Virulenzanalyse unterschiedlicher Morphotypen von Pseudomonas aeruginosa und Spezies der Gattung Burkholderia

aus dem Institut für Medizinische Mikrobiologie und Krankenhaushygiene der Medizinischen Hochschule Hannover

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Virulenzanalyse unterschiedlicher Morphotypen von Pseudomonas aeruginosa und Spezies der Gattung

Burkholderia

INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer

Doktorin der Veterinärmedizin (Dr. med. vet.)

durch die Tierärztliche Hochschule Hannover

Vorgelegt von

Isabel Ziegler

aus Eppingen

Hannover 2003

Wissenschaftliche Betreuung an der Medizinischen Hochschule:

Priv.-Doz. Dr. Ivo Steinmetz

1. Gutachter/in: Univ.-Prof. Dr. Gerald-Friedrich Gerlach 2. Gutachter/in: Dr. Astrid M. Tenter

Tag der mündlichen Prüfung: 26.11.2003

Gefördert durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG)

HÄUSSLER, S., I. ZIEGLER, A. LÖTTEL, F. v. GÖTZ, M. RHODE, D. WEHMHÖHNER, S.

SARAVANAMUTHU, B. TÜMMLER u. I. STEINMETZ (2003b)

Highly adherent small-colony variants of Pseudomonas aeruginosa in cystic fibrosis lung infection J. Med. Microbiol. 52: 295 – 301

Seite

1. EINLEITUNG 11

2. SCHRIFTTUM 13

2.1. Pseudomonas aeruginosa 13

2.1.1. Kulturcharakteristika und klinische Bedeutung 13

2.1.2. Virulenzfaktoren von P. aeruginosa 14

2.2. Burkholderia spp. 15

2.2.1. Taxonomie 15

2.2.2. Kulturcharakteristika und klinische Bedeutung 15

2.2.3. Virulenzfaktoren von B. cepacia 16

2.3. Small Colony Variants 17

2.4. Bakterielle Biofilmbildung 17

2.4.1. Biofilm als Virulenzfaktor in der CF-Lunge 17

2.4.2. Quorum-sensing-regulierte Entstehung von Biofilm 18 2.4.3. Phänotypische Charakteristika von Bakterien im Biofilm 19

2.5. Caenorhabditis elegans 20

2.5.1. Vorkommen und Bedeutung in der biologischen Grundlagenforschung 20

2.5.2. Anatomie, Lebenszyklus und Entwicklung 21

2.5.3.

22

2.5.4. Einfluss der Kulturbedingungen auf C.-elegans-Bakterien-Interaktionen 23

2.5.4.1. Slow Killing 23

2.5.4.2. Fast Killing 23

2.5.4.3. Letale Paralyse 24

2.6. Zielsetzung der Arbeit 25

3.1. Arbeitsplatz 26

3.2. Geräte 26

3.3. Bakterienstämme und Kulturbedingungen 26

3.3.1. Verwendete Bakterienstämme 26

3.3.1.1.

26

3.3.1.2.

30

3.3.1.3. Eingesetzte Bakterienstämme im C.-elegans-Modell 31

3.3.2. Einfrieren der Bakterien 31

3.3.3. Auftauen der Bakterien 31

3.3.4. Anzucht der Bakterien für die Versuche 31

3.3.5. Keimzahlbestimmung 32

3.3.6. Konstruktion der

P. aeruginosa 55 WT

32

3.4. Basistechniken mit C. elegans 32

3.4.1. Versuchstiere 32

3.4.2. Haltung der Versuchstiere 33

3.4.3. Herstellung der bakteriellen Nahrungsquelle 33

3.4.3.1. Herstellung der

33 3.4.3.2. Herstellung der

34 3.4.3.3. Übersetzen von

34

3.4.3.4.

34

3.5. C.-elegans-Infektionsmodell 35

3.5.1. Durchführung der

35

3.5.1.1. Durchführung des Reproduktionsassays auf NGM I-Agar (Slow Killing)

und PGS-Agar (Fast Killing) 35

3.5.1.2. Durchführung von

Stämmen 36

3.5.1.3. Darstellung

36

3.5.1.4. Durchführung des Fast Killing-Assays auf PGS-Agar 37

3.5.2. Assays zum Nachweis bakterieller Exoprodukte 37

als Futterquelle 38 3.5.2.3. Paralytic-Killing-Assay auf Brain-Heart-Infusion-(BHI-)Agar 38 3.5.2.4. Nachweis der Zyanidproduktion ausgewählter Bakterienstämme 38

3.6. Bakterielle Biofilmbildung in modifiziertem Vogel-Bonner-Medium und

anderen Medien 40

3.6.1. Nachweis der Biofilmbildung in modifziertem Vogel-Bonner-Medium in einem

Mikrotiterassay 40

3.6.2. Einfluss unterschiedlicher Kulturmedien auf die Biofilmbildung von

P. aeruginosa 20265

40

3.6.2.1. Biofilmbildung der drei Morphotypen bei Zusatz von Glukose und

Casaminosäuren 40

3.6.2.2. Biofilmbildung der drei Morphotypen in LB-Bouillon 40 3.6.3. Biofilmbildung von

verfügbaren Eisens 41

3.6.3.1. Zusatz von Eisen in unterschiedlichen Formulierungen 41 3.6.3.2. Biofilmbildung der drei Morphotypen bei unterschiedlichen Anzucht-

bedingungen und anschließender Modifizierung des Eisengehaltes

des Vogel-Bonner-Mediums 41

3.7. Motilität der Bakterien und Adhäsion an Oberflächen 41

3.7.1. Durchführung von Motilitätstests auf Swimming-Agar bei 30 °C 41 3.7.2. Durchführung von Motilitätstests auf Swarming-Agar bei 30 °C 42 3.7.3. Durchführung von Motilitätstests auf Twitching-Agar bei 30 °C 42 3.7.3.1. Bestimmung des Twitching-Verhaltens einzelner Stämme

nach 48 h bei 37 °C 42

3.7.4. Elektronenmikroskopische Darstellung der Morphotypen von

Twitching-Platten 42

4. ERGEBNISSE 43

4.1. P. aeruginosa im C. elegans-Infektionsmodell 43

4.1.1. Screening der

43

4.1.2. Charakterisierung von SCV und klonalem WT im Fast Killing-Assay 47

4.1.4. Mikroskopische Darstellung der gfp-markierten Stämme P. aeruginosa 17997 SCV und P. aeruginosa 55 WT im Verdauungstrakt von C. elegans 52 4.1.5. Charakterisierung ausgewählter

im Paralytic-Killing-Assay 54

4.1.5.1. Vergleich der Zyanidproduktion der unterschiedlichen Morphotypen 56

4.2. Biofilmformation von P. aeruginosa 58

4.2.1. Vergleich der Morphotypen von P. aeruginosa im Mikrotiterassay 58 4.2.2. Exemplarische Analyse der Biofilmbildung von P. aeruginosa 20265

bei modifizierten Versuchsbedingungen 63

4.2.2.1. Einfluss der Zusammensetzung des Kulturmediums

auf die Biofilmformation 63

4.2.2.2. Einfluss des verfügbaren Eisens auf die Biofilmformation 65 4.2.2.3. Vergleich der Morphotypen von P. aeruginosa 20265 bei unterschiedlichen

Anzuchtbedingungen 66

4.2.3. Analyse des Motilitätsverhaltens der einzelnen Morphotypen auf

unterschiedlichen Medien bei 30 °C 68

4.2.3.1. Analyse des Motilitätsverhaltens ausgewählter Stämme bei 37 °C 76 4.2.4. Elektronenmikroskopische Darstellung einzelner Stämme nach Anzucht auf

Twitching-Agar 77

4.3. Burkholderia spp. im C.-elegans-Infektionsmodell 78

4.3.1. Screening der

78 4.3.2. Absterbekinetiken ausgewählter

und Fast Killing-Assays 80

4.3.3. Vergleich einzelner Genomovare im modifizierten Nitrozellulose-Assay

auf PGS-Agar 84

4.3.4. Verhalten von

86

5. DISKUSSION 89

5.1. Charakterisierung unterschiedlicher P.-aeruginosa-Morphotypen

im C.-elegans-Modell 89

5.2. Charakterisierung der Biofilmformation von P. aeruginosa 91

5.3.1. Pathogenitätsunterschiede zwischen den einzelnen Genomovaren im

C.-elegans-Modell

93

5.3.2. Exotoxinvermitteltes Fast Killing von Burkholderia spp. 94

5.3.3. Food Choice – Futterwahl von C. elegans 95

5.4. Schlussfolgerungen 96

6. ZUSAMMENFASSUNG 97

SUMMARY 99

7. LITERATURVERZEICHNIS 101

8. ANHANG 117

8.1. Gebrauchsmaterialien 117

8.2. Medien und Zusätze 117

8.3. Lösungen und Puffer 119

8.4. Chemikalien 120

8.5. Tabellen- und Abbildungsverzeichnis 122

8.6. Abkürzungsverzeichnis 125

1. EINLEITUNG

Ursache der Krankheit Zystische Fibrose (CF, syn. Mukoviszidose) ist ein autosomal-rezessiv vererbter Defekt im CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator)-Gen. Als Folge dieses Gendefektes bildet sich in der Lunge der Betroffenen zähes Sekret, das die Atemwege verlegt und zu einer gestörten mukoziliären Clearance führt. Die in einer solchen Lunge vorliegenden Bedingungen bieten ideale Voraussetzungen für die Besiedlung mit Opportunistenkeimen (GOVAN u.

DERETIC, 1996a). Während im frühen Krankheitsstadium hauptsächlich Haemophilus influenzae und Staphylococcus aureus eine Rolle spielen, werden bei älteren CF-Patienten mit chronischen Lungeninfektionen am häufigsten Pseudomonas aeruginosa und Burkholderia spp. isoliert (GOVAN u.

DERETIC, 1996a). Diese Spezies stellen den Hauptgrund für Morbidität und Mortalität bei älteren Mukoviszidosepatienten dar.

