Aus dem Institut für Medizinische Mikrobiologie und
Krankenhaushygiene der Medizinischen Hochschule Hannover
Mechanismen der Antikörper-vermittelten Immunität des Respirationstraktes bei Infektionen mit Burkholderia
pseudomallei
THESE
zur Erlangung des Grades eines DOCTOR OF PHILOSOPHY
-Ph.D.-
im Fachgebiet Mikrobiologie
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
vorgelegt von Sonja Klocke aus Bad Oeynhausen
Hannover 2004
Supervisor: PD Dr. Ivo Steinmetz
Betreuungsgruppe: PD Dr. Ivo Steinmetz
Prof. Dr. Ludwig Haas
PD Dr. Thomas Tschernig
1. Gutachten: PD Dr. Ivo Steinmetz (Institut für Medizinische Mikrobiologie und Krankenhaushygiene der Medizinischen Hochschule Hannover) Prof. Dr. Ludwig Haas (Institut für Virologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover)
PD Dr. Thomas Tschernig (Zentrum Anatomie II: Funktionelle und angewandte Anatomie der Medizinischen Hochschule Hannover)
2. Gutachten: Prof. Dr. Ulrich Vogel (Institut für Hygiene und Mikrobiologie der Universität Würzburg)
Datum der mündlichen Prüfung: 11.11.2004
gefördert durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft Graduiertenkolleg 745 (Mukosale Erreger- Wirt-Interaktionen)
Für meine Eltern
1. EINLEITUNG... 11
2. SCHRIFTTUM ... 13
2.1. Burkholderia pseudomallei, der Erreger der Melioidose... 13
2.2. Epidemiologie... 15
2.3. Virulenzfaktoren von Burkholderia pseudomallei... 17
2.4. Melioidose: Krankheitsbild des Menschen... 20
2.5. Melioidose: Krankheitsbild bei Tieren... 22
2.7. Antikörper-vermittelte Immunität bei experimenteller Melioidose... 27
2.9. Zielsetzung der Arbeit... 33
3. MATERIAL UND METHODEN... 34
3.1. Bakterien... 34
3.1.1. Bakterienstämme... 34
3.1.2. Einfrieren und Auftauen von Bakterien... 34
3.1.3. Anzucht von Bakterien... 34
3.1.4. Bestimmung der Keimzahl mittels Colony Forming Units (CFU)... 35
3.2. Mausmodelle... 35
3.2.1. Rechtliche Grundlagen... 35
3.2.2. Mausstämme... 36
3.2.3. Haltung und Fütterung... 37
3.2.4. Narkose... 37
3.3. Zellkultur... 38
3.3.1. Präparation von Knochenmarkstammzellen aus der Maus... 38
3.3.2. Differenzierung von Knochenmarkstammzellen zu Makrophagen unter Zellkulturbedingungen... 38
3.3.3. Bestimmung der Zellzahl und Vitalität der Zellen... 39
3.4. Antikörper... 40
3.4.1. Bestimmung der Antikörperkonzentration mittels ELISA... 40
3.4.2. Bestimmung der Antikörperkonzentration mittels Proteinbestimmung nach Bradford41 3.5. Makrophagen Invasions- und Bakterizidie-Assays... 41
3.5.1. Makrophagen Invasions-Assay: Antikörper-vermittelte Phagozytose... 41
3.5.2. Makrophagen Bakterizidie-Assay IFNγ stimulierter und unstimulierter Zellen... 43
3.5.3. Makrophagen Bakterizidie-Assay: Hemmung der induzierbaren NO-Synthase (iNOS) 43 3.6. Infektion und passive Immunisierung im Mausmodell... 44
3.6.1. Infektions- und Immunisierungsrouten... 44
3.6.1.1. Intranasale Infektion und Immunisierung... 44
3.6.1.2. Intratracheale Infektion und Immunisierung ... 44
3.6.1.3. Intravenöse Immunisierung und Infektion... 44
3.6.2. Untersuchung der Mortalität... 45
3.6.3. Keimzahlbestimmung in Organen infizierter Tiere... 45
3.6.4. Neutralisation von IFNγ in vivo... 45
3.6.5. Statistische Auswertung der in vivo Versuche... 46
3.6.6. Histopathologische Untersuchung von Organen infizierter Mäuse... 46
3.7. Messung von NO... 47
3.7.1. Die Griess Reaktion: Prinzip der Methode... 47
3.7.2. Aussaat der Zellen... 48
3.7.3. NO-Messung nach Infektion... 48
3.7.4. NO-Messung nach Stimulation mit Immunkomplexen... 49
3.7.5. Hemmung von NF-κB bei NO-Stimulation durch Immunkomplexe... 49
3.8. Messung von ROI... 49
3.8.1. Bestimmung von H2O2 durch Fluoreszenz: Prinzip der Methode... 49
3.8.2. Aussaat der Zellen... 50
3.8.3. Messung nach Stimulation mit Phorbol Myristat Acetat... 51
3.8.4. Messung nach Infektion... 51
4. ERGEBNISSE ... 52
4.1. Pathohistologische Veränderungen von Lunge und Nasopharynx verursacht durch Infektionen mit Burkholderia pseudomallei... 52
4.2. Protektive Wirkung monoklonaler Anti-EPS Antikörper bei Infektionen mit Burkholderia pseudomallei im murinen Pneumoniemodell... 57
4.2.1. Effekt von lokal appliziertem IgG2a... 57
4.2.1.1. Mortalität nach intranasaler passiver Immunisierung mit IgG2a ... 57
4.2.1.2. Keimzahlbestimmung der Lunge nach intranasaler passiver Immunisierung mit IgG2a 59 4.2.1.3. Keimzahlbestimmung der Lunge nach intratrachealer passiver Immunisierung mit IgG2a ... 60
4.2.2. Effekt von lokal appliziertem EPS-spezifischem polymerem IgA... 62
4.2.2.1. Mortalität nach intranasaler passiver Immunisierung mit pIgA... 62
4.2.2.2. Keimzahlbestimmung der Lunge nach intranasaler passiver Immunisierung mit pIgA... 63
4.2.3. Effekte von systemisch appliziertem EPS-spezifischem IgG und IgA auf die Mortalität ... 65
4.3. Vergleich der opsonisierenden Eigenschaften verschiedener Isotypen EPS-spezifischer Antikörper bei der Phagozytose von Knochenmarkmakrophagen... 66
4.4. Bedeutung der Fcγ-Rezeptoren I und III für die protektiven Effekte von EPS-spezifischem IgG2a... 68
4.5. Antikörper-vermittelte Effektorfunktionen bei der Abwehr von Burkholderia pseudomallei71 4.5.1. NO-Produktion in Knochenmarkmakrophagen... 71
4.5.1.1. Kinetik der NO-Produktion von C57Bl/6- und BALB/c-Makrophagen ... 71
4.5.1.2. Stimulation der NO-Produktion in Knochenmarkmakrophagen nach Infektion mit Burkholderia pseudomallei... 73
4.5.1.3. Stimulation der NO-Produktion durch EPS- Immunkomplexe... 75
4.5.2. Die Rolle von NO in der intrazellulären bakteriziden Aktivität von Knochenmarkmakrophagen... 77
4.5.2.1. NO-Hemmung bei C57Bl/6- und BALB/c-Makrophagen ... 77
4.5.2.2. Invasion und Bakterizidie bei iNOS-Knock-out-Makrophagen ... 78
4.5.2.3. Antikörper-vermittelte Phagozytose bei iNOS-Knock-out-Makrophagen ... 80
4.5.3. Bedeutung von NO in vivo: Suszeptibilität von iNOS-Knock-out-Mäusen gegenüber Burkholderia pseudomallei... 81
4.5.3.1. Passive Immunisierung von iNOS-Knock-out-Mäusen ... 82
4.5.4. Stimulation von ROI in Knochenmarkmakrophagen... 84
4.5.4.1. Kinetik der Sauerstoffradikalproduktion in C57Bl/6- und BALB/c- Knochenmarkmakrophagen nach Stimulation mit Phorbol Myristat Acetat ... 84
4.5.4.2. Stimulation von ROI nach Infektion mit Burkholderia pseudomallei... 85
4.5.5. Bedeutung von ROI in vivo: Suszeptibilität von p47phox-Knock-out-Mäusen gegenüber Burkholderia pseudomallei... 88
4.5.6. IFNγ bei Bekämpfung von Burkholderia pseudomallei in vivo... 89
4.5.6.1. Neutralisierung von IFNγ bei C57Bl/6-Mäusen ... 89
4.5.6.2. Neutralisierung von IFNγ bei BALB/c-Mäusen ... 91
4.6. Rolle verschiedener Fcγ-Rezeptoren bei Phagozytose und NO-Produktion von Knochenmarkmakrophagen... 92
4.6.1. Phagozytosekapazität von Fcγ-chain-Knock-out-Makrophagen vermittelt durch verschiedene IgG Isotypen... 92
4.6.2. Stimulation von NO durch EPS-Immunkomplexe bei Fcγ-chain Knock-out- Makrophagen... 94
4.6.3. Phagozytosekapazität von Fcγ-chain/FcγRII-Knock-out vermittelt durch IgG verschiedener Subklassen... 95
4.6.4. Stimulation von NO durch EPS-Immunkomplexe bei Fcγ-chain/FcγRII-Knock-out- Makrophagen... 96
4.6.5. Rolle von NF-κB bei der Induktion der NO-Produktion durch EPS-Immunkomplexe.... 97
5. DISKUSSION ... 99
5.1. Vergleich der Bedeutung von EPS-spezifischem IgG und IgA für die Immunität des Respirationstraktes... 99
5.1.1. Die Rolle von Fc-Rezeptoren für die IgG-vermittelte Protektion... 102
5.2. Bedeutung von Immunkomplexen bei der Aktivierung von NO... 105
