9. Anhang
9.2 Abbildungsverzeichnis
Abb. 1: Chemische Strukturen der natürlich vorkommenden Tocopherole und Tocotrienole. Die Reste R1, R2 und R3 kennzeichnen die entsprechenden Substitutionen am Chomanolring ... 6 Abb. 2: Schematisierter Längsschnitt durch ein Gerstenkorn ... 11 Abb. 3: Schematische Darstellung von Absorption und Transport der Tocopherole
und Tocotrienole im Organismus. ... 18 Abb. 4: Mechanismus des oxidativen Seitenkettenabbaus der Tocopherole am
Beispiel von α-Tocopherol. ... 22 Abb. 5: Metabolismus der Tocotrienole am Beispiel von α-Tocotrienol. Aufgrund der
ungesättigten Seitenkette der Tocotrienole sind im 2. sowie 4. Schritt der ß-Oxidation zwei zusätzliche Enzyme nötig, 2,4-Dienoyl-CoA-Reduktase und 3,2-Enoyl-CoA-Isomerase ... 24 Abb. 6: Darstellung selbst hergestellter Nanoemulsionen (Kap.3.4) mit einem
transparenten (Α) und milchigen (B) Aussehen ... 31 Abb. 7: Kalibriergeraden der Tocotrienole; HPLC-Trennung mit der (a) Prontosil
120-3-Diol-Säule unter Verwendung des Eluenten (α) 1,4-Dioxan/TBME/n-Hexan (3,2:1,0:95,8; v/v/v) ... 52 Abb. 8: Kalibriergeraden der Tocopherole; HPLC-Trennung mit der (a) Prontosil
120-3-Diol-Säule unter Verwendung des Eluenten (a) 1,4-Dioxan/TBME/n-Hexan (3,2:1,0:95,8; v/v/v) ... 52 Abb. 9: Kalibriergeraden der Tocotrienole; HPLC-Trennung mit der (b) Prontosil
120-5-Diol-Säule (250 x 4 mm) unter Verwendung des Eluenten (b) 1,4-Dioxan/2-Propanol/n-Hexan (1,0:0,35:98,65; v/v/v) ... 54 Abb. 10: Kalibriergeraden der Tocopherole; HPLC-Trennung mit der (b) Prontosil
120-5-Diol-Säule (250 x 4 mm) unter Verwendung des Eluenten (b) 1,4-Dioxan/2-Propanol/n-Hexan (1,0:0,35:98,65; v/v/v) ... 54 Abb. 11: Graphische Darstellung und Formel der Kalibriergeraden des internen
Standards PMC ... 56 Abb. 12: Standardaddition zur Bestimmung von ß-Tocopherol im
gefriergetrockneten Eigelbpulver ... 57 Abb. 13: Bestimmung des Signalrauschverhältnisses (S/N) am Beispiel von
α-Tocopherol (RT = 10,91 min) ... 59
Abb. 14: Graphische Darstellung und Formel der Kalibriergeraden von Cholesterol unter Berücksichtigung des internen Standards Cholestanol ... 62 Abb. 15: Chromatogramm für die Bestimmungsgrenze (0,02 mg/mL) von Cholesterol
... 63 Abb. 16: Chromatogramm der acht Tocotrienol- und
Tocopherol-Vergleichssubstanzen (0,625 µg/mL) mit PMC als internen Standard. HPLC Trennung mit (b) Prontosil 120-5-Diol-Säule und der mobilen Phase (b) 1,4-Dioxan/2-Propanol/n-Hexan (1,0:0,35:98,65; v/v/v). ... 67 Abb. 17: Chromatogramm der T-und T3-Vitamere aus Gerstenöl. HPLC Trennung
mit (a) Prontosil 120-3-Diol-Säule und der Eluentenzusammensetzung (a) 1,4-Dioxan/TBME/n-Hexan (3,2:1,0:95,8; v/v/v). 1 = α-T (RT 9,22 min); 2 = α-T3 (RT 11,49 min); 4 = T (RT 15,92 min); 5 = γ-T (RT 18,26 min); 6 = β-T3 (RT 20,49 min); 7 = γ-β-T3 (RT 23,66 min); 8 = δ-T (RT 26,35 min); 9 = δ-T3 (RT 35,37 min); 10 = unbekannte Substanzen in Gerstenöl (RT 14,64 min; 25,03 min; 29,54 min ) ... 68 Abb. 18: Chromatogramm der T-und T3-Vitamere aus Palmöl. HPLC Trennung mit