Im Laufe der Erkrankung kommt es nach chronischer Infektion der Lunge zu einem Versagen der Lungenfunktion, wobei auch eine Kokolonisation verschiedener Keime anzutreffen ist. Für jede Spezies werden unterschiedliche Virulenzfaktoren diskutiert. Als Virulenzfaktor wird bei P. aeruginosa beispielsweise die Fähigkeit zur Biofilmbildung betrachtet. Nach Meinung von POSCHET et al. (

2001)

AUSUBEL, 2001) unterstreichen dagegen die Bedeutung sog. small colony variants (SCVs), kleinwüchsiger Varianten von P. aeruginosa, denen auch eine erhöhte Resistenz gegenüber antibiotisch wirksamen Substanzen zugeschrieben wird (HÄUSSLER et al., 1999). Ihre pathogenetische Bedeutung ist bis heute ungeklärt. Auch beim Burkholderia cepacia Komplex und vielen weiteren Spezies sind solche kleinwüchsigen Varianten bekannt. Generell wird B. cepacia neben seiner Bedeutung bei der chronischen Besiedelung der CF-Lunge auch mit einer progressiv verlaufenden septikämischen Form der Lungeninfektion bei Mukoviszidose in Zusammenhang gebracht (RAJAN u. SAIMAN, 2002). Unklar sind in diesem Kontext Virulenzunterschiede zwischen den einzelnen Genomovaren.

Interaktionen zwischen Virulenzfaktoren eines Bakterienstammes einerseits und Wirtsabwehrmechanismen andererseits konnten 1999 erstmals mit Hilfe eines Nematoden-Bakterien- Pathogenitätsmodell demonstriert werden, welches sich mit den Einflüssen von P. aeruginosa PA14 auf den Fadenwurm Caenorhabditis elegans befasste (TAN et al., 1999a, 1999b; MAHAJAN-MIKLOS et al., 1999; TAN et al., 2000). Weitere Pseudomonas-Stämme wurden in den folgenden Jahren im C.- elegans-Modell analysiert, unter anderem auch der Modellstamm P. aeruginosa PAO1 (DARBY et al., 1999). Auch Stämme der Gattung Burkholderia sind schon im C.-elegans-Modell untersucht worden (O´QUINN et al., 2001).

Im Rahmen dieser Studie soll unter Verwendung des C. elegans-Pathogenitätsmodells und eines In- vitro-Biofilm-Modells geklärt werden, inwiefern sich die Virulenz kleinwüchsiger Kolonietypen von der Virulenz des Wildtyps von P. aeruginosa und Burkholderia spp. unterscheidet. Es soll außerdem untersucht werden, ob im C.-elegans-Modell im bezug auf Burkholderia Unterschiede zwischen den

einzelnen Genomovaren erkennbar sind. In der vorliegenden Arbeit werden zudem erstmals SCVs untersucht, die in vivo aus den Lungen von CF-Patienten isoliert wurden.

2. SCHRIFTTUM

2.1. Pseudomonas aeruginosa

2.1.1. Kulturcharakteristika und klinische Bedeutung

Pseudomonas aeruginosa ist ein stäbchenförmiges, polar monotrich begeißeltes, gramnegatives Bakterium. Es ist die am längsten bekannte und humanmedizinisch bedeutendste Pseudomonasart.

Die optimale Wachstumstemperatur des Keimes liegt bei 37 °C; Wachstum wird aber sowohl unterhalb dieser Temperatur als auch noch bei bis zu 43 °C beobachtet. Auf Standardnährmedien gibt es unterschiedliche Kolonietypen (Phänotypen): klassisch, rau, runzelig, mukoid und winzig. Mukoide Formen können eine feuchte oder gummiartige Konsistenz haben; feuchte Formen sind transparent.

Beide Varianten neigen nach längerer Inkubation zur Verschmelzung. SCVs bilden meist erst nach längerer Inkubationszeit (> 48 h) sichtbare Kolonien. Auf Standardnährböden zeigen viele P.

aeruginosa-Stämme schillernde Flecken mit metallischem Glanz.

Aufgrund seiner Anspruchslosigkeit ist der Keim in der Lage, fast jede ökologische Nische zu besiedeln. Er kommt ubiquitär sowohl an aquatischen Standorten als auch im Boden und in der Luft vor. Diese große Flexibilität von P. aeruginosa wird auch an der Vielzahl möglicher Wirtsorganismen deutlich; hierzu zählen neben Säugern auch Pflanzen (RAHME et al., 1997), Nematoden (TAN u.

AUSUBEL, 2000) und Insekten (RAHME et al., 1995; MAHAJAN-MIKLOS et al., 2000). Erst kürzlich wurde die Genomsequenz von P. aeruginosa veröffentlicht (STOVER et al., 2000). Die Größe (6,3 Mbp) und die Komplexizität des Genoms mit einem überdurchschnittlich hohen Anteil an Regulatorgenen (8,4 %) spiegeln das hohe Adaptionsvermögen von P. aeruginosa an unterschiedliche Umweltbedingungen wieder.

2.1.2. Virulenzfaktoren von P. aeruginosa

Da in taxonomischer und funktioneller Hinsicht kein größerer Unterschied zwischen P.-aeruginosa- Umweltkeimen und klinischen Isolaten festgestellt werden kann (FOGHT et al., 1996; ROMLING et al., 1994), kann auf eine hohe physiologischen und genetischen Variabilität des Keimes geschlossen werden. Der Erfolg von P. aeruginosa als ubiquitär vorkommendes Bakterium wird einerseits seiner breiten metabolischen Vielfalt, andererseits der Produktion zahlreicher zellassoziierter und sezernierter Virulenzfaktoren zugeschrieben (VAN DELDEN et al., 1998).

Zu den zellassoziierten Virulenzfaktoren wird z. B. das auf der Zelloberfläche von P. aeruginosa befindliche polare Flagellum gezählt, das für Motilität in flüssiger Umgebung verantwortlich ist, dem sog. Swimming. Flagellen vermitteln auch eine andere Motilitätsform, das Swarming, das erst kürzlich zum ersten Mal bei P. aeruginosa beschrieben wurde (RASHID et al., 2000). Der Besitz von Flagellen und die damit verbundene Motilität scheinen eindeutig zur Virulenz eines Keimes beizutragen. Nicht- motile Mutanten von P. aeruginosa rufen nicht ohne weiteres Infektionen im Tiermodell hervor und

DORING u. DORNER (1997) stellten fest, dass eine Flagellen-Vakzine einen Schutz vor experimenteller Infektion bietet.

Andere Zelloberflächenstrukturen, die als potentielle Virulenzfaktoren angesehen werden, sind Typ-IV- Pili, die die meisten P. aeruginosa-Stämme besitzen. Diese sog. Fimbrien sind einzeln oder an beiden Polen lokalisiert und zählen 5–20 pro Pol. Sie sind flexible Filamente, bestehend aus einem Protein, dem Pilin. Sie sind höchstwahrscheinlich verantwortlich für Adhärenz sowohl an eukaryotischen Zellen (HAHN et al., 2000) als auch an abiotischen Oberflächen (SEMMLER et al., 1999). Außerdem werden sie mit einer flagellenunabhängigen Motilitätsform, dem Twitching, in Verbindung gebracht (DARZINS et al., 1997; SEMMLER et al., 1999; WALL et al., 1999). Die Präsenz von Fimbrien ist aber keine Voraussetzung für Virulenz, da es auch nicht-fimbrientragende virulente Stämme gibt.

Zellgebunden sind auch die von P. aeruginosa produzierten Lipopolysaccharide mit endotoxischer Wirkung. P. aeruginosa besitzt außerdem die Fähigkeit zur Bildung einer Schleimkapsel, die antiphagozytär wirkt. Die Synthese von Alginat, einem Exopolysaccharid (EPS) aus Mannuron- und Guluronsäure-Monomeren, spielt zusammen mit dem Vorhandensein von Flagellen und Pili eine bedeutende Rolle bei der Biofilmbildung durch P. aeruginosa.

Extrazellulär abgesonderte Substanzen umfassen beispielsweise Exoproteasen, Exotoxine, Hämolysine und Lipasen. Die meisten P. aeruginosa-Isolate bilden proteolytische Enzyme, die eine Reihe von Substraten abbauen. Es werden drei verschiedene Proteasen unterschieden; eine gewöhnliche Protease, eine alkalische Protease (AP) und eine Elastase (EP). Bei pathogenen Prozessen im Respirationsapparat vergrößern bestimmte Proteasen die Permeabilität des Respirationsepithels durch Angriffe auf die „tight junctions“ zwischen den Epithelzellen. Folge ist eine leichtere Ablösung der Epithelzellen von den Nachbarzellen und von der Basalmembran und ein leichteres Eindringen des Erregers. Bei akuter Sepsis spielen Proteasen eine wichtige Rolle; Stämme mit mangelhafter Proteasenbildung erscheinen im Mausmodell weniger virulent.

Das wichtigste von P. aeruginosa produzierte Toxin ist das Exotoxin A (ETA). Es inaktiviert durch Übertragung eines Adenosindiphosphat-Ribose-Fragmentes auf den Elongationsfaktors EF-2 die Peptidkettenverlängerung und somit die Proteinsynthese der Wirtszelle. Über diese Hemmung der Proteinsynthese führt es schließlich zum Tod. ETA wird von ca 90 % aller klinischen Isolate unter eisenarmen Wachstumsbedingungen gebildet. ETA ist hochtoxisch; im Tiermodell verursacht es Hypotension und Schock, hepatische Nekrosen und Leukopenie. Toxin-Expression ist nicht unbedingt erforderlich für die Virulenz eines Stammes, aber toxin-negative Mutanten verursachen weniger schwere Infektionen in experimentellen Studien. Exotoxin S ist ein weiteres von P. aeruginosa gebildetes Toxin, es führt aber nicht zu Inaktivierung von EF-2. Es fördert die Anheftung des Bakteriums an die Epithelzellen des Respirationstraktes und führt zu einer Beeinträchtigung von Wirtsabwehrmechanismen.

P. aeruginosa bildet zwei verschiedene Hämolysine, eine hitzelabile Phospholipase C und ein hitzestabiles Rhamnolipid PLC (HÄUSSLER et al., 1999). Auch lipolytische Aktivität konnte bei den meisten Stämmen nachgewiesen werden. Extrazelluläre Lipasen werden hauptsächlich in der späten logarithmischen Wachstumsphase abgesondert.