5.3. Bedeutung von NO bei der Bekämpfung einer Infektion mit Burkholderia pseudomallei in vitro und in vivo... 107
5.4. Bedeutung von ROI bei der Bekämpfung von Burkholderia pseudomallei... 111
5.5. NO und ROI; redundante Mechanismen bei der Bekämpfung von Burkholderia
pseudomallei?... 113
5.6. Rolle von IFNγ bei Burkholderia pseudomallei Infektionen von C57Bl/6- und BALB/c- Mäusen... 115
5.7. Aktivierung intrazellulärer Abwehrmechanismen durch Fcγ-Rezeptoren... 118
6. ZUSAMMENFASSUNG/SUMMARY ... 122
7. LITERATURVERZEICHNIS ... 126
8. ANHANG... 141
8.1. Geräte... 141
8.2. Gebrauchsmaterialien... 142
8.3. Medien... 143
8.3.1. Medien für die Bakterienanzucht:... 143
8.3.2. Medien für die Zellkultur... 143
8.4. Puffer und Lösungen... 144
8.5. Chemikalien... 145
8.6. Antikörper... 147
8.6.1. Antikörper für ELISA... 147
8.6.2. Monoklonale anti EPS Antikörper gegen B. pseudomallei... 147
8.6.3. Sonstige Antikörper... 148
8.7. Software... 148
Danksagungen ... 149
Veröffentlichungen: ... 151
Eidesstattliche Erklärung... 152
Abkürzungsverzeichnis:
Abb. Abbildung
ADCC Antibody Dependent Cellular Cytotoxicity
°C Grad Celsius CFU Colony Forming Units DCF Dichlorofluoreszein
DCF-DA Dichlorofluoreszein Diazetat DMSO Dimethylsulphoxid
ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay eNOS endotheliale Stickoxid-Synthase
EPS Exopolysaccharid
Fa. Firma
Fcµ/αR Fcµ/α-Rezeptor FCS Fetales Kälber Serum FcγR Fcγ-Rezeptor
g Mittlere Erdbeschleunigung 9,81 m/s2
GM-CSF Granulocyte Macrophage Colony-Stimulating Factor h Stunde(n)
HE Hämatoxilin Eosin IFNγ Interferon γ
iNOS induzierbare Stickoxid-Synthase
ITAM Immunoreceptor Tyrosin-based Activation Motive ITIM Immunoreceptor Tyrosin-based Inhibitory Motive
KO Knock-out
LB Luria Bertani LPS Lipopolysaccharid M Molar
mAK monoklonale Antikörper min. Minute(n)
MOI Multiplicity of Infection
MUG Methylumbelliferyl Galactopyranosid n.d. nicht detektierbar
NED Naphtyl Ethylendiamin NO Nitric Oxide (Stickoxid)
nNOS neuronale Stickoxid-Synthase PBS Phosphate buffered saline PDTC Pyrrolidindithiocarbamat pIgA polymeres IgA
PMA Phorbol Myristat Acetat RFU Relative Fluorescent Unit ROI Reactive Oxygen Intermediate SA Sulfanilsäure
U Unit WT Wildtyp
1. Einleitung
Das gram-negative Bakterium Burkholderia pseudomallei ist der Erreger der Melioidose, einer lebensbedrohenden Erkrankung. Zu den Endemiegebieten zählen vor allem Regionen mit tropischem und subtropischem Klima. Hier findet sich der saprophytisch lebende Erreger im Erdboden und auf Wasseroberflächen. Das Wirtsspektrum umfasst sowohl den Menschen als auch zahlreiche Tierarten, wobei eine Infektion vor allem über kontaminierte Hautwunden, aber auch durch Inhalation erfolgen kann (White 2003). Als fakultativ intrazellulärer Erreger ist Burkholderia pseudomallei in der Lage, in verschiedenen Körperzellen, wie zum Beispiel Makrophagen und Epithelzellen, zu überleben und sich sogar zu vermehren (Jones et al. 1996). Melioidose tritt in vielen verschiedenen klinischen Verlaufsformen auf, wobei die häufigste lokalisierte Form eine Pneumonie ist. Dabei sind die Mechanismen der Wirtsabwehr bislang noch größtenteils unbekannt.
Intranasale Infektionen bei verschiedenen Mausstämmen mit Burkholderia pseudomallei verursachen eine schwere Pneumonie und dienen so als gutes Modell zur Untersuchung der antibakteriellen Immunität des Respirationstraktes (Liu et al.
2002). Dabei zeigt sich, dass der Mausstamm C57Bl/6 eine deutlich höhere Resistenz gegenüber Burkholderia pseudomallei aufweist als der diesbezüglich hochempfängliche BALB/c-Stamm. Diese Resistenzunterschiede spiegeln sich nicht nur durch ein deutlich schnelleres Versterben der BALB/c-Tiere und höhere Keimzahlen in den inneren Organen in vivo wider (Hoppe et al. 1999), sondern korrelieren auch mit einer schlechteren bakteriziden Funktion der Knochenmarkmakrophagen von BALB/c- im Vergleich zu Knochenmarkmakrophagen von C57Bl/6- Mäusen in vitro (Breitbach 2004).
Für eine Vielzahl von Bakterien konnte gezeigt werden, dass die Produktion von Stickoxiden (NO) ein wichtiger Mechanismus bei der intrazellulären Abtötung von Erregern in Makrophagen ist und durch IFNγ und LPS stimuliert werden kann. Auch bei Infektionen der Makrophagenzelllinie J774.A1 mit Burkholderia pseudomallei konnte NO als wichtiger Faktor der intrazellulären bakteriziden Aktivität identifiziert werden (Miyagi et al. 1997). Des Weiteren induziert LPS von Burkholderia
pseudomallei im Vergleich zu Salmonella und Escherichia coli eine geringere und verzögerte Induktion von NO. Diesen Umstand bringt man mit der besonderen LPS- Struktur von Burkholderia pseudomallei in Verbindung (Utaisincharoen et al. 2001).
Neben LPS und IFNγ spielen auch Antikörper eine wichtige Rolle bei der Stimulation von NO. So konnte zum Beispiel in einem Modell mit Cryptococcus neoformans gezeigt werden, dass die NO-Produktion von Makrophagen durch verschiedene Immunkomplexe stimuliert werden kann (Mozaffarian et al. 1995). Die genauen Mechanismen sind jedoch bislang unbekannt. Eine Beteiligung von Fc-Rezeptoren und des globalen Transkriptionsfaktors NF-κB kann jedoch vermutet werden.
Die Bedeutung von Antikörpern bei der Abwehr von Burkholderia pseudomallei- Infektionen ist jedoch noch ungeklärt. Nach experimentellen Infektionen mit Burkholderia pseudomallei wurde die Bildung von Antikörpern verschiedener Isotypen in vivo im Mausmodell induziert (Hoppe et al. 1999). Ihre Rolle in der Abwehr einer Burkholderia pseudomallei-Infektion ist allerdings unklar. In anderen Experimenten führten lokal applizierte monoklonale Antikörper, die gegen Exopolysaccharide (EPS) von Burkholderia pseudomallei spezifisch sind, zu einer Protektion des Respirationstraktes im oben genannten Mausmodell (Breitbach 2004).
Experimentelle Daten über die Bedeutung einer IgG- und IgA- vermittelten Immunität bei Infektionen des Respirationstraktes sowie ihrer Verbindung mit der Produktion von NO und anderen Fc-vermittelten Effektorfunktionen liegen bislang jedoch nicht vor.
2. Schrifttum
2.1. Burkholderia pseudomallei, der Erreger der Melioidose
Melioidose ist eine potenziell tödliche Infektionskankheit, deren Krankheitsbild äußerst vielfältig ist, und die neben dem Menschen auch diverse Säugetiere und Vögel befallen kann. Sie wird vom gram-negativen Erreger Burkholderia pseudomallei verursacht und tritt vor allem in tropischen und subtropischen Regionen der Erde auf. Erstmalig wurde das Krankheitsbild der Melioidose 1912 von dem britischen Militärarzt und Pathologen Alfred Whitmore und seinem indischen Assistenten C.S. Krishnaswami im Ragnoon General Hospital in Burma, dem heutigen Myanmar, beschrieben (Whitmore & Krishnaswami 1912). Im Rahmen von polizeilich routinemäßig durchgeführten Sektionen stellten Whitmore und Krishnaswami fest, dass ein den pathologischen Veränderungen des Pferderotz ähnliches Krankheitsbild eine häufige Todesursache bei morphiumabhängigen Obdachlosen war. Die Veränderungen bestanden in multiplen Abszessen in verschiedenen Organen und der Haut. Es gelang ihnen weiterhin, den verantwortlichen Erreger zu isolieren. Dieser war ähnlich wie Burkholderia mallei, der Erreger des Rotzes bei Pferden, auf Peptonagar zu kultivieren. Im Tierversuch war er für Meerschweinchen tödlich. Im Gegensatz zu Burkholderia mallei zeigte der neu isolierte Erreger ein deutlich schnelleres Wachstum, war zudem nicht in der Lage, die charakteristische Straussreaktion zu induzieren und zeigte mikroskopisch Motilität.
