des Zentrums für Kinder- und Jugendmedizin, Humangenetik und Dermatologie der Medizinischen Hochschule Hannover:
Pseudomonas aeruginosa als intrazelluläres Pathogen:
Funktionelle Analyse essentieller Gene
Dissertation
zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin in der Medizinischen Hochschule Hannover
vorgelegt von Sandra Fehrmann aus Meppen
Hannover 2005
Angenommen vom Senat der Medizinischen Hochschule Hannover am 21.11.2005 Gedruckt mit Genehmigung der Medizinischen Hochschule Hannover
Präsident: Prof. Dr. Dieter Bitter-Suermann Betreuer: Prof. Dr. Dr. Burkhard Tümmler Referent: Prof. Dr. Franz-Christoph Bange Korreferent: Prof. Dr. Jan Buer
Tag der mündlichen Prüfung: 21.11.2005
Promotionsausschussmitglieder: Prof. Dr. Alexander Kapp
Prof. Dr. Burkhard Wippermann
Priv.-Doz. Dr. Stefan Kubicka
Inhalt:
1 Einleitung ... 4
1.1 Pseudomonas aeruginosa...4
1.2 Cystische Fibrose ...7
1.3 P. aeruginosa in der CF-Lunge ...9
2 Zielsetzung der Arbeit... 14
3 Material... 16
3.1 Bakterien-Stämme und Cosmide...16
3.2 Kulturmedien ...18
3.3 Antibiotika ...20
3.4 Puffer und Lösungen ...21
3.5 Herkunftsnachweise ...24
3.5.1 Chemikalien ...24
3.5.2 Verbrauchsmaterialien...25
3.5.3 Geräte...26
4 Methoden ... 27
4.1 Allgemeine Methoden...27
4.1.1 Lagerung und Anzucht von Bakterien in Vorkultur ...27
4.1.2 Gewinnung von LB-Medium mit verringertem Eisen-Gehalt...27
4.1.3 Waschen von Bakterien...28
4.1.4 Bestimmung der Wachstumskurve für den TB-Wildtyp ...28
4.2 Methoden zur Untersuchung von Bakterien unter oxidativem Streß ...29
4.2.1 Anzucht von Bakterien auf Peroxid-Agar...29
4.2.2 Semiquantitative Bestimmung von oxidativem Stress ...29
4.2.3 Messung der Radikalfreisetzung im Zeitintervall ...29
4.2.4 Detektion von Sauerstoffradikalen über die Belichtung von Röntgenfilmen ...31
4.3 Methoden zur Untersuchung von bakteriellen Kulturüberständen...33
4.3.1 Präparation von Proteinen aus bakteriellen Kulturüberständen ...33
4.3.2 SDS-Gradientengel-Elektrophorese ...33
4.3.3 Färbung von SDS-Polyacrylamidgelen...34
4.3.4 Auswertung der Gel-Banden mittels MALDI-TOF...34
4.4 Methoden zur Untersuchung von Bakterien unter Stress durch PMN ...36
4.4.1 Präparation von humanen Granulozyten aus heparinisiertem Vollblut...36
4.4.2 Kultivierung von Bakterien unter Streß durch PMN ...36
4.5 Triparentale Konjugation ...38
4.6 Untersuchung der positiven Klone auf Wiederherstellung des Phänotyps ...40
5 Ergebnisse ... 41
5.1 Phänotyp-Untersuchungen an P. aeruginosa 41D3 ...41
5.1.1 Beschreibung der STM-Mutante P. aeruginosa 41D3 ( PA5349)...41
5.1.2 Semiquantitative Bestimmung von oxidativem Stress für P. aeruginosa 41D3 ..42
5.1.3 Detektion von Radikalen über die Chemolumineszenz von Luminol für P. aeruginosa 41D3 ...44
5.1.4 Radikaldetektion mittels Röntgenfilmexposition bei P. aeuginosa 41D3 ...47
5.2 Phänotyp-Untersuchungen an P. aeruginosa 29D2 ...50
5.2.1 Beschreibung der STM-Mutante P. aeruginosa 29D2 ...50
5.2.2 Wachstum auf Peroxid-Agar für P. aeruginosa 29D2...50
5.2.3 Radikaldetektion mittels Röntgenfilmexposition für P. aeruginosa 29D2 ...53
5.3 Phänotyp-Untersuchungen an P. aeruginosa 22D11 ...55
5.3.1 Beschreibung der STM-Mutation in P. aeruginosa 22D11 (PA 1441) ...55
5.3.2 Untersuchung der Kulturüberstände durch SDS-Gelelektrophorese für P. aeruginosa 22D11 ...57
5.3.3 Analyse ausgewählter Gelbanden mittels MALDI-TOF für P. aeruginosa 22D11 ...57
5.4 Wiederherstellung der Schwärmfähigkeit für P. aeruginosa 22D11 ...60
5.4.1 Gewinnung einer Revertanten von P. aeruginosa TB aus der Mutante 22D11 ..60
5.4.2 Analyse ausgewählter Gelbanden mittels MALDI-TOF ...64
6 Diskussion ... 65
6.1 Vorüberlegungen ...65
6.2 Bakterielle Peroxidresistenz ...67
6.3 Pyochelin ...73
6.4 Flagellen und Virulenz ...75
7 Zusammenfassung... 83
8 Anhang ... 85
8.1 Schriftenverzeichnis ...85
8.2 Auflistung aller verwendeten Abkürzungen ...100
9 Lebenslauf ... 102
10 Erklärung nach § 2 Abs. 2 Nr. 5 und 6 PromO ... 103
11 Danksagung... 104
1 Einleitung
1.1 Pseudomonas aeruginosa
Pseudomonas aeruginosa ist ein 1,5 bis 3 µm langes und 0,5 bis 0,8 µm dickes polar begeißeltes, bewegliches, gramnegatives Bakterium aus der Gruppe der Pseudomonaden. Es findet sich häufig in Wasser und Boden und ist gleichzeitig ein Pathogen für Pflanze, Mensch und Tier.
Als erster isolierte 1882 Carl Gessard das Bakterium aus Hautwunden, deren Eiter die für P. aeruginosa typische blau-grünliche Farbe aufwies. Er nannte den Keim Bacterium pyocyaneum [1].
Der Begriff Pseudomonas wurde im Jahr 1894 von Migula eingeführt. Er sollte ursprünglich alle geraden, stäbchenförmigen Bakterien mit polaren Bewegungs- fortsätzen zusammenfassen [2].
Der Erkenntnisgewinn über die physiologischen und biochemischen Eigenschaften des Bakteriums führte bis Mitte der siebziger Jahre des 20. Jahrhunderts zu einer exakteren Definition des Genus Pseudomonas. Aufgrund unterschiedlicher RNS- Homologien unterschied man damals noch 5 Gruppen metabolisch außerordentlich vielseitiger, gramnegativer Bakterien mit ubiquitärem Vorkommen in Wasser und Boden.
Mit der von Carl Woese begründeten Ära der molekularen Taxonomie, Bakterien nach ihrer Sequenzähnlichkeit in den ribosomalen Operons zu klassifizieren, fasst man heute unter dem Genus Pseudomonas nur noch die Typ I-Pseudomonaden der RNS-Gruppe I zusammen. Alle anderen Gruppen wurden anderen Genera der β- und γ-Proteobakterien wie Burkholderia, Pandorea, Ralstonia oder Stenotropho-
und gehört zur Untergruppe der fluoreszierenden Pseudomonaden. Im Jahr 2000 gelang es, das vollständige Genom des Referenzstammes P. aeruginosa PAO1 zu entschlüsseln [3, 4].
Neben der schon von Gessard im vorletzten Jahrhundert beobachteten Produktion von Pigmenten weist P. aeruginosa zwei weitere Hauptcharakteristika auf:
Zum einen besitzt das Bakterium gegen antimikrobielle Substanzen eine Vielzahl an wirkungsvollen Resistenzmechanismen, die sich sowohl plasmidgebunden als auch chromosomal finden.
Zum anderen ist P. aeruginosa in der Lage, ein weites Spektrum niedermolekularer Stoffe als Kohlenstoffquelle zu nutzen. Schon geringe Mengen organischer Substanz in Wasser genügen als minimales Milieu für das Wachstum des Keimes.
Außerdem kann er neben dem für sein Überleben obligaten Sauerstoff auch Nitrat als Elektronenakzeptor für die zelluläre Atmung nutzen und so, obschon er nicht zur Fermentation befähigt ist, selbst unter mikroaerophilen Bedingungen genauso wachsen wie unter aeroben.
Die Bildung von sessilen Biofilmen auf künstlichen und biologischen Oberflächen ist neben der sehr beweglichen, schwimmenden oder schwärmenden planktonischen Form ein zweiter möglicher Phänotyp von P. aeruginosa, mit Hilfe dessen er einen Lebensraum dauerhaft zu kolonisieren vermag [5].
Die Bakterien leben dabei in einer organisierten Matrix aus Alginat, welches P.
aeruginosa sezerniert. Durch diesen Wechsel zu einem mucoiden Phänotyp entzieht sich der Keim den Abwehrmechanismen seines Wirtes [6]. Die Biofilme von P.
aeruginosa können in Wasserleitungen, Luftbefeuchtern und auf medizinischem
Gerät nachgeweisen werden, und genau so in der Lunge von Patienten mit cystischer Fibrose (CF) [7].