Charakteristisch ist weiterhin die Ausscheidung wasserlöslicher Pigmente. Das blaugrüne Phenazinderivat Pyocyanin führt durch Inaktivierung des α1-Protease-Hemmers zu einer

unkontrollierten Aktivität der Serin-Protease und trägt somit zum fortschreitenden Gewebsuntergang in der CF-Lunge bei (BRITIGAN et al., 1999). Gelbgrün fluoreszierende Pigmente wie Pyoverdin und Pyochelin dienen als Siderophore, die für den Eisentransport im aeroben, neutralen Milieu eine wichtige Rolle spielen (COX u. ADAMS, 1985; SRIYOSACHATI u. COX, 1986). Dunkelrote Pigmente (Pyorubin) sind ebenfalls bekannt.

2.2. Burkholderia spp.

2.2.1. Taxonomie

1949 wurde B. cepacia erstmals unter dem Namen Pseudomonas cepacia beschrieben (BURKHOLDER, 1949). Seit 1992 wird B. cepacia dem Genus Burkholderia zugeordnet (YABUUCHI et al., 1992). Diesem Genus werden zur Zeit insgesamt 22 Spezies zugerechnet; neben B. cepacia (Genomovar I und III) auch B. gladioli, B. vietnamiensis, B. stabilis u. a. (GOVAN et al., 1996b;

SEGONDS et al., 1999).

VANDAMME et al. (1996) unterscheiden mindestens fünf B.-cepacia-Genomovare, die zum sog. B.- cepacia-Komplex gerechnet werden. In darauffolgenden Studien konnten zwei weitere Genomovare identifiziert werden (COENYE et al., 2001a, 2001b).

Inzwischen zählen zum B.-cepacia-Komplex mindestens neun unterscheidbare Genomovare (I-IX), die zum Teil bereits eigenen Speziesstatus erlangt haben (GILLIS et al., 1995; VANDAMME et al., 1997;

VANDAMME et al., 2000; COENYE et al., 2001a, 2001b). Hierbei handelt es sich neben den Genomovaren I, III und VI um B. multivorans (Genomovar II), B. stabilis (Genomovar IV), B.

vietnamensis (Genomovar V), B. ambifaria (Genomovar VII), B. anthina (Genomovar VIII) sowie B.

pyrrocinia (Genomovar IX).

2.2.2. Kulturcharakteristika und klinische Bedeutung

Bakterien vom B.-cepacia-Komplex sind gramnegative, aerobe, polar begeißelte Stäbchenbakterien.

Auf Standardmedium bilden sie nach 24 h Inkubation Kolonien mit bis zu 5 mm Durchmesser von butterartiger Konsistenz. Sie bilden nicht-fluoreszierende gelbe, grüne oder rote Pigmente. Die optimale Wachstumstemperatur liegt bei 30 °C.

B. cepacia ist ebenso wie P. aeruginosa ein ubiquitär vorkommendes gramnegatives Bakterium, das aus dem Erdboden, Oberflächengewässern und Wasserleitungen isoliert werden kann. Für den Menschen und für Tiere ist B. cepacia unter normalen Bedingungen apathogen. Der Erreger zeichnet sich durch eine hohe Resistenz gegenüber Antibiotika aus. B. cepacia ist außerdem in der Lage, sich in Wasser und Desinfektionsmitteln zu vermehren (BLESSING et al., 1979; LIPUMA et al., 1998).

Burkholderia cepacia galt zunächst ausschließlich als pflanzenpathogen, wurde dann Ende der 1980er Jahre als wichtiger Erreger bei nosokomialen Infektionen, bei chronischer Granulomatose und Mukoviszidose beschrieben. Hauptinfektionsquelle stellt wie bei P. aeruginosa das Krankenhaus dar, in dem B. cepacia häufig auf feuchten Oberflächen und Instrumenten, an Blumenvasen oder in wässrigen Lösungen anzutreffen ist. Auch eine Übertragung mittels Aerosolen (HUMPHREYS et al.,

1994) scheint ebenso möglich wie die Verbreitung über direkten Kontakt oder über kontaminierte Gegenstände (SMITH et al., 1993; GOVAN et al., 1993; WHITEFORD et al., 1995).

Vor allem bei älteren CF-Patienten lässt sich B. cepacia nachweisen (NELSON et al., 1994). Die Besiedelung der Lunge mit B. cepacia beschränkt sich im allgemeinen auf einen einzigen Stamm (LEDSON et al., 1998). Die meisten der isolierten Stämme gehören den Genomovaren II oder III an (VANDAMME et al., 1997).

Die Besiedelung der Lunge von CF-Patienten mit B. cepacia manifestiert sich in drei unterschiedlichen Verlaufsformen. Zum einen unterscheidet man eine asymptomatische Besiedelung der Lunge ohne klinische Symptome, zum zweiten eine chronisch verlaufende, fortschreitende Pneumonie und zum dritten eine akute, in der Regel tödlich verlaufende nekrotisierende Pneumonie, das sog. Cepacia- Syndrom (ISLES et al., 1984; GOVAN et al., 1996b). Das Cepacia-Syndrom wird häufig von Fieber und einer Bakteriämie begleitet und führt innerhalb kürzester Zeit zum Tod des Patienten. Dieses Phänomen wird nur in Zusammenhang mit B. cepacia genannt, andere CF-Pathogene scheinen hierbei keine Rolle zu spielen. Besonders häufig konnten hierbei Stämme des Genomovars III isoliert werden.

2.2.3. Virulenzfaktoren von B. cepacia

Im Gegensatz zu P. aeruginosa ist das Wissen über Virulenzfaktoren von B. cepacia beschränkt. Man unterscheidet auch hier zellassoziierte und zellunabhängige Virulenzfaktoren.

Bei den zellassoziierten Virulenzfaktoren scheinen Flagellen bei B. cepacia eine wichtige Rolle für die Pathogenität des Erregers zu spielen. TOMICH et al. (2002) konnten zwei Gene identifizieren, die für korrekte Funktion der Geißel kodieren. Mutanten mit Mutationen oder Defekten in einem von beiden Genen zeigten deutlich reduzierte Motilität und herabgesetzte Invasivität in die Epithelzelllinie A549.

Fimbrien stellen weitere wichtige Zelloberflächenstrukturen dar, die für Adhäsion des Erregers an die Schleimhautepithelien des Wirtes unabdingbar sind und die bei etwa 60 % der B.-cepacia-Isolate nachgewiesen werden konnten (KUEHN et al., 1992, NELSON et al., 1994). Die Adhäsionsrate von B.

cepacia an die Zellen des Respirationstraktes kann hierbei durch die Präsenz des meist ebenfalls in der CF-Lunge vorhandenen Keimes P. aeruginosa noch erhöht werden, indem dessen Exoprodukte die Wirtszelloberfläche verändern und Rezeptoren freisetzen (SAIMAN et al 1990).

Einige B.-cepacia-Isolate produzieren Proteasen, Lipasen, Hämolysine und Exopolysaccharide. Es gibt allerdings nur wenige Anzeichen dafür, dass diese Exoprodukte von B. cepacia entscheidend zur Pathogenese der CF beitragen. P. aeruginosa scheint auch eine bedeutende Rolle bei der Bildung dieser Exoprodukte zu spielen. So konnten MCKENNEY et al. (1995) unter dem Einfluss von P.

aeruginosa einen signifikanten Anstieg der Bildung von Siderophoren, Lipasen und Proteasen durch B. cepacia feststellen. Die Produktion dieser extrazellulären Virulenzfaktoren unterliegt bei B. cepacia - wie bei vielen anderen gramnegativen Bakterien auch - einem als Quorum Sensing bezeichneten Mechanismus (LEWENZA et al., 1999). Dieser wird von der Zelldichte beeinflusst und beruht auf der Bildung von N-Acyl-Homoserin-Lactonen, die auch als Autoinducer bezeichnet werden, und durch die das Verhalten einer Zellpopulation in einer feindlichen Umwelt oder im Wirtsorganismus gesteuert

wird. Autoinducer-negative B.-cepacia-Transposonmutanten waren in ihrer Virulenz deutlich attenuiert (LEWENZA et al., 1999).

2.3. Small Colony Variants

Als SCVs werden klein und langsam wachsende Subpopulationen eines Keimes bezeichnet, die bestimmte phänotypische Charakteristika aufweisen. Bei vielen grampositiven und gramnegativen Keimen sind solche SCVs bekannt und beschrieben.

Der Zusammenhang zwischen chronisch rezidivierenden Infektionen mit einer langen Latenzzeit und der Isolierung von SCVs scheint inzwischen unbestritten (KAHL et al., 1998; PROCTOR et al., 1995).

SCVs können nicht nur in kultivierten Endothelzellen persistieren (BALWIT et al., 1994), sondern weisen auch eine erhöhte Resistenz gegenüber Aminoglykosid-Antibiotika wie z. B. Gentamicin auf.

PROCTOR et al. (1995) gelang es sogar, Staphylococcus-aureus-SCVs in vivo und in vitro durch eine antibiotische Therapie zu induzieren; GERBER u. CRAIG (1982) gelang die In-vitro-Isolierung von P.- aeruginosa-SCVs nach Exposition zu Aminoglykosiden. HÄUSSLER et al. (1999) konnten bei CF- Patienten eine positive Korrelation zwischen antibiotischer Aerosoltherapie und gehäufter Isolierung von P. aeruginosa-SCVs feststellen; die Besiedelung der Lunge mit diesem klein wachsenden Phänotyp ging zudem mit einer eingeschränkten Lungenfunktion einher. Die von HÄUSSLER et al.

(1999) bestimmten minimalen Hemmstoffkonzentrationen einer Reihe von antibiotisch wirksamen Substanzen lagen bei den untersuchten SCVs zwei- bis achtfach über den Werten der korrelierenden Revertanten.

Bei Subkultivierung der kleinen Variante kann die spontane Entstehung eines größer wachsenden Phänotyps, der sog. Revertante (Rev), beobachtet werden (HÄUSSLER et al., 1999; DEZIEL et al., 2001; DRENKARD u. AUSUBEL, 2002).