(a) Prontosil 120-3-Diol-Säule und der Eluentenzusammensetzung (a) 1,4-Dioxan/TBME/n-Hexan (3,2:1,0:95,8; v/v/v). 1 = T (RT 10,32 min); 2 = α-T3 (RT 13,05 min); 4 = T (RT 17,00 min); 5 = γ-T (RT 19,75 min); 6 = β-T3 (RT 22,17 min); 7 = γ-β-T3 (RT 26,05 min); 9 = δ-β-T3 (RT 38,29 min); 10 = weitere unbekannte Substanz in Palmöl (RT 11,12 min) ... 68 Abb. 19: Chromatogramm der T- und T3-Vitamere aus dem Legehennenfutter. HPLC
Trennung mit (a) Prontosil 120-3-Diol-Säule und der
Eluentenzusammensetzung (a) 1,4-Dioxan/TBME/n-Hexan (3,2:1,0:95,8;
v/v/v). 1 = α-T (RT 10,22 min); 2 = α-T3 (RT 12,92 min); 4 = β-T (RT 16,77 min); 5 = γ-T (RT 19,47 min); 6 = β-T3 (RT 21,87 min); 7 = γ-T3 (RT 25,56 min); 8 = δ-T (RT 27,88 min); 10 = weitere unbekannte Substanzen im Legehennenfutter (RT 15,37 min; 43,99 min) ... 69 Abb. 20: Chromatogramm der T- und T3-Vitamere aus einer Eigelbprobe von Tag 0
der Fütterungstudie ohne Dotierung von Gerstenöl-bzw.
Palmöl-Supplement. HPLC Trennung mit (b) Prontosil 120-5-Diol-Säule und der mobilen Phase (b) 1,4-Dioxan/2-Propanol/n-Hexan (1,0:0,35:98,65; v/v/v). 1
= α-T (RT 10,52 min); 2 = α-T3 (RT 12,44 min); 3 = PMC (RT 13,37 min) 4 = β-T (RT 12,32 min); 5 = γ-T (RT 24,40 min); 6 = β-T3 (RT 26,07 min); 8
= δ-T (RT 38,40 min) ... 70
Abb. 21: Chromatogramm der T- und T3-Vitamere aus einer Eigelbprobe von Tag 28 nach Fütterung von Gersten ÖL NE. HPLC Trennung mit (b) Prontosil 120-5-Diol-Säule und der mobilen Phase (b) 1,4-Dioxan/2-Propanol/n-Hexan (1,0:0,35:98,65; v/v/v). 1 = α-T (RT 11,11 min); 2 = α-T3 (RT 13,16 min); 3 = PMC (RT 14,16 min) 4 = T (RT 22,48 min); 5 = γ-T (RT 25,78 min); 6 = β-T3 (RT 27,50 min); 7 = γ-β-T3 (RT 31,52 min); 8 = δ-T (RT 40,64 min) ... 71
Abb. 22: Chromatogramm der T- und T3-Vitamere aus einer Eigelbprobe von Tag 28 nach Fütterung von Palm ÖL NE. HPLC Trennung mit (b) Prontosil 120-5-Diol-Säule und der mobilen Phase (b) 1,4-Dioxan/2-Propanol/n-Hexan (1,0:0,35:98,65; v/v/v). 1 = α-T (RT 10,87 min); 2 = α-T3 (RT 12,88 min); 3 = PMC (RT 13,83 min) 4 = T (RT 22,06 min); 5 = γ-T (RT 25,32 min); 6 = β-T3 (RT 27,02 min); 7 = γ-β-T3 (RT 31,14 min); 8 = δ-T (RT 40,11 min); 10 = weitere unbekannte Substanz im Palmöl (RT = 11,45 min) (siehe Abb. 18) ... 71 Abb. 23: Ausschnitt eines Chromatogramms der T- und T3-Vitamere aus einer
Eigelbprobe (5-fache Aufkonzentrierung) von Tag 28 nach Fütterung der Palm ÖL NE. HPLC Trennung mit (b) Prontosil 120-5-Diol-Säule und der mobilen Phase (b) 1,4-Dioxan/2-Propanol/n-Hexan (1,0:0,35:98,65; v/v/v). 8
= δ-T (RT 42,65 min), 9 = δ-T3 (RT 53,11 min); 10 = weitere unbekannte Substanz im Palmöl (RT 40,30 min) ... 72 Abb. 24: Gesamt-T3-Gehalte im Verlauf der Fütterungsstudie, ausgedrückt als
Mittelwert aller Gerstenöl- bzw. Palmöl-Supplemente ... 75 Abb. 25: Gesamt-T-Gehalte im Verlauf der Fütterungsstudie, ausgedrückt als
Mittelwert aller Gerstenöl- bzw. Palmöl-Supplemente ... 77 Abb. 26: Ausschnitt aus einem Beispielchromatogramm der Cholesterolanalyse im
Eigelb mittels Gaschromatographie ... 85 Abb. 27: Cholesterolgehalte in Hühnereiern der Fütterungsstudie (n=3). ... 86 Abb. 28: Cholesterolgehalte im Blutserum der Legehennen an Tag 0 und Tag 28
der Fütterungsstudie (n=3). ... 87
9.3 Tabellenverzeichnis
Tab. 1: Biologische Aktivität ausgewählter Tocopherole und Tocotrienole als
Tocopheroläquivalente (TÄ) ... 7
Tab. 2: Tocopherole und Tocotrienole in ausgewählten Pflanzenölen [mg/kg] ... 9