Als opportunistischer Krankheitserreger des Menschen spielt P. aeruginosa stets in solchen Fällen eine bedeutende Rolle, in denen die Abwehrmechanismen des Wirtes in irgendeiner Form lokal oder systemisch geschwächt sind [8, 9, 10, 11].
Neutropenie oder Immunsuppression prädisponieren Patienten genau so für eine systemische Infektion mit P. aeruginosa wie längerfristig eingebrachte Fremdkörper, so z.B. Katheter oder Trachealtuben [12, 13]. Ebenso können flächenhafte Hautverletzungen oder Vebrennungen den Ausgangspunkt einer Infektion darstellen.
Bei der Abwehrlage eines Gesunden sind apparent verlaufende Infektionen mit P.
aeruginosa dagegen untypisch.
Schwere systemische Infektionen mit P. aeruginosa häufen sich besonders auf Intensivstationen, in onkologischen Abteilungen und in Verbrennungszentren. Die Inzidenz einer Sepsis ist im Vergleich zu anderen gramnegativen Erregern zwar eher gering, aber gleichzeitig ist die P. aeruginosa -Sepsis diejenige mit der höchsten Letalität.
Die hereditäre Stoffwechselerkrankung CF ist besonders eng mit der Kolonisation durch P. aeruginosa assoziiert. Schon innerhalb der ersten drei Lebensjahre erwerben mehr als 70% der CF-Patienten eine Infektion der Lunge mit diesem Keim [14]. Fast immer wird dann für Jahre der weitere Verlauf der Krankheit sehr stark durch die konsekutiv erforderliche antimikrobielle Therapie und das Infektionsgeschehen bestimmt.
1.2 Cystische Fibrose
Die cystische Fibrose (Mukoviszidose) ist mit einer Inzidenz von etwa 1: 3500 Neugeborenen die häufigste autosomal-rezessiv ererbte Stoffwechsel-Krankheit mit letalem Ausgang in Europa und Amerika. Aktuell liegt die mittlere Lebenserwartung bei etwa 30 Jahren, knapp ein Drittel der Patienten hat heute wenigstens das achtzehnte Lebensjahr erreicht [15, 16].
Charakteristisch für die CF ist eine generalisierte Dysfunktion der exokrinen Drüsen, die sich vor allen Dingen frühzeitig in der erhöhten Viskosität der Sekrete von Lunge und Verdauungstrakt manifestiert und in der Folge zur Fibrosierung dieser Organe führt. Gerade die Lunge ist schon früh im Leben der Patienten von absteigenden Infektionen mit opportunistischen Erregern betroffen [14].
Während im Kleinkindalter auch Staphylococcus aureus und Haemophilus influenzae noch eine untergeordnete Rolle spielen, ist P. aeruginosa ab dem Schulalter der allein dominierende Auslöser pulmonaler Infektionen bei CF-Patienten [6]. In einigen Fällen kommt es zur gleichzeitigen Infektion mit Burkholderia (früher: Pseudomonas) cepacia.
Als genetische Ursache von CF wurde 1989 eine Mutation im CFTR-Gen erkannt [17], welches für einen ATP-gesteuerten Chlorid-Kanal codiert. Dieser Kanal ist beim Gesunden an der apikalen Zellmembran exokriner Drüsenepithel-Zellen zu finden [18]. Bei CF ist das Protein dagegen entweder defekt, falsch lokalisiert, oder es fehlt vollständig. Bisher wurden über tausend Mutationen des CFTR-Genes beschrieben, die CF verursachen können. Gemeinsam ist allen Mutationen, daß es zu einer verstärkten Aufnahme von Natrium in die Epithelzellen kommt und die Viskosität des Mucus zunimmt [19, 20]. Eine signifikante Veränderung der Osmolalrität des Mucus konnte bisher nicht demonstriert werden [21, 22].
Bei der Mutation F508∆, welche die große Mehrheit aller Erkrankten betrifft, wird das defekte CFTR-Protein vermehrt im endoplasmatischen Retikulum abgebaut und zeigt sich an der apikalen Zellmembran gegenüber einer Aktivierung durch ATP stärker refraktär als der CFTR-Wildtyp.
Parallel dazu finden sich bereits in der noch sterilen Lunge junger CF-Patienten erhöhte und veränderte Werte von Entzündungsmediatoren [23, 24] und vermehrt neutrophile Granulozyten [23, 25], die zur Zerstörung des Lungengewebes beitragen und damit zur letztlich letalen respiratorischen Insuffizienz führen. Neuere Untersuchungen belegen einen sauren pH-Wert in Zellorganellen des Alveolarepithels und im Lungensekret von CF-Patienten [26].
Warum CFTR-Mutationen gerade im Respirationstrakt den Weg für Infektionen mit opportunistischen Bakterien bahnen, ist noch nicht vollständig aufgeklärt [27, 26].
Favorisiert wird der ätiopathogenetische Ansatz, dass die Viskosität des Sekretes die mukoziliäre Clearance der Lunge erschwert und dieses, in Assoziation mit viralen Infekten, die Ansiedelung und Persistenz opportunistischer Keime im Mucus begünstigt.
1.3 P. aeruginosa in der CF-Lunge
Was sind aber nun auf der anderen Seite die Eigenschaften, die gerade die Virulenz des Umweltkeimes P. aeruginosa bedingen und ihn als Opportunist in der CF-Lunge so erfolgreich machen?
P. aeruginosa ist ein metabolisch vielseitiges Bakterium, das sich bevorzugt in allen wässrigen Habitaten der Umwelt findet. Wie bereits oben skizziert, weist er zwei Phänotypen auf, mit Hilfe derer er sich in einem Habitat etablieren und dann persistieren kann: auf der einen Seite planktonisch und schwimmend, und auf der anderen Seite sessil im Biofilm.
Als planktonisches Bakterium ist er sehr beweglich und kann sich schnell im wässrigen Medium schwimmend ausbreiten. Zur Fortbewegung dient dabei ein einzelnes polares Flagellum, welches den Organismus durch seine Rotationsbewegung vorantreibt [28].
Auch auf visköserem Medium ist P. aeruginosa die Fortbewegung noch in Form von Schwärmbewegungen möglich, wie es auch von einigen anderen Arten der Proteobakterien bekannt ist, z. B. Proteus mirabilis. Hierzu ist bei P. aeruginosa neben dem Flagellarapparat auch das Vorhandensein der auf der Oberfläche verteilten Pili von Bedeutung. Mit seiner Fähigkeit zu schwärmen ist P. aeruginosa in der Lage, sich sowohl ungerichtet als auch gezielt als Reaktion auf chemotaktische Reize auszubreiten.
Als weiterer wichtiger Virulenzfaktor der Bakterien ist ihre Fähigkeit zu nennen, über diverse Sekretionsmechanismen Toxine und lytische Enzyme zu sezernieren, die Strukturen des Wirtes schädigen. Einige dieser Virulenzfaktoren sind auch in der Lage, Entzündungsmediatoren zu inhibieren und so die Abwehr des Körpers zu
unterminieren. In diesem Zusammenhang sei bereits der so genannte Typ III- Sekretionsmechanismus vorweg erwähnt, dessen Expression in direktem Zusammenhang mit einer schlechteren Prognose für den infizierten Patienten steht [29, 30].
Darüber hinaus sezerniert P. aeruginosa einige Homoserin-Lactone, deren extrazelluläre Konzentration die Exprimierung einzelner Virulenzfaktoren innerhalb der Population steuern. So kommt es in bestimmten Phasen der Etablierung der Infektion zu einer massiven Expression von Virulenzfaktoren, mit denen der Wirtsorganismus zuvor nicht konfrontiert wurde. Diese als „Quorum sensing“
bezeichnete Kommunikation unter den Bakterien koordiniert auch andere physiologische Vorgänge [31, 32].
Hat P. aeruginosa an eine Oberfläche adhäriert, entwickelt sich aus der wachsenden Kolonie ein Biofilm, dessen Hauptanteil mit 85% aus extrazellulärer Matrix besteht [5]. Durch die Matrix haftet die Kolonie an ihrer Oberfläche und ist einer Eradikation nur schlecht zugänglich. Als Grundsubstanz dient dabei neben dem von P.
aeruginosa sezernierten Alginat besonders der vom Wirt sezernierte Mucus in der CF-Lunge. Neuere Untersuchungen haben belegt, dass dieser Mucus fast vollständig frei von Sauerstoff ist und P. aeruginosa sich demzufolge unter anaeroben Bedingungen in der Lunge etabliert [33, 34, 35].
Biofilme sind komplex organisierte biologische Strukturen, in denen eine große Diversität an Phänotypen zu finden ist [36]. Im Inneren des Biofilmes ist der Stoffwechsel der Bakterien derart verlangsamt, dass die natürliche, ausgeprägte Resistenz von P. aeruginosa gegen antimikrobielle Substanzen noch weiter zunimmt:
Deren mittlere Hemmkonzentration (MHK) erhöht sich für Bakterien in Biofilmen noch um den Faktor 102 bis 105 gegenüber dem planktonischen Phänotyp.