2.4. Bakterielle Biofilmbildung

2.4.1. Biofilm als Virulenzfaktor in der CF-Lunge

Bakterien in natürlicher Umgebung wachsen in der Regel in Biofilmen, d. h. als organisierte Baterienpopulationen eingebettet in eine extrazelluläre Polysaccharidmatrix und an eine Oberfläche anhaftend (COSTERTON et al., 1994, 1995). Im Zusammenhang mit Infektionen wird die Fähigkeit zur Biofilmbildung als entscheidender Virulenzfaktor angesehen, der dem Bakterium die Möglichkeit gibt, in einer feindlichen Umgebung zu überleben (COSTERTON et al., 1994). Biofilmbildung dient als Schutzmechanismus vor dem Angriff antimikrobieller Substanzen und vor Phagozytose durch Zellen des wirtseigenen Immunsystems.

Abgesehen davon, dass bakterielles Wachstum im Biofilm eine natürliche Diffusionsbarriere für antimikrobielle Substanzen sowie Zellen der körpereigenen Abwehr darstellt, wird die hohe Resistenz von im Biofilmmodus wachsenden Bakterien im Vergleich zu frei in Dispersion wachsenden Keimen einer Vielzahl von Faktoren zugeschrieben. Sie wird durch eine erwiesenermaßen langsamere Wachstumsrate der Biofilmbakterien (BROWN et al., 1990) begünstigt, einem reduzierten

Sauerstoffgehalt im Innern des Biofilms und der gesteigerten Produktion von beta-Lactamase durch die Bakterien (GIWERCMAN et al., 1991). NICHOLS et al. (1988) wiesen die Bindung positiv geladener Aminoglykosidantibiotika an die die Bakterien umgebende negativ geladene Alginatpolymere nach. Biofilm bietet zudem Schutz vor Angriffen von Phagozyten (JENSEN et al., 1992) und Komplement (ANWAR et al., 1992).

Auch die chronische Lungeninfektion mit P. aeruginosa bei Patienten mit CF wird als Biofilminfektion angesehen, schwer beeinflussbar durch antibiotische Therapie und kaum beeinträchtigt von Wirtsabwehrmechanismen (COSTERTON, 2001). FUQUA et al. (1994) konnten zeigen, dass die von P. aeruginosa produzierten Quorum-Sensing-Signale von den Genen las und rhl abhängen.

Zumindest eines dieser Systeme („Las“) kontrolliert erwiesenermaßen die Biofilmbildung von P.

aeruginosa (DAVIES et al., 1998). SINGH et al. (2000) gelang der Nachweis, dass das im CF-Sputum bestimmte Verhältnis zweier Quorum-Sensing-Signale eher dem von Biofilmbakterien ausgesandten Muster ähnelt als den Signalen von frei in Dispersion wachsenden Bakterien. Zudem konnte mithilfe elektronenmikroskopischer Aufnahmen schon mehrfach demonstriert werden, dass aus den Sputen von CF-Patienten isolierte Zellen in Form von Mikrokolonien vorliegen (SINGH et al., 2000; LAM et al., 1980).

Bei Kokolonisation der Lunge eines CF-Patienten mit Pseudomonas spp. und Burkholderia spp.

scheinen nicht nur Wechselwirkungen innerhalb einer Spezies eine Rolle zu spielen. HENTZER et al.

(2001) konnte bei Kokultivierung beider Spezies in „flow cell chambers“ auch synergistische Effekte zwischen Pseudomonas und Burkholderia beobachten; es kam zu einer deutlichen Zunahme der Biofilmbildung bei Untersuchung einer Mischkultur im Vergleich zur Betrachtung eines einzelnen Keimes (HENTZER et al., 2001).

2.4.2. Quorum-sensing-regulierte Entstehung von Biofilm

Die Entstehung von Biofilm wird initial über Quorum Sensing reguliert. Quorum Sensing beschreibt einen interzellulären Kommunikationsprozess, der die Bakterien in die Lage versetzt, abhängig von der Zelldichte ihr Verhalten zu koordinieren. Dabei wird die bakterielle Genexpression optimal auf das vorhandene Nahrungsangebot, auf konkurrierende Mikroorganismen, auf evtl. vorhandene toxische Substanzen eingestellt und somit die Virulenz im Sinne einer erfolgreichen Infektion gesteuert. Zur Koordination untereinander nutzen die Bakterien bestimmte, auf niedrigem Niveau produzierte, lösliche Signalmoleküle, sog. Autoinducer. Bei gramnegativen Bakterien sind diese Autoinducer Acyl- Homoserinlactone (AHLs). Erreichen sie eine kritische Konzentration, wird die Expression bestimmter Gene aktiviert. Bei großer Bakteriendichte aktivieren diese Autoinducer sog. Response-Regulator- Proteine in der Zelle, die wiederum die Expression bestimmter Gene aktivieren sowie durch eine positive Rückkoppelung die eigene Synthese.

Nach initialen Quorum-Sensing-Signalen sind flagellenvermittelte Motilität und die auf Typ-IV-Pilus basierende Twitching-Motilität zum weiterem Aufbau von Biofilmen durch P. aeruginosa von Bedeutung (O´TOOLE et al., 1998). Flagellen verhelfen dem Bakterium in der Anfangsphase der Biofilmformation dazu, zum „Ort des Geschehens“ zu gelangen. Bei der weiteren zellulären Interaktion sind Typ-IV-Pili von zunehmender Wichtigkeit; sie regulieren sowohl die Verknüpfung zwischen den

Bakterien untereinander als auch die Anheftung an die Wirtszelle. Es entstehen zunächst sogenannte Mikrokolonien, kleine Bakterienhäufchen, die aber langsam zu immer größer werdenden Klumpen zusammenwachsen und schließlich einen zusammenhängenden Biofilm bilden. Die bakterielle Alginatsynthese wird hochreguliert; zwischen den Zellen wird eine Glykokalix aus Exopolysacchariden eingelagert. Innerhalb des Biofilms kann koordinierte Aktivität beobachtet werden, die durch Quorum- Sensing-Signale gesteuert wird. Die Wachstumsrate von Biofilmbakterien im Vergleich zu planktonischen Zellen ist reduziert (BROWN et al., 1990). Mit der Wandlung von frei in Dispersion wachsenden Bakterien zum zusammenhängenden Biofilm scheint eine Änderung des Phänotyps einherzugehen.

2.4.3. Phänotypische Charakteristika von Bakterien im Biofilm

Biofilmbakterien weisen einen Phänotyp auf, der sich deutlich vom frei in Dispersion wachsenden Phänotyp unterscheidet (COSTERTON et al., 1995; WATNICK et al., 2000).

OLIVER et al. (2000) erklärten die Isolierung unterschiedlicher Morphotypen, einschließlich mukoider Kolonietypen und SCVs, aus der Lunge von CF-Patienten mit dem hohen Selektionsdruck, der in der CF-Lunge herrscht. Durch Anpassung an die feindliche Umgebung entstehen in der chronisch infizierten Lunge unter antibiotischer Behandlung und unter dem Druck der Abwehrmechanismen des Wirtes Stämme mit erhöhten Mutationsraten, die bei akut mit P. aeruginosa infizierten (Nicht-CF- )Patienten nicht nachgewiesen werden konnten.

Die Etablierung der chronischen Lungeninfektion geht mit Konversion zum mukoiden Kolonietyp einher (KOCH u. HOIBY, 1993; PEDERSEN, 1992). MATHEE et al. (1999) konnten diese Umwandlung zum mukoiden Kolonietyp der Freisetzung von freien Sauerstoffradikalen durch neutrophile Granulozyten zuschreiben. Die Isolierung mukoider Stämme aus der Lunge eines CF- Patienten geht meist mit einer schlechten Prognose einher und korreliert mit erhöhten Antikörperspiegeln gegen Alginat (PEDERSEN et al., 1990). HENTZER et al. (2001) konnten nach Konversion zum mukoiden Kolonietyp auch eine veränderte Struktur des Biofilms in Durchflusskammern und daraus resultierend erhöhte Resistenz gegenüber antimikrobiellen Substanzen feststellen. Diese Umwandlung zum mukoiden Kolonietyp, die von einer erhöhten Resistenz der Bakterien begleitet wird, kann als ursächlicher Mechanismus der Biofilmbildung bei chronischen Lungeninfektionen von CF-Patienten gesehen werden (HOIBY et al., 2001).

Dagegen fiel DRENKARD u. AUSUBEL (2002) erst kürzlich eine klein und rau wachsende Variante von P. aeruginosa PA14 auf. Die Isolierung dieser rough small colony variant (RSCV) erfolgte in vitro ebenfalls unter erhöhtem antibiotischem Selektionsdruck. Neben erhöhter Antibiotikaresistenz fiel im Vergleich zum Wildtyp ein unterschiedliches Aggregationsverhalten auf; die beschriebenen RSCVs schlossen sich in Flüssigkultur zu sichtbaren Zellaggregaten zusammen und wiesen zudem erhöhte Adhäsivität an Glas und an PVC auf. Die Zelloberflächenhydrophobizität erwies sich im Vergleich zum Wildtyp deutlich gesteigert (DRENKARD u. AUSUBEL, 2002). Da bei Kultivierung auf antibiotikafreiem Medium aus den RSCVs Revertanten entstanden, die in ihren Eigenschaften dem ursprünglichen Wildtyp ähnelten, schlossen DRENKARD u. AUSUBEL (2002) auf einen vorübergehenden Wechsel

des Phänotyps. Es gelang hierbei auch die Identifizierung eines Regulatorproteins, das den Übergang zwischen beiden Phänotypen zu kontrollieren scheint.

Interessanterweise fiel bei Untersuchung von Sputumproben von fünf CF-Patienten auf, dass gerade aus den Sputen derjenigen Patienten gehäuft antibiotikaresistente SCVs zu isolieren waren, die sich gerade in antibiotischer Behandlung befanden; eine Tatsache, die die These zu unterstützen scheint, dass antibiotische Behandlung mit dem Auftreten resistenter SCVs einhergeht (DRENKHARD et al., 2002; HÄUSSLER et al., 1999).