Whitmore bezeichnete seinen Erreger deshalb als Bacillus pseudomallei. Der Name Melioidose selbst stammt jedoch von Stanton und Fletcher, die im Jahre 1921 in Kuala Lumpur unabhängig von Whitmore ein dem Pferderotz ähnliches Krankheitsbild beschrieben, ohne jedoch den Erreger zu kennen. Aufgrund der pathologisch-morphologischen Ähnlichkeit mit dem damals in Europa weit verbreiteten Rotz des Pferdes, nannten sie das Krankheitsbild Melioidose. Dieses leitet sich aus dem griechischen melis (Rotz) und eidos (Ähnlichkeit haben mit…) ab (Stanton & Fletcher 1921). Tatsächlich wurde mit modernen Untersuchungsmethoden festgestellt, dass zwischen dem Erreger der Melioidose (Burkholderia pseudomallei) und dem Erreger des Rotz (Burkholderia mallei) eine
enge Verwandtschaft besteht. Aus diesem Grunde wird er seit 1992 der neuen Gattung Burkholderia zugeordnet. In diese gehören neben Burkholderia pseudomallei und Burkholderia mallei auch die Keime des so genannten Burkholderia Cepacia-Komplex (Yabuuchi et al. 1992). Burkholderia cepacia ist ein opportunistischer Erreger der Atemwege, speziell bei Mukoviszidose-Patienten (Frangolias et al. 1999; Haussler et al. 2003). Er gliedert sich in mindestens neun Genomovare, welche genotypisch unterscheidbar sind. Bis zur Klassifizierung in die Gattung Burkholderia wechselte Burkholderia pseudomallei mehrmals den Namen - Bacillus pseudomallei, Malleomyces pseudomallei und schließlich Pseudomonas pseudomallei sowie auch seine Klassifizierungen - Actinomyces, Actinobacillus und Pseudomonas (Howe et al. 1971), was in älterer Literatur durchaus zu Verwirrung führen kann. Schon in der Mitte des zwanzigsten Jahrhunderts deutete sich an, dass die Spezies Burkholderia pseudomallei nicht einheitlich ist. Bei systematischen Untersuchungen wurde festgestellt, dass im Tiermodell virulente und avirulente Stämme genotypische und phänotypische Unterschiede aufweisen. Avirulenz war dabei stets mit der Assimilation von Arabinose assoziiert (Smith et al. 1997).
Außerdem besitzen avirulente Stämme Unterschiede in den Genen für 16 S rRNA (Brett et al. 1998), Unterschiede im Flagellingen sowie im Typ III-Sekretionssystem (Winstanley et al. 1998; Winstanley & Hart 2000). Aus diesen Gründen wurden diese avirulenten Stämme als neue Spezies Burkholderia thailandensis benannt (Brett et al. 1998).
2.2. Epidemiologie
Burkholderia pseudomallei ist ein in tropischen und subtropischen Klimazonen saprophytisch im Erdboden vorkommender Keim, der nur geringe Anforderungen an seine Umwelt stellt. So ist beschrieben, dass er über mehrere Jahre in destilliertem Wasser überleben kann (Wuthiekanun et al. 1995). In den Endemiegebieten kann Burkholderia pseudomallei aus stehenden Gewässern sowie dem Erdboden isoliert werden (Chambon 1955). Die Infektion des Menschen findet in erster Linie über Inokulation des Erregers in kleine Hautwunden statt (Dance 2000). Diesem Infektionsweg besonders ausgesetzt, sind Personen, die in Endemiegebieten häufigen Kontakt zu Boden und offenen Wasserflächen haben, so zum Beispiel Reisbauern. Es ist deshalb nicht verwunderlich, dass auch die Inzidenz der Erkrankung in dieser Berufsgruppe besonders hoch ist (White 2003). Auch der Infektionsweg über erregerhaltige Stäube scheint möglich, da eine relativ hohe Anzahl von Krankheitsfällen unter amerikanischen Hubschrauberbesatzungen auftrat (Howe et al. 1971). Die Evidenz dieser Vermutung ist jedoch gering, da auch eine Infektion über die Haut nicht ausgeschlossen werden kann (Dance 2000). Allerdings sind im Tiermodell intranasale, intravenöse, intraperitoneale und sogar per ingestionem Infektionen mit Burkholderia pseudomallei möglich (Miller et al. 1948).
Das Risiko, an Melioidose zu erkranken, wird vor allem durch bereits bestehende Grunderkrankungen wie Diabetes mellitus, Niereninsuffizienzen, Lungen- erkrankungen und Tumoren sowie durch Drogen- und Alkoholmissbrauch erhöht.
Deshalb kann Burkholderia pseudomallei durchaus als opportunistischer Erreger eingestuft werden. Allerdings kann eine Melioidose, wenn auch selten, bei völlig Gesunden auftreten und sogar einen letalen Verlauf nehmen (Chaowagul et al. 1989;
Currie et al. 2000c; Suputtamongkol et al. 1999). Generell sind alle Altersstufen von der Erkrankung betroffen. Die meisten Erkrankten sind aber im Alter zwischen 40 und 60 Jahren und es sind mehr Männer als Frauen betroffen (Verhältnis 3:2) (Chaowagul et al. 1993; Suputtamongkol et al. 1994a).
Als endemisch gilt Burkholderia pseudomallei vor allem in den Gebieten des tropischen Asiens. Klinische Fälle treten gehäuft in Burma, Malaysia, Singapur, Vietnam, Indonesien und den Philippinen auf. Aber auch aus Regionen Chinas,
Südamerikas, Afrikas und Australiens sind Berichte über Erkrankungen bekannt (Dance 1991). Am Besten epidemiologisch untersucht, ist die Melioidose jedoch in Thailand und Australien. Epidemiologische Studien haben gezeigt, dass 80% der thailändischen Kinder bis zum vierten Lebensjahr seropositiv gegenüber Burkholderia pseudomallei getestet werden (Kanaphun et al. 1993). Gegenwärtig werden dort jährlich 2000 bis 3000 Fälle klinischer Melioidose diagnostiziert, was bei einer geschätzten Gesamtbevölkerung von 60 Millionen eine Inzidenz der Erkrankung von 3-5 auf 100.000 Einwohnern entspricht (Leelarasamee 2000). An dieser Stelle sollte erwähnt werden, dass die wahre Inzidenz vermutlich höher anzusiedeln ist, da davon ausgegangen werden muss, dass aufgrund der schlechten medizinischen Infrastruktur vor allem in ländlichen Regionen nur ein gewisser Teil der Fälle von Melioidose auch diagnostiziert wird. Nach weiteren Untersuchungen wird etwa jede fünfte außerhalb des Krankenhauses erworbene Sepsis in Thailand durch Burkholderia pseudomallei verursacht (Chaowagul et al. 1989). Die Mortalität aller an Melioidose erkrankten Patienten in Australien liegt bei etwa 19% (Currie et al. 2000c). Beim Vorliegen einer Septikämie lag die Mortalität nach einer neueren Studie nur noch bei 14–18% (Chetchotisakd et al. 2001). Eine Häufung der Krankheitsfälle ist in Thailand in den Monaten Juni bis November und zwischen November und April in Australien zu verzeichnen. In diesen Zeiträumen treten etwa 80% aller klinischen Fälle auf (Ashdown 1994). Diese Monate fallen in den jeweiligen Ländern genau mit der Regenzeit zusammen. Es kann vermutet werden, dass unter den nassen und warmen Bedingungen der Erreger aus tieferen Erdschichten an die Bodenoberfläche gespült wird und dort optimale Bedingungen für die Replikation vorfindet, sodass es in den Monaten der Regenzeit zu einer erhöhten Exposition mit dem Erreger und Inzidenz an Melioidosefällen kommt (Chaowagul et al. 1989).
Tatsächlich besteht eine Korrelation zwischen regionalen Unterschieden der Keimkonzentration im Boden und dem Auftreten von Krankheitsfällen (White 2003).
2.3. Virulenzfaktoren von Burkholderia pseudomallei
Burkholderia pseudomallei besitzt ein großes Spektrum an potentiellen Virulenzfaktoren, die auf der einen Seite zellassoziiert sind und auf der anderen Seite auch extrazelluläre Komponenten beinhalten. Als gram-negatives bekapseltes Bakterium besitzt es sowohl Lipopolysaccharide (LPS) als auch Exopolysaccharide (EPS), die mit der Bakterienkapsel assoziiert sind (Reckseidler et al. 2001; Steinmetz et al. 1995). LPS, das auch als Endotoxin bezeichnet wird, besteht bei allen gram- negativen Bakterien aus drei Komponenten; Lipid A, das die eigentliche endotoxische Wirkung besitzt und beim Tod der Bakterien freigesetzt wird, das Kernpolysaccharid und die speziesspezifischen O-Antigene. Burkholderia pseudomallei besitzt Typ-1- und Typ-2-O Seitenketten, deren Beitrag zur Virulenz experimentell gezeigt werden konnte. Diese Seitenketten sind strukturell unterschiedlich. Während der Typ-1 ein Homopolymer aus 1,3-verknüpften 2-O- acetylierten 6-Desoxy-β-mannoheptoseeinheiten ist, besteht der Typ-2 aus
unverzweigten Glukose- und 6-Desoxytalose-haltigen, sich wiederholenden Einheiten und ist somit ein Heteropolymer (Perry et al. 1995). Transposonmutanten, die einen Defekt in der Produktion von Typ-2-0 Seitenketten besitzen, verlieren ihre Serumresistenz und weisen in verschiedenen Tiermodellen eine um einen Faktor
10-100 erhöhte LD50 auf (DeShazer et al. 1998). In der Produktion von Typ-1-O Seitenketten gestörten Mutanten weisen ebenfalls eine Verminderung der
Virulenz um einen Faktor 105 auf, zeigen aber keine Beeinträchtigung der Serumresistenz (Reckseidler et al. 2001). Im Vergleich mit enterobakteriellem LPS zeigt das LPS von Burkholderia pseudomallei jedoch eine schwächere pyrogene Wirkung auf Ratten (Matsuura et al. 1996), sowie eine schlechtere Stimulation von NO und TNFα im Vergleich mit LPS von Escherichia coli und Salmonella Typhi in Makrophagen (Utaisincharoen et al. 2000). Dieser Effekt mag mit der ungewöhnlichen Struktur der säurestabilen Kernpolysaccharide in Verbindung stehen, die mit dem Lipid A assoziiert ist (Kawahara et al. 1992).