Gleichzeitig schirmt der Biofilm die Prokaryonten von der Immunantwort des Wirtes ab. Die Bakterien sind so weder phagozytierenden Zellen noch opsonisierenden Antikörpern oder dem Komplementsystem zugänglich. Man kann den Lungenbefall mit P. aeruginosa bei CF als Prototyp für eine bakterielle Biofilm-Infektion bezeichnen. Gerade hier finden sich bei Untersuchung des Sputums gehäuft mucoide Stämme von P. aeruginosa.
Die spätere Bildung sessiler Kolonien im Wirt und auch die Invasion in sein Gewebe setzen für das planktonische Bakterium zunächst eine Kontaktaufnahme voraus. So ist die Adhärenz einer der entscheidenden Schritte für die Etablierung eines Keimes im Wirt. Umgekehrt ist aber auch für den Wirt zur Phagozytose der Pathogene eine Zell-zu-Zell-Bindung unerläßlich.
Es existieren dabei unterschiedliche Möglichkeiten der Adhärenz für P. aeruginosa an eine Wirtszelle. Untersuchungen zur Interaktion zwischen CFTR und P.
aeruginosa geben Hinweise darauf, dass es unter anderem auch durch die Bindung zwischen CFTR und den Lipopolysacchariden des Bakteriums zur spontanen Internalisierung in Epithelzellen kommt [37, 38]. Diese entspricht keiner Phagozytose und führt nicht zur Fusion des Bakterienvesikels mit lytischen Zellorganellen [39, 40].
Über den Mechanismus der Typ III-Sekretion ist P. aeruginosa dann in der Lage, so genannte Exotoxine durch die Zellmembran in die Wirtszelle zu injizieren, die in die Regulationskreisläufe der Zelle eingreifen und auf diesem Weg die Virulenz des Keimes steigern [41, 42, 43].
Eine entscheidende Rolle bei der Abwehr einer Infektion mit P. aeruginosa spielen die polymorphkernigen neutrophilen Granulozyten (PMN). Durch chemotaktische Reize angelockt, phagozytieren sie die durch die humorale Immunantwort opsonierten planktonischen Bakterien. Sie leisten damit den größten aktiven Beitrag
zur Abwehr einer Pseudomonas -Infektion. Neutropenie ist neben der CF einer der höchsten Risikofaktoren für schwer verlaufende Infektionen mit P. aeruginosa.
Gleichwohl kommt auch die Phagozytose durch PMN nicht immer einem Abtöten des Keimes gleich. Stattdessen hat sich gezeigt, dass es insbesondere dem Stamm P.
aeruginosa TB gelingt, konstitutiv intrazellulär zu überleben und sich in PMN sogar zu vermehren.
P. aeruginosa TB wurde 1983 aus dem Sputum eines CF-Patienten isoliert und fiel dort durch einen schweren Infektionsverlauf als hochvirulent auf. In vitro - Untersuchungen zeigten, dass Bakterien dieses Stammes PMN abtöten können, indem sie eine Schrumpfung und Kondensation der Abwehrzellen auslösen.
Um die verantwortlichen Virulenzgene von P. aeruginosa TB näher zu klassifizieren, erstellte Herr Lutz Wiehlmann im Rahmen seiner Promotion eine Bank spezifischer Minitransposons zur Mutagenese des Stammes. Diese wurden in Bakterien des Wildtyps P. aeruginosa TB eingebracht, um Einzelkopie-spezifische, stabile Mutanten des Wildtyps zu erzeugen. Durch die individuelle Signatur der Transposons wurde es möglich, mehrere unterschiedliche Klone parallel in einem einzelnen Versuchsansatz zu testen [44]. So konnte mit hoher Durchsatzrate ein großer Teil des bakteriellen Genoms auf Defekte mit Bedeutung für die intrazelluläre Überlebensfähigkeit in PMN untersucht werden.
Dieser Test führte über die Lokalisation des Transposons zur Identifikation einiger Dutzend Gene, deren Deletion das intrazelluläre Überleben von P. aeruginosa TB in PMN entweder im positiven oder negativen Sinne signifikant beeinflusst. Während ein Teil für bisher nicht näher identifizierte aber bereits beschriebene Gene codiert, konnten für andere Gene durch Vergleich mit dem vollständig sequenzierten Genom
von P. aeruginosa PAO1 oder anderer Bakteriengenera schon Proteine vorhergesagt werden.
Eine Gruppe von Genen ist involviert in den Metabolismus oxidativer Stressfaktoren wie zum Beispiel Wasserstoffperoxid. Dieses stellt über die Generierung von Hypochlorit eine wichtige Waffe der PMN zur Abtötung von Mikroorganismen dar.
Interessanterweise überlebt nur ein Teil der Mutanten dieser Gruppe schlechter in den PMN, wohingegen bei einigen, namentlich Mutanten mit defekten eisenbindenden Proteinen, eine noch weiter steigende Überlebensrate zu beobachten ist.
Die zweite Gruppe von Genen ist beteiligt am Aufbau des polaren Flagellums von P.
aeruginosa. Bei allen Mutanten dieser Gruppe ist die Rate der intrazellulär überlebenden Bakterien geringer als beim Wildtyp. Elektronenmikroskopisch konnten für die gefundenen Mutationen Defekte in der Morphologie des Flagellums belegt werden.
Neben seiner Bedeutung für Beweglichkeit und Adhärenz des Bakteriums zeigt der Aufbau des Flagellums und seines Transmembranapparates starke Homologien zum Typ III-Sekretionssystem, wie es auch für die Genera Salmonella und Yersinia belegt ist [45, 46, 47]. Defekte im Sekretionsmechanismus des Flagellums wären aufgrund ihrer strukturellen Ähnlichkeit mit dem Typ III-System eine weitere mögliche Ursache für die verringerte Virulenz dieser Mutanten, die es aber noch zu belegen gilt.
2 Zielsetzung der Arbeit
Die phänotypische und genetische Analyse der Transposon-Mutanten von P.
aeruginosa TB durch Herrn Lutz Wiehlmann hat zur Identifikation und teilweisen Annotation von Genen geführt, die für das intrazelluläre Überleben des Bakteriums in PMN essentiell sind. Die Identifikation von Genen, die die Virulenz eines Mikroorganismus bedingen, kann aber nur zu Vorhersagen über die eigentliche Ätiologie führen. Der nächste Schritt ist die Demonstration des tatsächlichen Phänotyps unter in vitro -Bedingungen, die sich dem Geschehen in vivo immer weiter annähern, bis sich daraus ein immer besseres Modell zum Verständnis für den Pathomechanismus der Infektion entwickelt.
Erstes Ziel dieser Dissertation war es nun, auf diesen Erkenntnissen aufbauend eine spezifizierte experimentelle Überprüfung von Phänotypen durchzuführen.
Ausgewählt hierfür wurden solche STM-Mutanten, für die bereits eine Annotation des deaktivierten Genes bekannt ist. Es sind dies im Einzelnen:
• PA 5349: codiert vermutlich für Rubredoxin-Reduktase
• PA 4228: codiert für ein essentielles Protein der Pyochelin–Biosynthese, PchD
• PA 1441: homolog zu fliK in S. typhimurium
Zu ihrer Untersuchung wurden im Rahmen dieser Dissertation neue geeignete in vitro- Detektionsverfahren etabliert und eingesetzt. Die beiden Mutanten mit Defekten in PA 5349, beziehungsweise PA 4228, wurden dabei besonders auf ihre Rolle bei der Bewältigung von oxidativem Stress hin untersucht.
Das Gen PA 1441 codiert für eine Untereinheit des Flagellen-Sekretionsapparates,
dieser Flagellen-Mutanten wurde das Augenmerk besonders auf Hinweise für eine mögliche Sekretion von Proteinen durch das Flagellum gerichtet.
Als zweites Ziel der Arbeit sollte der ursprüngliche Phänotyp von P. aeruginosa TB für einige der untersuchten Mutanten wiederhergestellt werden, indem zum ausgeschalteten Gen homologe DNS aus dem apathogenen Umweltisolat P.
aeruginosa SG17M mittels triparentaler Konjugation in die Mutanten eingebracht wurde. Die so gewonnene genetische Revertante wurde funktionell getestet und dabei in ihrem Verhalten mit der zugehörigen STM-Mutanten und dem Wildtyp verglichen.
3 Material
3.1 Bakterien-Stämme und Cosmide
P. aeruginosa TB Wildtyp: 1983 gewonnenes Isolat aus dem Sputum eines CF-Patienten
Serotyp: 4h, Pyocintyp: 1h
Phagenlysotypie: F8, M4, PS2, PS24, PS31;
352, 46b/2, 1214, Col 21, F7, F10, PS21, PS73 Ein Plasmid konnte nicht nachgewiesen werden.