Ebenfalls klein und langsam wachsende Phänotypen von P. aeruginosa 57PR, die im Zusammenhang mit Biofilmbildung und gesteigertem Adhärenzverhalten auffielen, wurden von DEZIEL et al. (2001) beschrieben. Diese In-vitro-Isolate unterschieden sich von der groß und schnell wachsenden L- Variante nicht nur durch eine erhöhte Biofilmbildungskapazität, sondern weisen zudem eine gesteigerte Zelloberflächenhydrophobizität, ein erhöhtes Adhäsionspotential, sowie reduzierte Motilität im Hinblick auf flagellen- und Typ-IV-Pili-abhängige Motilitätsformen auf. Bei elektronenmikroskopischer Untersuchung fallen diese S-Varianten durch eine deutliche Hyperpilierung auf; beim L-Typ sind nur wenige Fimbrien sichtbar. DEZIEL et al. (2001) konnten zudem eine erhöhte Produktion an Pyocyanin und Pyoverdin nachweisen. Abhängig von den Kulturbedingungen schien ein Wechsel des klein wachsenden Phänotyps zum L-Typ ohne weiteres möglich; aufgrund dieser Beobachtungen schreiben DEZIEL et al. (2001) die Entstehung dieses klein wachsenden Phänotyps im Rahmen der Biofilmbildung einer Phasenvariation zu.

2.5. Caenorhabditis elegans

2.5.1. Vorkommen und Bedeutung in der biologischen Grundlagenforschung

Caenorhabditis elegans ist ein etwa 1 mm großer, freilebender Nematode, der in den meisten gemäßigten Klimazonen der Erde zu finden ist. Er lebt im Erdreich und ernährt sich von den dort vorkommenden Mikroorganismen. Neben Bakterien als Nahrungsquelle benötigt er für Wachstum und Reproduktion lediglich eine feuchte Umgebung, gemäßigte Temperaturen und ausreichend Sauerstoff.

Unter Laborbedingungen wächst C. elegans auf mit Escherichia coli bewachsenen Agarplatten; der benötigte Platzaufwand ist somit aufgrund der geringen Größe des Wurmes minimal. Die Haltung und die Anschaffung über das Caenorhabditis elegans Genetics Center, CGC, University of Minnesota, St.

Paul, MN, USA gestalten sich kostengünstig. Im Bedarfsfall können Würmer bei –80 °C eingefroren und auch nach mehreren Monaten wieder aufgetaut werden, wodurch die Stammhaltung vereinfacht wird.

Im Hinblick auf die Verwendung als Modellorganismus für die Forschung bietet C. elegans neben seiner Anspruchslosigkeit in Bezug auf die Kulturbedingungen weitere Vorteile. Als erster multizellulärer Organismus wurde sein Genom bereits 1998 vollständig sequenziert. Das Vorliegen und die genetische Manipulierbarkeit dieser Sequenz machen die Herstellung und den Einsatz definierter Wurmmutanten für die Grundlagenforschung möglich. Mindestens 37 % der 19000 von C.

elegans exprimierten Proteine besitzen Äquivalente zum humanen Genom. Beim Screeening von

Virulenzfaktoren kann C. elegans z. B. als Vorstufe zum Mausmodell genutzt werden, eine Vorgehensweise, die sowohl aus tierschutzrechtlichen als auch aus Kostengründen von Vorteil ist. Die Entwicklung aller Zellen aus einer Eizelle ist inzwischen vollständig aufgeklärt. Neben einer kurzen Generationszeit – innerhalb weniger Tage entsteht eine umfangreiche Nematodenpopulation – ist vor allem die überschaubare Anatomie von Vorteil. Da C. elegans unter dem Mikroskop transparent erscheint, lassen sich Abläufe innerhalb des Wurmes leicht mitverfolgen. C. elegans bietet sich als multizellulärer Organismus mit komplexen Strukturen und Verhaltensweisen (z. B. Bewegung, sensorische Wahrnehmung) auch für die Studie von Entwicklung und Verhalten an.

2.5.2. Anatomie, Lebenszyklus und Entwicklung

Man unterscheidet zwei Geschlechter: Hermaphroditen (XX) und männliche Würmer (XO). Beide besitzen, mit Ausnahme des Reproduktionstraktes, die gleiche anatomische Grundstruktur.

Mikroskopisch betrachtet erscheint der männliche Wurm etwas kürzer und schlanker als die Hermaphroditen.

Die Körperhöhle von C. elegans besteht aus einer einzelligen dickschichtigen Hypodermis, von der die die Wurmoberfläche umgebende Kutikula produziert wird (KRAMER, 1997).Den größten Teil der inneren Organe, die von der Körperwand durch das flüssigkeitsgefüllte Pseudocoelom getrennt werden, nehmen Verdauungs- und Reproduktionstrakt ein. Die Mundöffnung von C. elegans befindet sich am Kopfende; der Anus der Hermaphroditen und die Kloake der männlichen Würmer liegen ventral nahe der Schwanzregion. Der Darmtrakt, bestehend aus Ösophagus und Darmkanal, erstreckt sich vom Kopf bis hin zum hinteren Wurmende. Durch Muskelkontraktionen werden die Bakterien aus der Maulhöhle in den Ösophagus befördert, im Mahlorgan zerkleinert, um schließlich durch den Klappenapparat in den Darm transportiert zu werden.

Die Gonaden des männlichen Nematoden sind einlappig und münden über Samenblase und Samenleiter in die Kloake nahe des Schwanzes. Er ist im Gegensatz zur einfach strukturierten Schwanzregion der Hermaphroditen mit zwei Spikula ausgestattet, die der Paarung dienen. Die Gonaden der Hermaphroditen sind dagegen zweilappig; sie enden mit einer einzigen Öffnung in den midventral bei der Vulva gelegenen Uterus (SCHEDL, 1997; GREENWALD, 1997). Die Befruchtung der Eizellen findet in der zwischen Eileiter und Uterus gelegenen Spermatheka statt. Fortpflanzung geschieht durch Selbstbefruchtung oder Paarung der männlichen Würmer mit den Hermaphroditen.

Durch Kreuzfertilisation entstehen männliche Würmer und Hermaphroditen zu gleichen Teilen, während Selbstbefruchtung fast ausschließlich Hermaphroditen hervorbringt (EMMONS u.

STERNBERG, 1997). Aus diesem Grund bestehen Populationen des C. elegans N2-Wildtypstammes zu 0,2 % aus männlichen Würmern (HODGKIN et al., 1979; MEYER 1997).

Bei der Entwicklung von C. elegans unterscheidet man eine prä- und eine postembryonale Phase. Die auch als Embryogenese bezeichnete präembryonale Entwicklung reicht von der Befruchtung bis zum Schlüpfen der ersten Larven und dauert bei einer Temperatur von 20 °C etwa 14 h. Die postembryonale Entwicklung erstreckt sich über vier Larvenstadien (L1–L4) bis hin zur letzten Häutung, aus der der adulte Wurm hervorgeht. Diese Entwicklung ist temperaturabhängig und variiert zwischen drei Tagen bei 25 °C und sechs Tagen bei 15 °C.

Ein geschlechtsreifer, adulter Wurm produziert über einen Zeitraum von vier Tagen bis zu 300 Nachkommen. Die maximale Lebenserwartung von C. elegans beträgt etwa 3 Wochen. Bei Nahrungsmangel oder bei zu hoher Populationsdichte ist die Entstehung eines resistenteren Dauerstadiums beschrieben (RIDDLE u. ALBERT, 1997).

2.5.3 C. elegans als Pathogenitätsmodell

Im Jahr 1999 stellte die Gruppe um FREDERICK M. AUSUBEL ein Nematoden-Bakterium- Pathogenitätsmodell vor, welches die Interaktionen zwischen dem Bakterium P. aeruginosa und C.

elegans analysiert (TAN et al., 1999a, 1999b; MAHAJAN-MIKLOS et al., 1999; TAN et al., 2000). Die Vorteile dieses Modells bestehen zum einen darin, dass sowohl die Genomsequenz von P.

aeruginosa als auch die des Wirtsorganismus vorliegen. Zudem besitzt P. aeruginosa eine große Bedeutung als humaner opportunistischer Krankheitserreger. Durch dieses Pathogenitätsmodell sind Interaktionen zwischen eukaryotischen Wirtsorganismen und pathogenen Bakterienstämmen erstmals einer breiten genetischen Analyse zugänglich; viele wirtsinduzierte Virulenzfaktoren konnten durch dieses System identifiziert werden. Da P. aeruginosa die Fähigkeit besitzt, viele unterschiedliche Wirte wie Pflanzen, Nematoden und Säugetiere infizieren zu können, besteht die Möglichkeit, Vergleiche zwischen den unterschiedlichen Infektionsmodellen anzustellen (TAN et al., 1999b, 2000). TAN et al.

(1999b) u. MAHAJAN-MIKLOS et al. (1999, 2000) konnten so zum Beispiel P. aeruginosa- Bakterienmutanten isolieren, die sowohl im C. elegans-, als auch im Mausmodell attenuiert waren.

Auch LABROUSSE et al. (2000), ABALLAY et al. (2000) und TAN et al. (1999b) gelang die Identifizierung von Bakterienmutanten, die sowohl im Mausmodell als auch im C.-elegans-Modell reduzierte Virulenz aufwiesen.

Das C.-elegans-Modell weist allerdings auch einige Einschränkungen auf. Die Arten der Bakterien, die C. elegans infizieren können, ist begrenzt. Neben P. aeruginosa sind dies z. B. Pseudomonas fluorescens, Serratia marcescens, B. cepacia (O´QUINN et al., 2001), Burkholderia pseudomallei (O´QUINN et al., 2001), Salmonella spp. (ABALLAY et al., 2000; LABROUSSE et al., 2000), Microbacterium nematophilum, Bacillus megaterium sowie der Pilz Drechmeria coniospora (TAN et al., 2000). Außerdem fehlt den Nematoden ein entwickeltes, adaptives Immunsystem; eine Untersuchung der Immunantwort des Wirtes auf Virulenzfaktoren des bakteriellen Erregers ist somit nicht möglich.

Einige Virulenzfaktoren werden auch erst durch äußere Umstände induziert, die aufgrund der Physiologie des Nematoden nicht induzierbar sind. So wird beispielsweise die Expression temperaturabhängiger Virulenzfaktoren bei 20 °C Raumtemperatur, die der Nematode benötigt, teilweise eingeschränkt.

