Biotransfer von Tocotrienolen aus Gersten- und Palmöl ins Hühnerei: Biotransferraten, Einfluss der
Emulsionsbildung und Effekte auf die Cholesterolgehalte im Ei und Blutserum
INAUGURAL – DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer Doktorin
der Veterinärmedizin
- Doctor medicinae veterinariae - ( Dr. med. vet. )
vorgelegt von Constanze Walde
geb. Lauterbach Hannover
Hannover 2013
Institut für Lebensmitteltoxikologie und Chemische Analytik
Abteilung Chemische Analytik
1. Gutachter Univ.- Prof. Dr. Waldemar Ternes
2. Gutachter PD Dr. Gerhard Glünder
Tag der mündlichen Prüfung: 31. Oktober 2013
Diese Arbeit wurde gefördert durch das Verbundprojekt Netzwerk Lebensmittel des Forschungsverbundes Agrar- und Ernährungswissenschaften Niedersachsen (FAEN)
Meiner Familie
Teile dieser Arbeit erscheinen in der internationalen Fachzeitschrift Journal of the Science of Food and Agriculture (doi: 10.1002/jsfa.6484):
Constanze M. Walde, Astrid M. Drotleff, Waldemar Ternes
Comparison of dietary tocotrienols from barley and palm oils in hen’s egg yolk:
transfer efficiency, influence of emulsification, and effect on egg cholesterol.
Abstract
BACKGROUND: The main component in tocotrienols (T3) from barley (Hordeum vulgare L.) is α-T3, the vitamer with the highest bioavailability, while palm oil T3 is particularly rich in γ- T3. Unlike tocopherols, T3 are known for their cholesterogenesis-inhibiting, neuroprotective, and anticarcinogenic properties. We compared the oral bioavailabilities of T3 from barley oil (3.98 mg day-1) and T3 from palm oil (3.36 mg day-1) in nanoemulsified formulations (NE) and self-emulsifying systems (SES) using hen’s eggs as a bioindicator. Furthermore, we
compared the transfer efficiencies into egg yolk of barley oil T3 with that of palm oil T3, and the effects on egg cholesterol levels.
RESULTS: Nanoemulsification led to T3 levels (132.9 µg egg-1) higher than with non- emulsified barley oil (112.8 µg egg-1) and barley oil SES (116.7 µg egg-1), due to the high proportions of α-T3 (99-117 µg egg-1), which has a particularly high transfer efficiency
(4.32%-6.75%). T3 contents of eggs from hens fed barley oil supplements (112-132 µg egg-1) were significantly higher than those fed palm oil supplements (70-78 µg egg-1). Addition of barley and palm oils to laying hen feed decreased egg yolk cholesterol by 4% and 6%, respectively.
CONCLUSION: Results from this animal study may help to establish T3 from barley as dietary supplement and to develop nutritionally improved hen eggs.
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung ... 1
2. Literaturübersicht ... 5
2.1 Struktur der Vitamin-E-Familie ... 5
2.1.1 Biologische Aktivität ... 7
2.2 Vorkommen von Tocotrienolen ... 8
2.2.1 Verteilung der Tocochromanole in Gerste und Strategien zur Rohstoffoptimierung ... 10
2.2.2 Produktion von Palmöl ... 13
2.3 Absorption und Transport von Tocopherolen und Tocotrienolen im Organismus... 15
2.3.1 Absorption ... 15
2.3.2 Verteilung im Organismus ... 16
2.3.3 Speicherung ... 18
2.3.4 Metabolismus und Ausscheidung ... 20
2.4 Physiologische Wirkungen der Tocotrienole ... 25
2.5 Bioverfügbarkeit ... 27
2.5.1 Chemische Struktur ... 27
2.5.2 Zusammensetzung der Nahrungsmittel ... 28
2.5.3 Dosishöhe ... 29
2.5.4 Art der Verabreichung... 30
2.6 Aspekte für die Durchführung der Fütterungsstudie am Modellsystem „Futter-Huhn-Ei“ ... 33
2.7 Analytische Methoden zur Bestimmung der Tocopherole und Tocotrienole 35 2.7.1 Probenaufbereitung ... 35
2.7.2 Trennung der Analyten mittels HPLC ... 35
2.8 Analytische Methoden zur Cholesterolbestimmung im Hühnerei ... 37
2.8.1 Enzymatische Bestimmung nach § 35 LMBG bzw. § 64 LFGB ... 37
2.9 Gaschromatographische Bestimmung nach § 35 LMBG bzw. § 64 LFGB ... 37
3. Material und Methoden ... 39
3.1 Chemikalien ... 39
3.2 Probenmaterial ... 39
3.2.1 Extrahiertes Gerstenöl aus Trockenbiertreber ... 39
3.2.2 Palmöl... 39
3.3 Studiendesign ... 40
3.4 Herstellung der Emulsionen ... 43
3.5 Probenaufbereitung ... 44
3.5.1 Herstellung der Reagenzien ... 44
3.5.2 Extraktion der Tocochromanole aus Gerstenöl und Palmöl ... 45
3.5.3 Extraktion der Tocochromanole aus dem Alleinfuttermittel für Legehennen ... 45
3.5.4 Verseifung des Eigelbs und Extraktion der unverseifbaren Lipide ... 45
3.5.5 Aufbereitung der Eigelbproben für die Cholesterolbestimmung ... 46
3.5.6 Vorbereitung der Blutproben für die Cholesterolbestimmung ... 47
3.6 Analytische Methoden ... 47
3.6.1 HPLC-Bestimmung von Tocotrienolen und Tocopherolen ... 47
3.6.1.1 Schematischer Darstellung der verwendeten HPLC-Fluoreszenz- Apparatur ... …….48
3.6.1.2 Kalibrierung ... 50
3.6.1.2.1 Ansetzen der Kalibrationslösungen... 50
3.6.1.2.2 Kalibriergeraden der Tocotrienole und Tocopherole ... 51
3.6.1.3 Probenmessung und Bestimmung der Tocochromanolgehalte ... 56
3.6.1.4 Reproduzierbarkeit und Bestimmung der Wiederfindungsraten .. 56
3.6.1.5 Nachweis- und Bestimmungsgrenzen ... 58
3.6.2 Cholesterolbestimmung mit Gaschromatographie ... 59
3.6.2.1 Gaschromatographische Bedingungen ... 59
3.6.2.2 Bestimmung der Cholesterolgehalte im Eigelb... 59
3.6.2.3 Berechnung der Cholesterolgehalte im Eigelb ... 61
3.6.2.4 Kalibrierung, Reproduzierbarkeit und Bestimmung der Nachweis- und Bestimmungsgrenzen ... 62
3.7 Berechnung der Tocochromanolgehalte im Eigelb ... 64
3.8 Biotransferraten der Tocotrienole und Tocopherole ins Eigelb ... 65
3.9 Statistische Auswertung ... 65
4. Ergebnisse ... 67
4.1 Analyse der Kalibrierlösungen von Tocochromanolen ... 67
4.2 Analytik der Tocochromanole im Gerstenöl, Palmöl und im Legehennenfutter mittels HPLC ... 68
4.3 Analytik der Tocochromanole in den Eigelbproben der Fütterungsstudie mittels HPLC ... 70
4.4 Legeleistung und Eigewicht während der Fütterungsstudie ... 73
4.5 Auswirkungen der dietätischen Supplemente auf die Tocochromanolgehalte im Hühnerei... 75
4.6 Biotransfer der Tocotrienole und Tocopherole ins Eigelb ... 82
4.7 Bestimmung der Cholesterolgehalte im Hühnerei mittels Gaschromatographie ... 85
4.8 Auswirkungen der Tocotrienole auf den Cholesterolgehalt im Ei ... 86
4.9 Auswirkung der Tocotrienole auf den Cholesterolgehalt im Blutserum ... 87
5. Diskussion ... 88
5.1 Ziel der Untersuchungen ... 88
5.2 Anmerkungen zur Methode ... 89
5.3 Legeleistung und Eigewicht während der Fütterungsstudie ... 90
5.4 Auswirkungen der dietätischen Supplemente auf die Tocochromanolgehalte
in den Hühnereiern ... 91
5.5 Biotransfer der Tocotrienole und Tocopherole ins Eigelb ... 95
5.6 Auswirkungen der Tocotrienole auf den Cholesterolgehalt im Ei und Blutserum ... 100
6. Zusammenfassung ... 103
7. Summary ... 106
8. Literaturverzeichnis ... 109
9. Anhang ... 125
9.1 Chemikalienverzeichnis ... 125
9.2 Abbildungsverzeichnis ... 127
9.3 Tabellenverzeichnis ... 130
9.4 Abkürzungsverzeichnis ... 132
9.5 Glossar ... 134
9.6 Bestimmung der Wiederfindungsraten im gefriergetrockneten Eigelb ... 135
9.7 Auswertungsberichte vom DIL über die Tröpfchengrößen der Nanoemulsionen und selbstemulgierenden Formulierungen ... 136
9.8 Danksagung ... 140
1. Einleitung
Vitamin E gehört zu den fettlöslichen Vitaminen und ist die Sammelbezeichnung für acht biologisch aktive Vitamere: vier Tocopherole (α-, ß-, γ-, δ-T) und vier Tocotrienole (α-, ß-, γ-, δ-T3).