Neben den Zellwand-assoziierten Lipopolysacchariden gelten auch die bei vielen virulenten gram-negativen Bakterien vorkommenden Kapsel-assoziierten EPS als Virulenzfaktoren. Die Kapsel ist nur schwach immunogen und die Bildung
kapselspezifischer Antikörper gering (Pruksachartvuthi et al. 1990). Dieser Umstand und die intrazelluläre Lage von Burkholderia pseudomallei mögen auch ein Grund für die langen Latenzphasen bei Melioidose sein (Brett & Woods 2000). Bei Burkholderia pseudomallei wurde 1995 das EPS I beschrieben (Steinmetz et al. 1995), welches ein unverzweigtes Polymer mit einer molekularen Masse von > 150 kDa darstellt (Nimtz et al. 1997). Die konstitutive Expression und molekulare Konserviertheit dieses EPS konnte durch ELISA und Immunoblot Untersuchungen an Burkholderia pseudomallei-Stämmen aus verschiedenen Teilen der Erde, sowie Kulturen unterschiedlicher Morphologie mit einem für EPS spezifischen monoklonalen Antikörper (3015 IgG1) gezeigt werden (Steinmetz et al. 1995). Hinweise auf ein zweites EPS von Burkholderia pseudomallei wurden im Jahr 2000 gefunden (Steinmetz et al. 2000). Kürzlich wurde auch ein EPS der Gruppe III nachgewiesen, dessen Defekt die LD50 von Burkholderia pseudomallei um den Faktor 104 erhöht (Reckseidler et al. 2001).
Weitere zellassozierte Strukturen, die mit bakterieller Virulenz in Verbindung gebracht werden, sind Flagellen (Moens & Vanderleyden 1996; Penn & Luke 1992).
Diese verleihen dem Bakterium Beweglichkeit und werden oft mit pathogenen Eigenschaften in Verbindung gebracht. Von Burkholderia pseudomallei ist bekannt, dass es beweglich ist und zwei bis vier polar angeordnete Flagellen besitzt (DeShazer et al. 1997). Nachdem DeShazer et al. 1997 an motilitätsdefekten Mutanten keine Attenuierung in vivo nachweisen konnte, beschrieben Chua et al.
2003 Flagellen im Mausmodell als entscheidenden Virulenzfaktor. In der Dissertation von B. Fehlhaber konnte für eine Mutante mit einem Defekt im hochkonservierten Flagellingen eine geringgradige Attenuierung im Mausmodell gezeigt werden (Fehlhaber 2002).
Neben den Flagellen besitzt Burkholderia pseudomallei auch mindestens zwei verschiedene Arten von Pili, deren Rolle beim Invasionsmechanismus des Erregers in Zellen noch nicht geklärt ist (Woods et al. 1999). Die Vermittlung einer Adhäsion an verschiedene Wirtszellen ist aber wahrscheinlich. Es ist bekannt, dass der Erreger in Epithelzellen, Fibroblasten, Granulozyten und Makrophagen eindringt, intrazellulär überlebt und sich auch vermehren kann (Jones et al. 1996; Pruksachartvuthi et al.
1990), sodass Burkholderia pseudomallei als fakultativ intrazelluläres Bakterium
bezeichnet wird. Aktive Aufnahme von der Wirtsseite findet durch Phagozytose in Makrophagen bzw. Endozytose in anderen Zellen statt. Einmal im Zytoplasma, liegt der Erreger offensichtlich in endozytischen Vakuolen, die jedoch nicht mit Lysosomen verschmelzen (Brown et al. 2002). Burkholderia pseudomallei ist in der Lage, aus diesen Vakuolen heraus ins Zytoplasma zu gelangen (Harley et al. 1998), wo der Erreger zelleigenes Aktin polymerisiert und sich auf diese Weise fortbewegt (Breitbach et al. 2003; Kespichayawattana et al. 2000). Vorwärts geschoben von diesem Aktinschweif ist es Burkholderia pseudomallei möglich, die Zellmembran der infizierten Zelle auszustülpen, bis eine Nachbarzelle erreicht wird. Durch Einstülpung deren Zellmembran gelangt der Erreger ins Zytoplasma einer Nachbarzelle und infiziert, diese ohne mit dem extrazellulären Raum in Berührung gekommen zu sein.
Neben den beschriebenen zellassoziierten Virulenzfaktoren besitzt Burkholderia pseudomallei eine Reihe von Exoprodukten, die im Verdacht stehen, für die dramatischen Verläufe der septikämischen Melioidose mit verantwortlich zu sein.
Beschrieben wurden bislang zwei hitzelabile Toxine, deren letale Wirkung nur bei einem der beiden durch eine proteolytische Aktivität zurückgeführt werden konnte (Heckly 1964; Heckly & Nigg 1958). Daneben konnte noch bei zwei weiteren Proteinen mit der Größe von 31 kDa und 3 kDa eine toxische Wirkung in vitro nachgewiesen werden. Dabei zeigt das kleinere Protein der beiden Hitzestabilität (Haase et al. 1997; Ismail et al. 1987). Burkholderia pseudomallei produziert verglichen mit anderen Bakterien nur wenig Hämolysin, welches hitzestabil, aber nicht besonders toxisch ist (Liu 1957). Dieses ist vermutlich identisch mit einem zytotoxischen hitzestabilen Ramnolipid, dass ebenfalls als Virulenzfaktor in Frage kommt (Haussler et al. 2003). Bei einigen Stämmen wurde noch ein zweites, hitzelabiles Hämolysin entdeckt (Ashdown & Koehler 1990). Burkholderia pseudomallei ist in der Lage, verschiedene Enzyme wie Proteasen, Lipasen, Lecitinasen, Superoxiddismutase und Peroxidase zu sezernieren (Ashdown &
Koehler 1990). Einige davon wie eine Protease, Lipase und Phospholipase C werden dabei im Zusammenhang mit einem Typ II-Sekretionsapparat sezerniert, der große Homologien zu dem anderer gram-negativer Bakterien aufweist (DeShazer et al.
1999). Des Weiteren verfügt Burkholderia pseudomallei über einen Typ III-Sekretionsapparat (Rainbow et al. 2002), der große Ähnlichkeit mit den Typ
III-Sekretionsapparaten von Salmonellen und Shigellen aufweist. Das Fehlen dieses Sekretionssystems bei den apathogenen Burkholderia thailandensis-Stämmen könnte ein Hinweis auf seine Bedeutung als Virulenzfaktor sein (Winstanley & Hart 2000).
Generell muss hinzugefügt werden, dass die Virulenz einzelner Burkholderia pseudomallei-Stämme in vivo sehr variabel ist. So konnten in Studien an klinischen- und Umweltisolaten, von denen die LD50 im Mausmodell bestimmt wurde, Schwankungen von bis zu fünf Log-Stufen innerhalb der Spezies festgestellt werden (Ulett et al. 2001).
2.4. Melioidose: Krankheitsbild des Menschen
Das Krankheitsbild der Melioidose ist sehr variabel und kann akute, subakute wie auch chronische Formen ausbilden. Nach einer Infektion kann die Erkrankung unmittelbar ausbrechen, typischerweise tritt aber zunächst eine längere Latenzphase auf, die bei einer Verschlechterung der Wirtsabwehr in eine manifeste Krankheit übergeht (Ip et al. 1995). Die Inkubationszeit reicht dabei von zwei Tagen bis zu 26 Jahren (Mays & Ricketts 1975).
Im Falle einer akuten Melioidose ist eine Septikämie die am häufigsten auftretende Manifestationsform. Hohes Fieber und Abszessbildung in verschiedenen Organen sind die Folge. Die häufigste Lokalisation der Erkrankung in der akuten Form ist die Lunge, einhergehend mit Bronchitis, disseminierter Bronchopneumonie oder nekrotisierender Lobärpneumonie. Die Infektion der Lunge ist in der Regel jedoch nicht primär pulmonal, sondern die Folge einer hämatogenen Streuung (Chaowagul et al. 1989; Ip et al. 1995). Ein weiteres häufiges Erscheinungsbild einer akuten Melioidose ist eine lokalisierte eitrige Entzündung in verschiedenen Organen.
Daneben gibt es allerdings auch noch zahlreiche Berichte über eher exotische Manifestationsorte, wie beispielsweise ein durch Burkholderia pseudomallei verursachtes mykotisches Aortenaneurysma (Steinmetz et al. 1996). Wie die akute Form der Melioidose kann auch die subakute Form lokalisiert oder disseminiert auftreten. Neben asymptomatischen Verlaufsformen sind Fieber, Gewichtsverlust und allgemeine Schwäche typische Symptome bei subakuter Melioidose.
Charakteristisch sind weiterhin multiple Abszesse in Haut, Knochenmark, Lymphknoten, Leber und Milz sowie bei Infektionen des Urogenitaltraktes eine Manifestation als Zystitis, Pyelonephritis oder Prostatitis (Dance 1990). Weiterhin wurden Fälle der Ausbreitung des Erregers im zentralen Nervensystem beobachtet, wobei es bei den betroffenen Patienten entweder zu makroskopischen Abszessen oder zu einer Enzephalitis mit entsprechenden neurologischen Ausfallserscheinungen kam (Currie et al. 2000b). Eine charakteristische und fast nur bei Kindern vorkommende Sonderform der subakuten Form der Melioidose sind eitrige Parotitiden, die mit meist unilateraler Abszessbildung einhergehen (Dance et al. 1989a). Ohne Therapie und in fortgeschrittenen Stadien können die Erreger aus Blut, Urin, Eiter sowie anderen Sekreten und Geweben isoliert und kultiviert werden (Walsh & Wuthiekanun 1996). Neben der subakuten Form ist aber vor allem die chronische Form der Melioidose von Bedeutung. Aufgrund der Rückzugsmöglichkeiten des Erregers in den intrazellulären Raum von Makrophagen und Epithelzellen, wo er Monate bis Jahre überleben kann, kommt es häufig nach Infektion oder überstandener Erkrankung zu Rezidiven (Currie et al. 2000a). Dieser Eigenschaft von Burkholderia pseudomallei verdankt die Erkrankung auch den Namen „Vietnam-time-bomb disease“ (Goshorn 1987), welcher aufgrund der erst später auftretenden Melioidosefälle bei Vietnamkriegsveteranen geprägt wurde.