P. aeruginosa 41D3: Transposonmutante von P. aeruginosa TB mit Defekt im Gen PA 5349, codiert vermutlich für Rubredoxin- Reduktase
P. aeruginosa 29D2: Transposonmutante von P. aeruginosa TB mit Defekt im Gen PA 4228, vermutlich homolog zu pchD
P. aeruginosa 22D11: Transposonmutante von P. aeruginosa TB mit Defekt im Gen PA 1441, homolog zu fliK in Salmonella typhimurium
P. aeruginosa fliK-R: durch triparentale Konjugation gewonnene Revertante von P. aeruginosa 22D11
P. aeruginosa PAO1: vollständig sequenzierter genetischer Referenzstamm von P. aeruginosa
P. aeruginosa SG17M: apathogenes Isolat aus der Umwelt
E. coli DH5α: Donorstamm für die triparentale Konjugation Genotyp: F-, endA1, hsdR17, (rk-, mk-), supE44, thi-1, λ-, recA1, gyrA96, relA1, ∆( arg F- lacZYA), U169, 80∆lacZM15
E. coli HB 101: Helferstamm für die triparentale Konjugation Genotyp: F-, leuB6, proA2, recA13, thi-1, ara-14, lacY1, galK2, xyl-5, mtl-1, rpsL20, supE44, hsdS20(rB-, mB-)
Cosmid: pLAFR3 mit P. aeruginosa SG17M-DNS aus der fliK-Region
3.2 Kulturmedien
Alle in diesem Kapitel verwendeten Angaben in % sind, wenn nicht anders angegeben, als Angaben in Gewicht-% (w/v) zu verwenden.
LB-Flüssigmedium : 0,5 % Hefeextrakt 1,5 % Pepton
1% NaCl
in H2O
LB-Agar (2%): 2% Agarose
in LB-Flüssigmedium
LB-Weichagar (0,2%): 0,2% Agarose
20% LB-Flüssigmedium (v/v)
in H2O
Trypton-Wasser: 1,5 % Pepton 1% NaCl
in H2O
ABC-Medium:
Stammlösung A (10fach): 2 % (NH4)2SO4
6 % Na2HPO4
6 % KH2PO4
3 % NaCl ad 1 l H2O
komplettes Medium B: 2 mM MgCl2
0,1 mM CaCl2
3 µM FeCl3
in Stammlösung A (einfach)
Kohlenstoffquelle C: 15 mM Na-Benzoat
Selektionsagar (2%): 2 % Agarose 10 % ABC-Medium
in H2O
Kohlenstoffquelle: 15 mM Na-Benzoat
3.3 Antibiotika
Tetracyclin- Stammlösung: 5 mg/ ml H2O, Lagerung bei –40 °C Selektionsagar (2 %): 200 µg/ ml Medium
Weichagar (0,2 %): 50 µg/ ml Medium
Kanamycin-Stammlösung: 100 µg/ ml H2O LB-Agar (2 %): 50 µg/ml Medium
3.4 Puffer und Lösungen
Alle in diesem Kapitel verwendeten Angaben in % sind, wenn nicht anders angegeben, als Angaben in Gewicht-% (w/v) zu verwenden.
Luminol-Stammlösung (30 mM): 30 mM Luminol in 1M NaOH
Diese Stammlösung konnte lichtgeschützt bei 4 °C für bis zu 4 Tage gelagert werden.
Peroxid-Stammlösung (200 mM): 200 mM H2O2
in H2O
Die Stammlösung wurde erst kurz vor Versuchsbeginn angesetzt und auf Eis gelagert.
Laemmli-Laufpuffer: 370 mM Glycin 50 mM Tris
0,1% SDS
Probenpuffer (4fach): 50 % Glycerin (v/v) 10 % SDS
10 % Mercaptoethanol (v/v) 2 mM EDTA
in 0,1 M TrisHCl, pH 8
Zusatz: Bromphenolblau
PBS-Puffer (pH 7): 0,8 % NaCl 0,02 % KCl
0,115 % Na2HPO4 x 7 H2O 0,02 % KH2PO4
in H2O
SDS-Acrylamidgel:
Sammelgel: 5 % Acrylamid
0,13 % Bisacrylamid 3 % Glycerin (v/v)
1% SDS
in 0,12 5 M Tris HCl, pH 6,8
Zusatz: Bromphenolblau
Gradiententrenngel 9-19 %: 9-19 % Acrylamid
0,09-0,38 % Bisacrylamid 10 % Glycerin (v/v)
1 % SDS
in 0,375 M TrisHCl, pH 8,8
Zusatz: Bromphenolblau
Die Polymerisation des Gels wurde mit TEMED und APS gestartet.
3.5 Herkunftsnachweise
3.5.1 Chemikalien
Aceton Riedel-de Haen
Agarose Gibco BRL
CaCl2 Merck
ChelexTM Sigma
Coomassie-Blau Merck Desoxycholsäure Merck Essigsäure J. T. Baker bv
FeCl3 Merck
Glycerin AppliChem H2O2 35 % Merck
Hefeextrakt Gibco BRL
HES 6 % Braun
Kanamycin Sigma
KCl Merck
KH2PO4 Merck
Liquemin Roche Luminol AppliChem Lymphoprep Axis-Shield Methanol J. T. Baker bv
MgCl2 Merck
MgSO4 Sigma
Na2HPO4 Merck
Na-Azid J.T. Baker bv
Na-Benzoat Fluka
NaCl Merck
(NH4)2SO4 Merck
Paraffin Merck
Pepton Gibco BRL
RPMI 1640 mit Glutamin Gibco BRL
Tetracyclin Sigma Trichloressigsäure Merck
3.5.2 Verbrauchsmaterialien
Columbia-Schafblutagar Beckton-Dickinson 19 CH-Butterfly Braun
20 ml-Einwegspritzen Braun
Fluoreszenz-Mikrotiterplatten Dynatech
humanes AB-Serum Blutbank der Medizinischen Hochschule, Hannover Kryoröhrchen Greiner
Küvetten Sarstedt Pasteurpipetten Brand
Petrischalen Sarstedt Reagiergefäße Sarstedt 50 ml-Röhrchen Greiner
Röntgenfilme Kodak Wattetupfer Beese
3.5.3 Geräte
Brutschrank Heraeus Filmentwickler Kodak
Fluorometer Schoeffel Instruments
Gradientengel-System BioRad
Photometer Hitachi Spectrophotometer U-300
Rotoren Sorvall GS3/SLA3000
Scanner Canon Schüttler Heidolph Reax 2000
Sterilwerkbank J.T. Baker bv
Thermo-Mixer Eppendorf Tischzentrifugen Hettich universal Zentrifuge Sorvall RC 5B plus
4 Methoden
4.1 Allgemeine Methoden
4.1.1 Lagerung und Anzucht von Bakterien in Vorkultur
Bakterienstämme wurden in LB-Kultur unter Zusatz von 15 % Glycerin bei -80 °C gelagert. Zur Anzucht wurde mit einer Impföse ein kleiner Teil dieser gefrorenen Kultur in 5ml Standard-LB oder Chelex™-LB überführt und über Nacht bei 200 rpm und 37 °C als Vorkultur herangezogen.
4.1.2 Gewinnung von LB-Medium mit verringertem Eisen-Gehalt
Zur Entfernung von Eisenionen aus dem LB-Standardmedium wurde eine unspezifische Methode mit ChelexTM-Kügelchen gewählt.
ChelexTM besteht aus Kunstharz, an dessen Oberfläche der Chelator EDTA gebunden ist. EDTA bildet hochaffin Komplexe mit zweiwertigen Ionen. Aufgrund ihrer Größe und Masse bilden die ChelexTM-Kügelchen einen Bodensatz im flüssigen Medium, so dass der Überstand nach der Inkubation einfach abgenommen und weiterverarbeitet werden kann.
Vor der Anwendung wurden jeweils 5 g ChelexTM über 24 Stunden in 30 ml Komponente A des ABC-Mediums als Pufferlösung äquilibriert und gleichzeitig durch Zusatz einer Spatelspitze Natriumazid sterilisiert. Direkt vor Verwendung des Chelators wurde dieser zehnmal mit Aqua bidest. gewaschen, um alle Rückstände von Natriumazid zu entfernen.
Das LB-Medium wurde dann mit 1 g ChelexTM pro 100 ml versetzt und über Nacht bei 200 rpm und 37 °C inkubiert. Das Medium wurde in ein neues steriles Gefäß
überführt und noch zwei weitere Male in der gleichen Art und Weise mit ChelexTM behandelt.
Mg2+ wurde abschließend mit einer 1 M MgCl2 –Lösung (p.a.) auf 10 mM substituiert.
Um das Medium steril zu halten, erfolgten alle Arbeitsschritte unter der Sterilbank.
4.1.3 Waschen von Bakterien
Die in der Übernacht-Kultur herangewachsenen Bakterien wurden zentrifugiert (5 Minuten, 2700 x g, 4 °C) und das Bakterien-Pellet vorsichtig in H2O resuspendiert.
Für die mikroaerophilen Ansätze wurde die Suspension direkt danach mit Paraffin überschichtet. Diese Suspensionen wurden auf Eis gelagert und umgehend weiterverarbeitet.
Die Bestimmung der Bakterien-Konzentration erfolgte über die Messung der optischen Dichte bei 578 nm (1 OD ≈ 109 cfu/ml).