Allerdings legt gerade die Vielfalt möglicher Wirtsorganismen von P. aeruginosa einen erheblichen Grad der Konservierung nahe, und somit besteht berechtigte Hoffnung darauf, C. elegans als Modellorganismus für eine genetische Analyse fundamentaler Pathogenitätsmechanismen zu nutzen.

2.5.4. Einfluss der Kulturbedingungen auf C.-elegans-Bakterien-Interaktionen

Entscheidenden Einfluss auf die Pathogenität eines Keimes für C. elegans scheinen die Kulturbedingungen zu haben, unter denen die Wechselwirkungen zwischen Wirt und Erreger analysiert werden.

Ausgehend von unterschiedlichen Kulturbedingungen definierten TAN et al. (1999a) zwei Arten des Wurmsterbens, das durch P. aeruginosa PA14 bei C. elegans ausgelöst werden konnte: ein sogenanntes Slow Killing und ein Fast Killing (TAN et al., 1999a). TAN et al. (1999a) und MAHAJAN- MIKLOS et al. (1999) konnten zudem PA14-Mutanten isolieren, die entweder im Slow oder Fast Killing reduzierte Virulenz aufwiesen; was wiederum nahelegt, dass bei beiden Tötungsarten unterschiedliche bakterielle Virulenzfaktoren induziert werden.

Von DARBY et al. (1999) wurde eine dritte Absterbekinetik (letale Paralyse) beschrieben, die sich mit Wechselwirkungen zwischen P. aeruginosa PAO1 und C. elegans befasst (DARBY et al., 1999).

Interessanterweise ist P. aeruginosa PA14 unter den von DARBY et al. (1999) beschriebenen Versuchsbedingungen für C. elegans apathogen (GALLAGHER U. MANOIL; 2001).

2.5.4.1. Slow Killing

Diese Tötungsart bezeichnet ein langsames Wurmsterben über mehrere Tage (TAN et al., 1999a). P.

aeruginosa PA14 wird auf modifiziertem NGM-Agar (0,35 % Pepton statt 0,3 %) kultiviert. Die Aufnahme lebender Bakterien durch C. elegans ist essentiell; adulte Nematoden sind für diese Tötungsart empfänglicher. Nach einer Expositionszeit von 24 bis 48 h lässt die Motilität der Würmer nach, die pharyngeale Pumpaktivität verlangsamt sich und wird schließlich ganz eingestellt. Die Nematoden werden schließlich ganz unbeweglich und sterben. TAN et al. (1999a) konnten auch einen sog. Eiablagedefekt beobachten, der durch das Schlüpfen der Embryonen im adulten Muttertier gekennzeichnet wird. Untersuchungen mit C. elegans-Mutanten konnten aber diesen Eiablagedefekt als alleinige Todesursache ausschließen. Untersuchungen mit gfp-markiertem P. aeruginosa PA14 und mit Wurmmutanten lassen das Slow Killing als einen aktiven infektionsähnlichen Prozess erscheinen, der durch Akkumulation der Bakterien im Verdauungstrakt von C. elegans gekennzeichnet ist (TAN et al., 1999a).

2.5.4.2. Fast Killing

TAN et al. (1999a) und MAHAJAN-MIKLOS et al. (1999) bezeichneten damit ein Wurmsterben innerhalb von 24 bis 30 h. Fast Killing von C. elegans durch P. aeruginosa PA14 findet auf einem hochosmolaren PGS-Agar statt; 4. Larven sind wesentlich empfindlicher als adulte Nematoden (TAN et al., 1999a). Die Geschwindigkeit, mit der das Fast Killing abläuft, lässt eher auf diffundierende Toxine als Todesursache schließen, als auf einen infektionsähnlichen Prozess. Durch Verwendung von Filtern zwischen Bakterien und C. elegans konnte gezeigt werden, dass für diese Tötungsart direkter Kontakt nicht zwingend erforderlich ist. Phenazine, insbesondere Pyocyanin, scheinen eine für

das Wurmsterben zumindest mitverantwortliche Toxinklasse zu repräsentieren (TAN et al., 1999a).

Pyocyanin führt bei C. elegans zu oxidativem Stress. Bestimmte in bezug auf oxidativen Stress empfindlichere Wurmmutanten sterben im Fast Killing-Assay schneller als Würmer des N2 Bristol- Wildtypstammes, so dass man sagen kann, dass die Resistenz bzw. Empfindlichkeit gegenüber oxidativem Stress mit der Resistenz bzw. Empfindlichkeit gegenüber dem Fast Killing korreliert. Da die Regulation der Expression bakterieller Virulenzfaktoren über verschiedene Umweltsignale erfolgt, ist es denkbar, dass die Expression der für das Fast Killing verantwortlichen Toxine durch hohe Osmolarität induziert wird. Es ist jedoch eher unwahrscheinlich, dass die höhere Sterberate unter Bedingungen erhöhter Osmolarität aus der gesteigerten Expression einer einzigen Toxinklasse, den Phenazinen, resultiert; auch O´QUINN et al. (2001) scheinen dies auszuschließen. Eine Beteiligung der beiden bekannten Toxine, hämolytische Pospholipase C und Exotoxin A, konnte jedoch mit Hilfe von Untersuchungen an PA14-Mutanten ausgeschlossen werden (TAN et al., 1999a).

2.5.4.3. Letale Paralyse

Unabhängig von den beiden oben genannten Absterbekinetiken wurde 1999 von der Gruppe um DARBY anhand des Stammes PAO1 ein dritter Mechanismus beschrieben, mit dessen Hilfe P.

aeruginosa C. elegans töten kann (DARBY et al., 1999). Als Medium zur Anzüchtung der Bakterien diente in diesem Fall Brain Heart Infusion-Agar (BHI). Der Mechanismus ist gekennzeichnet durch eine bei den Würmern innerhalb von 4 h eintretende letale Paralyse. Innerhalb weniger Minuten kommt es zu einer Reduktion der pharyngealen Pumpleistung, und zu einem Sistieren von Defäkation und Eiablage. Wurmbewegungen, sowohl spontane als auch induzierte, werden schwerfälliger und sind oftmals begleitet von spasmischen Zuckungen. Nach 4 h Bakterienexposition sind alle Würmer vollständig paralysiert. Die Geschwindigkeit dieses letalen Effektes legt nahe, dass der Tod vielmehr durch die Aktivität diffundierbarer Toxine als durch ein Infektionsgeschehen verursacht wird. Diese Annahme konnten DARBY et al. (1999) durch den Nitrozellulose-Assay (vgl. Kap. 3.5.2.1.) bestätigen.

Weitere Untersuchungen mit C.-elegans-Mutanten zeigten, dass die Produktion des oder der für die neuromuskuläre Paralyse verantwortlichen Toxine der Regulation durch zwei Quorum-Sensing- Systeme, LasR und RhlR, unterliegt. Durch die Analyse von PAO1-Mutanten konnten die Proteine Exotoxin A, Exoenzym S, Elastase, staphylolytische Protease, alkalische Protease, hämolytische Pospholipase C und nicht-hämolytische Pospholipase C als Verursacher der toxischen Aktivität ausgeschlossen werden. Die Mutagenisierung von C. elegans und die Auswahl im Assay resistenter Mutanten zeigten, dass das auch im Wirbeltier vorkommende Protein EGL-9, dessen Funktion bisher noch unbekannt ist, bei der Empfindlichkeit der Würmer für die letale Paralyse eine wichtige Rolle spielt.

Der von TAN et al. (1999a) und MAHAJAN-MIKLOS et al. (1999) im Slow und Fast Killing untersuchte und beschriebene P. aeruginosa-Stamm PA14 verursacht bei C. elegans keine letale Paralyse.

2.6 Zielsetzung der Arbeit

Im Rahmen der Dissertation sollten unterschiedliche P. aeruginosa-Morphotypen klinischer CF-Isolate und Stämme der Gattung Burkholderia aus dem Patientengut der Medizinischen Hochschule Hannover im C.-elegans-Modell untersucht werden. Ziel war ein Pathogenitätsvergleich zwischen den drei Morphotypen SCV, Revertante und Wildtyp. Im Screening auffällige Stämme sollten in Einzelassays genauer untersucht werden; durch modifizierte Versuchsbedingungen sollten die Pathogenitätsmechanismen genauer beleuchtet werden. Im Fall von Burkholderia spp. bestand das Ziel auch darin, eventuell vorhandene Pathogenitätsunterschiede zwischen den einzelnen Genomovaren durch das C.-elegans-Modell zu demonstrieren.

In einem In-vitro-Biofilmmodell sollten die P. aeruginosa-Morphotypen außerdem auf die Fähigkeit untersucht werden, Biofilm zu bilden; durch Modifizierung des Mediums sollte auf diese Biofilmbildung Einfluss genommen werden. In diesem Zusammenhang sollte zudem das Motilitätsverhalten von SCV, Revertante und Wildtyp auf unterschiedlichen Kulturplatten untersucht und mit der Biofilmbildung verglichen werden.

3. MATERIAL UND METHODEN

3.1. Arbeitsplatz

Alle Arbeiten wurden in den S1- und S2-Labors im Institut für Medizinische Mikrobiologie und Krankenhaushygiene der Medizinischen Hochschule Hannover durchgeführt.