Gerste (Hordeum vulgare L.) ist die reichhaltigste Quelle der Vitamin E Unterklasse Tocotrienole (T3), und Gerstenöl besitzt vermutlich die höchsten Tocotrienolgehalte im Vergleich zu anderen natürlichen Ölen (MOREAU et al. 2007). Weiterhin ist Gerste herausragend, da sie eine natürliche Quelle aller acht Tocochromanol- Vitamere darstellt, wobei die Tocotrienole 76 % an den Gasamttocochromanolen (55 mg/kg Trockenmasse) ausmachen, einschließlich 47 % α-T3, das Vitamer der Tocotrienole mit der höchsten Bioverfügbarkeit (ANDERSSON et al. 2008). In einer Ratten-Studie wurde für α-T3 die höchste orale Bioverfügbarkeit festgestellt (27,7 %
± 9,2 %), gefolgt von γ-T3 (9,1 % ± 2,4 %), und δ-T3 (8,5 % ± 3,5 %) (YAP et al.
2003). Diese hohe Bioverfügbarkeit für α-T3 zeichnet die T3 aus Gerstenöl gegenüber den T3 aus Palmöl aus. Rohes Palmöl stellt die am meisten verbreitete kommerzielle Tocotrienolquelle dar und ist insbesondere reich an γ-T3 (39 % des durchschnittlichen Gesamttocochromanolgehaltes von 587 mg/kg) (MCLAUGHLIN u.
WEIHRAUCH 1979). Allerdings ist die Kultivierung der Ölpalme (Elaeis guineensis) aufgrund ihrer Auswirkungen auf die Umwelt, z. B. durch die Abholzung der Regenwälder und Ausrottung der Orang Utans, negativer Kritik ausgesetzt (LAM et al. 2009).
Biertreber ist ein Abfallprodukt der Braugerste und fällt in großen Mengen in der Bierproduktion an. 2008 produzierten europäische Brauereien 427 Millionen Hektoliter Bier, woraus eine berechnete Menge von mehr als 8 Millionen Tonnen nassen Biertrebern als Rückstand resultierte (BOHNSACK et al. 2010).
BOHNSACK et al. entdeckten 2010, dass in den Siebfraktionen < 500 µm aus gemahlenen Trockentreber (mit einer Ölausbeute von 13 %) die Tocotrienole im Vergleich zum unbehandelten Rohstoff angereichert vorlagen. Mit T3- und Tocopherol (T)-Konzentrationen von jeweils bis zu 850,2 mg/kg und 318,0 mg/kg stellen die Siebfraktionen < 500 µm einen geeigneten Rohstoff für die wirtschaftliche Extraktion eines gesundheitsfördernden Öls dar. Mit Molekulardestillation ist es
außerdem möglich T3 aus Gerstenöl zu isolieren, um stark angereicherte T3- Konzentrate für die Verwendung in Nahrungsergänzungsmitteln oder Pharmazeutika zu produzieren (BOHNSACK et al. 2010). Trotz dieser Möglichkeiten ist zurzeit kein kommerzielles T3-Präparat aus Gerste auf dem Markt erhältlich.
Bedingt durch den besonderen gesundheitlichen Nutzen ist das Interesse an T3 in den letzten Jahren enorm angestiegen, denn sie zeichnen sich durch cholesterolsenkende, neuroprotektive und antikarzinogene Eigenschaften aus (SEN et al. 2006). Darüber hinaus ist die antioxidative Aktivität von α-T3 in biologischen Membranen bis zu 60-mal größer als die von α-T (SERBINOVA et al. 1991).
Gerste war die erste Substanz, die in Verbindung mit dem hypocholesterolemischen Effekt von T3 gebracht wurde (QURESHI et al. 1980; QURESHI et al. 1986). Es ist mittlerweile bekannt, dass dieser durch die posttranskriptionale Hemmung der 3-Hydroxy-3-Methylglutaryl Coenzyme A (HMG-CoA) Reduktase bedingt wird. Es handelt sich dabei um ein geschwindigkeitsbestimmendes Enzym, dass an der Cholesterol-Biosynthese beteiligt ist (PEARCE et al. 1992). Bereits vor mehr als 30 Jahren berichteten QURESHI et al. (1980), dass Inhaltsstoffe aus Gerste in Hühnern die Cholesterol-Biosynthese senkten. Im Jahre 1986 gelang es, eine Cholesterol- Biosynthese inhibierende Substanz aus Gerstenmehl zu isolieren, die als α-T3 identifiziert wurde (QURESHI et al. 1986). Der hypocholesterolemische Effekt von T3 in gewonnenem Öl aus Biertreber wurde zuerst von WEBER et al. (1991) beschrieben. Probanden mit einem durchschnittlichen Cholesterolgehalt von 266 mg/dL Blutserum bekamen jeweils eine tägliche Dosis von 3 g Öl aus Biertreber (T3- Gehalt nicht angegeben). Die Gesamtcholesterolgehalte und das Low Density Lipoprotein (LDL) wurden jeweils um 34-40 mg und 32-37 mg/dL gesenkt. Das High Density Lipoprotein (HDL) wurde nicht beeinflusst.
Um den gesundheitsfördernden Effekt der T3 zu maximieren wurden Bemühungen zur Optimierung der Bioverfügbarkeit unternommen. Die orale Absorption der T3 ist von den physiologischen Prozessen im Gastrointestinaltrakt abhängig. Durch die Aufnahme mit Nahrung konnte die Absorption der α-, γ-, und δ-T3 im Vergleich zu den fastenden Probanden um das Doppelte erhöht werden, da die Bildung von gemischten Mizellen aufgrund der Sekretion von Gallensalzen und
Pankreasenzymen stimuliert wurde (YAP et al. 2001). Weiterhin wird beschrieben, dass die Komplexbildung der T3 mit γ-Cyclodextrin die intestinale T3-Absorption durch Verbesserung der Löslichkeit und Stabilität im Gastrointestinaltrakt von Ratten steigert (IKEDA et al. 2010). Eine Verbesserung der oralen Bioverfügbarkeit kann auch durch die Aufnahme der T3 in emulgierten Formulierungen, wie selbstemulgierende Systeme (SES) oder Nanoemulsionen (NE) (Tröpfchengröße 20- 500 nm), erreicht werden. Yap und Yuen (2004) steigerten in fastenden Probanden die Bioverfügbarkeit von T3 aus Malaysischen Palmöl (148,7 mg Tocomin® 50 % in einer einzelnen Dosis) durch Verabreichung in selbstemulgierenden Formulierungen mit Tröpfchengrößen von 1-10 µm um das 2-3 fache im Vergleich zu einer nicht selbstemulgierenden Lösung. 2011 wurde von TERNES et al. (2011) eine Humanstudie durchgeführt, um die Bioverfügbarkeit von drei verschiedenen Zubereitungen zu testen: T3 aus Palmöl, T3 aus Palmöl formuliert in einer Nanoemulsion (Tröpfchengröße 40 nm) und T3 isoliert aus Gerste (getrockneter Biertreber). Jede Zubereitung enthielt 450 mg an Gesamttocotrienolen. Die nanoemulgierte Formulierung führte zu einem Anstieg des AUC0-24 h Wertes für die Gesamt-T3 im Blutplasma (49,6 µg x h/mL) im Vergleich zum Palmölextrakt (35,1 µg x h/mL). Die orale Bioverfügbarkeit für T3 aus Gerste war am höchsten, obwohl die Zubereitung nicht emulgiert vorlag. Die AUC0-24 h betrug 64,6 µg x h/mL und die α-T3 Werte im Blutplasma waren besonders hoch.