Trotz dieser Vielzahl von zum Teil schwersten Manifestationsformen und des besonders in unbehandelten Fällen oft tödlichen Verlaufs der Melioidose darf dennoch nicht vergessen werden, dass es sich bei Burkholderia pseudomallei im Grunde um einen opportunistischen Erreger handelt. So wird vor allem aus serologischen Studien in Endemiegebieten deutlich, dass subklinische und chronische Infektionen vorherrschend sind (Kanaphun et al. 1993).
Die Therapie der Melioidose ist langwierig und schwierig sowie bei zu kurzer Therapiedauer von Rezidiven gekennzeichnet. Burkholderia pseudomallei besitzt eine intrinsische Resistenz gegen Penicillin, Cephalosporine der ersten beiden Generationen, Makrolide und Aminoglycoside. Des Weiteren bilden sich unter einer antibiotischen Therapie oft Resistenzen gegen Chloramphenicol, Doxycyclin und Cotrimazol aus (Dance et al. 1989b; Jenney et al. 2001). Nach einer klinischen Studie von White, bei der die Mortalität mit Ceftazidim um 50% gesenkt werden konnte, ist dies heute das Mittel der Wahl in der Behandlung von Melioidose (White
et al. 1989). Dabei wird jede systemische Infektion über mindestens 10 Tage mit Ceftazidim (3 x 40 mg/kg parenteral) hochdosiert behandelt. Alternativ stehen Imipenem (3 x 20 mg/kg) oder Meropenem zur Verfügung (Simpson et al. 1999). Die Kombination aus Amoxicillin und Clavulansäure (6 x 27 mg/kg) resultiert in gleich hoher Mortalität, aber höherer Rate an Therapieversagen (Suputtamongkol et al.
1994b). Im Anschluss an die parenterale Therapie folgt eine 20-wöchige orale Behandlung mit der Viererkombination Chloramphenicol (4 x 10 mg/kg), Doxycyclin (2 x 2 mg/kg), Trimethoprim (2 x 5 mg/kg) und Sulfamethoxazol (2 x 25 mg/kg).
Hierbei wird Chloramphenicol nur die ersten acht Wochen verabreicht. Zusätzlich sind allgemeine Maßnahmen wie Rehydrierung zur Behandlung eines septischen Schocks, Ausräumung von Abszessen etc., durchzuführen.
2.5. Melioidose: Krankheitsbild bei Tieren
Obwohl Melioidose bei Tieren weniger gut untersucht ist als beim Menschen, gibt es doch zahlreiche Berichte über Burkholderia pseudomallei-Infektionen bei den verschiedensten Tierarten wie Nagern, Kaninchen, Sika Wild, Hunden, Katzen, Pferden, Rindern, Schweinen, Ziegen, Schafen und Kamelen (Bergin & Torenbeeck 1991; Radostis 1997; Sheikh-Omar & Muda 1986). Aber nicht nur bei Säugetieren, sondern auch bei Vögeln, Fischen und Krokodilen konnte der Erreger nachgewiesen werden (Choy et al. 2000). Aufsehen erregt hat vor allem der Fall eines mit Burkholderia pseudomallei infizierten Pandabären im Pariser Zoo, der als Geschenk von Mao Zedong an den französischen Präsidenten Pompidou Ausgangspunkt einer epidemischen Melioidose war und den Tierbestand des Zoos drastisch reduzierte (White 2003). Die Suszeptibilität der verschiedenen Säugerspezies scheint durchaus unterschiedlich zu sein. So gelten Schafe, Ziegen und Kamele beispielsweise als deutlich empfänglicher als Hunde und Katzen (Choy et al. 2000). Auch die klinische Symptomatik ist von Spezies zu Spezies verschieden. So zeigen erkrankte Schafe vor allem Schwäche und Festliegen; sie versterben in der Regel innerhalb einer Woche. Experimentell infizierte Schafe reagierten mit schwerem Fieber in Verbindung mit Anorexie, Lahmheit und exsudativem Nasen- und Augenausfluss.
Einige Tiere zeigten auch schwere neurologische Störungen mit Manegebewegungen, Nystagmus, Blindheit, Hyperästhesie und milden tetanischen Konvulsionen. Die Erkrankung endet in der Regel tödlich. Von einer Beteiligung der Haut wurde jedoch nicht berichtet. Ziegen zeigen bei akuter Melioidose eine ähnliche klinische Symptomatik wie Schafe. Generell nimmt hier die Erkrankung aber einen eher chronischen Verlauf. Im Schwein steht die chronische Infektion mit einer Manifestation als zervikale Lymphadenitis im Vordergrund. Bei einigen Ausbrüchen waren aber auch Symptome ähnlich denen anderer Spezies zu finden. Bei solchen Ausbrüchen traten weiterhin leichte Paresen der Hinterhand, mildes Fieber, Husten, Nasen- und Augenausfluss, Anorexie, Aborte sowie einige Todesfälle auf. Pferde dagegen entwickeln oft eine akute Pneumonie, die mit hohem Fieber einhergeht.
Auch Kolik, Diarrhöe und Lymphangitis der Beine können auftreten. Auch ein Fall akuter Meningoencephalitis beim Pferd wurde beschrieben (Ladds et al. 1981).
Charakteristisch in allen betroffenen Spezies sind multiple Abszesse vor allem in Lunge, Leber, Milz sowie in der Unterhaut (außer beim Schaf) und deren assoziierten Lymphknoten (Radostis 1997).
Auch bei Tieren wird eine Infektion mit Burkholderia pseudomallei aus der Umwelt akquiriert. Der Erreger wird durch Inhalation, Ingestion oder in Assoziation mit Hautwunden über kontaminierte Stäube und Wasser aufgenommen (Thomas et al.
1988a). Ähnlich der Epidemiologie beim Menschen treten auch bei Tieren Fälle von Melioidose hauptsächlich während der Regenzeit auf (Thomas 1981). Anders als bei Burkholderia mallei sind für Burkholderia pseudomallei nur wenige Fälle möglicher Zoonosen beschrieben, dabei handelt es sich um das Auftreten von Ulzerationen oder Abszessen in der Haut bei exponierten Berufsgruppen, wie einem Schlachter, einem Tierarzt und einem Landwirt (Choy et al. 2000). Wenn auch höchst zweifelhaft ist, ob eine zoonotische Übertragung vom Tier auf den Menschen möglich ist, so stellen doch die Tiere ein großes Reservoir für Burkholderia pseudomallei dar. Des Weiteren ist eine Übertragung auf den Menschen über kontaminierte Rohmilch denkbar, da Burkholderia pseudomallei aus Milch an Mastitiden erkrankter Kühe und Ziegen isoliert werden konnte (Mustaffa Babjee & Nor Aidah 1994). Daher wäre in Endemiegebieten eine Pasteurisierung der Milch unbedingt zu empfehlen.
Die Therapie von an Melioidose erkrankten Tieren ist oft teuer, langwierig und von zweifelhaftem Erfolg. Für landwirtschaftliche Nutztiere empfehlen sich daher eher Präventionsmaßnahmen wie das Fernhalten der Herden von kontaminierten Weiden und Schlamm sowie eine Haltung auf befestigten Böden. Auch der Zusatz von Chlor zum Trinkwasser hat sich als effektive Präventions- und Kontrollmaßnahme erwiesen (Thomas 1991). Bei Liebhabertieren wie Hunden und Katzen mag eine mit hohen Kosten verbundene intensive Therapie sinnvoll sein. Hierbei kann nach den aus der Humanmedizin empfohlenen Therapieregimen mit Einsatz von Ceftazidim und Carbapenemen entsprechend behandelt werden (Choy et al. 2000).
2.6. Murine Burkholderia pseudomallei Infektionsmodelle
Eine Burkholderia pseudomallei Infektion kann wie bereits beschrieben eine Vielzahl unterschiedlicher Verlaufsformen haben, wie das äußerst heterogene klinische Bild zeigt. Dabei scheint der Verlauf der Infektion nicht nur von der Infektionsroute und der jeweiligen Pathogenität des Stammes abhängig zu sein, sondern auch von der Abwehrlage im Wirtsorganismus, wobei Grunderkrankungen das Risiko einer klinischen Melioidose erhöhen, aber nicht Voraussetzung sind (Brett & Woods 2000).
Es ist unbekannt, warum manche Menschen eine chronische, andere eine akute und wieder andere nur eine subklinische Form der Melioidose entwickeln. Um die Pathogenese der Erkrankung und die Mechanismen der angeborenen Immunität zu untersuchen, wird daher im Tiermodell mit zwei Inzuchtmausstämmen mit unterschiedlicher Empfänglichkeit gegenüber Burkholderia pseudomallei gearbeitet.
Es wurde gezeigt, dass BALB/c-Mäuse hochempfänglich und C57Bl/6-Mäuse relativ resistent gegenüber Infektionen mit virulenten Burkholderia pseudomallei Stämmen sind und somit als Modell für chronische und akute Melioidose eingesetzt werden können (Leakey et al. 1998). Nach einer intravenösen Infektion mit nur 37 Keimen zeigten BALB/c-Mäuse starkes bakterielles Wachstum in Leber und Milz, gefolgt von einer fulminanten Bakteriämie und dem Tod der Tiere innerhalb von 72 bis 96 Stunden post infektionem. C57Bl/6-Mäuse dagegen entwickelten keine Bakteriämie, auch wenn die Tiere bakterielles Wachstum in Leber und Milz zeigten und schließlich
ebenfalls verstarben (Leakey et al. 1998). Anhand von Keimzahlbestimmungen in Leber, Lunge und Milz konnten schon 24 Stunden nach einer Infektion signifikante Unterschiede zwischen C57Bl/6- und BALB/c-Mäusen festgestellt werden (Hoppe et al. 1999).