Tab. 3: Aufbau und Zusammensetzung des Hühnereies ... 33
Tab. 4: Zusammensetzung des Alleinfuttermittels für Legehennen ... 41
Tab. 5: Tocochromanolgehalte in der täglich verabreichten Ration an Gerstenöl und Palmöl über die verschiedenen Supplemente und in der gesamten täglich aufgenommenen Futtermenge ... 42
Tab. 6: Tröpfchengrößen von selbst hergestellten Nanoemulsionen mit 5 % Ölgehalt ... 43
Tab. 7: Tröpfchengrößen von selbst hergestellten selbstemulgierenden Formulierungen mit 83,3 % Ölgehalt ... 43
Tab. 8: Physikalische Eigenschaften der Tocochromanole ... 51
Tab. 9: Formeln der Kalibriergeraden der Tocochromanole; HPLC-Trennung mit der (a) Prontosil 120-3-Diol-Säule unter Verwendung des Eluenten (a) 1,4-Dioxan/TBME/n-Hexan (3,2:1,0:95,8; v/v/v) ... 53
Tab. 10: Formeln der Kalibriergeraden der Tocochromanole; HPLC-Trennung mit der (b) Prontosil 120-5-Diol-Säule (250 x 4 mm) unter Verwendung des Eluenten (b) 1,4-Dioxan/2-Propanol/n-Hexan (1,0:0,35:98,65; v/v/v) ... 55
Tab. 11: Nachweis- und Bestimmungsgrenzen der Tocochromanole im Eigelb ... 58
Tab. 12: Gaschromatographische Bedingungen ... 59
Tab. 13: Mittelwerte der Fütterungsstudie ... 66
Tab. 14: Parameter von Legeleistung und Eigewicht während der 28-tägigen Fütterungsstudie ... 74
Tab. 15: HPLC Quantifizierung der T3- und T-Vitamere in Tag-0- und Tag-28-Eiern der Fütterungsstudie ... 80
Tab. 16: HPLC Quantifizierung der T3- und T-Vitamere in Tag-10- und Tag-19-Eiern der Fütterungsstudie ... 81
Tab. 17: Biotransferraten (%) der Tocochromanole ins Eigelb ... 84
9.4 Abkürzungsverzeichnis
α-, ß-, γ-, δ-T Alpha-, beta-, gamma-, delta-Tocopherol α-, ß-, γ-, δ-T3 Alpha-, beta-, gamma-, delta-Tocotrienol α-TTP Alpha-Tocopheroltransferprotein
ABCA1 ATP-binding cassette A1
AUC Area under the curve
(Fläche unter der Konzentration-Zeit-Kurve)
CPO Crude Palm Oil
CYP Cytochrom P450-abhängige Monooxygenase CDMD(en)2HC Carboxydimethyldecadienylhydroxychroman CDMDHC Carboxydimethyldecylhydroxychroman CDMO(en)2HC Carboxydimethyloctadienylhydroxychroman CDMO(en)HC Carboxydimethyloctenylhydroxychroman
Gersten ÖL Gerstenöl ohne Emulgierung
Gersten ÖL NE Formulierung des Gerstenöls in einer Nanoemulsion
Gersten ÖL SES Formulierung des Gerstenöls in einem selbstemulgierenden System HDL High Density Lipoprotein
HMG-CoA 3-Hydroxy-3-Methylglutaryl Coenzym A HPLC High Performance Liquid Chromatographie,
(Hochleistungsflüssigkeitschromatographie)
Hrsg. Herausgeber
IDL Intermediate Density Lipoprotein
Kap. Kapitel
kg Kilogramm
LDL Low Density Lipoprotein
LFGB Lebensmittel- und Futtermittelgesetzbuch LMBG Lebensmittel- und Bedarfsgegenständegesetz
LPL Lipoproteinlipase
LSD-Test Least Significant Difference test
mg Milligramm
NPC1L1 Niemann-Pick C1-like protein 1 O/W-Emulsion Öl-in-Wasser-Emulsion
Palm ÖL Palmöl ohne Emulgierung
Palm ÖL NE Formulierung des Palmöls in einer Nanoemulsion
Palm ÖL SES Formulierung des Palmöls in einem selbstemulgierenden System PMC 2,2,5,7,8-Pentamethyl-6-chromanol
RP Reversed Phase
RT Retentionszeit
SES Selbstemulgierende Systeme SLN Solid Lipid Nanoparticles SPF Supernatant Protein Factor
SR-B1 Scavenger Rezeptor class B type 1
T Tocopherol VLDL Very Low Density Lipoprotein W/O-Emulsion Wasser-in-Öl-Emulsion