3.2. Geräte

Blockthermostat BT 100, Fa. Kleinfeld Labortechnik Brutschrank, Fa. Heraeus

ELISA Reader Titertek Multiskan MCC/340, Fa. Flow Laboratories GmbH Fotomikroskop Axioskop MC80DX, Modell J2-21, Fa. Zeiss

Nematodenschrank (Chromatographieschrank) 2023, Mini Cold Lab, Fa. Pharmacia LKB Phasenkontrastmikroskop, Fa. Zeiss

Photometer Ultrospec III, Fa. Pharmacia LKB

Schüttelinkubator (Incubator Shaker Model G 25), New Brunswick Scientific Co. Inc. NJ, USA Schüttelinkubator (für die Nematoden) KS 130 basic, Fa. IKA

Tischzentrifuge, Fa. Bachofer Vortexer, Fa. Heidolph REAX 2000 Zentrifuge Varifuge S, Fa. Heraeus Zentrifuge Minifuge RF, Fa. Heraeus Zentrifuge Modell J2-21, Fa. Beckman

3.3. Bakterienstämme und Kulturbedingungen 3.3.1. Verwendete Bakterienstämme

3.3.1.1. Pseudomonas aeruginosa

Sämtliche P.-aeruginosa-Stämme mit Ausnahme der Stämme PA14 und PAO1 wurden im Zeitraum zwischen dem 1. Januar 1996 und dem 31. Januar 1998 an der Medizinischen Hochschule Hannover von ambulant behandelten Mukoviszidosepatienten isoliert. P.-aeruginosa-Wildtypen (WT) und SCVs wurden aus Sputumproben oder Rachenabstrichen von 22 CF-Patienten isoliert. Aus den SCVs ließ sich nach mehrmaliger In-vitro-Passage in BHI eine Revertante (Rev), ein größer und schneller wachsender Phänotyp, erzeugen (HÄUSSLER et al., 1999).

Bei zwei Patienten war die In-vitro-Erzeugung einer Revertante nicht erfolgreich (Tab. 1a; Patient H, Patient J). Sieben der 22 Patienten waren ausschließlich mit ein oder zwei SCVs besiedelt und wiesen keinen Wildtyp auf (Tab. 1a; Patient Q bis Patient W). Bei fünf Patienten wurde zusätzlich ein nicht- klonaler Wildtyp isoliert; diese sind in Tab. 1a mit * gekennzeichnet (Tab. 1a, Patient B, C, N, O und

P). Klonalität von SCV, Wildtyp und Revertante wurde durch Pulsfeldgelelektrophorese überprüft;

maßgelblich war ein identisches SpeI-Restriktionsprofil.

Tab. 1a. Liste der mit P. aeruginosa besiedelten Patienten.

Patient Stamm Morphotyp Klonalität

A P. aeruginosa 20265 SCV klonal

P. aeruginosa 20265 Rev klonal

P. aeruginosa 20265 WT klonal

B P. aeruginosa 8226 SCV klonal

P. aeruginosa 8226 Rev klonal

P. aeruginosa 38 WT klonal

P. aeruginosa 76 WT nicht klonal

C P. aeruginosa 52 SCV klonal

P. aeruginosa 52 Rev klonal

P. aeruginosa 53 WT klonal

P. aeruginosa 54 WT nicht klonal

D P. aeruginosa 17997 SCV klonal

P. aeruginosa 17997 Rev klonal

P. aeruginosa 55 WT klonal

E P. aeruginosa 10 SCV klonal

P. aeruginosa 10 Rev klonal

P. aeruginosa 32 SCV klonal

P. aeruginosa 32 Rev klonal

P. aeruginosa 49 WT klonal

F P. aeruginosa 29 SCV klonal

P. aeruginosa 29 Rev klonal

P. aeruginosa 45 SCV klonal

P. aeruginosa 45 Rev klonal

P. aeruginosa VI71 WT klonal

G P. aeruginosa 18 SCV klonal

P. aeruginosa 18 Rev klonal

P. aeruginosa 191 WT klonal

H P. aeruginosa 4211 SCV klonal

P. aeruginosa 44 WT klonal

J P. aeruginosa 6898 SCV klonal

P. aeruginosa VI59 WT klonal

K P. aeruginosa 35 SCV klonal

P. aeruginosa 35 Rev klonal

P. aeruginosa 13 WT klonal

L P. aeruginosa 26 SCV klonal

P. aeruginosa 26 Rev klonal

P. aeruginosa IV60 WT klonal

M P. aeruginosa 50 SCV klonal

P. aeruginosa 50 Rev klonal

P. aeruginosa VI37 WT klonal

N P. aeruginosa 3695 SCV klonal

P. aeruginosa 3695 Rev klonal

P. aeruginosa IV22 WT nicht klonal

O P. aeruginosa 114672 SCV klonal

P. aeruginosa 114672 Rev klonal

P. aeruginosa 48 WT nicht klonal

P P. aeruginosa 7 SCV klonal

P. aeruginosa 7 Rev klonal

P. aeruginosa 14700 SCV klonal

P. aeruginosa 14700 Rev klonal

P. aeruginosa 134 WT nicht klonal

Q P. aeruginosa 15400 SCV klonal

P. aeruginosa 15400 Rev klonal

R P. aeruginosa 111207 SCV klonal

P. aeruginosa 111207 Rev klonal

S P. aeruginosa 37 SCV klonal

P. aeruginosa 37 Rev klonal

P. aeruginosa 74861 SCV klonal

P. aeruginosa 74861 Rev klonal

T P. aeruginosa 1 SCV klonal

P. aeruginosa 1 Rev klonal

U P. aeruginosa 5 SCV klonal

P. aeruginosa 5 Rev klonal

V P. aeruginosa 1957 SCV klonal

P. aeruginosa 1957 Rev klonal

W P. aeruginosa 54 SCV klonal

P. aeruginosa 54 Rev klonal

Abb. 1 gibt die phänotypische Morphologie von SCV, Revertante und Wildtyp des repräsentativen P.- aeruginosa-Stammes 20265 wieder. Nach 24-stündigem Wachstum bei 37 °C in Luria-Bertani- Bouillon bildet die SCV einen Rand; klonaler Wildtyp und Revertante wachsen in homogener Dispersion (Abb. 1 A). Nach 48 Stunden Inkubation bei 37 °C formt der Wildtyp auf Columbia- Blutagarplatten Kolonien mit bis zu 3 mm Durchmesser, die SCV wächst charakteristisch klein (ca. 1 mm Durchmesser) und die Revertante bildet flache, breite Kolonien (ca. 10 mm Durchmesser) mit unregelmäßiger Oberfläche (Abb. 1 B).

Abb. 1. Wachstum der drei Morphotypen SCV, Rev und WT von P. aeruginosa 20265 in Flüssigkultur und auf Blutagarplatte. (A) Biofilmbildung der SCV in Flüssigmedium (Luria-Bertani-Bouillon) im Vergleich zu WT und Rev; (B) Koloniemorphologie von SCV und klonalem Wildtyp und Revertante auf Columbia-Blutagarplatten nach 48-stündiger Inkubation bei 37 °C.

3.3.1.2. Burkholderia spp.

Untersucht wurden insgesamt 19 Stämme des B.-cepacia-Komplexes (einschliesslich des Stammes B. gladioli 28496 SCV und B. gladioli 60732 WT). Hiervon stammten 15 ebenfalls aus dem Patientengut der Medizinischen Hochschule Hannover. Sie wurden im Zeitraum zwischen dem 1. April 1999 und dem 1. Januar 2001 von insgesamt 11 Patienten isoliert. Um eine repräsentative Anzahl von Stämmen jeden Genomovars zu erhalten, wurden zusätzlich vier Stämme aus der Sammlung der Arbeitsgruppe Steinmetz untersucht. Diese sind in der Tab. 1b mit )* gekennzeichnet.

Die Identifizierung erfolgte mittels Selektivmedien sowie anhand des API NE20 Systems (bioMérieux, Frankreich); die weitere Differenzierung erfolgte mittels SDS-PAGE und recA- Genanalyse (HÄUSSLER et al., 2003a) im Labor von Prof. Vandamme, Gent, Belgien. CF-Isolate, die nach einer Inkubationszeit von mehr als 48 h bei 37 °C auf Blutagarplatten Kolonien mit weniger als 1 mm Durchmesser aufwiesen, wurden als SCVs bezeichnet, falls sie den kleinwüchsigen Kolonietyp über mindestens zwei Subkulturen beibehielten (HÄUSSLER et al., 2003a). Die Klonalität der einzelnen Morphotypen wurde mittels Pulsfeldgelelektrophorese untersucht (HÄUSSLER et al., 2003a).

Tab. 1b. Liste der mit Burkholderia spp. besiedelten Patienten.

Patient Stamm Genomovar Morphotyp Klonalität

)* B. cepacia LMG 6889 I WT nicht klonal

)* B. cepacia 1222T I WT nicht klonal

1 B. multivorans 1 II SCV klonal

B. multivorans 208 II WT klonal

2 B. multivorans 293 II WT nicht klonal

3 B. multivorans 302 II WT nicht klonal

4 B. multivorans 356 II WT nicht klonal

5 B. multivorans 5441 II WT nicht klonal

6 B. cepacia 273 ? SCV nicht klonal

7 B. cepacia 314 III WT klonal

B. cepacia 46897 III SCV klonal

8 B. cepacia 376 III WT nicht klonal

)* B. cepacia 187550 III WT nicht klonal

)* B. stabilis 134 IV WT nicht klonal

9 B. stabilis 196 IV WT nicht klonal

10 B. vietnamensis 253 V SCV klonal

B. vietnamensis 5223 V SCV klonal

11 B. gladioli 28496 SCV klonal

B. gladioli 60732 WT klonal

)* = Stämme, die eigentlich nicht zum Patientengut gezählt werden können, die aber zusätzlich in die Untersuchungen aufgenommen wurden, um statistisch auswertbare Ergebnisse zu erzielen.

3.3.1.3. Eingesetzte Bakterienstämme im C.-elegans-Modell

Als Futterquelle für C. elegans wurde der Stamm E. coli OP50 eingesetzt, freundlicherweise überlassen vom Caenorhabditis Genetics Center (CGC), University of Minnesota, St. Paul, MN, USA.

Als Vergleichsstamm bei den Fluoreszenzaufnahmen diente der gfp-markierte Stamm E. coli P Sunny1, überlassen von Dr. Susanne Häussler. Der für die Konstruktion der gfp-markierten Morphotypen verwendete E. coli puTTcGFPMH76 sowie der Helferstamm E. coli Hb101pRK2013 wurden überlassen von Morten Hentzer, DTU Lyngby, Lyngby, Dänemark.

Außerdem wurden die Stämme P. aeruginosa PA14 (AG Dr. Eberl, TU München, Lehrstuhl für Mikrobiologie) und P. aeruginosa PAO1 (DSM 1707) in den entsprechenden Versuchen als Positivkontrollen eingesetzt.