Eine intravenöse Infektion ist zwar ein guter Weg, eine systemische Melioidose zu simulieren, doch der erste Kontakt mit einem Pathogen findet oft über die Schleimhäute statt. Deshalb wurde ein intranasales Infektionsmodell etabliert, das primär zu einer Pneumonie mit anschließender Streuung der Keime in andere Organe führt. Dieses trägt eher zum Verständnis einer mukosalen Immunität bei (Liu et al. 2002). Auch in diesem Infektionsmodell konnte gezeigt werden, dass C57Bl/6-Mäuse etwa 100-mal resistenter gegenüber der Infektion waren als BALB/c- Mäuse. Auch hier waren deutliche Unterschiede in den Keimzahlen der
verschiedenen Organe zu unterschiedlichen Zeitpunkten zwischen 24 und 72 Stunden nachweisbar (Liu et al. 2002). Die unterschiedliche Fähigkeit der
Mausstämme, auch schon zu sehr frühen Zeitpunkten die Infektion zu bekämpfen, weist auf eine entscheidende Bedeutung angeborener Immunmechanismen für die Resistenz gegenüber Burkholderia pseudomallei hin.
Das Phänomen der unterschiedlichen Suszeptibilität dieser beiden Mausstämme wurde auch bei diversen anderen Erregern für Studien der Wirtsabwehr genutzt.
Dabei ist eine erhöhte Resistenz von C57Bl/6- im Vergleich zu BALB/c-Mäusen nicht
generell bei Infektionen mit gram-negativen Erregern vorhanden. Der C57Bl/6-Stamm ist deutlich resistenter gegenüber Yersinia enterocolitica (Hancock et
al. 1986), Trypanosoma congolense (Tabel et al. 2000), Brucella abortus (Ho &
Cheers 1982) und, wie oben beschrieben, Burkholderia pseudomallei (Leakey et al.
1998). BALB/c-Mäuse dagegen zeigen im Vergleich zu C57Bl/6-Mäusen eine größere Resistenz gegenüber Toxoplasma gondii (Johnson 1984), Pseudomonas aeruginosa (Morissette et al. 1995) und Helicobacter felis (Mohammadi et al. 1996).
Für einige Pathogene wie Mycobacterium bovis, Salmonella Typhimurium und Listeria Spezies konnte der Grund einer relativen Resistenz bereits mit dem Vorhandensein des Ity/Lsh/Bcg Lokus auf Chromosom 1 in Verbindung gebracht werden (Vidal et al. 1995). Dieser ist verantwortlich für die Expression von Nramp 1,
einer Zink-Metalloprotease, die als Transporter in der Membran von Phagosomen dient (Skamene et al. 1998). Da jedoch sowohl C57Bl/6- wie auch BALB/c-Mäuse einen ItyS Genotyp besitzen und somit Nramp 1-defizient sind, scheidet dieser spezielle Mechanismus als Erklärung für den Unterschied in der Empfänglichkeit gegenüber einer Burkholderia pseudomallei-Infektion aus (Hoppe et al. 1999).
Wahrscheinlicher ist, dass dieser auf einer komplexen Regulation verschiedener Gene beruht, da Tiere der F1-Generation aus Verpaarung von C57Bl/6- und BALB/c-Mäusen eine intermediäre Empfänglichkeit besitzen (Leakey et al. 1998).
Ein Schlüssel zum Verständnis immunologischer Vorgänge bei der Bekämpfung einer Infektion ist die Messung verschiedener Cytokine sowie Immunglobulinspiegel unter Infektionsbedingungen. So konnte beispielsweise bei Leishmaniose gezeigt werden, dass bei C57Bl/6-Mäusen eine stärkere zellvermittelte Immunabwehr induziert wird, während bei BALB/c-Mäusen eher eine humorale Abwehr stattfindet.
Bei Messung verschiedener Cytokine 24 bis 36 Stunden nach einer Infektion mit Burkholderia pseudomallei zeigten beide Mausstämme eine Erhöhung von IFNγ, TNFα, IL-1β, IL-6, IL-10 und IL-12, was keine eindeutige Polarisierung zu einem Th1- oder Th2-Profil zulässt (Ulett et al. 2000a). In einer anderen Studie konnte im Serum systemisch infizierter C57Bl/6-Mäuse ein hoher IgG2a-Spiegel gemessen werden, der vor allem bei einer Th1-Antwort und durch IFNγ induziert wird. Bei BALB/c-Mäusen wurde dagegen vor allem IgG1 nachgewiesen, dessen Produktion durch IL-4 stimuliert wird und welches als typisches Cytokin bei einer Th2-Antwort ausgeschüttet wird (Hoppe et al. 1999).
Bei Experimenten mit Yersinia enterocolitica wurde festgestellt, dass T-Zellen aus der Milz der resistenten C57Bl/6-Mäuse nach Infektion mit hitzeinaktivierten Yersinien signifikant höhere Mengen IFNγ produzieren als T-Zellen von BALB/c-Mäusen (Autenrieth et al. 1994). T-Zellen, die der Milz von infizierten C57Bl/c-Mäusen entnommen wurden, waren in der Lage, eine Protektion gegenüber sonst letalen Yersinieninfektionen zu vermitteln, während T-Zellen infizierter BALB/c-Mäuse dazu nicht in der Lage waren. Des Weiteren konnte die Resistenz von BALB/c-Mäusen durch Substitution von rekombinantem IFNγ wie auch durch Behandlung mit anti-IL-4 Antikörpern gesteigert werden (Autenrieth et al. 1994).
Auch bei Infektionen mit Burkholderia pseudomallei konnte für IFNγ eine obligate
Rolle beim Überleben einer Infektion nachgewiesen werden. Durch eine Hemmung von IFNγ in Taylor-Outbred-Mäusen konnte eine erhebliche Steigerung der Empfänglichkeit induziert werden. Auch die Hemmung von IL-12, einem Stimulans der Produktion von IFNγ und TNFα, führte zu einer erhöhten Empfindlichkeit (Santanirand et al. 1999). In einer anderen Studie konnte an Milzzellen von µMT-Mäusen belegt werden, dass große Mengen IFNγ bei Infektionen mit Burkholderia pseudomallei freigesetzt wurden. Als IFNγ Produzenten wurden neben Natürlichen Killerzellen überraschender Weise auch CD8+ T-Zellen identifiziert (Lertmemongkolchai et al. 2001). Im Vergleich der IFNγ Produktion bei C57Bl/6- und BALB/c-Mäusen zeigte sich jedoch, dass gerade die hochempfänglichen BALB/c-Mäuse größere Mengen IFNγ mRNA besitzen als C57Bl/6-Mäuse. Dieses Phänomen kann möglicherweise mit der Induktion eines toxischen Schocks in Verbindung gebracht werden, und so den akuten Verlauf der Melioidose in BALB/c-Mäusen erklären. (Ulett et al. 2000a).
2.7. Antikörper-vermittelte Immunität bei experimenteller Melioidose Es stellt sich nun die Frage, was Antikörper gegen einen Organismus ausrichten können, der so gut an das intrazelluläre Leben adaptiert ist wie Burkholderia pseudomallei. Die klassische Vorstellung, dass antikörper-vermittelte Immunität vor extrazellulären Erregern und zellvermittelte Immunität vor intrazellulären Erregern schützen, ist aber schon seit langem ins Wanken geraten. Für die verschiedensten intrazellulären Erreger konnte gezeigt werden, dass Antikörper den Verlauf der Infektion zugunsten des Wirtes beeinflussen konnten. Darunter sind Cryptococcus neoformans (Dromer et al. 1987), Listeria monozytogenes (Edelson et al. 1999) und Toxoplasma gondii (Kang et al. 2000), sowie noch einige mehr. Der Erfolg einer Protektion hängt aber von verschiedenen Faktoren ab. Spezifische Antikörper sind in der Lage, durch Komplementaktivierung entzündungsfördernd zu wirken. So werden die Faktoren C3a und C5a aktiviert, die stark chemotaktisch wirken und eine Verbindung zwischen angeborener und erworbener Immunität herstellen (Hogarth 2002). Durch Opsonisierung werden die Phagozytose und die Antigenpräsentation
verbessert. Somit sind Antikörper auch in der Lage, die zelluläre Immunität zu beeinflussen. Gleichzeitig kommt es zu einer Kreuzvernetzung von Fc-Rezeptoren, wodurch Signalkaskaden aktiviert werden, die Cytokin- und NO-Freisetzung beeinflussen. Dabei kann eine Kreuzvernetzung der Rezeptoren auf Leukozyten entweder zu einer Inhibition oder Stimulation der Entzündungsprozesse führen, abhängig von der Aktivierung inhibierender oder stimulierender Fc-Rezeptoren (Casadevall & Pirofski 2003). Für den Erfolg einer Protektion ist auch die Antikörpermenge entscheidend. Für Listeria monozytogenes (Edelson et al. 1999) und Cryptococcus neoformans (Dromer et al. 1987) konnte gezeigt werden, dass eine bestimmte Mindestmenge des Antikörpers für eine Protektion notwendig ist. Zu große Mengen Antikörper zeigten einen schlechteren Schutz gegen die Infektion mit Cryptococcus neoformans. Es wird spekuliert, dass zu große Mengen Antikörper mit Wirtsfaktoren für die intrazelluläre bakterizide Aktivität interferieren oder die Zytokinantwort für den Wirt nachteilig beeinflusst wird (Taborda et al. 2003).