Bisher liegen noch keine Ergebnisse über die orale Bioverfügbarkeit von isolierten T3 aus Gerste in emulgierten Formulierungen vor. Aus diesem Grund bestand das erste Ziel der vorliegenden Dissertationsarbeit darin, die orale Bioverfügbarkeit von T3 aus Gerstenöl ohne Emulgierung, in einer Nanoemulsion und in einer selbstemulgierenden Formulierung zu bestimmen und die Ergebnisse mit denen für T3 aus Palmöl zu vergleichen. Legehennen erwiesen sich als ideale Versuchstiere, da Hühnereier, ohne einen invasiven Eingriff in den Organismus, leicht zugänglich sind und in der menschlichen Ernährung eine große Bedeutung haben. Weiterhin zeichnen sich Hühnereier dadurch aus, dass sie mit funktionellen Inhaltsstoffen, durch Biotransfer von Substanzen aus dem Futter ins Ei, angereichert werden können. SOOKWONG et al. (2008) supplementierten 2 % Reiskleieöl (1,3 % T3) zum Legehennenfutter (insgesamt 170 mg T3/kg) und erreichten einen Anstieg der Tocotrienolgehalte im Hühnerei von 0,11 mg/Ei auf 0,62 mg/Ei.
Der Transfer der einzelnen T3-Vitamere (α-, β-, γ-, δ-T3) ins Hühnerei durch Supplementierung von Palmöl übers Futter wurde in nur einer Studie untersucht (WALKER et al. 2012). Nach den für diese Arbeit gewonnenen Erkenntnissen gibt es bisher keine Studien, die die Transferraten von verschiedenen T3-Zubereitungen mit unterschiedlicher Vitamerzusammensetzung vergleichen. Für die Bewertung der Qualität von T3 aus Gerste als Nahrungsergänzungsmittel wäre es jedoch hilfreich die Unterschiede in den Transferraten von T3 aus Gerstenöl, welches reich an α-T3 ist, und von T3 aus Palmöl, in welchem γ-T3 dominiert, zu wissen. Deshalb liegt das zweite Ziel dieser Arbeit darin, die Transferraten der T3 aus Gerstenöl und Palmöl zu vergleichen. Dieses erfolgt exemplarisch durch Fütterung dieser T3-Quellen an Legehennen.
Aufgrund der cholesterolsenkenden Eigenschaften der T3 wurde eine Langzeitstudie durchgeführt, um Veränderungen zu den üblicherweise durchschnittlichen Cholesterolgehalten von 184 mg/Ei (LITTMANN-NIENSTEDT 1996) zu bestimmen.
Die Ergebnisse dieser Dissertationsarbeit sollen für die Entwicklung von gesundheitsfördernden α-T3-reichen Zubereitungen aus Gerste, für die Verwendung in Nahrungsergänzungsmitteln oder Pharmazeutika zur Vorbeugung von Zivilisationskrankheiten nützlich sein. Die T3-reichen Zubereitungen aus Gerste könnten eine sich lohnende Alternative zu den Palmöl Präparaten darstellen, die derzeit den Markt dominieren.
Die Ergebnisse sollen außerdem zur ernährungsbedingten Verbesserung von Eiern, durch Ergänzung des Legehennenfutters mit T3-reichen Gerstennebenprodukten, beitragen.
2. Literaturübersicht
2.1 Struktur der Vitamin-E-Familie
Vitamin E wurde erstmals 1922 von EVANS und BISHOP an der University of California in Berkeley als essentieller Nahrungsbestandteil zur Aufrechterhaltung der Reproduktionsfähigkeit von Ratten beschrieben (EVANS u. BISHOP 1922). Die eigentliche Benennung von Vitamin E erfolgte erst zwei Jahren später durch SURE (1924). Aufgrund der fertilitätsfördernden Eigenschaften wurde für Vitamin E die Bezeichnung Tocopherol eingeführt, die sich aus dem Griechischen „tocos“ (Geburt) und „pherein“ (tragen) ableitet, während die Endung „ol“ auf die phenolische Struktur verweist. In den darauffolgenden Jahren gelang schließlich die Isolierung von α- Tocopherol aus Weizenkeimöl durch EVANS et al. (1936) Die Strukturaufklärung und chemische Synthese von α-Tocopherol folgte in 1938 (FERNHOLZ 1938; KARRER et al. 1938). Die ersten Veröffentlichungen über das Vorkommen von Tocotrienolen erschienen erst viele Jahre später (PENNOCK et al. 1964; DUNPHY et al. 1965).
Heute wird Vitamin E als Sammelbegriff für alle Tocopherol- und Tocotrienolvitamere verwendet, die qualitativ die gleiche biologische Wirkung wie RRR-α-Tocopherol aufweisen (TRABER u. SIES 1996). Tocopherole und Tocotrienole sind lipophil und bestehen aus einem Chromanolring mit einer Phytyl-Seitenkette. In der Natur kommen vier Tocopherole (α-, ß-, γ- und δ-Tocopherol) und vier Tocotrienole (α-, ß-, γ- und δ-Tocotrienol) vor (Abb. 1), wobei sich die jeweilige Benennung auf die Anzahl und Stellung der Methylgruppen am Chromanolring bezieht. Während die Tocopherole über eine gesättigte Seitenkette verfügen, unterscheidet sich die Seitenkette der Tocotrienole durch drei isolierte Doppelbindungen (ungesättigt).
Darüber hinaus existieren Tocopherole in der Natur nur als freie Phenole, während Tocotrienole auch verestert vorkommen können (KAMAL-ELDIN u. APPELQVIST 1996).
Die 4 Tocopherole und 4 Tocotrienole werden auch als Tocochromanole zusammengefasst.
Das Tocopherolmolekül zeigt drei chirale Zentren (2, 4’ und 8’) in der Phytyl- Seitenkette auf, so dass insgesamt acht (23) stereoisomere Formen vorliegen
können. In der Natur kommen die Tocopherole in der (2R,4’R,8’R)-Konfiguration (R,R,R-Tocopherole) vor. Synthetisch hergestelltes α-Tocopherol beinhaltet ein Gemisch aus acht Stereoisomeren und wird als all-rac-α-Tocopherol (früher dl-α-Tocopherol) bezeichnet (KAMAL-ELDIN u. APPELQVIST 1996).
CH3 CH3 O
R1 O H
R2 R3
CH3
CH3 CH3
4' 8'
2 12'
5 4 6 7
8
R R R
(R,R,R)-
Tocopherole R1 R2 R3
α-T CH3 CH3 CH3
β-T CH3 H CH3
γ-T H CH3 CH3
δ-T H H CH3
CH3 CH3 O
R1 O H
R2 R3
CH3
CH3 CH3
2
3' 7' 11'
5 4 6 7
8
R
E E
(R,E,E)-
Tocotrienole R1 R2 R3
α-T3 CH3 CH3 CH3
β-T3 CH3 H CH3
γ-T3 H CH3 CH3
δ-T3 H H CH3
Abb. 1: Chemische Strukturen der natürlich vorkommenden Tocopherole und Tocotrienole. Die Reste R1, R2 und R3 kennzeichnen die entsprechenden Substitutionen am Chomanolring
Die Tocotrienole besitzen nur ein chirales C-Atom (C2), so dass sie lediglich als (2R)- und (2S)-Stereoisomere vorkommen können. Da die Tocotrienole jedoch die Doppelbindungen an der Position 3’ und 7’ in der Phytyl-Seitenkette aufweisen, sind vier geometrische E/Z-Isomere möglich. Demnach kann jedes Tocotrienol acht Isomere aufzeigen. Alle natürlich vorkommenden Tocotrienole verfügen ausschließlich über die (2R,3’E,7’E)-Konfiguration (R,E,E-Tocotrienole) (KAMAL- ELDIN u. APPELQVIST 1996; DROTLEFF u. TERNES 1999).
Die Nomenklatur der Tocopherole und verwandter Verbindungen wurde 1981 in Richtlinien der Joint Commission on Biochemical Nomenclature (IUPAC-IUB), gegründet aus der International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC) und der International Union of Biochemistry and Molecular Biology (IUBMB), näher bestimmt (IUPAC-IUB 1982).
Chromanolring Phytyl-Seitenkette (gesättigt)
Chromanolring Phytyl-Seitenkette (ungesättigt)
2.1.1 Biologische Aktivität
Die biologische Aktivität gibt an, welchen biologischen Effekt eine bestimmte Menge einer Substanz im Körper erzielt. Die einzelnen Vitamere weisen hinsichtlich ihrer biologischen Aktivität Unterschiede auf, die von der Methylierung des Chromanolringes, der Sättigung der Seitenkette und der stereoisomeren Konfiguration abhängen (BUNYAN et al. 1961; WEISER et al. 1996). Basierend auf einen Fertilitätstest an Ratten wurde für RRR-α-Tocopherol im Vergleich zu dem synthetischen all-rac-α-Tocopherol und allen weiteren natürlich vorkommenden Vitamin-E-Derivaten die höchste biologische Aktivität ermittelt (KAMAL-ELDIN u.
