Untersuchungen zur Ubiquitinierung von DBP

80 Abbildung 20: DBP-S76A interagiert nicht mit der TRAF-like Domäne von USP7.

H1299-Zellen wurden mit 10 µg der Plasmidkonstrukte Flag-DBP WT oder Flag-DBP Mutante (S35A; S76A; S122A; S179A; S354A) transfiziert (4.2.4.1), 48 h p.t. geerntet (4.2.5) und lysiert (4.5.1). Die Proteinlysate wurden mit der GSH-Sepharose-gekoppelten GST-TRAF-like-Domäne (TD) von USP7 inkubiert (4.5.7), die Proteine mittels SDS-PAGE aufgetrennt (4.5.5) und durch Immundetektion visualisiert (4.5.6). Die DBP-Gleichgewichtsmengen der Zelllysate sowie das gebundene DBP wurden mit Hilfe des Antikörpers B6-8 (α-DBP) detektiert. Die Mengen der eingesetzten GSH-Sepharose gekoppelten GST-Tags und GST-USP7-TDs wurden mit Hilfe einer Coomassie-Färbung überprüft (4.5.5). Das Molekulargewicht ist in kDa auf der linken und die detektierten Proteine auf der rechten Seite der Abbildung angegeben.

81 USP7 negativ auf die Protein-Gleichgewichtsmengen von DBP auswirkt und somit die Interaktion der beiden Proteine mit der Deubiquitinierungsfunktion von USP7 zusammenhängt. Die katalytische Aktivität der Deubiquitinase USP7 kann durch synthetische Chemikalien wie z.B. HBX41108 oder P22077 inhibiert werden (Colland et al., 2009;

Reverdy et al., 2012; Fan et al., 2013). Dabei erfolgt die Inhibition durch die kleine Molekül-Verbindung HBX41108 unkompetitiv und reversibel.

Für die Untersuchung wurden H1299-Zellen mit H5pg4100 (WT) infiziert und anschließend mit HBX41108 behandelt. Die Zelllysate wurden mittels Western Blot-Analysen untersucht.

Neben DBP wurde das adenovirale Protein E1B-55K als Positivkontrolle untersucht, da bereits geringere Protein-Gleichgewichtsmengen von E1B-55K nach USP7-Inhibition beschrieben wurden (Ching et al., 2013). Die Zugabe von DMSO oder HBX41108 hatte keinerlei Einfluss auf die Gleichgewichtsmengen von USP7 (Abbildung 21A und B). Jedoch konnte beobachtet werden, dass sich die Gleichgewichtsmengen von DBP und E1B-55K mit zunehmender HBX41108-Konzentration verringern (Abbildung 21A, Spuren 6-11). Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die Inhibition von USP7 die Gleichgewichtsmengen von DBP und E1B-55K vor allem 24 h nach der Infektion verringert (Abbildung 21A, Spuren 6-11;

Abbildung 21B, Spur 6). 48 h nach der Infektion sind die Gleichgewichtsmengen von DBP und E1B-55K bei den mit HBX41108 behandelten Zellen vergleichbar zu denen der unbehandelten Zellen (Abbildung 21B, Spur 9). Zusammenfassend führt die Inhibition der katalytischen Aktivität von USP7 durch HBX41108 zu verringerten Gleichgewichtsmengen von DBP.

82 Abbildung 21: Inhibition von USP7 durch HBX41108 führt zu verringerten Gleichgewichtsmengen der viralen Proteine E1B-55K und DBP.

H1299-Zellen wurden mit H5pg4100 (WT) infiziert (MOI 20; 4.3.4) und 7 h p.i. mit 8 µl DMSO oder HBX41108 (1 µM – 10 µM; gelöst in DMSO) behandelt. 24 h oder 48 h nach der Infektion wurden die Zellen geerntet (4.2.5) und lysiert (4.5.1). Die Gesamtproteinzellextrakte wurden mittels SDS-PAGE aufgetrennt (4.5.5) und die Proteine durch Immundetektion visualisiert (4.5.6).

Gleichgewichtsmengen spezifischer Proteine wurden mit den Antikörpern B6-8 DBP), 3D8 (α-USP7), α-β-Aktin und 2A6 (α-E1B-55K) detektiert. Das Molekulargewicht ist in kDa auf der linken und die detektierten Proteine auf der rechten Seite der Abbildung angegeben.