Weiterhin spielen Affinität, Spezifität, Isotyp und Idiotyp des Antikörpers, sowie genetischer Hintergrund und Immunkompetenz des Wirtes eine wichtige Rolle bei der Protektion (Casadevall 2003). Auch für Burkholderia pseudomallei wurde in verschiedenen passiven Immunisierungsversuchen eine Protektion durch Antikörper beschrieben. So waren beispielsweise polyklonale Seren gegen LPS und Flagellin in einem Tiermodell an diabetischen Ratten protektiv (Brett & Woods 1996). Im Mausmodell an BALB/c-Mäusen zeigten monoklonale Antikörper gegen LPS, Flagellin und EPS bei niedrigen Infektionsdosen ebenfalls einen protektiven Effekt.
Bei höheren Infektionsdosen waren dagegen nur die anti-EPS Antikörper protektiv (Jones et al. 2002). Die protektive Wirkung von verschiedenen IgG-Subklassen eines gegen EPS gerichteten Antikörpers nach systemischer und intranasaler Infektion konnte auch im Rahmen zweier Dissertationen gezeigt werden (Breitbach 2004; Hoppe I 1998).
Die Induktion einer aktiven Immunität nach Burkholderia pseudomallei-Infektionen ist ebenfalls beschrieben worden. So wurden BALB/c-Mäuse virulenzattenuierten Transposonmutanten, deren Defekt in der Azetolaktat Synthase lag, ausgesetzt und fünf Wochen später mit dem entsprechenden Wildtyp infiziert. Die so aktiv
immunisierten Tiere überlebten die Infektion zu 80 -100%, während alle Kontrolltiere verstarben (Atkins et al. 2002). Bei C57Bl/6- und BALB/c-Mäusen, die zunächst mit einem niedrigvirulenten Stamm von Burkholderia pseudomallei und zwei Wochen später mit einem hochvirulenten Stamm infiziert wurden, konnte ebenso eine geringere Mortalität im Vergleich zur Kontrollgruppe festgestellt werden (Ulett et al.
2002). Dieses weist auf die Möglichkeit der Kreuzreaktivität verschiedener Stämme hin.
2.8. Bedeutung von Fc-Rezeptoren bei der Antikörper-vermittelten Immunität
Fc-Rezeptoren sind die Verbindung der antikörper-vermittelten Immunantwort mit zellulären Effektorfunktionen. Für alle Isotypen existieren spezifische Fc-Rezeptoren, die die jeweiligen Immunglobuline an ihren Fc-Teilen erkennen. Sie werden auf allen Zellen des Immunsystems exprimiert. Eine Kreuzvernetzung von Fc-Rezeptoren auf der Zelle induziert eine Vielzahl intrazellulärer Funktionen, die eine Modulation der Immunantwort bewirken. So sind Fc-Rezeptoren beteiligt an der Phagozytose von Makrophagen, der Antikörper-vermittelten Zytotoxizität von Natürlichen Killerzellen und der Aktivierung von Neutrophilen Granulozyten.
Für IgG sind drei verschiedene Klassen von Fc-Rezeptoren beschrieben, die sich in ihrer Affinität für die verschiedenen Subklassen von IgG unterscheiden. Sie weisen speziesspezifisch noch verschiedene Untergruppen auf, die sowohl aktivierende wie auch inhibierende Signale an die jeweiligen Zellen weitergeben. Fcγ-Rezeptoren gehören zu Immunglobulin-Supergen-Familie und bestehen aus oligomeren Komplexen mit verschiedenen oligomeren Untereinheiten, die in Verbindung mit γ und ζ Ketten assoziiert sind. Diese Ketten sind Homo- oder Heterodimere und geben Signale über konservierte zytoplasmatische Tyrosinmotive weiter (Tyrosine- based Activation Motives = ITAM). Die γ-Kette ist dabei außerdem essenziell für die intrazelluläre Zusammenlagerung des Rezeptors und seiner Expression auf der Zelloberfläche.
Die Signaltransduktion erfolgt dabei über eine Phosphorylierung des Tyrosins in ITAM infolge einer Kreuzvernetzung der Rezeptoren auf der Zelloberfläche. So wird eine Bindungsstelle für die N-terminale SH2-Domäne des zytoplasmatischen Enzyms Syk, einem Mitglied der Scr-Familie geschaffen. Über die C-terminal gelegene Domäne von Syk können nun weitere Signalproteine aktiviert werden. Dazu gehören zum Beispiel die Phosphatidylinositol 3-Kinase (PI3), die zur Produktion von Phosphatidyl Insositol 3-Phosphat (PIP 3) führt. PIP 3 rekrutiert anschließend PH-Domänen enthaltene Moleküle wie Phospholipase Cγ (PLCγ) und Tec-Kinasen, zum Beispiel Bruton´s Tyrosin Kinase (Btk). Die Aktivierung von PLCγ induziert die Bildung von Insositol 3 Phosphat (IP3), Diacylglycerin (DAG) und unterstützt so die Kalziummobilisierung in der Zelle (Ravetch & Bolland 2001). Des Weiteren bestehen Hinweise auf eine Verbindung der Kreuzvernetzung von Fc-Rezeptor I und II mit der Aktivierung von NF-κB in humanen Monozyten (Drechsler et al. 2002).
Abb. 1
Zelluläre Aktivierung durch Fcγ-Rezeptor III Aggregation. Beispiel eines möglichen Signaltransduktionswegs über die FcR ITAM Phosphorylierung (Ravetch und Bolland 2001).
Im Folgenden werden nur die Subklassen muriner Fcγ-Rezeptoren beschrieben, da in dieser Studie ausschließlich mit murinen Zellen gearbeitet wurde. Der Fcγ-
Rezeptor I (FcγRI) ist ein hochaffiner Rezeptor, der mit zwei γ-Ketten assoziiert ist, und in erster Linie auf Makrophagen zufinden ist. Dabei bindet er IgG2a mit viel höherer Affinität als IgG1, IgG2b und IgG3. Ihm wird vor allem die Phagozytose und Induktion der Antikörper-vermittelten Zytotoxizität (ADCC) zugeschrieben. Der murine Fcγ-Rezeptor III (FcγRIII) bindet Antikörper mit niedrigerer Affinität als FcγRI, wobei er IgG1, IgG2a und IgG2b gleichermaßen gut bindet, IgG3 aber mit niedrigerer Affinität. Er ist ebenfalls mit zwei γ-Ketten assoziiert und besitzt des Weiteren eine β-Kette sowie eine γζ-Kette und kommt vor allem auf Makrophagen, Mastzellen, Neutrophilen- und Eosinophilen Granulozyten, Natürlichen Killerzellen sowie γδ T-Zellen vor. Er ist beteiligt an Antigenpräsentation, Phagozytose, ADCC, Degranulation von Mastzellen und Mediatorfreisetzung.
Der murine Fcγ-Rezeptor II (FcγRII) ist im Gegensatz zu Fcγ-Rezeptor I und III ein Monomer und entspricht in Funktion und Aufbau dem humanen FcγRIIB, der auch bei der Maus in zwei Untergruppen (1 und 2) unterteilt ist. Die Untergruppe 1 kommt vor allem auf B- und T-Zellen vor und vermittelt eine negative Regulation der B-Zell- und Mastzellaktivierung sowie Induktion der Apoptose. Die Untereinheit 2 kommt hauptsächlich auf Makrophagen vor und vermittelt Endozytose und Antigenpräsentation, außerdem gibt es Hinweise auf die Vermittlung von Phagozytose opsonisierter Partikel. IgG1, IgG2a und IgG2b werden von diesen Rezeptoren mit gleicher Affinität erkannt, während IgG3 schlechter gebunden wird.
FcγRII unterscheidet sich von den anderen beiden Rezeptoren durch zwei Besonderheiten. Zum einen besitzt er keine γ-Kette und zum anderen kein aktivierendes, sondern ein inhibierendes Tyrosinmotiv (Tyrosin-based Inhibition Motive = ITIM) (Gessner et al. 1998).
Die Signaltransduktion über ITIM unterscheidet sich von der durch ITAM insofern, als dass nach einer Phosphorylierung des Tyrosins nicht die SH2-Domäne von Syk, sondern das inhibitorische Signaltransduktionsmolekül SHIP (Insositol Polyphosphat 5 -Phosphatase) gebunden wird. Aktiviertes SHIP hydrolysiert PIP3 und bewirkt die Dissoziation von PH-Domänen enthaltener Proteine wie PLCγ und Btk. Durch diesen Mechanismus werden die Freisetzung sowie der Influx von Kalzium in die Zelle verhindert, der aufgrund der Stimulation von ITAM induziert wurde. Darüber hinaus führt eine Phosphorylierung von FcγRIIB zum Abbruch B-Zell-Rezeptor vermittelter Proliferation, die vermutlich durch eine Störung der Aktivierung von MAP-Kinasen induziert wird sowie einer Verhinderung der Rekrutierung der antiapoptotischen
Kinase Akt. FcγRIIB übernimmt somit eine negative Kontrolle der Zellaktivierung (Ravetch & Bolland 2001).
Abb. 2
Signaltransduktion durch Coligation des BCR-FcγRII. Die zelluläre Aktivierung wird durch die Rekrutierung der Inositol Phosphatase SHIP an das FcγRIIB ITIM inhibiert (Ravetch und Bolland 2001).
Bislang war in der Maus kein Rezeptor für IgA bekannt, da der im Menschen vorhandene Fcα-Rezeptor (CD 89) kein Homolog in der Maus besitzt. Kürzlich konnte jedoch in der Maus ein Fc-Rezeptor beschrieben werden, der monomeres und polymeres IgA sowie IgM bindet. Ein Homolog dieses als Fcµ/α-Rezeptor bezeichneten Rezeptors wurde auch im Menschen gefunden (Shibuya et al. 2000).