APPELQVIST 1996; BRIGELIUS-FLOHE u. TRABER 1999). Zur Standardisierung der biologischen Aktivität der einzelnen Vitamere wurde der Begriff Tocopheroläquivalent (TÄ) eingeführt. Die Tab. 1 gibt die biologischen Aktivitäten verschiedener Tocopherole und Tocotrienole in mg Tocopheroläquivalent an.
Als Refererenzwerte für die Vitamin-E-Zufuhr wird von der Deutschen Gesellschaft für Ernährung (DGE) eine tägliche Aufnahme Tocopheroläquivalent in Höhe von 3-4 mg für Säuglinge, 5-14 mg für Kinder, 11-15 mg für Erwachsene, 13 mg für
Schwangere und 17 mg für Stillende empfohlen (DEUTSCHE GESELLSCHAFT FÜR ERNÄHRUNG (DGE) 2000)
Tab. 1: Biologische Aktivität ausgewählter Tocopherole und Tocotrienole als Tocopheroläquivalente (TÄ)
Tocochromanole Biologische Aktivität als TÄ
(mg/mg Vitamer)
R,R,R-α-Tocopherol 1,0
R,R,R-β-Tocopherol 0,5
R,R,R-γ-Tocopherol 0,1
R,R,R-δ-Tocopherol 0,03
R-α-Tocotrienol 0,3
R-β-Tocotrienol 0,05
R-γ-Tocotrienol 0,01
R-δ Tocotrienol k.A.
k.A.: Für δ-Tocotrienol liegen keine Zahlenangaben vor. Sein Beitrag zur Vitamin-E-Aktivität gilt als vernachlässigbar, Quelle: (GAßMANN 1995).
2.2 Vorkommen von Tocotrienolen
In der Pflanzenwelt sind Tocotrienole nicht so weit verbreitet wie Tocopherole (HORVATH et al. 2006). Besonders reichhaltige Quellen für Tocotrienole sind die ölhaltigen Anteile von Cerealien wie Gerste, Weizen, Roggen, Hafer und Reis, die in der menschlichen Ernährung eine große Rolle spielen. Hohe Konzentrationen sind auch in pflanzlichen Ölen, wie Palmöl, Reiskeim- und Reiskleieöl, zu finden.
Außerdem wurden bereits 1965 beträchtliche Mengen im Milchsaft des Kautschukbaums (Hevea brasiliensis) nachgewiesen (DUNPHY et al. 1965).
Die Tab. 2 zeigt den Gehalt an Tocopherolen und Tocotrienolen in einigen ausgewählten Pflanzenölen.
Tab. 2: Tocopherole und Tocotrienole in ausgewählten Pflanzenölen [mg/kg]
Pflanzenöl α-T ß-T γ-T δ-T α-T3 ß-T3 γ-T3 δ-T3 Gesamt -T3
Gesamt-
T +T3 Referenzen
Gerstenöl
142 6 104 1 558 − 85 5 648 901 (WANG et al.
1993b)
385 20 312 7 1691 − 231 51 1973 2697 (WANG et al.
1997)
Kokosnussöla 18 3 2 3 11 1 4 k.A. 16 42 (SOUCI et al.
2008)
Leinöl 6 − 757 17 6 − 8 − 14 794 (BOZAN u.
TEMELLI 2008)
Maiskeimöl 257 10 752 33 15 − 20 − 35 1087 (SYVAOJA et
al. 1986)
Olivenöl 119 − 13 − − − − − − 132 (SYVAOJA et
al. 1986)
Palmöl
167 Sp − − 112 25 227 − 364 531
(MCLAUGHLIN u.
WEIHRAUCH 1979; NG et al.
2004)
420 − − − 260 − 360 80 700 1120
Rapsöl 189 − 486 12 − − − − − 687 (SYVAOJA et
al. 1986)
Reiskeimöl 1729 82 112 11 126 − 85 9 220 2154 (KO et al. 2012)
Reiskleiöl 320 50 160 10 190 − 600 40 830 1370 (ORTHOEFER
2005)
Sojaöl 95 13 699 239 − − − − − 1046 (SYVAOJA et
al. 1986)
Sonnenblumenöl 622 23 27 − − − − − − 672 (SYVAOJA et
al. 1986)
Weizenkeimöl 1508 312 527 − 36 − 19 − 55 2402 (SYVAOJA et
al. 1986) a raffiniert; „−“ nicht detektiert; Sp = Spuren
Die obige Tabelle illustriert, dass die Gesamtgehalte der Tocotrienole in Gerstenöl, Palmöl und Reiskleieöl am höchsten sind. Während sich Gerstenöl durch die hohen α-T3-Gehalte abhebt, überwiegen bei Palmöl und Reiskleieöl die γ-T3-Gehalte.
2.2.1 Verteilung der Tocochromanole in Gerste und Strategien zur Rohstoffoptimierung
Weltweit steht Gerste an fünfter Stelle in der Kulturpflanzenproduktion (jährlich 129 Millionen Tonnen in 2002-2005) hinter Mais, Weizen, Reis und Sojabohnen.
Während Gerste historisch gesehen dem Menschen als wichtige Nahrungsquelle diente, werden die weltweiten Gerstenerträge heutzutage zu etwa zwei Dritteln als Futtermittelquelle für Tiere und zu etwa einem Drittel als Rohprodukt in der Biergewinnung genutzt. Nur noch circa 2 % werden in der menschlichen Ernährung eingesetzt und weniger als 1 % werden für die Produktion von Bioethanol verwendet (BAIK u. ULLRICH 2008).
Traditionell werden größtenteils bespelzte Gerstensorten angebaut. Für die Verwendung in Nahrungsmitteln werden Gerstenkörner geschält (entspelzt) und abgeschliffen, um den Geschmack zu verbessern. Dabei werden die äußeren Schichten des Getreidekorns (Fruchtschale, Samenschale, Aleuronschicht, Subaleuronschichten und Keimling) entfernt, wodurch die Gehalte an unlöslichen Fasern, Proteinen, Rohasche und Lipiden reduziert und die Gehalte an Stärke und ß- Glukane angereichert werden (PETERSON 1994; BAIK u. ULLRICH 2008; PANFILI et al. 2008). Es entstehen rundliche Körner, die als Graupen bezeichnet werden (BELITZ et al. 2008). Mittlerweile werden auch entspelzte Gerstensorten (Nacktgerste) gezüchtet, deren Spelzen bereits während des Wachstums und der Ernte auf den Feldern abfallen. Dadurch entfällt der mechanische Schälungsprozess, und die Gerstenkörner zeichnen sich durch einen geringeren Rohfasergehalt aus (MOREAU 2009). Als Braugerste werden bespelzte Getreidesorten bevorzugt, da die Schalen am Aroma des Bieres mitwirken und als Filterhilfsmittel während des Brauprozesses dienen (BAIK u. ULLRICH 2008).
In Abb. 2 ist die schematische Darstellung eines Gerstenkorns im Längsschnitt zu sehen. Der Hauptanteil des Gerstenkorns wird von dem stärkehaltigen Mehlkörper (Endosperm) eingenommen, an dessen Basis der Keimling zu finden ist. Nach außen wird das Endosperm von der Aleuronschicht begrenzt, die hohe Gehalte an Lipiden und Proteinen aufweist und dem Endosperm zugeordnet wird. Umkapselt werden Endosperm und Keimling von Samenschale (Testa) und Fruchtschale (Perikarp), die miteinander verwachsen sind. Als äußerste Umhüllung befindet sich die Spelze, die bei entspelzten Gerstensorten entfällt (BELITZ et al. 2008).
Abb. 2: Schematisierter Längsschnitt durch ein Gerstenkorn
Die Tocochromanole sind in den Schichten der Gerstenkörner unterschiedlich verteilt (LIU u. MOREAU 2008). Der Hauptanteil der Tocochromanole ist im Perikarp (50 %) und im Endosperm (37 %) zu finden, wobei der Keimling nur etwa 13 % der Tocochromanole aufweist. Die Tocopherole sind größtenteils im Keimling und die Tocotrienole im Endosperm und Perikarp konzentriert (FALK et al. 2004), wobei die höchsten T3-Gehalte in der Aleuronschicht und den Subaleuronschichten zu finden sind (PANFILI et al. 2008).
Die tatsächliche Höhe der Tocotrienolgehalte in Gerstenkörnern ist variabel und kann von der Funktion des Genotyps, den Wachstumsbedingungen der Gerstenpflanze und den Lagerungsbedingungen der Gerstenkörner abhängen. Die Tocochromanolgehalte in Gerste reichen in etwa von 40 bis 100 mg/kg (MOREAU 2009).