4.1.4 Bestimmung der Wachstumskurve für den TB-Wildtyp
Im Abstand von 16 Stunden wurden zweimal 400 ml Trypton-Wasser mit 400 µl bakterieller Vorkultur beimpft und bei 200 rpm und 37 °C inkubiert. Während der Tageszeit wurde stündlich ein Aliquot entnommen und die optische Dichte in zehnfacher Verdünnung bei 578 nm bestimmt. Durch den Vergleich beider Teilmessungen miteinander wurde die Wachstumskurve erstellt.
4.2 Methoden zur Untersuchung von Bakterien unter oxidativem Streß
4.2.1 Anzucht von Bakterien auf Peroxid-Agar
Um die Resistenz der Bakterien gegen oxidativen Streß zu testen, wurden verschiedene Peroxid-Konzentrationsreihen mit einer Ausgangskonzentration von Wasserstoffperoxid zwischen 2 mM und 300 mM hergestellt.
LB-Agar (2 %) wurde im Wasserbad durch Erhitzen verflüssigt und auf etwa 60 °C abgekühlt, um den vorzeitigen Zerfall von Wasserstoffperoxid zu vermeiden.
In sterilen, fest verschließbaren 50 ml-Röhrchen wurden definierte Mengen einer 35 %igen H2O2-Lösung vorgelegt, mit flüssigem LB-Agar auf 25 ml aufgefüllt und durch Schwenken vermischt. Dieser Peroxid-Agar wurde jeweils in eine Petrischale gegossen und sofort nach dem Erkalten mit je einem Tropfen von 20 µl bakterieller Vorkultur der zu testenden Mutante und des TB-Wildtyps als Referenz inokuliert.
Die anschließende Inkubation erfolgte bei 37 °C im Brutschrank über Nacht.
4.2.2 Semiquantitative Bestimmung von oxidativem Stress
In einem Reagenzglas wurden 2 ml einer über Nacht angezüchteten Bakterien- suspension mit 1 ml einer 300 mM Peroxid-Lösung versetzt und vorsichtig durchmischt. Die Bildung von Schaum oder Gasblasen wurde direkt beobachtet.
4.2.3 Messung der Radikalfreisetzung im Zeitintervall
Alle Messungen dieser Versuchsreihe wurden mit freundlicher Unterstützung der Abteilung für biophysikalische und biochemische Verfahren an der Medizinischen Hochschule Hannover durchgeführt.
Prinzip:
Zur Detektion der außerhalb der Bakterien entstehenden Sauerstoff-Radikale diente ihre Reaktion mit dem Chemolumineszenzstoff Luminol, bei welcher neben N2 und H2O auch Energie in Form von Licht der Wellenlänge 425 nm freigesetzt wird (Abb.
4.1).
Abbildung 4.1: Luminol-Reaktion
Die Lichtintensität diente als Meßparameter für die Menge der entstehenden freien Sauerstoffradikale, wenn die Bakterien oxidativem Streß in Form von Wasserstoffperoxid ausgesetzt wurden. Dabei konnten die Radikale mit dieser Methode nur detektiert werden, soweit sie nicht durch andere Reaktionen umgesetzt wurden.
Durchführung:
Die Bakteriensuspension direkt aus dem Kulturmedium wurde entsprechend ihrer bei 578 nm gemessenen optischen Dichte mit LB-Flüssigmedium auf eine Konzentration von 1,25 x 108 Bakterien pro ml verdünnt und umgehend zur Messung verwendet. In
gleicher Weise wurden die gewaschenen Bakterien mit H2O verdünnt. In diesem Fall erfolgte die Messung jeweils exakt zehn Minuten nach Resuspension der Bakterien in H2O im voran gegangenen Waschschritt (vergleiche Abschnitt 4.1.3). 800 µl der Bakterien-Suspension wurden in einer Küvette vorgelegt.
Der Reaktionsstart erfolgte durch zeitgleiche Zugabe von je 100 µl einer 30 mM Luminol-Stammlösung und 100 µl einer 300 mM Wasserstoffperoxid-Stammlösung.
Gemessen wurde die Lichtemission mit Hilfe eines Fluorometers bei 425 nm über wenigstens 300 Sekunden bei Raumtemperatur. Ausgewertet wurden die Daten mit Hilfe des Programmes Excel.
4.2.4 Detektion von Sauerstoffradikalen über die Belichtung von Röntgenfilmen Für diesen Ansatz wurde das bei der Reaktion von Luminol mit Sauerstoffradikalen emittierte Licht zur Belichtung von Röntgenfilmen ausgenutzt.
Direkt vor Beginn des Versuches wurden in einer 96 well- Fluoreszenz- Mikrotiterplatte 50 µl einer 30 mM Luminol-Stammlösung und 20 µl einer 200 mM Wasserstoffperoxid-Stammlösung vorgelegt, so daß sich für ein Endvolumen von 200 µl pro Well die Konzentration von 7,5 mM/l für Luminol und 10 mM/l für H2O2
ergab. Für die mikroaerophilen Ansätze wurden die Reagenzien abschließend mit Paraffin überschichtet.
Bei 578 nm wurde die optische Dichte der Bakteriensuspensionen bestimmt und daraufhin eine Verdünnungsreihe erstellt (107, 5x106, 106, 5x105, und 105 cfu/ml). Der Versuch wurde mit Zugabe von 130 µl Bakteriensuspension zu den Reagenzien gestartet. Dabei wurde für den mikroaerophilen Ansatz die Suspension unter die Paraffinschicht pipettiert. Nach einer Minute wurde je ein Röntgenfilm für 30, 45, 60
und 90 Sekunden exponiert. Als Meßparameter für die Radikalbildung diente der Schwärzungsgrad des Röntgenfilms.
4.3 Methoden zur Untersuchung von bakteriellen Kulturüberständen
4.3.1 Präparation von Proteinen aus bakteriellen Kulturüberständen
Zur Anzucht der Bakterien wurden 400 ml Trypton-Wasser mit 400 µl Vorkultur beimpft und für ca. 24 Stunden bei 200 rpm und 37 °C inkubiert, bis sie sich gemäß der Wachstumskurve am Übergang von der spätlogarithmischen in die stationäre Wachstumsphase befanden. Dann wurden die Bakterien durch Zentrifugation (15 Minuten, 6000 x g, 4 °C) vom Überstand getrennt. Der so gewonnene Kulturüberstand wurde in ein neues Gefäß überführt und unter Zusatz von 0,2 mg/ml Desoxycholsäure für 30 Minuten auf Eis inkubiert.
Die Fällung der Proteine erfolgte durch Zugabe von Trichloressigsäure auf eine Endkonzentration von 6 % über 2 Stunden bei 4 °C. Nach Zentrifugation über 30 Minuten bei 18 000 x g und 4 °C wurde das Präzipitat-Pellet in wenig eiskaltem Wasser resuspendiert, mit dem 8fachen Volumen an Aceton (-20 °C) aufgefüllt und für 2 Stunden bei –20 °C inkubiert.
Nach einer erneuten Zentrifugation (20 Minuten, 3500 x g, 4 °C) wurde der Überstand entfernt und das Pellet unter dem Abzug für etwa 10 Minuten getrocknet und anschließend in Auftragspuffer aufgenommen und für 5 Minuten bei 95 °C erhitzt. Die so gewonnenen Proben wurden bei –40 °C gelagert.
4.3.2 SDS-Gradientengel-Elektrophorese
Die Bereitstellung der Mittel für die maschinell erstellten Gradientengele und standardisierten Lösungen erfolgte freundlicherweise durch Frau Brandes aus der Abteilung Zellbiologie des Zentrums Anatomie der Medizinischen Hochschule Hannover.
Die präparierten Proteinproben wurden mit Auftragspuffer auf die gewünschte Konzentration verdünnt und für 5 Minuten bei 95 °C erhitzt, bevor sie auf das Gradientengel aufgetragen wurden.
Das Gel bestand aus einem 5 %igen Acrylamid-Sammelgel und einem stufenlosen Trenngel aus 9 bis 19 % Acrylamid über eine Laufstrecke von 10 beziehungsweise 20 cm. Dem Gel lag zunächst für 15 Minuten eine Spannung von 70 V an und anschließend von 160 V für 125 Minuten. Darauf folgte die Färbung über Nacht.
4.3.3 Färbung von SDS-Polyacrylamidgelen
Die Färbung von SDS-Gelen zur Darstellung der Proteinbanden erfolgte durch die Inkubation mit Coomassie Brillant Blue R 250 -Farblösung in 50 % Ethanol und 10 % Essigsäure über Nacht bei Raumtemperatur. Nicht gebundene Farblösung wurde durch anschließendes Waschen des Gels in einer Mischung aus 10 % Methanol und 10 % Essigsäure entfernt.
4.3.4 Auswertung der Gel-Banden mittels MALDI-TOF
Diese Analysen erfolgten mit freundlicher Unterstützung durch Frau Atrée am CEA in Grenoble.
Prinzip:
Die Abkürzung MALDI-TOF bezeichnet ein Analyseverfahren der Massenspektrometrie, mit dem das Molekulargewicht großer Moleküle mit hoher Genauigkeit bestimmt werden kann.