Offenbar besitzt er nur eine Immunglobulin-assoziierte-Domäne, ist aber trotzdem in der Lage, Antikörper hochaffin zu binden. Dieser Rezeptor wurde auf B-Zellen und Makrophagen, jedoch nicht auf Granulozyten, T-Zellen und Natürlichen Killerzellen aus der Milz gefunden. IgM-vermittelte Phagozytose konnte für den Fcµ/α-Rezeptor mit IgM in B-Zellen nachgewiesen werden und eine Induktion der Antigenpräsentation wird vermutet (Shibuya et al. 2000). Die Funktionen dieses Rezeptors in Makropagen sowie die Mechanismen seiner Signaltransduktion konnten bislang jedoch nicht geklärt werden.
2.9. Zielsetzung der Arbeit
Die Mechanismen und die protektive Bedeutung der unterschiedlichen Immunglobulinklassen bei der Abwehr bakterieller Infektionen des Respirationstraktes sind noch wenig untersucht. Vor Beginn dieser Arbeit gab es erste experimentelle Hinweise, dass eine protektive Funktion bei Infektionen des Respirationstraktes mit Burkholderia pseudomallei durch verschiedene monoklonale Antikörper besteht.
Ziel dieses Projektes war es, am Beispiel der Infektion mit dem fakultativ intrazellulären Erreger Burkholderia pseudomallei, die Rolle von IgA und IgG mit Spezifität für EPS hinsichtlich ihrer protektiven Bedeutung und der verwendeten Mechanismen vergleichend zu untersuchen. Zu diesem Zweck sollte in einem murinen Burkholderia pseudomallei-Pneumoniemodell mit unterschiedlich empfänglichen Mausstämmen in vivo die Bedeutung der Antikörper-vermittelten mukosalen Abwehr durch passive Immunisierung des oberen und unteren Respirationstraktes mit Anti-EPS IgG- und IgA-Isotyp-Switch-Varianten untersucht werden.
Ein weiteres Ziel war die nähere Charakterisierung der Mechanismen der Antikörper- vermittelten Immunität von Burkholderia pseudomallei sowie die Untersuchung der Bedeutung von Effektormolekülen der intrazellulären bakteriziden Aktivität. Dazu sollten zur Klärung der Bedeutung der Fc-Rezeptoren Fcγ-Ketten defiziente Mäuse (Fcγ-chain-Knock-out) eingesetzt werden; Mäuse mit Defekten der induzierbaren NO-Synthase (iNOS Knock-out) und der NAHPH-Oxidase (p47phox Knock-out) sollten zur Untersuchung der Bedeutung intrazellulärer bakterizider Effektorfunktionen zum Einsatz kommen. In diesen Modellen sollte die Bedeutung von NO und Sauerstoffradikalen (ROI) für eine Bekämpfung von Burkholderia pseudomallei in vivo im Pneumoniemodell und in vitro anhand von Knochenmarkmakrophagen geklärt werden.
3. Material und Methoden
3.1. Bakterien
3.1.1. Bakterienstämme Burkholderia pseudomallei
In allen Versuchen mit Burkholderia pseudomallei wurde der Stamm Wildtyp E8 verwendet. Dabei handelt es sich um ein Umweltisolat aus Ubon Ratchatani, Thailand. Dieser Stamm wächst auf Columbia Platten innerhalb von 24 Stunden zu ca. 2 mm großen weißen bis grauen rauen Kolonien heran.
Für weitere Versuche wurden folgende Bakterien verwendet:
Salmonella Typhimurium Typ 331, ATCC 14028
Pseudomonas aeruginosa PAO I: Wundisolat (DSM 1707)
3.1.2. Einfrieren und Auftauen von Bakterien
Zur Herstellung eines in der Keimzahl bestimmten Bakterienstocks wurden Bakterien auf Columbia Platten angeimpft und für 24 Stunden bei 37 °C bebrütet. In mit 10% Glycerin versetztem LB-Medium wurde eine hochkonzentrierte Bakteriensuspension hergestellt, in 0,5 ml Reagiergefäßen á 50 µl aliquotiert und bei -70 °C eingefroren. Zur Bestimmung der Keimzahl wurden mehrere Aliquots aufgetaut und Verdünnungsreihen hergestellt. Von verschiedenen Verdünnungsstufen wurden je 100 µl auf Columbia Platten ausplattiert und nach 24-48 Stunden Bebrütung die Koloniezahl bestimmt.
3.1.3. Anzucht von Bakterien
Die in den in vitro-Experimenten verwendeten Bakterien wurden aus dem oben genannten Stock aufgetaut und mittels Platinöse auf Columbia Platten überimpft und bei 37 °C für 24 Stunden bebrütet. Diese Platte wurde bei 4 °C mit Parafilm abgedichtet gelagert und von ihr wiederum Bakterien für weitere Versuche auf Columbia Platten abgeimpft und 24 Stunden bei 37 °C bebrütet. Für die Infektionen in vivo wurden Bakterien aus dem Stock aufgetaut und die gewünschte Infektionsdosis durch Verdünnung in PBS hergestellt.
3.1.4. Bestimmung der Keimzahl mittels Colony Forming Units (CFU)
Zur Bestimmung der Keimzahl bei in vivo- und in vitro-Experimenten wurden jeweils 100 µl verschiedener Verdünnungsstufen der Probe in Doppelwerten auf Columbia Platten (für die Bestimmung der Infektionsdosis des Bakterienstocks und von Dosiskontrollen), Müller-Hinton Agar-Platten (Keimzahlbestimmung in Makrophagenassays) oder Ashdown Agar-Platten (Keimzahlbestimmung der in vivo- Versuche) ausplattiert.
Die Platten wurden 24-48 Stunden bei 37 °C bebrütet und die Koloniezahl bestimmt.
Aus Platten der gleichen Verdünnungsstufe wurde das arithmetische Mittel der gezählten Kolonien gebildet und mit dem jeweiligen Verdünnungsfaktor multipliziert.
Die absolute Keimzahl wurde durch die Bildung des arithmetischen Mittels der so bestimmten Werte verschiedener Verdünnungsstufen ermittelt.
3.2. Mausmodelle
3.2.1. Rechtliche Grundlagen
Die Genehmigung zur Durchführung der Tierversuche wurde gemäß der geltenden gesetzlichen Bestimmungen von der zuständigen Behörde erteilt und das Versuchvorhaben unter dem Aktenzeichen 509c-42502-99/219 genehmigt.
Die Versuche wurden mit Beteiligung von Frau Jessika Garlisch durchgeführt. Vor Beginn der Versuche erfolgte der Nachweis der Sachkunde durch die Teilnahme an einem 40-stündigen Kurs in Versuchstierkunde gemäß den Empfehlungen der FELASA und der GV-SOLAS für die Aus- und Weiterbildung von Personen, die an der Durchführung von Tierversuchen beteiligt sind (Kategorie B – FELASA). Der Kurs wurde vom Institut für Tierschutz und Verhalten der Tierärztlichen Hochschule Hannover durchgeführt.
3.2.2. Mausstämme
Die in dieser Studie verwendeten Mäuse waren weiblich und zwischen 8 und 10 Wochen alt.
C57Bl/6 (H-2b Haplotyp, Bcg/Tty/Lshs Phänotyp)
BALB/c (H-2d Haplotyp, Bcg/Tty/Lshs Phänotyp)
129.Sv Imj
Die Inzuchtstämme C57Bl/6 und BALB/c wurden von der Firma Charles River Wiga (Sulzfeld) bezogen.
Die Tiere des Stammes 129.Sv Imj stellte freundlicherweise die Arbeitsgruppe Gaestel, Institut für Molekularbiologie der Medizinischen Hochschule Hannover zur Verfügung.
B6.129P2-Nos2tm1Lau: iNOS-Knock-out
B6.129S2-Ncf1tm1shlN14: p47phox-Knock-out
B6,129Fcerg1tm1-Fcgr2tm1: Fc-Rezeptor γ-chain/Fc-Rezeptor II- Knock-out
Die iNOS-Knock-out Tiere wurden von der Firma Jackson Laboratories, Bar Habour, USA bezogen.
Die Knock-out-Stämme p47phox-Knock-out und Fc-Rezeptor γ-chain/Fc-Rezeptor II- Knock-out wurden von der Firma Taconic M & B, Bomholdvej, Dänemark bezogen.
Fc-Rezeptor γ-chain Knock-out: Fcγ-chain-Knock-out
Die Fcγ-chain-Knock-out Mäuse stellte freundlicherweise die Arbeitsgruppe Gessner, Abteilung für Klinische Immunologie der Medizinischen Hochschule Hannover zur Verfügung.
3.2.3. Haltung und Fütterung
Die Tiere wurden in Gruppen von maximal 10 Tieren in Makrolonkäfigen Typ III (337 x 215 x 150 mm) bzw. in Gruppen von maximal 4 Tieren in Makrolonkäfigen Typ II (222 x 162 x 144 mm) auf staubfreien Weichholzspänen gehalten. Die Raumtemperatur betrug 22 +/- 2 °C und die relative Luftfeuchtigkeit betrug 55 +/-5 %.
Futter (Haltungsfutter- Ratten/Mäuse von Altromin 1324) und Wasser standen den Tieren ad libitum zur Verfügung.
Die Tiere waren frei von kontagiösen Ektoparasiten und Endoparasiten, seronegativ gegenüber diversen murinen Viren und spezifischen Pathogenen sowie frei von primären Mauspathogenen.
3.2.4. Narkose
Für intranasale und intratracheale Infektionen wurden die Tiere mit einer Kombination aus Xylazin (Rompun® Bayer) und Ketamin (Gräub) durch intraperitoneale Injektion narkotisiert.
Für intranasale Infektionen betrug die Dosis 5,56 mg/kg Xylazin und 55,5 mg/kg Ketamin in einem Volumen von 100 µl PBS. Die Dosis bei intratrachealer Infektion betrug 8,33 mg/kg Xylazin und 83,34 mg/kg Ketamin in einem Volumen von 150 µl PBS.
Während der Dauer der Narkose erfolgte eine regelmäßige Überwachung der Atmung.