3.3.2. Einfrieren der Bakterien

Alle Versuche wurden vom gleichen Bakterienstock durchgeführt. Zur Herstellung des Stocks wurden die Bakterien 24 bis 48 h auf Columbia-Blutagarplatten mit 5 % Schafblut (Beckton Dickinson) kultiviert, danach mit einem sterilen Wattetupfer geerntet, in 1 ml Einfriermedium (LB-Medium + 20 % Glyzerin) aufgenommen und bei –20 °C eingefroren. Von diesem Stock wurden die Bakterien zu Beginn der jeweiligen Versuchsreihe aufgetaut.

3.3.3. Auftauen der Bakterien

Für die Versuche wurde eine Öse von der eingefrorenen Bakteriensuspension entnommen, auf eine Columbia-Agarplatte überführt und diese im Brutschrank bei 37 °C inkubiert. Anschließend wurden die Bakterien alle zwei Tage auf eine neue Blutagarplatte transferiert. Bei den SCVs wurde sorgfältig auf die Vermeidung der Überführung eventuell auftretender Revertanten geachtet.

3.3.4. Anzucht der Bakterien für die Versuche

Für sämtliche Versuche – mit Ausnahme der Versuche beschrieben in Kapitel 3.5.2.1., 3.5.2.3. und 3.6.3.2. – wurden die Stämme mit einer sterilen Öse auf Columbia-Blutagarplatten überführt und 24 bis 48 h bei 37 °C inkubiert. Aufgrund der möglichen Reversion der SCVs zur Revertante in Flüssigmedium wurden die SCVs für die Versuche auf Agarplatten angezogen und dann in Flüssigmedium resuspendiert, da nur unter diesen Bedingungen das Erstellen einer Reinkultur möglich war. Um gleiche Bedingungen zu gewährleisten, wurden Wildtyp und Revertante genauso inkubiert.

3.3.5. Keimzahlbestimmung

Die Bakterienzelldichte wurde durch Messung der optischen Dichte von Flüssigkulturen bei 650 nm (OD650) im Photometer ermittelt. Die anschließende Keimzahlbestimmung pro ml Bakteriensuspension erfolgte anhand einer für die jeweilige Bakterienspezies angelegten Eichkurve. Als Leerwert wurde unbeimpftes Medium eingesetzt.

3.3.6. Konstruktion der gfp-markierten Stämme P. aeruginosa 17997 SCV und P. aeruginosa 55 WT

Der Stamm P. aeruginosa 55 WT und die zugehörige klonale SCV P. aeruginosa 17997 wurden auf Columbia-Blutagarplatten inokuliert und über Nacht bei 42 °C inkubiert. Der transposontragende Stamm E. coli puTTcGFPMH76 wurde in 5 ml Luria-Bertani (LB) mit Zusatz von 12,5 µg Tetrazyklin/ml inokuliert und über Nacht bei 37 °C im Schüttler inkubiert. Der Helferstamm E. coli Hb101pRK2013 wurde in 5 ml LB mit Zusatz von 25 µg Kanamycin/ml inokuliert und über Nacht ebenfalls bei 37 °C im Schüttler inkubiert.

Sowohl Wildtyp als auch SCV wurden in 10 mM MgSO₄ resuspendiert und auf eine OD₆₅₀ von 1,0 eingestellt. Hiervon wurde eine 1:10 Verdünnung in 10 mM MgSO4 hergestellt. Beide E. coli–

Übernachtkulturen wurden auf eine OD650 von 1,0 eingestellt.

Je 100 µl der beiden E. coli-Kulturen und der jeweilige Morphotyp wurden zusammengegeben und vermischt. Anschließend wurde jeder dieser Ansätze direkt auf Müller-Hinton-Platten ausgestrichen und bei 37 °C über Nacht inkubiert. Die Bakterienrasen jeder Mating-Platte sowie die Organismen jeweils einzeln als Negativkontrollen wurden in 3 ml 0,85 %igem NaCl resuspendiert. Von der Bakteriensuspension wurden jeweils 100 µl auf LB-Agarplatten mit antibiotischem Zusatz (100 µg Tetrazyklin/ml, 100 µg Carbenicillin/ml) inokuliert und mindestens 48 h bei 37 °C inkubiert.

Anschließend wurden die so erhaltenen Klone unter dem Fluoreszenzmikroskop auf Fluoreszenz untersucht; gegebenenfalls wurden ein bis zwei Subkultivierungsschritte durchgeführt.

3.4. Basistechniken mit C. elegans 3.4.1. Versuchstiere

In den Versuchen wurden Nematoden der Gattung C. elegans des Stammes Bristol N2 Wildtyp eingesetzt. Dieser Stamm wurde freundlicherweise vom Caenorhabditis Genetics Center (CGC, University of Minnesota, St. Paul, MN, USA) zur Verfügung gestellt. Dabei handelte es sich fast ausschließlich um selbstbefruchtende Hermaphroditen (Anteil männlicher Würmer 0,2 %). Man unterscheidet 4 Larvenstadien (L1 bis L4) sowie den adulten Wurm. Für die Versuche wurden, soweit nicht anders beschrieben, synchronisierte Würmer des Larvenstadiums 4 eingesetzt.

Verschiedene Entwicklungsstadien von C. elegans (Eier, Larvenstadien 1–4, sowie adulte Nematoden) sind in Abb. 2 dargestellt.

Abb. 2. Verschiedene Entwicklungsstadien von C. elegans. (A) adulter Nematode, L1- und L2-Larven, Eier;

(B) L1- und L2-Larven, Eier; (C) 4. Larven; (D) Eier.

3.4.2. Haltung der Versuchstiere

Die Kultivierung von C. elegans erfolgte wie von RIDDLE u. ALBERT (1997) beschrieben auf mit E.

coli OP50 bewachsenen NGM (Nematode Growth Medium)-Platten bei 20 °C. Die Würmer wurden hierbei mindestens alle fünf Tage übergesetzt und alle drei bis vier Monate durch neue Würmer ausgetauscht.

3.4.3 Herstellung der bakteriellen Nahrungsquelle

Als Nahrungsquelle von C. elegans diente sowohl auf den NGM-Agarplatten als auch in der Eipräparation der Stamm E. coli OP50.

3.4.3.1. Herstellung der E.-coli-OP50-NGM-Agarplatten

Zur Herstellung der für die Übersetzung von C. elegans benötigten Stockplatten wurde E. coli OP50 auf Columbia-Agar mit 5 % Schafblut über Nacht bei 37 °C angezüchtet. Anschließend wurde hiervon

eine Vorkultur hergestellt, indem mit einer sterilen Öse etwas E. coli OP50 in 5 ml LB überführt wurde.

Nach einer Inkubation von einigen Stunden im Schüttler bei 37 °C wurden jeweils 100 µl der Bakteriensuspension mit einem Drigalskispatel auf NGM-Platten ausplattiert. Die Inkubation der Platten erfolgte bei 37 °C über 24 Stunden, die anschließende Lagerung bei 20 °C im Nematodenschrank.

3.4.3.2. Herstellung der E.-coli-OP50-Pellets für die Eipräparation

Von einer E. coli OP50-Vorkultur wurden 4 x 100 µl in jeweils 500 ml frisches LB-Medium in großen Erlenmeyerkolben gegeben und diese für 24 h bei 37 °C im Schüttler inkubiert. Die Bakteriensuspensionen wurden dann bei 4 °C für 15 min mit 3000 x g in einer Beckman-Zentrifuge abzentrifugiert. Der Überstand wurde abgegossen und die abzentrifugierten E. coli-Pellets in einem Zentrifugenröhrchen bei 4 °C gelagert.

3.4.3.3. Übersetzen von C. elegans zur Erhaltung der Stockplatten

Zur Überführung von C. elegans von einer NGM-Platte (5 cm Durchmesser) auf eine neue Platte zur Stockerhaltung wurde von einer gut besiedelten Agarplatte mit Hilfe eines sterilen Skalpells ein kleines Agarstück herausgeschnitten und auf eine frisch mit E. coli OP50 bewachsene Agarplatte übersetzt, ohne dabei die Oberfläche der neuen Platte zu beschädigen.

Die Häufigkeit, mit der die Würmer übersetzt wurden, hing davon ab, bei welcher Temperatur sie gehalten wurden und wofür sie eingesetzt werden sollten. Die Würmer auf den Stockplatten konnten einige Wochen ohne weitere Nahrungszufuhr gehalten werden, bevor sie neu übersetzt wurden. Die Aufbewahrung erfolgte bei 20 °C im Nematodenschrank (Chromatographieschrank 2023, Mini Cold Lab, Fa. Pharmacia). Würmer, die für die Eipräparation angezüchtet wurden, wurden alle ein bis zwei Tage transferiert, um Platten mit vielen adulten Würmern und Eiern zu erhalten.

3.4.3.4. C.-elegans-Eipräparation

Um für die Versuche eine synchrone Wurmpopulation der gewünschten Entwicklungsstufe (4.

Larvenstadium) zu erhalten, wurde eine Eipräparation durchgeführt.

Hierbei wurden C.-elegans-Stockplatten mit möglichst vielen Eiern und zahlreichen graviden Hermaphroditen mit sterilem Aqua bidest. mehrfach gewaschen. Die Flüssigkeit wurde in einem 15 ml Zentrifugenröhrchen gesammelt. Das Volumen betrug hierbei mindestens 3,5 ml. 600 µl Aqua bidest., 500 µl Natriumhypochlorit (12 %ig) und 400 µl 6 N NaOH wurden miteinander vermischt und zu der Wurmsuspension gegeben. Anschließend wurde die Mischung einige Sekunden stark geschüttelt. Das Schütteln wurde in den folgenden 10 min alle zwei Minuten wiederholt, bis makroskopisch kein Nematode mehr sichtbar war. Es folgte eine Zentrifugation in der Minifuge RF bei 4 °C mit 1316,6 x g über 30 Sekunden. Die überstehende Flüssigkeit wurde aspiriert und verworfen. Das Volumen wurde bis auf 5 ml mit sterilem Aqua bidest. aufgefüllt und anschließend wieder stark geschüttelt. Nach wiederholtem Zentrifugieren und Verwerfen des Überstandes wurden die im Pellet enthaltenen Eier