Obwohl in Gerste große Mengen an Tocochromanolen zu finden sind, ist es fraglich, ob durch den Verzehr von Gerste oder anderen T3-haltigen Nahrungsmitteln der tägliche Bedarf an T3 gedeckt werden kann (SEN et al. 2007), denn die berechnete biologisch aktive Dosis beträgt etwa 60 mg T3 pro Tag (QURESHI et al. 2002).
Deswegen wäre es vorteilhaft die aus Gerste gewonnenen Tocochromanole anzureichern und in funktionellen Lebensmitteln wie Nahrungsergänzungsmittel oder in Pharmazeutika darzureichen.
Spelze
Frucht- und Samenschale
Mehlkörper
stärke- und eiweißreich Aleuronschicht
eiweißreich
hoher Tocotrienolgehalt
Keimling
fettreich
hoher Tocopherolgehalt
Als geeignete Methode zur Anreicherung der Tocochromanole aus Gerste hat sich die Vermahlung von Gerstenkörnern mit anschließender Siebung des Mehls bewährt (BOHNSACK et al. 2010). Während des Mahlprozesses reichern sich die Tocochromanole in bestimmten Mahlfraktionen wie in der Kleie (Perikarb, Testa, Aleuron-, und Subaleuronschichten) und dem Keimling an (BRAMLEY et al. 2000), wobei die T3-Gehalte der Kleie (50,9-98,2 mg/kg) und im Keimling (14,3 mg/kg) erheblich variieren (TIWARI u. CUMMINS 2009). PETERSON (1994) konnte im Vergleich der verschiedenen Mahlfraktionen nahezu doppelt so hohe T3-Gehalte in der Kleie (55,9 mg/kg) wie zum Gerstenkorn im Ganzen (30,6 mg/kg) nachweisen.
Noch höhere Tocotrienolkonzentrationen konnten in den Nebenerzeugnissen aus dem Abschleifen von Gerstenkörnern für die Verwendung in Nahrungsmitteln erfasst werden. WANG et al. (1993a) konnten in Fraktionen die durch Abpolieren von ganzen Gerstenkörnern anfielen (20 % des ganzen Korns) T3-Gehalte (146,0-159,9 mg/kg) nachweisen, die fast 3-fach so hoch waren wie die des ganzen Kornes (52,0- 58,9 mg/kg). In einer anderen Studie verwendeten MOREAU et al. (2007) Nebenerzeugnisse aus der Skarifizierung von Gerstenkörnern mit anschließender Siebung als Rohstoff für die T3-Gewinnung. Die höchsten T3-Gehalte wurden im extrahierten Öl aus der Siebfraktion mit einem Partikeldurchmesser von < 700 µm (378-1208 mg T3/kg Öl) gefunden.
Um tocotrienolreiche, funktionelle Lebensmittel aus Gerste kosteneffizient zu gewinnen, sollte der Ölgehalt so hoch wie möglich sein und mindestens 5-9 % betragen. Obwohl es möglich wäre Gerstenöl aus gemahlenen, ganzen Gerstenkörnern zu gewinnen, ist der Ölgehalt (≈ 2 %) zu niedrig und die Ölgewinnung somit nicht ökonomisch (MOREAU et al. 2007). Erfolgsversprechender sieht die Gewinnung von Gerstenöl aus Gerstenfraktionen aus. Während die Extraktion von Gerstenkleie Ölgehalte von 3,8-5,6 % ergab (MOREAU 2009), können durch die Extraktion der Feinkörnern aus dem Abschleifen und der Skarifizierung von Gerstenkörnern sogar Ölgehalte von jeweils 5-7 % und 7-9 % erreicht werden (MOREAU et al. 2007). Trotz dieser vielversprechenden Möglichkeiten fallen diese Gerstenfraktionen nur bei der Verarbeitung von Gerstenkörnern für die menschliche Ernährung an, die, wie bereits erwähnt, nur circa 2 % der weltweiten Gerstenerträge ausmachen. Somit wäre die Gewinnung von T3 aus diesen Nebenprodukten sehr
kostenaufwendig und ist aus wirtschaftlichen Gesichtspunkten als nicht sinnvoll zu betrachten.
Als kosteneffizientere Lösung hat sich die Extraktion von Gerstenöl aus Biertreber herausgestellt, da die T3 in diesen lebensmittelindustriellen Nebenprodukten bereits angereichert vorliegen. Während des Brauprozesses setzen Enzyme die wasserunlösliche Stärke der Gerste in löslichen Malzzucker um. Anschließend werden alle vergärbaren Stoffe und löslichen Proteine von den Malzkörnern extrahiert, während die Tocochromanole im unlöslichen Rückstand (Treber), der hauptsächlich aus Spelze, Kleie und Keimling besteht, zurückbleiben (BOHNSACK et al. 2010).
2.2.2 Produktion von Palmöl
Palmöl wird aus dem Fruchtfleisch der Ölpalme gewonnen, die in tropischen Gebieten von Asien, Afrika und Lateinamerika kultiviert wird. Die weltweite Produktion von Palmöl erreichte innerhalb der letzten Jahre durch zunehmende industrielle Nutzung sowohl in der Nahrungsmittelindustrie als auch im Bereich der technischen Industrie, wie der Erzeugung von Bioethanol, einen enormen Anstieg von 5 Millionen Tonnen in 1980 zu 38,5 Millionen Tonnen in 2007. Damit stammt ein Viertel des weltweit produzierten Pflanzenöls (154 Millionen Tonnen in 2007) von der Ölpalme. Malaysia und Indonesien beherrschen mehr als 90 % der globalen Palmölproduktion (LAM et al. 2009; CRAMB u. CURRY 2012).
Die Früchte der Ölpalme sind pflaumengroße Steinfrüchte, die in dichten Fruchtbündeln wachsen. Sie bestehen aus dem Exokarb (Fruchthaut), Mesokarb (Fruchtfleisch), Endokarb (äußere Umhüllung des Samens) und dem Samen. Aus dem Fruchtfleisch der Steinfrüchte wird das Palmöl, aus dem Samen der Steinkerne das Palmkernöl gewonnen. Um das rohe Palmöl (Crude Palm Oil, CPO) zu gewinnen, werden die Früchtstände der Ölpalme mit der Hand abgehackt und in Körben an Seilen vorsichtig zu Boden gelassen. Bei Gewebsverletzungen werden die in dem Fruchtfleisch vorhandenen Lipasen aktiviert, die das Fett in Glycerin und Fettsäuren spalten und damit die Qualtität des Palmöls senken. Noch am Tag der Ernte werden die Früchte mit Dampf erhitzt (Sterilization), um die Lipasen zu deaktivieren, und anschließend maschinell vom Fruchtstand gelöst und gequetscht
(Stripping). Darauf wird das Fruchtmus gepresst (Extraction) und das abfließende Rohöl geklärt und gereinigt (Purification). Aufgrund seines hohen Carotinoidgehaltes haben sowohl die Früchte als auch das gewonnene Öl eine orangerote Farbe (LIEBEREI u. REISDORFF 2012; MPOC 2012).
2.3 Absorption und Transport von Tocopherolen und Tocotrienolen im Organismus
Aufgrund ihres lipophilen Charakters benötigen Tocochromanole spezielle Transportmechanismen im wässrigen Milieu von Körperflüssigkeiten, Blutplasma und Zellen. Während die T und T3 im Dünndarm im Inneren von Mizellen absorbiert werden, erfolgt der Transport im Blutplasma mit Lipoproteinen sehr geringer Dichte (Very Low Density Lipoprotein, VLDL), Lipoproteinen geringer Dichte (Low Density Lipoproteins, LDL) und Lipoproteinen hoher Dichte (High Density Lipoproteins, HDL) (KAYDEN u. TRABER 1993).
Im Folgenden werden Absorption, Verteilung im Organismus, Speicherung sowie Metabolismus und Ausscheidung der T- und T3-Vitamere näher beschrieben.
2.3.1 Absorption
Die Absorption der Tocochromanole ist eng an die Lipidverdauung gekoppelt.
Voraussetzung für die Absorption ist die Freisetzung aus der Lebensmittelmatrix.