83 5.1.4.2 Verstärkte Ubiquitinierung von DBP-S354A

Da die Inhibition der katalytischen Aktivität von USP7 zu verringerten Gleichgewichtsmengen von DBP führte, könnte USP7 einerseits durch Deubiquitinierung von DBP zur direkten Stabilisierung des Proteins führen. Andererseits könnte sich USP7 auch durch Stabilisierung anderer Proteine, die wiederum für die Expression oder Stabilisierung von DBP notwendig sind, indirekt auf die Gleichgewichtsmengen von DBP auswirken.

Es wurde beschrieben, dass virale Interaktionspartner von USP7 wie z.B. ICP0 (HSV-1) oder Tat (HIV-1) deubiquitiniert und stabilisiert werden (Ali et al., 2017; Canning et al., 2004).

Allerdings werden Interaktionspartner von USP7 nicht notwendigerweise deubiquitiniert wie im Falle vom viralen Protein EBNA1 (EBV). EBNA1 rekrutiert USP7 zu der EBV-DNA, wo USP7 Histone deubiquitiniert und somit die EBNA1-vermittelte Aktivierung der Transkription verstärkt (Sarkari et al., 2009). Im Folgenden wurde daher untersucht, ob die Interaktion von DBP mit USP7 zur Deubiquitinierung von DBP führt. Dazu wurden H1299-Zellen mit DBP-, USP7- und Ubiquitin-Plasmidkonstrukten kotransfiziert. Die Zelllysate wurden mittels in-situ Ubiquitinierungs- und Western Blot-Analysen untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass DBP bei Überexpression von Ubiquitin posttranslational modifiziert wird (Abbildung 22, Spur 3). Ubiquitin-modifizierte DBPs wurden in leiterartiger Bandenaufreihung oberhalb der DBP-Bande im SDS-Gel detektiert. Weiterhin wurde beobachtet, dass DBP durch Erhöhung der zellulären USP7-Proteinmenge (> 10 µg Plasmid-DNA) deubiquitiniert wird (Abbildung 22, Spuren 5 und 6). Dies äußerte sich durch eine reduzierte Signalintensität der Bandenleiter oberhalb der DBP-Bande. Folglich führt die Interaktion von DBP mit USP7 zur Deubiquitinierung des viralen Proteins.

84 Abbildung 22: Ubiquitinierung und Deubiquitinierung von DBP-WT.

H1299-Zellen wurden mit 5 µg des Plasmidkonstruktes Flag-DBP, 7 µg des Plasmidkonstruktes 6xHis-Ubiquitin und 10-20 µg (+ = 10 µg, ++ = 20 µg) des Plasmidkonstruktes myc-USP7 kotransfiziert (4.2.4.1). Um die Zellen mit gleicher Plasmid-DNA-Menge zwischen den verschiedenen Ansätzen zu transfizieren, wurde die Plasmid-DNA-Differenz der jeweiligen Ansätze mit dem Expressionsvektor pCMX3b-Flag ausgeglichen. Die Zellen wurden 48 h p.t. geerntet (4.5.4) und 30%

des Zellpellets lysiert (4.5.1). Das 6xHis-gekoppelte Ubiquitin und die daran gebundenen Proteine wurden aus dem restlichen Zellpellet mit Ni-NTA-Agarose aufgereinigt (4.5.4), die Proteine mittels SDS-PAGE aufgetrennt (4.5.5) und durch Immundetektion visualisiert (4.5.6). Gleichgewichtsmengen spezifischer Proteine wurden mit den Antikörpern B6-8 (α-DBP), 3D8 (α-USP7), α-His und α-β-Aktin detektiert. Aufgereinigtes 6xHis-Ubiquitin und mitaufgereinigtes DBP wurde mit den Antikörpern α-His und B6-8 (α-DBP) detektiert. Das Molekulargewicht ist in kDa auf der linken und die detektierten Proteine auf der rechten Seite der Abbildung angegeben.