Dabei werden im Vakuum ionisierte Moleküle aus der Probe verdampft. Diese Ionen werden durch ein Magnetfeld abgelenkt, abhängig von ihrer Masse und Ladung. Bei bekannter Ladung läßt die Fluggeschwindigkeit (Die Abkürzung TOF steht für „time of flight“) einen genauen Rückschluß auf das Molekulargewicht zu. Das exakte Gewicht ermöglicht die Identifikation des Moleküls.
Um große Moleküle, wie in diesem Fall Proteine, als Ionen in die Gasphase übertreten zu lassen, bedient man sich einer UV-Licht absorbierenden, sauren Matrix. Diese bildet Kokristalle mit den Proteinmolekülen und dient ihnen als Protonendonator. Wird die Protein-beladene Matrix mit einem UV-Laser-Puls betrahlt, werden positiv geladenen Proteinionen freigesetzt, die im Magnetfeld beschleunigt und gemessen werden können. (Die Abkürzung MALDI steht für
„matrix-assisted laser-desorption ionization“). Das Matrix-Verfahren verhindert einen Zerfall der großen Moleküle.
Bei Proteinen gelingt die Entschlüsselung ihrer Aminosäuresequenz durch die MALDI-TOF-Analyse in einzeln enzymatisch abgespaltenen Peptidfragmenten und den Vergleich der dabei gewonnenen Peptidsequenzen mit einer bestehenden Protein-Datenbank.
4.4 Methoden zur Untersuchung von Bakterien unter Stress durch PMN
4.4.1 Präparation von humanen Granulozyten aus heparinisiertem Vollblut
In vier 20 ml-Einwegspritzen wurden je 200 µl Liquemin® vorgelegt (Das entspricht 1000 I.E. Heparin) und damit einem gesunden männlichen Spender 80 ml Blut entnommen.
Es wurden umgehend je 10 ml Blut in sterile Reagenzgläser mit je 5 ml Hydroxyethylstärke-Infusionslösung 6 % überführt. Nach 40 Minuten war die Erythrozytenfraktion ausreichend sedimentiert, und der Plasmaüberstand mit den Leukozyten konnte in ein neues steriles Gefäß übernommen werden.
Zur Auftrennung der Leukozytenfraktionen nach der Dichte wurde unter das Plasma 0,25 ml Lymphoprep-Lösung pro ml Plasma pipettiert und für 15 Minuten bei 3500 x g und 4 °C zentrifugiert. Danach befanden sich die Lymphozyten an der Interphase, während die Granulozyten mit wenigen zuvor nicht sedimentierten Erythrozyten ein Pellet am Boden des Gefäßes bildeten. Der Überstand wurde sorgfältig entfernt.
Die aus jeweils 10 ml Blut gewonnenen Granulozyten wurden in je 1 ml RPMI 1640- Zellkulturmedium vorsichtig resuspendiert und kurzzeitig auf Eis gelagert. 1 ml dieser Suspension entspricht etwa einer Menge von 107 PMN.
4.4.2 Kultivierung von Bakterien unter Streß durch PMN
1,5 ml Granulozytensuspension (entspricht etwa 1,5 x 107 PMN) wurden in sterilen verschließbaren Reagiergefäßen mit 1,5 x 108 Bakterien aus der Vorkultur versetzt.
Zur Opsonierung der Bakterien enthielt der mit RPMI 1640-Medium auf 3 ml Endvolumen ergänzte Versuchsansatz 300 µl humanes Serum der Blutgruppe AB.
Zeitpunkten (nach 1, 25, 50, 75, 100 und 125 Minuten) wurde je ein Aliquot von 400 µl entnommen und weiterverarbeitet.
4.4.3 Methode zur Quantifizierung der Bakterienfraktionen
Die Trennung von extrazellulären Bakterien und Granulozyten aus dem Versuchsansatz erfolgte durch Zentrifugation über 3 Minuten bei 1000 x g und Raumtemperatur. Der Überstand wurde als extrazelluläre Bakterienfraktion abgenommen. Das Pellet mit den intrazellulären und extrazellulär-adhärenten Bakterien wurde zur Lyse der PMN mit 400 µl H2O versetzt, kräftig geschüttelt und dann auf Eis gelagert.
Aus beiden Fraktionen wurde ein Aliquot von 100 µl entnommen und ausgehend davon 3 Verdünnungsstufen hergestellt (10-2, 10-4 und 10-6). Je 100 µl dieser Verdünnungsstufen wurden sodann auf LB-Agarplatten ausgestrichen und über Nacht bei 37 °C im Brutschrank inkubiert.
Nach 18 Stunden erfolgte die Auswertung durch Auszählung der Einzelkolonien.
4.5 Triparentale Konjugation
Prinzip:
Um das jeweilige inaktivierte Gen in den STM-Mutanten von P. aeruginosa TB auch wieder in der aktiven Form zur Expression zu bringen, wurde die Methode der triparentalen Konjugation angewandt. Praktisch bedeutet dies, dass die STM- Mutanten, im Folgenden als Akzeptor bezeichnet, zusätzliche DNS aus der jeweiligen homologen Genregion von P. aeruginosa PAO1 aufnehmen. Sie wird dabei nicht in das vorhandene Genom integriert.
Als Vektor dient in diesem Fall ein Cosmid, das mittels Konjugation von einem E.
coli-Helferstamm auf P. aeruginosa übertragen wird. Den Donor stellt ein zweiter E.
coli-Stamm dar, in den das Cosmid zuvor durch Transformation eingebracht wurde.
Da nur der Helferstamm zur Konjugation befähigt ist und die Wahrscheinlichkeit der Konjugation für das einzelne Bakterium als Akzeptor eher gering ist, kann man auf diese Weise sicherstellen, dass positive Konjugationsereignisse nur einzeln auftreten und ein positiver Klon nur ein Cosmid und damit nur eine Kopie des gesuchten Genes trägt.
Durchführung:
Der transformierte Donorstamm wurde freundlicherweise als LB-Agar-Kultur von Frau von Pall de Tolna zur Verfügung gestellt.
Der E. coli-Helferstamm HB 101 wurde als Vorkultur, ebenfalls auf LB-Agar, unter Zusatz von 50 µg/ml Kanamycin ausplattiert.
Der Akzeptorstamm von P. aeruginosa wurde zuvor über 7 Tage auf Columbia- Schafblutagar bei 42 °C inkubiert, um das Restriktionssystem von P. aeruginosa zu inaktivieren [48]. Dabei wurde die Kultur täglich neu überimpft.
Der Bakterienrasen aller drei Stämme wurde mittels eines mit 10 mM MgSO4-Lösung befeuchteten sterilen Wattetupfers von der Platte abgenommen und in je 5 ml 10 mM MgSO4 resuspendiert. Hiervon wurde jeweils eine verdünnte Suspension mit einer optischen Dichte von 1,0 bei 578 nm hergestellt (≈109 Bakterien/ ml). Akzeptor, Helfer und Donor wurden alsdann im Verhältnis 1:10:10 gemischt, und 200 µl dieser Suspension wurden auf LB-Agar ausgestrichen. Die Platte wurde solange bei 37 °C im Brutschrank inkubiert, bis eine Grünfärbung das Erreichen der stationären Wachstumsphase für P. aeruginosa anzeigte.
Das Kulturmaterial wurde wieder mit einem befeuchteten Tupfer in 10 mM MgSO4
resuspendiert und 200 µl davon auf Selektionsagar ausplattiert. Hierbei erfolgte die Selektion auf Vermehrung cosmidtragender Zellen durch 200 µg/ml Tetracyclin und die Selektion auf P. aeruginosa durch 15 mM Na-Benzoat als alleinige Kohlenstoffquelle im Medium. Mögliche noch vitale Klone von E. coli in den gefundenen Kolonien wurden über mehrere Passagen auf Selektionsagar eliminiert.
4.6 Untersuchung der positiven Klone auf Wiederherstellung des Phänotyps
Als Kriterium für einen wiederhergestellten Phänotyp von P. aeruginosa TB wurde die Fähigkeit der Klone getestet, sich in 0,2 %igem Agar durch Schwimmen fortzubewegen. Dazu wurden einzelne Kolonien vom Selektionsagar mit einem sterilen Holzstäbchen aufgenommen und durch Einstechen in die Mitte des Weichagars angeimpft. Um den Selektionsdruck für die cosmidtragenden Bakterien zu erhalten, wurde der Agar zuvor mit 50 µg/ml Tetracyclin versetzt.
Die Bakterien wurden für 14 Stunden bei 37 °C im Brutschrank inkubiert und danach die Ausbreitung innerhalb des Agars im Vergleich zu Wildtyp und seiner ursprünglichen Mutante bewertet.
5 Ergebnisse
5.1 Phänotyp-Untersuchungen an P. aeruginosa 41D3
5.1.1 Beschreibung der STM-Mutante P. aeruginosa 41D3 ( PA5349)
Das Gen PA5349 befindet sich in Assoziation mit zwei Rubredoxin-ORFs (Abb. 5.1) und zeigt zu 59 % eine Homologie zum Rubredoxin-Reduktase-Gen von Acinetobacter calcoaceticus [49]. Es ist noch als Gen der Klasse 3 mit hypothetischer Funktion annotiert.