Dieses geschieht bei den Lipidverdauungsvorgängen in Mund, Magen und Dünndarm. Nach Aufnahme der Nahrungsfette beginnt zunächst die mechanische Dispersion durch Kaubewegungen und Magenkontraktionen. Gleichzeitig wird im Magen durch die linguale und gastrale Lipase die Hydrolyse der Triacylglyzeride eingeleitet, wobei einzelne endständige Fettsäuren abgespalten werden (Abb. 3 Α, Seite 20). Im Dünndarm werden die vom Magen abgegebenen Fetttröpfchen durch konjugierte Gallensäuren (Tauro- und Glykocholsäure sowie Tauro- und Glykochenodesoxycholsäure) und Phospholipiden aus der Galle emulgiert. Die dadurch bewirkte Oberflächenvergrößerung der Triacylglycerintröpfchen begünstigt die Wirkung der Pankreaslipasen, die anschließend die Nahrungs-Triacylglyceride in Monoacylglycerine und Fettsäuren aufspalten. Mit Hilfe der konjugierten Gallensäuren werden die lipophilen Substanzen, wie z. B. die Tocopherole und Tocotrienole, in Mizellen überführt und somit im wässrigen Milieu des Dünndarmlumens solubilisiert (Abb. 3 B). Bei den gemischten Mizellen handelt es sich um Molekülaggregate, bei denen der hydrophobe Molekülanteil ins Innere zeigt und der hydrophile Molekülanteil nach außen gerichtet ist (SCHARRER u.
WOLFFRAM 2005).
Eingebettet in Mizellen erreichen die Tocochromanole den Bürstensaum des Dünndarms wo sie durch passive Diffusion (KAYDEN u. TRABER 1993), oder teils auch durch rezeptorvermittelte Transportprozesse in die Enterozyten aufgenommen werden (Abb. 3 C). In neueren Studien konnte gezeigt werden, dass Transporter wie der SR-B1 (scavenger rezeptor class B type 1) (REBOUL et al. 2006) und der NPC1L1 (Niemann-Pick C1-like 1) (NARUSHIMA et al. 2008), welche auch in der Cholesterolabsorption eine Rolle spielen, an der Aufnahme von Vitamin E in Enterozyten beteiligt sind. Bezüglich der intestinalen Aufnahme erfolgt eine Differenzierung zwischen den einzelnen Tocopherol- und Tocotrienol-Vitameren.
Anhand von Caco2 Zellstudien konnten TSUZUKI et al. (2007) zeigen, dass die zellulären Konzentrationen der einzelnen T3-Vitamere im Vergleich zu den entsprechenden T-Vitameren signifikant erhöht waren. Sie vermuteten, dass bei den T3 die chemische Struktur der Phytyl-Seitenkette, die zu einer höheren Mobilität im Intermembranraum beiträgt, dafür verantwortlich sei. In einer weiteren Studie, die an Thorax-Kanal kanülierten Ratten durchgeführt wurde, berichteten IKEDA et al.
(1996), dass α-T3 bei der Absorption im Dünndarm im Vergleich zu γ-T3, δ-T3 und α-T um etwa den Faktor 2 bevorzugt wurde.
2.3.2 Verteilung im Organismus
Von den Enterozyten erfolgt die Sekretion der Tocochromanole über zwei verschiedene Wege. Der größte Teil der T- und T3-Vitamere wird in Chylomikronen inkorporiert und gelangt über die Lymphe und den Ductus thoracicus in den Blutkreislauf (ANWAR et al. 2007). Ein kleiner Teil kann jedoch durch ABCA1, einem zellulären Membrantransporter der ATP-binding-cassette-(ABC-)Familie, mit intestinalem HDL direkt in das Blutsystem sezerniert werden (Abb. 3 C). Dieser Weg spielt bei gestörter Chylomikronensynthese eine Rolle, oder wenn die Fettaufnahme über die Nahrung gestört ist (ANWAR et al. 2007; REBOUL et al. 2009). Auf dem Weg zur Leber wird ein Teil des Vitamin E infolge des Chylomikronen-Katabolismus durch die endothelständige Lipoproteinlipase (LPL) direkt in die peripheren Gewebe, wie Skelettmuskel, Fettgewebe und Gehirn verteilt. Ein anderer Teil wird während des Abbaus durch die LPL als überschüssiger Oberflächenbestandteil auf HDL übertragen. Die verbliebenen Chylomikronenreste (Remnants) erhalten Apolipoprotein E von den HDL und werden über einen Apolipoprotein-E-Rezeptor vermittelten Prozess in die Parenchymzellen der Leber aufgenommen. Das HDL
kann Vitamin E direkt mit anderen zirkulierenden Lipoproteinen austauschen (Abb. 3 D, E, F) (KAYDEN u. TRABER 1993).
In der Leber erfolgt eine Differenzierung der einzelnen T- und T3-Vitamere, zugunsten des α-Tocopherols. Verantwortlich für diese Diskriminierung ist das cytosolische α-Tocopheroltransferprotein (α-TTP), da es das R,R,R-α-Tocopherol bevorzugt in VLDL inkorporiert und dann als Einheit ins Blutplasma sezerniert.
Während R,R,R-α-Tocopherol in vitro zu 100 % an das α-TTP gebunden wird, ist in Relation dazu die Affinität bei R,R,R-ß-Tocopherol (38 %), R,R,R-γ-Tocopherol (9 %), R,R,R-δ-Tocopherol (2 %) und α-Tocotrienol (12 %) deutlich geringer (Abb.
3 F) (HOSOMI et al. 1997).
Nach Sezernierung der VLDL in den Blutkreislauf kann α-T auf verschiedenen Wegen weitertransportiert werden. Während der Lipolyse kann α-T im Inneren der VLDL zu LDL oder HDL abgebaut werden, oder als VLDL-Rest (z. B. als Lipoprotein mittlerer Dichte, Intermediate Density Lipoprotein, IDL) wieder in die Leber zurückkehren (KAYDEN u. TRABER 1993). Eine Reihe von Kinetikstudien hat gezeigt, dass R,R,R-α-Tocopherol schnell aus dem Blutplasma verschwindet, wieder in VLDL inkorporiert wird und nach kurzer Zeit erneut im Blutplasma erscheint (TRABER et al. 1994). Außerdem findet im Blutplasma ein intensiver Austausch der Tocopherole zwischen LDL und HDL statt (Abb. 3 D) (KAYDEN u. TRABER 1993).
Die Bedeutung des α-TTP für die Absorption und Verteilung von α-T wurde dadurch bekannt, dass Mäuse mit fehlerhafter α-TTP unfruchtbar waren und trotz α-T Supplementierung an einem α-T Mangel litten (TERASAWA et al. 2000; JISHAGE et al. 2001). Da die Affinität bei den restlichen T- und T3-Vitameren deutlich geringer ist, bleibt die Bedeutung des α-TTP für deren weitere Verteilung bisher unklar. TRABER und KAYDEN (1989) postulierten, dass die restlichen T-und T3-Vitamere zum größten Teil abgebaut und über die Galle ausgeschieden werden. Allerdings konnte in weiblichen α-TTP Knockout-Mäusen durch die Gabe von α-T3 die Fertilität wieder hergestellt werden und somit gezeigt werden, dass die Absorption und Verteilung von α-T3 nicht von dem α-TTP abhängt (KHANNA et al. 2005a). Demzufolge könnten die Tocotrienole unabhängig vom α-TTP während des Chylomikronen-Katabolismus von den Chylomikronen-Remnants auf die zirkulierenden HDL und von dort weiter auf andere Lipoproteine, wie LDL und VLDL, ins Blutplasma übertragen werden (KAYDEN u. TRABER 1993). In einer Humanstudie gelang es FAIRUS et al. (2006)
die Anwesenheit von α-, γ- und δ-T3 in verschiedenen zirkulierenden Lipoproteinen im Blutplasma nachzuweisen.
Abb. 3: Schematische Darstellung von Absorption und Transport der Tocopherole und Tocotrienole im Organismus.
T + T3 = Tocopherole und Tocotrienole, ABCA1 = ATP-binding cassette A1, VLDL = Very Low Density Lipoprotein, LDL = Low Density Lipoprotein, HDL = High Density Lipoprotein, LPL = Lipoproteinlipase
2.3.3 Speicherung
Anhand von Studien an unterschiedlichen Tiermodellen konnten spezifische Speicherorgane für die T- und-T3 Vitamere nachgewiesen werden.