85 Nachdem gezeigt werden konnte, dass DBP-WT ubiquitiniert und durch USP7 deubiquitiniert wird, wurde die Ubiquitinierung und Deubiquitinierung der USP7-Bindemotiv-Mutanten DBP-S76A und DBP-S354A untersucht. Diese DBP-Mutanten wurden im Folgenden analysiert, weil in der vorliegenden Arbeit gezeigt wurde, dass DBP-S76A nicht mit USP7 interagiert (Abbildung 18) und DBP-S354A geringere Protein-Gleichgewichtsmengen im Vergleich zum DBP-WT aufweist (Abbildung 17).

Dazu wurden H1299-Zellen mit USP7-, Ubiquitin- und den jeweiligen DBP-Plasmidkonstrukten kotransfiziert. Die Zelllysate wurden mittels in-situ Ubiquitinierungs- und Western Blot-Analysen untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass WT und beide DBP-Varianten (S76A, S354A) bei Überexpression von Ubiquitin posttranslational modifiziert werden (Abbildung 23, Spuren 5-7). Jedoch wird DBP-S354A im Vergleich zum DBP-WT stärker ubiquitiniert (Abbildung 23, Spur 7), während DBP-S76A im gleichen Maße wie DBP-WT ubiquitiniert wird (Abbildung 23, Vergleich Spur 5 mit Spur 6). Weiterhin wurde beobachtet, dass DBP-WT und beide DBP-Varianten (S76A, S354A) bei Überexpression von USP7 eine geringere Ubiquitinierung aufweisen (Abbildung 23, Spuren 8-10). Allerdings wurden bei Überexpression von USP7 verringerte Ubiquitin-Mengen im Gesamtzellextrakt detektiert, sodass nicht ausgeschlossen werden kann, dass diese zu einer verringerten Ubiquitinierung der DBPs führten.

Zusammenfassend zeigte sich beim Vergleich der DBP-Varianten vor allem, dass sowohl die Ubiquitinierung als auch die potentielle Deubiquitinierung von DBP-S76A vergleichbar zu der von DBP-WT ist und dass DBP-S354A stärker ubiquitiniert wurde als DBP-WT und DBP-S76A.

86 Abbildung 23: DBP-S354A wird stärker ubiquitiniert als DBP-WT und DBP-S76A.

H1299-Zellen wurden mit 10 µg des Plasmidkonstruktes 6xHis-Ubiquitin, 15 µg des Plasmidkonstruktes myc-USP7 und je 5 µg der Plasmidkonstrukte Flag-DBP WT oder Flag-DBP Mutante (S76A; S354A) kotransfiziert (4.2.4.1). Um die Zellen mit gleicher Plasmid-DNA-Menge zwischen den verschiedenen Ansätzen zu transfizieren, wurde die Plasmid-DNA-Differenz der jeweiligen Ansätze mit dem Expressionsvektor pCMX3b-Flag ausgeglichen. Die Zellen wurden 48 h p.t. geerntet (4.5.4) und 30% des Zellpellets lysiert (4.5.1). Das 6xHis-gekoppelte Ubiquitin und die daran gebundenen Proteine wurden aus dem restlichen Zellpellet mit Ni-NTA-Agarose aufgereinigt (4.5.4), die Proteine mittels SDS-PAGE aufgetrennt (4.5.5) und durch Immundetektion visualisiert (4.5.6). Gleichgewichtsmengen spezifischer Proteine wurden mit den Antikörpern B6-8 (α-DBP), 3D8 (α-USP7), α-His und α-β-Aktin detektiert. Aufgereinigtes, 6xHis-Ubiquitin gekoppeltes DBP wurde mit dem Antikörper B6-8 (α-DBP) detektiert. Das Molekulargewicht ist in kDa auf der linken und die detektierten Proteine auf der rechten Seite der Abbildung angegeben.

