für Phosphorylierungs-Mutanten von DBP beschrieben (Morin et al., 1989a). Bei diesen wurde der Phosphorylierungsstatus von DBP durch Mutation von 8 Phosphorylierungsstellen verändert.
Die 11 bisher beschriebenen Phosphoserin- und Phosphothreoninreste befinden sich in der N-terminalen Domäne von DBP (Klein et al., 1979). Eine Phosphorylierung von DBP an der AS-Position 354 (Serin), die beim UBM5-Virus mutiert wurde, wurde bisher nicht gezeigt
135 und würde den Phosphorylierungsstatus von DBP vermutlich nicht gravierend verändern.
Jedoch führt der AS-Austausch S354A womöglich zu einer Inhibition der Bindung einer bestimmten Kinase an DBP-S354A. Daher sollte künftig auch der Phosphorylierungsstatus von DBP-S354A untersucht werden.
Sowohl in Transfektions- als auch in Infektionsexperimenten kann im SDS-Gel ein proteolytisches Spaltprodukt von DBP mit einem Molekulargewicht von 39-45 kDa detektiert werden, das der nicht phosphorylierten, C-terminalen Domäne von DBP entspricht (Linné et al., 1977; Tsernoglou et al., 1985a). Es wurde gezeigt, dass die C-terminale Domäne von DBP in einem in-vitro DNA-Replikationsassay biologisch aktiv ist (Tsernoglou et al., 1985a).
Womöglich regulieren die unterschiedlich phosphorylierten und gespaltenen Formen von DBP die vielfältigen Funktionen des Proteins. In diesem Zusammenhang wurde beschrieben, dass es zwei Subklassen von DBP gibt, die durch in situ Zellfraktionierung getrennt isoliert werden können (Voelkerding & Klessig, 1986). Für die erste Subklasse wurde eine diffuse Verteilung im Nukleus und für die zweite Subklasse eine Lokalisation in viralen Replikationszentren beschrieben. Somit sollte künftig untersucht werden, ob bei der Virusmutante H5pm4251 (UBM5) eine bestimmte Form von DBP, die für die virale DNA-Replikation notwendig ist, fehlt.
Zusammenfassend bildet die Virusmutante H5pm4251 (UBM5) keine Replikationszentren aus und zeigt einen gravierenden Defekt in der viralen DNA-Synthese, Expression später viraler Proteine und Virusnachkommen-Produktion. Die weitreichenden Auswirkungen des AS-Austausches S354A im DBP zeigen, dass das Protein eine Rolle in verschiedenen Prozessen des Infektionszyklus spielt. Da die UBM5-Virusmutante nur eine Punktmutation im DBP aufweist, sind diese Beobachtungen für die Herstellung potentieller Medikamente in Form von Inhibitoren interessant. Der Inhibitor müsste, vergleichbar zur Punktmutation, das Serin an der AS-Position 354 von DBP inhibieren, um die Vermehrung des Virus zu unterbinden.
Um einen solchen DBP-Inhibitor zu finden, müssen künftig Inhibitor-Screenings durchgeführt werden. Da es bisher keine Adenovirus-spezifischen Therapeutika gibt, würde ein passender DBP-Inhibitor erstmalig die Möglichkeit bieten therapeutisch gegen eine adenovirale Infektion zu intervenieren.
136
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