In einer Studie an Mäusen, die über eine Standarddiät mit 10,5 mg T3/kg (α-T3, 3,1 mg/kg; γ-T3, 7,4 mg/kg) und 40 mg T/kg (α-T, 30 mg/kg; γ-T, 10 mg/kg) supplementiert wurden, konnten in der Haut die höchsten T3-Gehalte im Vergleich zu den anderen Körpergeweben aufgezeigt werden (PODDA et al. 1996). Während in der Haut neben 84 % α-T (5,4 nmol/g) auch 15 % T3 (α-T3, 0,24 nmol/g und γ-T3, 0,76 nmol/g) und 1 % γ-T (0,04 nmol/g) an den Gesamttocochromanolen zu finden
F Leber T+T3
Metabolisierung α- TTP
VLDL α-T
T+T3 Alimentäres
T+T3
T+T3
Fetttröpfchen Α Magen
E
Periphere Gewebe
LPL T+T3 Chylomikron-
Remnant
VLDL α-T LDL
T+T3
HDL T+T3
D Lymphbahn und Blutkreislauf C
Enterozyt B
Darmlumen
Gallensekret Pankreaslipasen
Ausscheidung Mizelle
T+T3
T+T3
Chylomikron T+T3
HDL T+T3
Bürstensaum
ABCA1
waren, nahmen die T3- und γ-T-Gehalte in Herz, Niere und Leber nur circa 1 % (α- T3, 0,1 nmol/g; γ-T3 0,2 nmol/g und γ-T 0,2-0,4 nmol/g) der Gesamttocochromanole ein. Vorwiegend konnte in allen untersuchten Geweben α-T nachgewiesen werden, insbesondere im Gehirn (5,4 nmol/g; 99,8 %), wobei die α-T-Gehalte in Herz, Nieren und Leber am höchsten waren (21,2-24,2 nmol/g Gewebe).
Die Ergebnisse bezüglich der bevorzugten Anreicherung von T3 in der Haut stimmen mit denen von IKEDA et al. (2000; 2001; 2003) überein. Im Gegensatz zu den Ergebnissen von Podda et al. (1996) waren die α-T3-Gehalte im Vergleich zu den γ-T3-Gehalten in der Haut von Ratten sowie von Mäusen höher, obwohl der γ-T3- Gehalt in der für 8 Wochen verabreichten T- und T3-Mixtur aus Palmöl größer war (IKEDA et al. 2000; 2001). IKEDA et al. (2001) vermuteten, dass bei α-T3 die Methylgruppe an C5 des Chromanolringes für diese Diskriminierung verantwortlich sei.
Als weiteres Zielgewebe für die Akkumulation von Tocotrienolen hat sich das Fettgewebe herausgestellt (HAYES et al. 1993; IKEDA et al. 2001; KAWAKAMI et al.
2007; UCHIDA et al. 2012). HAYES et al. (1993) konnten im Fettgewebe von Hamstern durch Supplementierung eines mit Palmöl versetzten Futters mit T3- Gehalten von 223 mg/kg über 11 bis 15 Wochen beträchtliche α-T3, γ-T3 und sogar δ-T3-Gehalte nachweisen. In einer anderen Studie verabreichten KAWAKAMI et al.
(2007) über die Dauer von 3 Wochen Tocotrienole aus Reiskleie mit hohem γ-T3- Anteil (61,6 %) an Ratten und berichteten über einen signifikanten Anstieg der γ-T3- Gehalte im Fettgewebe von 1,1 nmol/g zu 10,2 nmol/g. Auch in Haut, Lunge, Herz, Nieren und Muskulatur wurde γ-T3 schnell absorbiert, wobei ein Anstieg der γ-T3- Konzentrationen von jeweils 0,21 nmol/g zu 1,84 nmol/g, 0,03 nmol/g zu 1,47 nmol/g, 0,05 nmol/g zu 1,28 nmol/g, 0,01 nmol/g zu 0,93 nmol/g und 0,02 nmol/g zu 0,87 nmol/g erreicht wurden. Damit waren die γ-T3 Gehalte im Vergleich zur Kontrollgruppe um jeweils das 9-, 49-, 26-, 93-, und 44-fache höher. Über die Verteilung der α-T3-, ß-T3- und δ-T3-Vitamere im Organismus wurde in dieser Studie nicht berichtet, vermutlich da die prozentualen Anteile von jeweils 0,5 %, 0,6 % und 2,7 % in Reiskleie im Vergleich zu γ-T3 sehr gering waren.
Ergebnisse einer Langzeitstudie an Ratten zeigten ebenfalls, dass die Aufnahme von T- und T3-Vitameren im Fettgewebe langsamer abläuft, aber dass dennoch im Falle eines Vitamin-E-Mangels die Speicherung im Fettgewebe im Vergleich zu anderen
Organen über viele Wochen ohne Abbauvorgänge aufrechterhalten werden kann (UCHIDA et al. 2012).
Einige Studien berichteten, dass α-T die Aufnahme von α-T3 in das Körpergewebe vermindert (IKEDA et al. 2003; KHANNA et al. 2005a; UCHIDA et al. 2012). Die γ-T3 Gehalte wurden nicht beeinflusst. KHANNA et al. (2005a) führten die Überlegung aus, dass die gemeinsame Supplementierung von α-T und α-T3, durch die Konkurrenz der beiden Vitamere um das α-TTP in der Leber, den Transfer von α-T3 ins Gewebe beeinträchtigen würde. KAWAKAMI et al. (2007) vermuteten, dass die Speicherung der Tocotrienole auch von dem Cytochrom P450-Gehalt im Körpergewebe beeinflusst wird. Bei Cytochromen P450 handelt es sich körpereigene Enzyme, die für die Biotransformation lipophiler Stoffe von Bedeutung sind. Die T- und T3-Gehalte im Gewebe von Ratten können durch Sesamin, einer Komponente in Sesamsamen und einer Hemmsubstanz von Cytochrom P450, erhöht werden (IKEDA et al. 2001). Cytochrom P450 kommt in vielen extrahepatischen Geweben vor und wird unterschiedlich exprimiert (KALSOTRA et al. 2002;
YOSHINARI et al. 2004).
2.3.4 Metabolismus und Ausscheidung
Die Abbaurate der einzelnen T- und T3-Vitamere unterscheidet sich erheblich und ist ebenfalls ein wichtiger Faktor für deren Bioverfügbarkeit (BIRRINGER et al. 2002;
ZHAO et al. 2010; TERNES et al. 2011).
In der Leber werden die Tocopherole und Tocotrienole über einen oxidativen Seitenkettenabbau zu Carboxyethylhydroxychromanen (CEHCs) metabolisiert. Der Abbau wird durch eine ω-Hydroxylierung der Phytyl-Seitenkette initiiert und durch Cytochrom P450-abhängige Monooxygenasen (CYP) katalysiert. Im Anschluss erfolgt ein schrittweiser Abbau der Seitenkette durch fünf ß-Oxidationsschritte, wobei bei jedem Zyklus zwei Kohlenstoffreste von der Seitenkette abgespalten werden. Als Endprodukte fallen die kurzkettigen CEHCs an, wie die 2,5,7,8-tetramethyl-2(2`- carboxyethyl)-6-hydroxychromane (α-CEHCs) als Metabolite von α-T und α-T3, und die 2,7,8-trimethyl-2(2`carboxyethyl)-6-hydroxychromane (γ-CEHCs) als Metabolite von γ-T und γ-T3, sowie deren Vorläufer Carboxymethylbutylhydroxychromane (CMBHC), die als Glucuronid- oder Sulfatkonjugate über den Urin ausgeschieden werden (LI et al. 2008; ZHAO et al. 2010). Zusätzlich zur Ausscheidung über den Urin ist die Absonderung der überschüssigen T und T3 über die Galle von Bedeutung
(TRABER u. KAYDEN 1989). ZHAO et al. (2010) gelang es im Urin und in Fäzesproben von Menschen und Mäusen verschiedene Metabolite aus dem oxidativen Seitenkettenabbau der T- und T3-Vitamere zu analysieren. Während nach Verabreichung eines Tocopherolpräparates (α-T, 13,0 %; β-T,1,5 %; γ-T, 56,8 % und δ-T, 24,3 %) im Urin nur kurzkettige CEHCs und CMBHCs zu finden waren, konnten in den Fäzes zusätzlich zu den Ausgangsverbindungen α-T, γ-T und δ-T, deren mittelkettige Metabolite, die Carboxymethylhexylhydroxychromane (CMHHCs) und Carboxydimethyloctylhydroxychromane (CDMOHCs) sowie die langkettigen Metabolite, die Carboxydimethyldecylhydroxychromane und carboxylierten Tocopherole (Tocopherol-COOH), nachgewiesen werden. Der Metabolismus der Tocopherole ist in Abb. 4 zu sehen. Da die Tocopherole und deren längerkettigen Metabolite lipophiler sind, werden sie mit anderen fettlöslichen Substanzen über die Galle in den Darm ausgeschieden, während die hydrophilen kurzkettigen Metabolite als Konjugate über das Blut in den Urin gelangen. Zusätzlich war ein stärkerer und vermehrter Abbau von γ-T und δ-T im Vergleich zu α-T nachzuweisen. Während α-T durch die bevorzugte Bindung an das α-TTP von der Leber ins Blut transportiert wird, verbleiben γ-T und δ-T vermutlich in der Leber und werden dort metabolisiert.