Das Enzym Rubredoxin-Reduktase gehört zur Klasse der Eisen-Schwefel-Proteine.
Diese werden auch als Nicht-Häm-Eisenproteine bezeichnet und komplexieren Eisen assoziiert mit anorganischen Sulfiden und Cystein-gebundenem Schwefel in so genannten Eisen-Schwefel-Clustern. Enzyme dieser Klasse spielen eine Rolle als Elektronenüberträger in zahlreichen energiebindenden Stoffwechselwegen, z. B. der Atmungskette (NADH-Q-Reduktase) oder dem Citratzyklus (Aconitase, Succinat- Dehydrogenase) [50].
In Desulfovibrio vulgaris bildet Rubredoxin-Reduktase, auch als Superoxid- Reduktase oder Desulfoferrodoxin bezeichnet, ein Redox-System gemeinsam mit Rubredoxin und Rubrerythrin. Bei diesem anaerob wachsenden δ-Proteobakterium haben die drei Proteine eine protektive Wirkung gegen oxidativen Stress durch Wasserstoffperoxid und Superoxid [51].
Für Pseudomonas oleovorans ist daneben bereits ein System aus Alkan- Hydroxylase, Rubredoxin und Rubredoxin-Reduktase zur Oxidation von Alkanen beschrieben [52].
Die hier untersuchte STM-Mutante P. aeruginosa 41D3 hatte im Versuch mit Granulozyten eine gegenüber dem Wildtyp deutlich verringerte intrazelluläre Überlebensrate gezeigt. Es sollte nun experimentell belegt werden, dass diese geringere Überlebensrate bei den Mutanten mit einer höheren Entstehungsrate von Hydroxylradikalen bei Kontakt mit H2O2 einhergeht und somit der durch H2O2
vermittelte oxidative Stress für das Bakterium bei defekter Rubredoxin-Reduktase zunimmt. Das Peroxid stellt einen der wichtigsten Abwehrstoffe der PMN gegen Bakterien dar.
5.1.2 Semiquantitative Bestimmung von oxidativem Stress für P. aeruginosa 41D3 Versetzt man 2 ml einer über Nacht angezüchteten Bakteriensuspension von P.
aeruginosa 41D3 mit einer Peroxidlösung und setzt sie damit oxidativem Stress aus, so kommt es zu einer deutlich sichtbaren Entwicklung von Gasbläschen im Reagenzglas. Führt man das gleiche Experiment hingegen mit dem Wildtyp P.
aeruginosa TB durch, tritt keine sichtbare Gasentwicklung auf.
Abbildung 5.1: Ausschnitt aus der Genkarte von P. aeruginosa PAO1, PA5349-Region (vermutlich Rubredoxin-Reduktase)
5.1.3 Detektion von Radikalen über die Chemolumineszenz von Luminol für P.
aeruginosa 41D3
Um ein meßtechnisch erfaßbares Korrelat für die Entstehung von Hydroxylradikalen in einer Bakteriensuspension zu erhalten, wurde in allen nachfolgend aufgeführten Experimenten die Emission von blauem Licht der Wellenlänge 425 nm genutzt.
Dieses entsteht, wenn die Radikale das Reagens Luminol umsetzen (vergleiche Abb.
4.1 in Abschnitt 4.2.3). Als Leerprobe diente mit Wasserstoffperoxid und Luminol versetztes Wasser.
Es zeigte sich bei allen durchgeführten Versuchen, dass die maximale Lichtemission direkt nach Zusatz von Wasserstoffperoxid stattfand und danach eine kontinuierliche Abnahme zu verzeichnen war. Die Unterschiede zwischen den einzelnen Messungen waren daher stets zu Beginn des Experimentes am größten.
Die zur Verfügung stehende Versuchsanordnung erforderte einen Reaktionsstart direkt im Strahlengang von Hand. Damit war eine gewisse Totzeit sofort nach dem Zufügen der Reagenzien nicht auszuschließen. Eine exakte und reproduzierbare Erfassung des Absolutwertes für die maximal emittierte Lichtenergie pro Zeiteinheit war aus diesem Grund nicht durchführbar.
Der Zeitraum der Lumineszenz- Messung wurde auf wenigstens 300 Sekunden ab Reaktionsstart festgelegt. Im gemessenen Zeitintervall wurde Luminol zu keiner Zeit vollständig umgesetzt.
Die erste Versuchsreihe diente dem Vergleich von Wildtyp und Mutante in ihrem eigenen Kulturmedium. Dabei wurden beide Stämme sowohl in der stationären als auch in der logarithmischen Wachstumsphase untersucht.
Für die stationäre Phase zeigten in allen Fällen die Messungen mit der Rubredoxin- Reduktase-Mutanten eine deutlich stärkere Emission von Licht pro Zeiteinheit als jene mit dem Wildtyp. Auch im Vergleich mit weiteren, zu späteren Zeitpunkten erhobenen Kontrollmessungen am Wildtyp blieb dieser deutliche Unterschied zu den Messungen mit der Mutante 41D3 immer bestehen (Abb. 5.2). In der logarithmischen Wachstumsphase war die zwischen Mutante und Wildtyp beobachtete Differenz beim Vergleich beider Stämme weniger stark ausgeprägt (Abb. 5.3).
Dafür zeigte diese Versuchsreihe aus der logarithmischen Wachstumsphase im Vergleich mit den in der stationären Phase erhobenen Daten, dass die absolute Menge der Radikalentwicklung bei allen Versuchen mit Bakterien in der logarithmischen Phase weitaus größer war als bei Durchführung des gleichen Experimentes mit Bakterien in der stationären Wachstumsphase.
0,00E+00 1,00E-01 2,00E-01 3,00E-01 4,00E-01 5,00E-01 6,00E-01 7,00E-01 8,00E-01
1 17 33 49 65 81 97 113 129 145 161 177 193 209 225 241 257 273 289 Zeit (Sekunden)
Lumineszenz
Mutante 41D3 TB, 1. Messung TB, 2. Messung TB, 3. Messung TB, 4. Messung
Abbildung 5.2
Abbildung 5.3
0,00E+00 1,00E-01 2,00E-01 3,00E-01 4,00E-01 5,00E-01 6,00E-01 7,00E-01 8,00E-01
1 19 37 55 73 91 109 127 145 163 181 199 217 235 253 271 289 Ze it (Se k unde n)
Lumineszenz
Mutante 41D3 TB-Wildtyp
Erläuterungen zu den Abbildungen der vorigen Seite:
Abbildung 5.2: grafische Darstellung einer Lumineszenz- Messungen von P.
aeruginosa 41D3 im Vergleich mit 4 verschiedenen Messungen vom Wildtyp. Alle Bakterien stammen direkt aus dem Kulturmediumund befinden sich in der stationären Wachstumsphase. Der Kurvenverlauf der Mutante hebt sich von allen Wildtyp- Messungen ab.
Abbildung 5.3: grafisch Darstellung einer Lumineszenz- Messung von P. aeruginosa 41D3 im Vergleich mit dem Wildtyp, wie in Abb. 5.2 bei Bakterien direkt aus dem Kulturmedium, hier jedoch in der logarithmische Wachstumsphase. Die Radikalentwicklung ist deutlich stärker.
5.1.4 Radikaldetektion mittels Röntgenfilmexposition bei P. aeuginosa 41D3
Um eine bessere Darstellbarkeit der Ergebnisse zu erzielen, wurde die Versuchsanordnung aus der Küvette in die Mikrotiterplatte transferiert: Auf diese Art und Weise wurde es möglich, eine Vielzahl an Bedingungen zur gleichen Zeit zu testen und die Sensitivität der Messung durch unterschiedlich lange Expositionszeit eines Röntgenfilms zu steuern.
Alle Experimente wurden mit einer konstanten Menge von Luminol und H2O2
durchgeführt.
Aufgrund ihrer intensiven Lichtemission in den vorangegangenen Experimenten wurden in den folgenden Versuchsreihen gewaschene Bakterien der stationären Wachstumsphase getestet. Ihre Menge variierte von 107 bis 105 Bakterien pro Well.
Eine parallel hierzu durchgeführte Versuchsreihe mit ungewaschenen Bakterien in
ihrem Kulturmedium lieferte mit den durch die Chemolumineszenz-Messung gewonnenen Daten vergleichbare Ergebnisse (hier nicht dargestellt).
Mit Zunahme der Bakterienanzahl wurde auch die Chemolumineszenz intensiver, wohingegen in der Negativkontrolle (nur Peroxid und Luminol) kaum eine detektierbare Reaktion stattfand. Auch in dieser Form der Lumineszenzdetektion zeigte die Mutante in allen Konzentrationsstufen eine intensivere Lichtemission als der Wildtyp und damit eine stärkere Radikalfreisetzung. (Abb. 5.4).
Wurden die Bakterien dagegen unter reduziertem Eisenangebot in ChelexTM-LB herangezogen, war bei beiden Stämmen in jedem Fall nur noch eine abgeschwächte Reaktion zu sehen. Unterschiede zwischen Mutante und Wildtyp waren nicht mehr nachweisbar (Abb. 5.4.).