87 5.1.4.3 Erhöhung der Protein-Gleichgewichtsmengen von DBP-S354A nach

Proteasom-Inhibition

Die verstärkte Ubiquitinierung von DBP-S354A könnte zu einem gesteigerten Abbau des Proteins führen, wodurch wiederum die verringerten Gleichgewichtsmengen des Proteins zu erklären wären. Um zu überprüfen, ob das DBP-S354A proteasomal abgebaut wird, wurden H1299-Zellen mit den Plasmidkonstrukten DBP-WT, DBP-S76A oder DBP-S354A transfiziert und mit dem Proteasom-Inhibitor Bortezomib behandelt. Da bereits beschrieben wurde, dass p53 proteasomal abgebaut wird, wurden als Positivkontrolle H1299-Zellen mit den Plasmidkonstrukten p53, E1B-55K und E4orf6 kotransfiziert (Querido et al., 1997; Roth et al., 1998). Die Zelllysate wurden mittels Western Blot-Analysen untersucht. Die Gleichgewichtsmengen des Kontrollproteins p53 verringern sich in Anwesenheit der viralen Proteine E1B-55K und E4orf6 (Abbildung 24, Spuren 4-6). Nach Bortezomib-Behandlung wurde eine zunehmende Gleichgewichtsmenge von p53 beobachtet (Abbildung 24, Spur 6).

Wie bei p53 nimmt auch die Gleichgewichtsmenge des DBP-S354A nach Bortezomib-Behandlung zu (Abbildung 24, Spur 15). Bei den Gleichgewichtsmengen von DBP-WT und DBP-S76A konnte nach Bortezomib-Behandlung keine Zunahme im Vergleich zu den unbehandelten Proben detektiert werden (Abbildung 24, Spuren 9 und 12). Somit können die verringerten Gleichgewichtsmengen von DBP-S354A zumindest teilweise durch proteasomalen Abbau erklärt werden. Jedoch kann nicht ausgeschlossen werden, dass die Gleichgewichtsmengen von DBP-S354A noch durch einen anderen Faktor beeinflusst werden.

88 Abbildung 24: Bortezomib führt zu erhöhten Gleichgewichtsmengen von DBP-S354A.

H1299-Zellen wurden mit je 7 µg der Plasmidkonstrukte p53, E1B-55K und E4orf6-HA kotransfiziert oder mit je 10 µg der Plasmidkonstrukte Flag-DBP WT, Flag-DBP S76A oder Flag-DBP S354A transfiziert (4.2.4.1). Um die Zellen mit gleicher Plasmid-DNA-Menge zwischen den verschiedenen Ansätzen zu transfizieren, wurde die Plasmid-DNA-Differenz der jeweiligen Ansätze mit dem Expressionsvektor pCMX3b-Flag ausgeglichen. Die Zellen wurden 30 h p.t. mit 5 µl DMSO oder Bortezomib (10 µM; gelöst in DMSO) behandelt, 46 h p.t. geerntet (4.2.5) und lysiert (4.5.1). Die Gesamtproteinzellextrakte wurden mittels SDS-PAGE aufgetrennt (4.5.5) und durch Immundetektion visualisiert (4.5.6). Gleichgewichtsmengen spezifischer Proteine wurden mit den Antikörpern B6-8 (α-DBP), FL-393 (α-p53), 2A6 (α-E1B-55K), RSA3 (α-E4orf6) und α-β-Aktin detektiert. Das Molekulargewicht ist in kDa auf der linken und die detektierten Proteine auf der rechten Seite der Abbildung angegeben.

Zusammenfassend konnte bisher gezeigt werden, dass DBP ein Interaktionspartner von USP7 ist und die TRAF-like Domäne von USP7 an das virale Protein bindet. Weiterhin wurde die

89 AS-Sequenz „PSTS“ (N-Terminus, AS 73-76) als USP7-Bindemotiv im DBP identifiziert.

Darüber hinaus wurde nachgewiesen, dass DBP und USP7 in viralen Replikationszentren kolokalisieren. Außerdem konnte gezeigt werden, dass DBP-WT ubiquitiniert und in Anwesenheit von USP7 deubiquitiniert wird. Dabei führte ein AS-Austausch in einem der fünf potentiellen USP7-Bindemotive von DBP (S354A) zu einer stärkeren Ubiquitinierung des Proteins im Vergleich zum DBP-WT. Sowohl DBP-S76A als auch DBP-S354A scheinen bei Überexpression von USP7 deubiquitiniert zu werden. Zuletzt konnte gezeigt werden, dass sich die Gleichgewichtsmengen von DBP-S354A nach Proteasom-Inhibition erhöhen.