Literaturübersicht
CH3 CH3 O
CH3 O H
C H3
CH3
CH3
CH3 CH3
CH3 O
CH3 O H
C H3
CH3
CH3 CH3 CH3
COOH
COOH O
CH3 O H
C H3
CH3
CH3
CH3 CH3
COOH O
CH3 O H
C H3
CH3
CH3
CH3 CH3
COOH O
CH3 O H
C H3
CH3
CH3
CH3
COOH O
CH3 O H
C H3
CH3
CH3 CH3
O CH3 O H
C H3
CH3
COOH CH3
Abb. 4: Mechanismus des oxidativen Seitenkettenabbaus der Tocopherole am Beispiel von α-Tocopherol.
Nach einer initialen ω-Hydroxylierung wird α-Tocopherol durch fünffache ß-Oxidation zum finalen Metaboliten α-CEHC abgebaut.
α-Tocopherol
α-Tocopherol-COOH
α-CDMDHC
Carboxydimethyldecyl- hydroxychroman ω-Oxidation
ß-Oxidation
ß-Oxidation
α-CDMOHC
Carboxydimethyloctyl- hydroxychroman ß-Oxidation
α-CMHHC
Carboxymethylhexyl- hydroxychroman ß-Oxidation
ß-Oxidation
α-CMBHC
Carboxymethylbutyl- hydroxychroman α-CEHC Carboxyethyl- hydroxychroman
Bei der Verabreichung eines Tocotrienolpräparates (α-T3, 20,2 %; ß-T3, 4,0 %; γ-T3, 16,1 %; δ-T3, 9,9 %; α-T, 14,8 % und γ-T, 3,1 %) über 21 Wochen konnten in den Fäzesproben von Mäusen die Ausgangsverbindungen γ-T3 und α-T3, deren Metabolite α-CEHCs und CMBHCs, sowie die bis dahin unbekannten γ-Carboxymethylbutenylhydoxychromane (CMBenHC) identifiziert werden. Weiterhin ergab die Analyse den Nachweis von Carboxymethylhexenylhydroxychromanen (CMHenHCs), Carboxydimethyloctenylhydroxychromanen (CDMOenHCs), Carboxydimethyloctadienylhydroxychromanen (CDMOen2HC),
Carboxydimethyldecadienylhydroxychromanen (CDMD(en)2HCs) und carboxylierten Tocotrienolen (Tocotrienol-COOH) (ZHAO et al. 2010). Der oxidative Seitenkettenabbau der Tocotrienole läuft aufgrund der vorhandenen Doppelbindungen im Vergleich zu den Tocopherolen komplexer ab (Abb. 5), da im 2.
sowie 4. Schritt der ß-Oxidation zusätzliche Enzyme nötig sind, 2,4-Dienoyl-CoA- Reduktase und 3,2-Enoyl-CoA-Isomerase (BIRRINGER et al. 2002).
Im Vergleich zu dem Spektrum der Tocopherolabbauprodukte waren in den Mäusefäzes vermehrt kurzkettige Metaboliten zu finden.
Durch den Überschuss an T- und T3-Vitameren und deren Abbauprodukten in nicht konjugierter Form in den Fäzes, kann herausgestellt werden, dass die Exkretion über die Fäzes der Haupteliminierungsweg ist (ZHAO et al. 2010).
Die Ergebnisse bezüglich der geringen Ausscheidung über den Urin werden durch LODGE et al. (2001) bestätigt. In einer Humanstudie konnten im Verhältnis zur verabreichten Dosis an α-Tocotrienol und γ-Tocotrienol ebenfalls nur geringe Mengen α-CEHC (1-2 %) und γ-CEHC (4-6 %) im Urin wiedergefunden werden.
CH3 CH3 O
CH3 O H
C H3
CH3
CH3
CH3 CH3
COOH CH3 O
CH3 O H
C H3
CH3
CH3
CH3 CH3
COOH O
CH3 O H
C H3
CH3
CH3
CH3 CH3
O CH3 O H
C H3
CH3
CH3 CH3
COOH CH3
O CH3 O H
C H3
CH3
CH3 CH3
COOH CH3
O CH3 O H
C H3
CH3
CH3
CH3
COOH
O CH3 O H
C H3
CH3
CH3
COOH CH3
O CH3 O H
C H3
CH3
CH3
COOH CH3
O CH3 O H
C H3
CH3
COOH CH3
Abb. 5: Metabolismus der Tocotrienole am Beispiel von α-Tocotrienol. Aufgrund der ungesättigten Seitenkette der Tocotrienole sind im 2. sowie 4. Schritt der ß-Oxidation zwei zusätzliche Enzyme nötig, 2,4-Dienoyl-CoA-Reduktase und 3,2-Enoyl-CoA-Isomerase
α-Tocotrienol
α-Tocotrienol-COOH
α-CDMD(en)2HC
Carboxydimethyldecadienyl- hydroxychroman
ω-Oxidation
ß-Oxidation
ß-Oxidation
α-CDMO(en)HC Carboxydimethyloctenyl- hydroxychroman
ß-Oxidation
α-CMHenHC
Carboxymethylhexenyl- hydroxychroman
ß-Oxidation
α-CMBHC
Carboxymethylbutyl- hydroxychroman
α-CEHC Carboxyethyl- hydroxychroman α-CDMO(en)2HC
Carboxydimethyloctadienyl- hydroxychroman
2,4-Dienoyl-CoA-Reduktase 3,2-Enoyl-CoA-Isomerase
α-CMBenHC
Carboxymethylbutenyl- hydroxychroman ß-Oxidation
2,4-Dienoyl-CoA-Reduktase 3,2-Enoyl-CoA-Isomerase
2.4 Physiologische Wirkungen der Tocotrienole
Bedingt durch den besonderen gesundheitlichen Nutzen ist das Interesse an T3 in den letzten Jahren enorm angestiegen. In seiner Funktion als Antioxidans weist α-T3 in biologischen Membranen eine bis zu 60-mal größere Aktivität als α-T auf (SERBINOVA et al. 1991). Zusätzlich verfügen sie über antikarzinogene, neuroprotektive und cholesterolsenkende Eigenschaften, wobei die letzten beiden ausschließlich auf die T3 zurückzuführen sind (SEN et al. 2006; KHANNA et al.
2010). Bereits in nanomolaren Konzentrationen wurde für α-T3 eine neuroprotektive Wirkung durch Regulation spezifischer neurodegenerativer Signalwege nachgewiesen (KHANNA et al. 2003; 2006; 2010). In einer tierexperimentellen Untersuchung wurde α-T3 nach oraler Aufnahme nicht nur ins Gehirn transportiert, sondern schützte dort auch vor herbeigeführten Schäden (Neurodegeneration) durch einen Schlaganfall (KHANNA et al. 2005b). Weiterhin zeigten in vitro Studien, dass T3 die Proliferation unterschiedlicher Tumorzellen unterdrücken können. In vivo konnte den T3 in Tiermodellen eine besondere Aktivität gegenüber Brustkrebs und Melanomen sowie für Krebserkrankungen der Lunge und Leber nachgewiesen werden (CONSTANTINOU et al. 2008).
Eine ausführlichere Beschreibung der antioxidativen, neuroprotektiven und antikarzinogenen Eigenschaften ist in den Arbeiten von SEN et al. (2007) und WATSON und PREEDY (2009) zu finden.
Im Folgenden wird ausschließlich auf die cholesterolsenkenden Eigenschaften der Tocotrienole, einem Schwerpunktthema dieser Arbeit, näher eingegangen.
Obwohl Cholesterol für viele Körperfunktionen lebensnotwendig ist, kann durch eine genetisch oder diätetisch bedingte Stoffwechselstörung eine Hypercholesterolämie ausgelöst werden, die ein Risikofaktor für verschiedene Erkrankungen wie Atherosklerose oder die Alzheimer Krankheit darstellt (MAXFIELD u. TABAS 2005).
Aus diesem Grund ist es wichtig den Blutserum-Cholesterolspiegel zu kontrollieren um der Entstehung von Zivilisationserkrankungen vorzubeugen.
Es ist mittlerweile bekannt, dass die cholesterolsenkende Wirkung der T3 durch die posttranskriptionale Hemmung der HMG-CoA-Reduktase bedingt wird. Es handelt sich dabei um ein geschwindigkeitsbestimmendes Enzym, dass in der Cholesterolbiosynthese das HMG-CoA zu Mevalonat reduziert (PEARCE et al.