Abbildung 5.4: durch Chemolumineszenz geschwärzter Röntgenfilm (60 Sekunden Expositionszeit). Bei konstantem Zusatz eines Luminol-Peroxid-Gemisches wurde die Menge der vorgelegten Bakterien in abnehmender Reihe variiert (von links nach rechts: 107, 5 x 106, 106, 5 x 105, 105 und zum Schluss 107 cfu/ml als Kontrolle). Parallel dazu wurde in einer zweiten Reihe der gleiche Test mit gleichen Bakterienmengen aus der Anzucht in ChelexTM-LB durchgeführt. Beide Ausschnitte sind Teil eines belichteten Films aus demselben Experiment. Deutlich ist zu erkennen, dass es bei der Rubredoxin-Reduktase-Mutante (hier als RubR bezeichnet) zu einer viel intensiveren Filmschwärzung kommt als beim Wildtyp (TB). Stammen die Bakterien aus mit ChelexTM präpariertem Medium, bleibt die Reaktion fast undetektierbar (jeweils untere Reihe).
5.2 Phänotyp-Untersuchungen an P. aeruginosa 29D2
5.2.1 Beschreibung der STM-Mutante P. aeruginosa 29D2
Das betreffende Gen pchD ist Bestandteil des eisenregulierten Operons pchDCBA in P. aeruginosa (Abb. 5.5). Es zeigt eine Homologie von 99 % zu anderen Adenylat- bindenden und -aktivierenden Enzymen in P. aeruginosa und gilt als Gen der Klasse 1, dessen Funktion als eindeutig gesichert gilt.
PchD codiert für ein Enzym zur Adenylierung an der Carboxylgruppe von Salicylat zu Dihydroaeruginat (Dha). Dha ist ein Zwischenprodukt der Biosynthese des Siderophoren Pyochelin in P. aeruginosa. Ohne pchD kann Pyochelin nicht synthetisiert werden [53, 54].
Die Bedeutung von Pyochelin für das Bakterium liegt in seiner Kapazität, Eisen zu binden und zu transportieren. Eisen ist essentieller Bestandteil für viele Enzyme und dadurch für die Energiegewinnung der Zelle unersetzlich.
Gleichzeitig könnte das an Pyochelin gebundene Eisen aber durch katalytische Bildung von Hydroxylradikalen aus Wasserstoffperoxid die Schädigung der Zelle bei PMN-Attacken verstärken. Die Auswirkung des Pyochelin-Defekts auf die Peroxid- Resistenz wurde daher untersucht.
5.2.2 Wachstum auf Peroxid-Agar für P. aeruginosa 29D2
Bei Anzucht auf Peroxid-versetztem LB-Agar zeigte die Mutante 29D2 eine deutlich erhöhte Resistenz gegenüber dem Wildtyp (Abb. 5.6 A-C). Aufgrund der hohen Zerfallsrate von Wasserstoffperoxid bei der Vermischung mit verflüssigtem warmem Agar müssen die angegebenen Konzentrationen allerdings als theoretische
Abbildung 5.5: Ausschnitt aus der Genkarte von P. aeruginosa PAO1, PA 4228-Region (pchD)
A 200 mM/l B 50 mM/l C 12,5 mM/l
Abbildung 5.6: A-C: P. aeruginosa 29D2 (jeweils rechte Kolonie) zeigt eine erhöhte Peroxid-Resistenz. Das Wachstum des TB-Wildtyps (linke Kolonie) setzt erst bei einer geringeren Wasserstoffperoxid-Konzentration im Agar ein. Als Nebeneffekt zeigt sich die Bleichung des Nähragars bei höherem Peroxid-Zusatz. Detektion von Radikalen
Höchstwerte angesehen werden. Das Wachstum des Wildtyps stellte die tatsächliche Kontrolle dar. Der Versuch wurde zweifach in jeweils zwei von einander unabhängigen Verdünnungsreihen durchgeführt und zeigte in allen vier Fällen erst bei Halbierung der Peroxid-Konzentration eine Koloniebildung des Wildtyps nachdem das Wachstum der Mutanten bereits eingesetzt hatte.
Analog zu den unter 5.1.3 beschriebenen Untersuchungen für P. aeruginosa 41D3 wurde auch die Pyochelin-Mutante 29D2 auf die Freisetzung von Radikalen bei oxidativem Streß getestet. Während die Rubredoxin-Mutante hier deutlich stärker als der Wildtyp reagiert hatte, waren Unterschiede zum Wildtyp bei der Pyochelin- Mutanten nur unter bestimmten Bedingungen zu beobachten.
Für die Untersuchungen in der stationären Wachstumsphase zeigte sich schon bei der ersten Versuchsreihe mit Bakterien direkt aus dem Kulturmedium kein signifikanter Unterschied in der Radikalentwicklung zwischen P. aeruginosa 29D2 und dem Wildtyp (ohne Abbildung), ganz im Gegensatz zu den zuvor gesehenen deutlichen Unterschieden bei P. aeruginosa 41D3 (vergleiche nochmals Abb. 5.2).
Auch für die noch in der logarithmischen Phase befindlichen Bakterien zeigte die erste Versuchsreihe keine Unterschiede zwischen der Mutanten und P. aeruginosa TB (ohne Abbildung).
Ebenso war für die zweite Versuchsreihe mit gewaschenen Bakterien zehn Minuten nach ihrer Resuspension weder während der stationären noch während der logarithmischen Wachstumsphase eine Differenz zum Wildtyp messbar (ebenfalls ohne Abbildung).
Die im Vergleich mit dem Wildtyp reduzierte Produktion von Radikalen war nach dieser Untersuchung nur für solche Bakterien des Stammes P. aeruginosa 29D2 zu
belegen, die sich in der logarithmischen Wachstumsphase in ihrem Medium befanden.
5.2.3 Radikaldetektion mittels Röntgenfilmexposition für P. aeruginosa 29D2
Der Test wurde analog zu den unter 5.1.4 für P. aeruginosa 41D3 beschriebenen Bedingungen für die Bakterien der stationären Wachstumsphase des Stammes P.
aeruginosa 29D2 durchgeführt. Eine Differenz zwischen dem Wildtyp TB und der Mutanten war nicht darzustellen; damit war dar Ergebnis kongruent zu den in Abb.
5.4 dargestellten Messungen. Unter dem durch Vorbehandlung mit ChelexTM herbeigeführten Eisenmangel reduzierte sich auch hier die Radikalentwicklung erheblich (Abb. 5.7)
Abbildung 5.7: Röntgenfilmschwärzung nach Chemolumineszenz-Exposition (60 Sekunden) bei P. aeruginosa 29D2 und TB. Die Ausschnitte entstammen demselben Röntgenfilm wie beim Experiment in Abb. 4.5, für TB sind sie identisch.
Dementsprechend gleichen sich auch die Bakterienkonzentrationen (von links nach rechts: 107, 5 x 106, 106, 5 x 105, 105 und zum Schluss 107 cfu/ml als Kontrolle).
Zwischen P. aeruginosa TB (TB) und P. aeruginosa 29D2 (pchD) ist kein Unterschied zu erkennen (Vergleiche hierzu Abbildung 4.4 in Abschnitt 4.1.1.).
5.3 Phänotyp-Untersuchungen an P. aeruginosa 22D11
5.3.1 Beschreibung der STM-Mutation in P. aeruginosa 22D11 (PA 1441)
Das mit Hilfe des Transposons ausgeschaltete Gen ist mutmaßlich Teil eines Clusters von Genen, die für den Aufbau des bakteriellen Flagellums genutzt werden (Abb. 5.8). Es handelt sich bei dem codierten Protein um ein Protein der Klasse 4;
dies bedeutet, dass seine Funktion und subzelluläre Lokalisation noch weitgehend ungeklärt sind.
Dessen ungeachtet weist die codierte Peptidsequenz eine Homologie von 47% zu FliK von Salmonella typhimurium auf. FliK wird hier während des Aufbaus der Flagelle sezerniert und steuert die Länge des entstehenden Hakens: ohne FliK kommt es offensichtlich nicht zum Ende des Hakenaufbaus und zum Anschluss der Flagellin-Einheiten [55, 56].
Für P. aeruginosa 22D11 konnte unter dem Elektronenmikroskop bereits gezeigt werden, dass die von der STM-Mutanten exprimierten Flagellen eine gegenüber dem Wildtyp veränderte Struktur aufweisen: Bei dem Flagellum von P. aeruginosa TB lässt sich die gitternetzartige Oberflächenstruktur des Hakens gut von den Längsrillen des Filamentes unterscheiden. Dagegen setzt sich diese Gitternetz- Struktur bei P. aeruginosa 22D11 auf der ganzen Länge des Filamentes fort. Eine gleichartige Veränderung der Flagelle gegenüber dem Wildtyp ist bereits für fliK- Mutanten der Spezies Salmonella dokumentiert [57].
Es sollte nun untersucht werden, ob sich durch den Verlust von FliK neben den strukturellen Veränderungen des Flagellums auch weitere Änderungen in der Sekretion von P. aeruginosa 22D11 gegenüber dem Wildtyp ergeben.
Abbildung 5.8: Ausschnitt aus der Genkarte von P. aeruginosa PAO1, PA1441-Region (fliK)