9.5 Glossar
alimentär die Ernährung betreffend
Anämie Blutarmut
antikarzinogen krebshemmend Atherosklerose Arterienverkalkung Ductus thoracicus Milchbrustgang Enterozyten Darmepithelzellen gastral den Magen betreffend hepatisch die Leber betreffend Hepatozyten Leberzellen
Hypercholesterolämie Cholesterolüberschuss
Hypocholesterolämie Verminderter Cholesterolgehalt des Blutes intestinal auf den Darm bezogen
koronar auf die Herzkranzgefäße bezogen lingual die Zunge betreffend
Myopathie Muskelerkrankung
neuroprotektiv die Nervenzellen schützend
9.6 Bestimmung der Wiederfindungsraten im gefriergetrockneten
WFR % = Wiederfindungsrate %; < NWG = < Nachweisgrenze; STABWA = Standardabweichung
a T3- und T-Standardlösung ist ein Gemisch aus: ß-T (30 mg/L), δ-T (10 mg/L), γ-T3 (10 mg/L), δ-T3 (10 mg/L).
9.7 Auswertungsberichte vom DIL über die Tröpfchengrößen der Nanoemulsionen und selbstemulgierenden Formulierungen
Tröpfchengrößen von selbst hergestellten Nanoemulsionen mit 5 % Gerstenöl
Tröpfchengrößen von selbst hergestellten Nanoemulsionen mit 5 % Palmöl
Tröpfchengrößen von selbst hergestellten selbstemulgierenden Formulierungen mit 83,3 % Gerstenöl
Tröpfchengrößen von selbst hergestellten selbstemulgierenden Formulierungen mit 83,3 % Palmöl
9.8 Danksagung
Die Anfertigung der vorliegenden Dissertationsarbeit wäre ohne die Unterstützung von Familie, Freunden und Kollegen nicht möglich gewesen, weswegen ich mich an dieser Stelle bei allen bedanken möchte.
Herrn Prof. Dr. Ternes danke ich für die Überlassung des interessanten Promotionsthemas sowie die allzeit gewährte fachliche Betreuung und freundliche Unterstützung.
Besonders bedanke ich mich bei Frau Dr. Astrid Drotleff, die mir mit ihrem Fachwissen, konstruktiven Ratschlägen und vielen Ideen immer wieder den nötigen Anschwung für das Gelingen der Arbeit gegeben hat.
Des Weiteren gilt mein großer Dank Frau Barras-Akhnoukh für die fleißige Unterstützung während der Probenaufbereitung und die zahlreichen Cholesterolmessungen.
Frau Dr.-Ing. habil. Ute Bindrich vom Deutschen Institut für Lebensmitteltechnik e.V.
danke ich für die Partikelgrößenanalysen der Emulsionssysteme.
Weiterhin möchte ich mich bei allen Mitarbeitern der Klinik für Geflügel der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover, insbesondere bei Herrn PD Dr. Gerhard Glünder, für die Bereitstellung der Versuchstiere und Räumlichkeiten sowie der Unterstützung bei der Durchführung der Fütterungsstudie bedanken.
Der Bruno Fehse u. Sohn GmbH & Co. KG danke ich für die kostenlose Überlassung des Legehennenfutters.
Ein großer Dank geht auch an alle Kolleginnen und Kollegen des Arbeitskreises der Chemischen Analytik für die gegenseitige Unterstützung und das außerordentlich
gute Arbeitsklima, allen voran den Doktoranden Eva, Martina, Guido, Sabrina, Anne, Kathrin, Sonia, Katrin, Rebekka, Peter und Timo.
Meinen Eltern dafür, dass sie mir das Studium der Veterinärmedizin ermöglichten und auch während der Anfertigung der Dissertation immer für mich da waren.
Von ganzem Herzen danke ich meinem Mann Michael, für die unermüdliche Unterstützung und das Vertrauen in mich während aller Höhen und Tiefen der Doktorzeit.